第一篇:教案2-细胞核的分离
细胞核的分离与纯化
我们知道每一个细胞内部都是由多个结构组成的,比如说有细胞核,线粒体,内质网,高尔基体等,如果要研究细胞内这些部位的结构和功能,以及细胞器在细胞活动中所起的作用时,那么首先必须将其从生物材料中提取出来,进行分离纯化和测定之后,然后才能进行更深入的研究。我们今天就以小鼠的肝细胞核的提取为例,来了解一般分离提取的基本原理和方法。
通过本次实验,要求我们达到以下两个目的,1:掌握离心技术的原理和使用方法
2:掌握细胞核分离的原理和方法。那关于离心机的原理及使用方法我们在第一次实验课上已经讲过了,那么在这里我只强调两点,就是在使用的时候首先要注意配平原则并且规范操作,一定要注意安全,安全是第一的。那接下来我们就看一下细胞核的分离原理。
由于细胞内不同结构它的比重和大小是不同的,在同一离心场内的沉降速度也是不相同的。因此我们可以首先将我们的生物材料研磨成匀浆,然后通过离心的方法分离出细胞质和粗制细胞核,细胞核粗制品加入0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液(含Ca2+,可防止细胞核凝集,维持细胞核的正常形态),混匀制成匀浆,然后选用高渗蔗糖—柠檬酸溶液作为梯度介质,调整离心力,通过密度梯度离心的方法进行离心,可以使细胞核单独沉淀于离心管底部,从而将细胞核与其他比重相接近的亚细胞结构分离开。在这里我要告诉大家细胞器沉降的先后顺序是细胞核、线粒体、溶酶体和其他微体、核糖体和大分子。那接下来我们看一下在这个实验中需要用到哪些试剂?
实验试剂:1,生理盐水 2, 1.5%柠檬酸 3,0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液 4,0.88mol/L蔗糖—柠檬酸溶液 5,核洗液 6,0.02mol/L NaOH溶液,关于各试剂的作用我们在操作的时候会说到。接下来我们看一下具体的操作步骤。
(1)首先第一步就是肝细胞匀浆的制备。用颈椎脱位的方法杀死小白鼠后,迅速剖开腹部取出肝脏,剪成小块(去除结缔组织),尽快置于盛有生理盐水的烧杯中,反复洗涤,尽量除去血液,剪碎,称取0.5g的肝组织,放入匀浆器中,加1.5%的柠檬酸溶液4.5mL,柠檬酸具有抑制核酸酶活性的作用,因此可以防止核酸的降解。反复研磨制成匀浆。再将匀浆用尼龙布过滤2-3次,除去残渣。
(2)分离细胞质和细胞核
a.将过滤好的匀浆液转入离心管中,放入普通离心机,大家注意一定要配平,然后以3500r/min的转速,离心15min.离心之后的上清液含有细胞质,要倒到另外一个试管中保留,待测定核酸时使用。
b.余下的沉淀物就是粗制的细胞核,然后加入0.25mol/L蔗糖—柠檬酸溶液1mL,用玻璃棒搅匀,制成细胞核悬液,在这个溶液中加入了CaCl2,因此含有Ca2+,这可防止细胞核凝集,能够维持细胞核的正常形态。
c.另取一个离心管,先加入0.88 mol/L蔗糖—柠檬酸溶液9Ml,用滴管吸取上述的核悬液,沿管壁缓缓铺于0.88 mol/L蔗糖—柠檬酸溶液面上,因为该溶液中含有蔗糖,且浓度较高,所以溶液比较黏,跟上面的核悬液能有一个明显的界面。然后再以2000r/min 转速离心10min,倾去上清液,将试管倒立于试纸上,以吸干余液,沉淀即为初步纯化的细胞核。
d.加入核洗液5mL,以2000r/min离心10min,除去上清液,再重复洗涤一次,得到的白色沉淀即为纯化的细胞核。
e.加5mL的0.02mol/L NaOH溶液使细胞核溶解为核液,保留,待测定核酸。注意事项:1.红细胞与细胞核大小相似,可与细胞核一起沉淀,不易分离,因此从杀死动物到取出肝脏,动作要迅速,否则血液凝固,不易将红细胞洗净。2 倾到上清时要求一次倒出,不得反复倾倒,防止震荡沉淀,影响结果。3 一定要正确使用离心机。
第二篇:细胞核的分离
实验四 细胞核的分离
[实验目的]
1.为了研究细胞核及其组分。
2.定量分析细胞核的生化组分及其它一些特殊成分。
[实验原理]
1956年由chauveau等人提出,用高密度介质来分离细胞核。由于细胞核的密度较大,在高密度介质中,在高速离心条件下沉降下来,从而达到与细胞质其它成分分开来的目的。chauveau的方法是将动物肝脏直接在2.2mol/l蔗糖溶液中匀浆,然后高速离心40 000g 1小时,细胞核沉淀到底部,线粒体和完整细胞,包括红血球漂浮在液面,通过一步操作即可分离得到细胞核。其后又有不少研究者对此方法进行了改进,例如加进氯化钙、氯化镁、氯化钾等改变分离介质的渗透压;选择介质的ph以及不同的高密度蔗糖溶液离心方法等。这样减少了细胞核的脆性,防止聚集,维持恒定的ph,就能保持细胞核的精细结构。虽然这一方法比较简单,能得到较高纯度的细胞核,也已被广泛采用,但实验需要高速离心机,这在一般实验室不能进行,此方法要用高浓度的蔗糖,如果要分离大量的细胞核,也很不经济。
目前在一般实验室中更多的是用柠檬酸分离细胞核,在柠檬酸介质中分离细胞核可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分。由于柠檬酸降低了溶液的ph值,这样可以减少细胞核的破碎率,并能分离得到较高分子质量的核酸,可能是由于核糖核酸(一种酸溶性蛋白)被柠檬酸除去,以及二价阳离子被柠檬酸螯合所致。
柠檬酸的浓度对分离细胞核的质量有较大影响。通常在较低的ph值时,可以得到较高的细胞核。但在过酸条件下,可能引起细胞核成分的改变和酶的失活。为了研究细胞内核酸,一般常在ph值为4,甚至在ph值为2.5时分离细胞核。如为了分离细胞核的酶,则需要较温和的条件,此时可以在ph值为6~6.2的极稀柠檬酸溶液中分离细胞核。细胞核纯度的鉴定,可以从两方面进行,用光学显微镜或电子显微镜进行形态观察和生物化学方法进行酶活力的测定,某些细胞质的酶(如过氧化氢酶、碱性磷酸酶、淀粉酶和脂酶等),在纯细胞核制品中活力应较低或检查不出来。
本实验以动物肝脏为材料用柠檬酸的方法分离细胞核,用光学显微镜观察细胞核的形态。
[实验用品]
一、材料:动物肝脏。
二、试剂:
1.0.9 %氯化钠。
2.1.5 %柠檬酸钠。
3.0.25mol/l蔗糖-1.5% 柠檬酸溶液。
4.0.88mol/l蔗糖-1.5% 柠檬酸溶液。
5.台盼蓝染液:取0.4g台盼蓝,0.81g氯化钠,0.06g磷酸二氢钾和0.05g羟基苯甲酸盐于95ml重蒸水中,加热溶解后用1mol/l氢氧化钠溶液调ph值至7.2~7.3之间,最后定容到100ml。
三、器材:
1.解剖器一套。
2.高速组织捣碎机或组织匀浆器。
3.离心机(能准确调速的)。
4.台秤。
5.光学显微镜。[实验内容及方法]
一、细胞核的分离
1.实验前24小时内动物须保持空腹,然后将动物断头杀死,取出肝脏,在生理盐水中充分漂洗除去血污,用滤纸吸去表面液体,将肝脏放入-20℃低温冰箱过夜待用。
2.取10g肝脏剪成小块,按1﹕10(重量﹕体积)加入1.5%柠檬酸溶液,用组织捣碎机或组织匀浆器破碎细胞(注意不要把细胞核破坏),如果用高速组织捣碎机,要捣3次,每次5~10秒钟(转速为10 000~20 000r/min)。
3.把捣碎液用4层纱布过滤,滤液以800~900r/min离心10分钟,弃上清液,沉淀再用1.5%柠檬酸液洗一次。
4.将沉淀再悬浮于100 ml 0.25mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液中制成悬液,将离心管内预先加好200 ml 0.88mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液,并将上述悬液置于0.88mol/l蔗糖-1.5%柠檬酸溶液之上以1 000r/min离心10分钟,即可得到较纯的细胞核沉淀。
二、细胞核纯度的鉴定
用玻璃棒碰一下细胞核的沉淀,放在载玻片上轻磨,然后加一滴台盼蓝(trypan blue)染色液,加上盖玻片,即可在光学显微镜下进行观察,高纯度的细胞核制品必须在计数400个核中不能有一个完整的细胞;在1 000个细胞中不能有一个带有细胞质的核。
[实验报告及思考题]
1.绘制细胞核形态图sssss
2.分析影响细胞核提取的主要因素。
第三篇:细胞核 教案
第3节 细胞核——系统的控制中心 教案
《普通高中课程标准实验教科书 生物必修一《分子与细胞》第三章第三节的 [课标要求]:
1、阐明细胞核的结构与功能(Ⅱ)
2、尝试建立真核细胞的模型(Ⅰ)教学目标
1.阐明细胞核的结构和功能。
2.认同细胞核是细胞生命系统的控制中心。3.尝试制作真核细胞的三维结构模型。教学重点
(1)细胞核的结构和功能。
(2)制作真核细胞的三维结构模型。教学难点
理解细胞核是细胞生命系统的控制中心 教学过程:
【导入】同学们:今年最流行的国产动画片是什么? 今天,喜羊羊的家族里来了三个新成员,分别是黑羊羊、白羊羊和灰羊羊,黑羊羊、白羊羊非常受他们的欢迎,而灰羊羊常常被冷落。灰羊羊想改变后代的命运,可正常情况下,灰羊羊只能生灰色的羊”灰羊羊的梦想是生一只漂亮的小白羊,我们怎样才能帮她实现梦想呢?(配合2张幻灯片)
学生若答上:鼓励,然后指出这个方案的关键之处是取白羊羊的“细胞核”,从而引出课题。学生若答不上:我们要帮她实现梦想,必须研究细胞核的有关知识,带着这个问题,我们今天学习第三节 细胞核──系统的控制中心
一、细胞核有什么功能 分析资料探究细胞核的功能
资料一:(美西螈核移植实验)逐步放映实验步骤并提出问题:
问题:移植后长大的美西螈是什么体色? 理由是什么?由此你认为生物性状的遗传主要由什么控制?据此能不能帮助灰羊羊设计一个方案,实现她生一只漂亮的小白羊的梦想 结论:生物的性状是由细胞核决定的 资料二:(蝾螈受精卵横缢实验)逐步放映实验步骤,边放映边提出问题:
问题:分隔后蝾螈受精卵的两半有什么不同?会出现什么不同的结果?此结果说明什么问题?怎样进一步设计实验证明这个问题?最后根据结果归纳总结该实验的结论。
整个实验最突出的试验设计思想是什么?怎么对照的?围绕什么而对照?(分隔后两部分的对照,自身前后的对照,都是围绕细胞核而对照的)
结论:没有细胞核,细胞就不能分裂 资料三:(变形虫去核及核移植实验)
问题1.若想利用变形虫探究细胞核的功能,你会如何设计实验?(小组讨论,代表回答)指出:生物学家的设计和你们的设计一样,然后边放幻灯片片介绍每一步的不同结果。2:根据实验结果能得出什么结论?3:人成熟的红细胞还能生长分裂吗?为什么?
结论:细胞核是细胞生命活动的控制中心,细胞核与细胞质关系紧密 资料四:(伞藻嫁接与核移植实验)
(1)老师先对照图片简介伞藻的结构。
(2)以图片的形式打出生物学家的操作流程图,让学生观察讨论试验步棸,然后表述实验步骤,并预测实验结果。
问题串1:伞藻嫁接实验:切去帽后长出来的新帽的形状是由柄决定的?还是由假根决定的?该实验能否说明伞帽的形状由细胞核控制?要证明“伞帽的形状由细胞核控制”需再怎样设计实验?
问题2:根据伞藻嫁接实验和伞藻核移植实验结果,得出什么结论? 结论:生物体形态结构的建成主要与细胞核有关 板书: 细胞核功能---控制细胞代谢和遗传
细胞核为什么能成为细胞代谢和遗传的控制中心,这是由细胞核的结构决定的。引出对细胞结构的学习。
二、为什么具有此功能──细胞核的结构
1、核膜:双层生物膜,把核内物质与细胞质分开。就像细胞膜把细胞与外界环境分隔开一样,但又不是完全分隔开,因为核内要不断地与核外细胞质进行物质交换和信息交流,而核孔则主要是大分子进出的通道。
2、核孔:分布在核膜上,是内外两层生物膜连接在一起形成的(打手势比喻)。联系观察DNA和RNA在细胞中分布实验,及核糖体是合成蛋白质的场所,讲解RNA穿过核孔出来,蛋白质穿过核孔进去。进一步指出,代谢越旺盛的细胞需要交换的物质和信息越多,为适应这一功能,所以核孔的数目就越多。
3、核仁:主要是一部分染色质聚在一起形成的,这部分染色质里的DNA主要控制合成构成核糖体的RNA,所以说它与某种RNA及于核糖体的形成有关。通常蛋白质合成旺盛的细胞核仁较大。
4、染色质,染色体:主要有DNA和蛋白质组成,呈细长丝状,因易被碱性染料染成深色而得名。若细胞要分裂,染色质就螺旋化,缩短变粗,形成棒状或杆状的染色体。染色质:最早是由德国生物学家瓦尔德尔提出来的,主要是指细胞核内容易被碱性染料染成深色的物质,因此叫做染色质
三、谁在承担这个功能---DNA DNA:是遗传信息的载体,细胞的一切生命活动都是由DNA控制的,比如(指某个同学)你长得像你爸妈,是因为你细胞核内的DNA一半来自你爸爸一半来自你妈妈;同样的草,羊吃了长羊肉,牛吃了长牛肉,是因为牛羊细胞内的DNA不同。所以细胞的代谢和遗传都是DNA控制的。而DNA主要分布在细胞核内,因此细胞核又被称为──遗传性息库。所以细胞核才具有控制细胞代谢和遗传的功能
四、细胞是一个有机的统一整体
细胞只有保持完整性,才能正常地完成各种生命活动。(草履虫实验:证明核质关系)
细胞是生物体结构和功能的基本单位,也是生物体代谢和遗传的基本单位。课后作业:
试制作真核细胞的三维结构模型(下节课评选最佳作品。注意:科学性、准确性应放第一位,还应考虑艺术性、成本低廉等等)[教学反思] 补充:高等植物成熟的筛管细胞和哺乳动物成熟的红细胞等没有细胞核
第四篇:高一生物教案细胞核教案
高一生物教案细胞核教案
编辑:sx_xingt 2013-01-29
【摘要】鉴于大家对自考考务考籍十分关注,小编在此为大家搜集整理了此文“高一生物教案细胞核教案”,供大家参考!
高一生物教案细胞核教案
高一生物第3章第3节 细胞核——系统的控制中心教学案
【预习目标】
1、了解细胞核的结构和功能
2、了解细胞的概述及模型构建
【新知自主探究】
一、细胞核的结构和功能
1、细胞核的分布:用光学显微镜观察细胞,最容易注意到的是;
除了高等植物成熟的__________细胞和哺乳动物成熟的_____细胞等少数细胞外,真核细胞都有细胞核。
2、细胞核的结构:(观察课本P53细胞核结构模式图)细胞核是由、和、组成的,核膜是_ __层膜,把 与 分开,核膜上有大分子通道,核孔的作用是实现 之间频繁的 和。染色质由_______和________组成,________是遗传信息的载体,因容易被 染料染成深色而得名。染色质与染色体的关系是。核仁的作用是与__________的合成以及___________的形成有关。
3、细胞核的功能:细胞核是,是细胞 和___________的控制中心。
二、细胞的概述及模型建构
1、细胞的概述:细胞作为基本的,其结构复杂而精巧;各组分之间分工合作成为,使生命活动能够在变化的环境中、地进行。这是几十亿年进化的产物。细胞既是生物体 的基本单位,也是生物体 的基本单位。
2、模型构建:模型是人们为了某种特定目的而对认识对象所作的一种 ___________ 的描述。其形式很多,包括__________、_________、___________等。例如,挂图、细胞结构模式图和模型、沃森和克里克制作的著名的___________________模型,属于________模型。座标曲线、公式Nt=N0·λt)都是 模型。
第五篇:高一生物细胞核和细胞器2
《细胞核和细胞器》教学设计(1)
教材分析:
《细胞核和细胞器》是高中《生命科学》第三章“生命的结构基础”第二节内容,这一部分内容是在学生初中阶段认识细胞显微结构的基础上,进一步学习细胞的亚显微结构。它既是今后相关章节学习的基础,也是提高学生科学素养的重要组成部分。
学情分析:
学生在初中已经初步学习了有关细胞膜、细胞质和细胞核的知识,对本节知识有一定的了解。但由于学生较长时间没有继续学习生物学知识,而且细胞的亚显微结构比较抽象,学生学习时会感到有一定的难度。
教学目标:
【知识与技能】
1.了解细胞核的亚显微结构、组成成分以及生理功能;
2.掌握细胞质中的各种细胞器:叶绿体、线粒体、液泡、中心体、核糖体、内质网、高尔基体的形态、结构、分布和功能;
3.了解原核生物与真核生物的主要区别。【方法与过程】
1.使学生学会利用生物图来学习生物细胞的亚显微结构;
2.通过对相关细胞知识的比较、归纳,使学生掌握学习生命科学的方法与过程。【情感态度与价值观】
培养学生认真、细致的观察品质,提高学生交流、互助合作的意识。
重点、难点:
(一)教学重点:
1.细胞核的亚显微结构以及生理功能;
2.与能量代谢有关的细胞器-线粒体和叶绿体的结构与功能。
(二)教学难点:
1.染色体与染色质;
2.“颤藻与水绵的比较观察”实验。
教学方法:教师引导学习教学策略:
1.注重启发、引导:利用课件的直观展示和教师的讲解、分析,帮助学生掌握细胞质和细胞核的相关知识。
2.强化训练:利用学习内容,教师创造条件,给学生提供更多能积极参与的机会。
课前准备:
课件、演示设备(电脑、实物投影仪)等。
教学过程:两课时 新课引入
1.提问:什么是“生命的结构基础”?
2.学生回答之后,教师引入:细胞作为生命的结构基础,要表现出物质运动最高级的形式─生命现象,是将各种化合物按照一定的方式组织起来,形成具有一定形态和功能的各个结构。
在上一节里,我们学习了细胞膜的结构与功能,在这一节中,我们将学习有关细胞核与细胞器的知识。(板书课题:第三章第二节 细胞核与细胞器)
新课教学
第一课时
一.细胞核
引导学生先观察细胞核的模式图,逐一了解细胞核的亚显微结构主要包括核膜、核液(内有染色质)、核仁几个部分,然后再重点分析核膜以及染色质的结构、成分和功能。
(一)细胞核结构
1.核膜:细胞核具有双层膜结构,因此物质进出细胞核比较困难,尤其是大分子物质一般是难以通过核膜的。但由于细胞核核膜上的许多小孔─核孔的存在,使得完成细胞核功能所必须的大分子物质得以顺利进出(无需过膜,如核仁与核糖体的形成有关)。2.染色质与染色体:
(1)电镜下的染色质呈细丝状(30nm的染色质纤维),其主要成分是DNA和组蛋白。在细胞分裂期间通过螺旋化缩短变粗形成光学显微镜下可见的染色体。
(2)让学生自己归纳出染色质与染色体的关系——是同一物质在细胞不同时期的两种形态表现。
(3)教师用图形进一步补充:伸展的染色质形态有利于DNA储存信息的充分表达,高度螺旋化了的棒状染色体则有利于细胞分裂时遗传物质的平分(由于纺锤丝的牵动,两个染色体分别向细胞的两极移动)。
(二)细胞核的功能:
1.已知染色体中所含的DNA是遗传物质,所以细胞核成为遗传物质储存和复制的场所。2.用克隆羊多利的图例使学生懂得细胞核是控制细胞代谢的活动中心。
“多莉”的产生与三只母羊有关:一只是怀孕三个月的白面母绵羊,两只是黑面母绵羊。先从白面母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞,取其细胞核(称之为供体,提供了全套遗传信息),再从一只黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细胞,将其细胞核除去,仅留下一个无核的卵细胞(称之为受体);利用电脉冲的方法,使供体细胞和受体细胞发生融合,形成融合细胞,待融合细胞分裂、分化进而形成胚胎细胞后,将该胚胎细胞转移到另一只苏格兰黑面母绵羊的子宫内,胚胎细胞进一步分化和发育,最后形成一只小绵羊——“多莉”。让学生预测新出生的小绵羊的外貌,并说明理由(激发兴趣,培养思维)要求答:与供体白面母绵羊有着完全相同的外貌。二.细胞器
(一)亚显微结构的概念:
1.出示真核细胞的显微结构图,使学生首先认识到细胞核、细胞膜和细胞质这三个部分组成原生质(细胞中的生命物质)。2.再出示真核细胞亚显微结构图,使学生了解到细胞质内还有多种细微结——细胞器。
3.教师用文字进一步介绍亚显微结构的概念:由于普通光学显微镜的分辨力极限约为0.2微米,而细胞内一些微细结构,例如细胞膜、内质网膜和核膜的厚度以及核糖体、微管、微丝的直径等均小于0.2微米,所以这些细胞结构用普通光学显微镜是观察不到的。要想观察到这些结构,必须用分辨率更高的电子显微镜(电子显微镜的分辨力极高,可达0.2纳米左右)。用电子显微镜所观察到的结构就是亚显微结构,又称为超微结构。
(二)细胞质内的各个细胞器
1.先让学生观察并阅读课本p50~51动物细胞、植物细胞亚显微结构图相关的内容; 2.然后教师分别出示动物细胞亚显微结构图,让学生辨别其中的各种细胞器:(1)线粒体
①线粒体很小,只有在高倍光学显微镜下才能看到它,呈粒状、棒状。②电子显微镜下的线粒体切片,可以观察到它具有内外两层膜。
外膜将线粒体与周围细胞质基质分开(保证了线粒体内部各种生化反应的环境条件,同时也能控制着物质的进出)。
内膜的某些部位向内腔折叠成嵴(增加了内膜的表面积,有利于酶系的附着,确保有氧呼吸化学反应的顺利进行),嵴上分布着许多小颗粒,叫做基粒。③嵴周围充满着液态的基质。
④在内膜上和基质中,都含有许多与呼吸作用有关的酶,使线粒体成为有氧呼吸的主要场所。
(2)溶酶体:由膜围成的小球体。(3)核糖体:
①核糖体有的附着在内质网上,有的游离在细胞质的基质中(让学生观察课本P18)。②核糖体是细胞内的一种微小颗粒,无膜结构。由于其主要成分是核糖体核糖核酸(rRNA),使其能按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链(让学生回顾氨基酸缩合成肽的知识), 所以核糖体是细胞内蛋白质合成的组装机器。
③拓展:除核糖体外,在线粒体、叶绿体内也有少量的RNA和DNA,为什么?(4)高尔基体:
①教师先补充介绍:1889年,Golgi用银染法在猫头鹰的神经细胞内观察到了其清晰的结构(由单层膜所包围成的分隔腔及一些分泌小泡组成),因此定名为高尔基体。
②结合细胞结构图,让学生了解它一般位于细胞核附近的细胞质中。它不仅参与多糖合成,还是糖蛋白加工(内吞)、浓缩和分泌(外排)的场所。因此,动物细胞中的高尔基体,与细胞分泌物的形成有关;而植物细胞中的高尔基体,与细胞壁的形成有关。(5)内质网:
①粗面内质网:膜的外侧附着核糖体。核糖体所合成的蛋白质多肽链,会进入内质网腔被运输到其他细胞器继续进行加工。
②光面内质网:膜的外侧无核糖体附着。一般与核膜内相通连,不仅扩大了细胞内膜的表面积,同时也使内质网与脂类代谢和糖类合成有关。
(6)中心体:常见于动物细胞和低等植物细胞之中,因总是位于细胞核附近,接近细胞的中心,故此得名。电镜下的每个中心体都含有两个互相垂直排列的中心粒(中心粒由9组三联微管围成圆筒状,在细胞有丝分裂时发出星射线,形成星状体),与动物细胞的有丝分裂有关。