体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则--生物芯片

第一篇：体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则--生物芯片

附件6: 体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则 ——生物芯片类试剂生产及质量控制技术指导原则

前 言

本指导原则所定义的生物芯片诊断试剂是指将多个生物探针(包括DNA片段,寡核苷酸,抗原,抗体,组织,细胞等)按预先设计的排列方式固定在特制的基质(包括玻璃片,尼龙膜,硝酸纤维素膜等)上,用特定的方法提取生物靶分子并进行标记,然后与固定在基质上的生物探针特异性的结合,再用相应的检测设备(如激光扫描仪,CCD检测仪等)和分析方法(包括软件)进行检测,记录,分析,实现对生物靶分子的定性或定量检测的试剂.根据芯片制作的主要原料和方法,生物芯片可分为核酸芯片,蛋白芯片,细胞芯片,组织芯片,芯片实验室等.本指导原则是针对核酸和蛋白为检测靶分子生物芯片的生产及质量控制技术指导原则,其它类型靶分子检测的芯片诊断试剂可参考本指导原则.由于生物芯片技术还在不断发展,国家食品药品监督管理部门可依据科学技术发展的需要,适时组织对本指导原则进行修订.一,基本原则

(一)生物芯片诊断试剂生产用的物料包括:原料,辅料和包装材料.各种物料应当制定相应的质量指标,并应符合有关法规的要求.(二)生物芯片诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员,相适应的仪器设备和生产环境,获得《医疗器械生产许可证》;应当按照《体外诊断试剂生产实施细则(试行)》的要求建立相应的质量管理体系,形成文件和记录,加以实施并保持有效运行;应当通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准(试行)》的考核.(三)生物芯片诊断试剂的研制应当按照科学,规范的原则组织研发,各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理.(四)生物芯片诊断试剂生产过程中所用的物料及工艺,应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜.二,物料质量控制(一)核酸检测芯片

核酸芯片检测时,从生物样本中提取的核酸可用荧光标记,金标记和酶标记.检测方法包括光谱学方法和化学显色.下面为荧光标记芯片技术指导原则,采用金标记和酶联显色等的生物芯片诊断试剂可参照核酸芯片和蛋白芯片相关部分.1,主要生物原料

核酸检测芯片的主要生物原料包括模板DNA,dNTPs,引物,探针,标记物等.应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验,以保证其达到规定的质量标准.主要生物原料的供应商要求相对固定,不得随意变更供应商.(1)模板DNA 重组DNA:经测序验证,关键位置没有错误.1×TE溶解,浓度为1μg/μl以上,-20℃保存.(2)dNTPs(dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP)HPLC纯,PCR级,无DNase,RNase污染.-20℃以下保存.外购者,由生产厂家提供质量保证证明,达到生产要求.(3)引物

序列确证;进行PCR扩增后,克隆测序鉴定验证,建立引物标准品.生产中的引物原材料为冻干粉,PAGE纯或HPLC纯,外购者,供应商应提供该产品的质检证明,如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱;自己合成的引物,需有PAGE电泳结果或HPLC分析图谱.用标准DNA模板扩增,电泳检测,谱带单一,大小正确,与对照引物比较,产物量一致.符合视为合格引物.-20℃以下保存.(4)探针(用于阵列制备)重组DNA, 冻干粉(或1×TE溶解液):每种90μg以上,酶切鉴定分析图谱.PCR产物,冻干粉(或1×TE溶解液):每种90μg以上,PCR电泳鉴定图谱.合成寡核苷酸:PAGE纯或HPLC纯,每种90μg以上,提供该产品的PAGE电泳分析图谱或HPLC分析图谱.外购者,供应商应提供质量保证证明,达到生产要求.探针序列的正确性:应用克隆鉴定的标准DNA杂交鉴定或进行测序鉴定.外购者,供应商应提供质量保证证明,达到生产要求.纯度和浓度检测:用电泳方法,电泳图谱没有杂带,目标条带的强度与已知浓度的标准DNA条带进行参比计算其强度.纯度较高的DNA,可用紫外分光光度计进行定量.检定合格后入库.避光,-20℃以下保存.(5)标记物

含有激发光波长和发射光波长介于280680nm的所有荧光分子,HPLC纯,供应商应提供质量保证证明.(6)Taq DNA聚合酶

SDS-PAGE 检测,纯度>95%,具DNA聚合酶活性,无核酸外切酶活性及核酸内切酶活性,具热稳定性,94℃1小时后仍保持50%活性,由供应商提供质量保证.-20℃保存.(7)UNG(尿嘧啶糖基化酶)具尿嘧啶糖基化酶活性,无核酸外切酶及核酸内切酶活性.1U UNG 37℃处理3分钟后,103拷贝以下含U模板被降解后,不能产生扩增产物,供应商提供质量保证.-20℃保存.(8)RT 酶

具有逆转录活性,供应商提供质量保证.-20℃保存.(9)RT-PCR酶

具逆转录酶活性和DNA聚合酶活性,无核酸外切酶活性及核酸内切酶活性,具热稳定性,94℃1小时后仍保持50%活性.-20℃保存.(10)缓冲液

各类酶制品需要的的反应缓冲液由厂家随酶制品提供,供应商提供质量保证.-20℃保存.2,主要生物辅料(1)杂交液

购买成品者,供应商提供质量标准,并按要求保存.自制杂交液,按半成品检定标准要求进行检定.(2)酶类

蛋白酶,核酸酶等,供应商提供质量标准,并按要求保存.(3)核酸提取试剂

供应商提供质量保证,并按要求保存.如果是自制提取液,按半成品检定要求.(4)鱼精DNA 供应商提供质量保证,并按要求保存.(5)封闭用蛋白

包括牛血清白蛋白,奶粉等,提供质量标准,并按要求保存.3,主要化学原辅料 参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准(2000年版)》分析纯级别进行检验.主要的检测指标包括:溶液外观,一般盐类检测,溶液pH值检测,溶解情况检测,干燥失重的检测,炽灼残渣等.主要化学原材料的供应商要求相对固定,不得随意发生变更.化学原材料在购入时,原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量质量保证材料和质量检验报告,其质量标准应达到生产所需的质量标准.(1)无机类

主要包括氯化钠,氢氧化钠,纯化水等.(2)有机类

主要包括有丙酮,乙醇,枸橼酸,吐温20,乙二胺四乙酸二钠,氨基吡啉等.(3)特殊化学原料

聚乙二醇,多聚赖氨酸,丙烯酰胺,甲叉双丙烯酰胺,N,N,N',N'-四甲基二乙胺(TEMED),溴化乙锭(EB),染色剂等.4,其他物料(1)载玻片

外观:明亮处用肉眼观察无缺刻,无划伤等.规格按设计要求.激光扫描仪扫描(波长为芯片检测波长):包被层基本均匀.(2)试管,吸头,试剂瓶等

一次性使用,由生产厂家提供质量保证,达到设计要求.(3)其他:说明书,包装外盒等

参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书,标签和包装标识管理规定》执行.(二)蛋白检测芯片 1,主要生物原料

与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种活性抗原,重组抗原,单克隆杭体,多克隆抗体以及多肽类生物原科.这类原料可用于点膜,标记相关酶,纳米金,光学基团及中和反应用抗原或抗体等.使用前应按工艺要求对这类生物原料进行质量检验,以保证其达到规定的质量要求.主要生物原料若为企业自己生产,其工艺必须相对稳定;若购买,其供应商要求相对固定,不能随意变更供应商,如果主要原料(包括工艺)或其供应商有变更,必须进行原料验证,并进行补充申报.主要生物原料的常规检验项目一般包括:(1)外观

肉眼观察,大部分生物原料为澄清透明的液体,不含异物,浑浊或摇不散的沉淀;或者为白色粉末,不含有其他颜色的杂质;特殊生物原料应具备相应外观标准.(2)纯度和分子量

主要通过SDS-PAGE电泳和电泳结果扫描仪进行检测,也可用其他适宜的方法,如高效液相法等.作为免疫诊断试剂用生物原材料,用银染法染色后,纯度一般都要大于90%;用考玛氏亮蓝染色后;纯度一般都要大于95%.SDS凝胶电泳法测定分子量.(3)蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法,280nm光吸收法,双缩脲方法等进行检测;(4)效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果通过倍比稀释法进行.效价应达到设计规定的要求.(5)功能性实验 功能性实验是指生物原料用于试剂盒试剂实际生产中的情况,一般考查该原料使用后的试剂灵敏度,特异性和稳定性.2,主要生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料,主要包括小牛血清,山羊血清,牛血清白蛋白和酪蛋白等.这些生物原料均应按照《中国生物制品主要原辅材料质控标准(2000年版)》所规定的质量标准要求进行检验,达到相应的质量标准后方应用于生产.生物辅料的供应商同样要求相对固定,不得随意变更供应商.对于小牛血清或山羊血清,牛血清白蛋白以及酪蛋白等,还应进行功能性实验,即以其为原料配制10%浓度的稀释液作为样品,进行酶联免疫测定,均不得出现非特异性反应.对于标记用酶,应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称(如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶等),同时应根据不同生产厂家的检定方法和质量标准进行检验,酶的纯度RZ值(OD403nm/OD280nm)应大于3.0.3,化学原辅料

参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准(2000年版)》分析纯级别进行检验.主要的检测指标包括:溶液外观,一般盐类检测,溶液pH值检测,溶解情况检测,干燥失重的检测,炽灼残渣等.主要化学原材料的供应商要求相对固定,不得随意发生变更.化学原材料在购入时,原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量质量保证材料和质量检验报告,其质量标准应达到生产所需的质量标准.(1)无机类

主要包括氯化钠,氢氧化钠,纯化水等.(2)有机类

主要包括有丙酮,乙醇,枸橼酸,吐温20,乙二胺四乙酸二钠,氨基吡啉等.(3)特殊化学原料

DAB(联苯二胺),染色剂等.4,其他物料(1)基质

以硝酸纤维素膜为例:孔径符合设计要求(0.45μm,0.22μm等),均一性(厚度及毛细迁移速度±20%),尺寸(与标识吻合)(2)瓶子和干燥剂

由生产厂家提供质量保证,达到规定要求.(3)其他:说明书,包装外盒等

应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书,标签和包装标识管理规定》执行.三,试剂盒各组分的生产

生物芯片主要包括DNA芯片,蛋白芯片,组织芯片,细胞芯片以及芯片实验室等.生物芯片诊断试剂产品基本可分成二个部分,一部分是芯片,另一部分检测用工作液.如果有配套的检测仪器,还需对仪器及处理软件的应用加以说明.(一)芯片的生产

芯片生产的基本过程包括探针的获取方法,纯化,点样,固定.1,探针获取

不同的芯片,主要是探针不同,生物芯片的探针主要包括以下几类,其它探针可参考制定相应的技术及质量标准.(1)DNA探针的获取

探针的形式有PCR产物,克隆DNA,人工合成DNA片段等;要求有生产程序和质量指标及检测方法,要进行纯化,有固定的纯化程序.(2)抗原的生产

抗原的获得方法包括细胞培养,从生物材料中分离提取,基因工程表达以及合成肽等.基因工程表达产物又分为纯抗原蛋白,融合蛋白等.(3)抗体

抗体分单克隆抗体和多克隆抗体.抗体制备包括细胞培养,动物腹水,基因工程表达等方式.(4)细胞和组织

包括细胞或组织类型,固定方法.组织材料还包括固定,包埋,切片等.(5)芯片实验室,包括各种管道泵的制作等.2,阵列的排列设计

阵列的排列包括依次排列,随机排列,对角线排列等,设计时需考虑重复次数等.3,点阵的制作

使用仪器的要确定型号,程序;手工制作的也要有标准操作程序.4,固定:包括固定方式,固定的条件等.应对芯片生产的过程进行相应的质量控制,如点样和固定过程的监控,点样均一性检验等.(二)工作液配制

1,芯片生产所需试剂,包括细胞培养基,探针制备试剂,阵列制作和固定试剂等.2,样品处理试剂,芯片检测靶分子分为核酸和蛋白质.检测核酸的样品处理试剂包括临床取样,DNA提取或RNA提取试剂,逆转录试剂,PCR扩增试剂,核酸标记试剂等;检测蛋白的处理试剂包括取样试剂,蛋白稀释液以及特殊试剂等.3,反应液:检测核酸时的反应液包括预杂交液,杂交液,洗脱液等;检测蛋白时,包括封闭液,抗原/抗体反应液,洗脱液,显色液,显色终止液等.(三)数据判读

1,判断标准及依据,包括Cut off值的确定依据.2,数据判读方式:人工还是软件判读.3,如果是软件判读,应提供软件判断的科学依据(包括生物学原理,数据获取原理和判断实验是否成立的依据)以及实验测试的原始报告(或数据),并需要说明:(1)软件的来源:购买或自己编制,是否获得注册等.(2)软件的用途:包括对数据的分析,存储,解读,含义等.(3)软件的使用:基本的使用程序.四,半成品质量控制(一)抽样

检验人员按批号抽取检定需要数量的半成品,作好标记,待检.(二)质控品

可用克隆并测序鉴定的DNA或经特异性鉴定的抗原(或抗体).质控品的基质应尽可能与被测物基质相一致.(三)检定要求 1,芯片检定

(1)灵敏度:最低检测限达到规定要求.(2)特异性:应达到规定要求.若进行全阴,全阳和交叉反应检测,全阴性检测应在没有靶分子存在时,所有检测位点没有检测信号;全阳性检测应在加入足够量的靶分子,所有检测位点均有检测信号;交叉反应检测时,用某一位点的靶分子检测,应只有该位点有检测信号,其它位点不能有检测信号.(3)精密性(均一性):用比最低检测限高一个数量级的质控品,重复检测10次,判定结果一致.考虑到芯片的多位点检测,因此要进行全位点和单个位点进行检测.半成品检定可以用克隆DNA和鉴定的抗原和抗体作质控品.2,工作液的检定

(1)物理检测:外观颜色正常,没有杂质.(2)质量检定:用被检定的工作液检测标准样,检测结果达到预定要求.五,成品质量控制(一)生产批量

申报生产的批量每批原则上不低于1000人份.(二)抽样

检验人员按批号抽取检定需要数量的半成品,做好标记,待检.(三)标准品(参考品)应用国家标准品或参考品进行检定,若无国家标准品(参考品),可以使用企业参考品,但其标准不得低于第一家已经获得批准的该类试剂.(四)检定要求

1,灵敏度:应达到规定要求.2,特异性:应达到规定要求.3,精密性(均一性):对某一样本,重复10次,对病种的定性检测结果一致.4,稳定性(仅对蛋白芯片)37℃放置至少3天,灵敏度,特异性和精密度仍达到规定要求.热加速破坏试验的时间长短,可由生产单位根据不同产品在37℃贮存与常温贮存(2℃8℃)中质量变化的相关性来决定

第二篇：体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则(生物芯片报批稿)

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则——生物芯片类试剂生产及质量控制技术指导原则（报批稿）

2009-05-15 09:00 本指导原则所定义的生物芯片诊断试剂是指将多个生物探针（包括DNA片段，寡核苷酸、抗原、抗体，组织，细胞等）按预先设计的排列方式固定在特制的基质（包括玻璃片，尼龙膜，硝酸纤维素膜等）上，用特定的方法提取生物靶分子并进行标记，然后与固定在基质上的生物探针特异性的结合，再用相应的检测设备（如激光扫描仪、CCD检测仪等）和分析方法（包括软件）进行检测、记录、分析，实现对生物靶分子的定性或定量检测的试剂。

根据芯片制作的主要原料和方法，生物芯片可分为核酸芯片、蛋白芯片、细胞芯片、组织芯片等。本指导原则是针对核酸和蛋白为检测靶分子生物芯片的生产及质量控制技术指导原则，其它类型靶分子检测的芯片诊断试剂可参考本指导原则。国家食品药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）试剂研制、生产用各种原料、辅料等应制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。

（二）试剂生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；还应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

（三）生物芯片类试剂在研制时，应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）试剂研制、生产过程中所用的物料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

二、原材料质量控制

（一）核酸检测芯片

核酸芯片检测时，从生物样本中提取的核酸可用荧光标记、金标记和酶标记；检测方法包括光谱学方法和化学显色。下面为荧光标记芯片技术指导原则，采用金标记和酶联显色等的生物芯片诊断试剂可参照核酸芯片和蛋白芯片相关部分。

1、主要生物原料

核酸检测芯片的主要生物原料包括模板DNA、dNTPs、引物、探针、标记物等。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定，企业应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，同时，供应商应提供相应的质量保证证明和相应的质检报告，达到生产规定的质量标准。如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

（1）模板DNA 重组DNA：经测序验证，关键碱基或序列没有错误。1×TE溶解，浓度为100ng/μl以上，-20℃保存。作为阳性参考品时，其稀释度由企业根据产品标准确定。（2）dNTPs（dATP/dUTP/dGTP/dCTP/dTTP）

HPLC纯，PCR级，无DNase、RNase污染，-20℃以下保存。

（3）引物

生产中的引物原材料为冻干粉，PAGE纯或HPLC纯。用标准DNA模板扩增，电泳检测，谱带单一，大小正确，与对照引物比较，产物量一致。符合视为合格引物，-20℃以下保存。

（4）探针（用于阵列制备）

重组DNA, 冻干粉（或1×TE溶解液）：至少满足一个批次的用量，酶切鉴定分析图谱。

PCR产物，冻干粉（或1×TE溶解液）：至少满足一个批次的用量，PCR电泳鉴定图谱。

合成寡核苷酸：PAGE纯或HPLC纯，至少满足一个批次的用量，提供该产品的PAGE电泳分析图谱或HPLC分析图谱。

探针序列的正确性：应用克隆鉴定的标准DNA杂交鉴定或测序鉴定。

纯度和浓度检测：采用电泳方法，电泳图谱没有杂带，目的条带的强度与已知浓度的标准DNA条带进行参比计算其强度。纯度较高的DNA，可用紫外分光光度计进行定量。检验合格后入库，避光、-20℃以下保存。

（5）标记物

含有激发光波长和发射光波长介于280?680nm的所有荧光分子，HPLC纯。

（6）Taq DNA聚合酶

SDS-PAGE 检测，纯度＞95%，具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50％活性。产品-20℃保存。

（7）尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性。1U UNG 37℃处理3分钟后，103拷贝以下含U模板被降解后不能产生扩增产物。产品-20℃保存。

（8）RT 酶

具有逆转录活性，无核酸内切酶活性，-20℃保存。

（9）RT-PCR酶

具逆转录酶活性和DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性，具热稳定性，94℃ 1小时后仍保持50%活性。产品-20℃保存。

（10）缓冲液

各类酶制品所需的反应缓冲液由厂家随酶制品提供，-20℃保存。

2、主要生物辅料

主要生物辅料包括酶类（蛋白酶、核酸酶等）、核酸提取试剂、鱼精DNA、封闭用蛋白、杂交液等，企业应建立相应的质量标准。主要生物辅料若为企业自己生产（配制），其工艺必须相对稳定，并按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，同时，供应商应提供相应的质量保证证明和相应的质检报告，达到生产规定的质量标准。

3、主要化学原辅料

化学原材料的质量标准参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：溶液外观、一般盐类检测、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质检报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

4、其他物料

（1）载玻片 外观：明亮处用肉眼观察无缺刻，无划伤等。规格按设计要求。

激光扫描仪扫描（波长为芯片检测波长）：包被层基本均匀。

（2）试管、吸头、试剂瓶等

一次性使用，由生产厂家提供质量保证，达到设计要求。

（3）其他：

包括试剂瓶标签、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量标准。

（二）蛋白检测芯片

1．主要生物原料

与生产的产品质量最密切相关的生物原料包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆杭体、多克隆抗体以及多肽类生物原科。这类原料可用于点膜、标记相关酶、纳米金、光学基团及中和反应用抗原或抗体等。使用前应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

⑴ 外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

⑵ 纯度和分子量

生物原料经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析；也可用其他适宜的方法，如高效液相法等进行分析。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳。一般每个电泳道加样量为5μg；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。

⑶ 蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲法或其它适宜方法进行检测。

⑷ 效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

⑸ 功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

2．主要生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》规定的质量标准要求，并且要适合于企业生产。

建议作以下检验：

⑴ 牛血清或羊血清

外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物

无菌试验：将血清直接37℃放置7天，放在明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，标准为不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀。沉淀溶于0.85%NaCl溶液至1ml，用Lowry法测定蛋白含量不能大于2mg/ml。⑵ 牛血清白蛋白：

外观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，溶解时间在18-26℃时应不大于15分钟。pＨ值应为6.5?7.1。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，其标准为不小于干重的95％。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为不小于总蛋白含量的95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为不小于90%。

⑶ 酪蛋白：

应符合生产所需的质量标准。

⑷ 标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行测定，均不得出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

3．化学原辅料

参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：溶液外观、一般盐类、溶液pH值、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量保证材料和质检报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

4．其他物料

⑴ 基质

以硝酸纤维素膜为例：孔径符合设计要求（0.45μm、0.22μm等）、均一性（厚度及毛细迁移速度±20％）、尺寸（与标识吻合）

⑵ 试剂瓶和干燥剂

由生产厂家提供质量保证，达到规定要求。

⑶ 其他：说明书、包装外盒等

应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准，如数量、规格等。

三、试剂盒各组分的生产

生物芯片主要包括DNA芯片、蛋白芯片、组织芯片和细胞芯片等。生物芯片诊断试剂产品基本可分成二个部分，一部分是芯片，另一部分检测用工作液。如果有配套的检测仪器，还需对仪器及处理软件的应用加以说明。

（一）芯片的生产

芯片生产的基本过程包括探针的获取方法，纯化，点样，固定。

1．探针获取

不同芯片，主要是探针不同，生物芯片的探针主要包括以下几类，其它探针可参考制定相应的技术及质量标准。

（1）DNA探针的获取

探针的形式包括PCR产物、克隆DNA、人工合成DNA片段等；要求有生产程序和质量指标及检测方法，要进行纯化，有固定的纯化程序。（2）抗原的生产

抗原获得方法包括细胞培养、从生物材料中分离提取、基因工程表达以及合成肽等。基因工程表达产物又分为纯抗原蛋白、融合蛋白等。

（3）抗体

抗体分单克隆抗体和多克隆抗体。抗体制备包括细胞培养，动物腹水，基因工程表达等方式。

（4）细胞和组织

包括细胞或组织类型，固定方法。组织材料包括固定，包埋，切片等。

2．阵列的排列设计

阵列的排列可以是依次排列、随机排列、对角线排列以及其它排列方式，但设计时需考虑重复次数和对照等因素。

3．点阵的制作

使用仪器的需要确定型号，程序；手工制作的也应有标准操作程序。

4．固定：包括固定方式，固定条件等。

应对芯片生产的过程进行相应的质量控制，如点样和固定过程的监控、点样均一性检验等。

（二）工作液配制

1．芯片生产所需试剂，包括细胞培养基，探针制备试剂，阵列制作和固定试剂等。

2．样品处理试剂，芯片检测靶分子分为核酸和蛋白质。检测核酸的样品处理试剂包括临床取样，DNA提取或RNA提取试剂，逆转录试剂，PCR扩增试剂，核酸标记试剂等；检测蛋白的处理试剂包括取样试剂，蛋白稀释液以及特殊试剂等。

3．反应液：检测核酸时的反应液包括预杂交液，杂交液，洗脱液等；检测蛋白时，包括封闭液，抗原/抗体反应液，洗脱液，显色液，显色终止液等。

（三）数据判读

1．判断标准及依据，包括Cut off值的确定依据。

2．数据判读方式：人工还是软件判读。

3．如果是软件判读，应提供软件判断的科学依据（包括生物学原理、数据获取原理和判断实验是否成立的依据）以及实验测试的原始报告（或数据），并需要说明：

⑴ 软件的来源：购买或自己编制，是否获得注册等。

⑵ 软件的用途：包括对数据的分析、存储、解读、含义等。

⑶ 软件的使用：基本的使用程序。

四、半成品质量控制

（一）抽样

检验人员按批号抽取检验需要数量的半成品，作好标记，待检。

（二）半成品检验

利用上一批检验合格的试剂盒的相应组分，对本批生产出的各种试剂盒组分分别进行检验，检验结果达到产品的质量标准。

半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品进行。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

检测所抽样的半成品试剂盒的性能，包括阴/阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应质量标准的要求。精密性用比最低检测限高一个数量级的质控品，重复检测10次，判定结果一致。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和校准品检测结果的准确性。

企业应该对每一批试剂的半成品进行稳定性测试。稳定性试验可在在特定温度或特定条件下完成。对蛋白芯片，应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

五、成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批生物芯片类诊断试剂报批批量不少于2000人份。

（1）成品检验

一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的企业参考品进行。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

（2）稳定性试验

试剂批放行前，应完成稳定性试验。稳定性试验可在特定温度或特定条件下完成。对蛋白芯片，每批试剂批放行前，应完成37℃热稳定性试验，达到相应的质量标准。

第三篇：体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则

附件1：

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则 ——酶联免疫诊断试剂生产及质量控制技术指导原则

（征求意见稿）

酶联免疫诊断试剂是指在酶标板上包被相关的抗原（或抗体）后，利用直接或间接的方法与待测样品中的相关抗体（或抗原）反应，形成的抗原抗体复合物再与相应的酶标记的抗体或抗原进一步反应，经过酶催化底物发生显色反应，由形成的颜色的强弱来判断样本中相应的抗体或抗原的存在。

为了规范酶联免疫诊断试剂的生产和质量控制，制定本技术指导原则。

本指导原则适用于应用酶联免疫法的第三类诊断试剂（病原微生物）的生产和质量控制，其他类酶联免疫诊断试剂参考本指导原则。国家药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）酶联免疫诊断试剂生产用的各种原料、辅料应当制定其相应的质量指标，并应符合有关法规的要求。

（二）酶联免疫诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；生产企业还应该通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

（三）酶联免疫诊断试剂在研制时，应当遵循科学、规范的原则，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）酶联免疫诊断试剂生产过程中所用的各种材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）生产和质量控制的总体目标：保证试剂使用安全、质量稳定、工艺可控、检测有效。

二、原材料质量控制

（一）主要生物原料

与诊断试剂的质量最密切相关的生物原料主要包括各种生物活性抗原、重组抗原、单克隆杭体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。一般应按照工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，必须进行原料验证，并进行补充申报。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

1、外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清透明的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀；或者为白色粉末，不含有其他颜色的杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

2、纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜丙烯酸胺凝胶浓度进行电泳。一般情况下，每个电泳道加样量为5μg，同时用已知分子量标准作参照，采用合适的电泳电流和电泳时间；电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量。作为诊断试剂用生物原材料，用银染法染色后，纯度一般都要大于90％；用考马斯亮蓝染色后，纯度一般都要大于95％。

3、蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测；

4、效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

5、功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

（二）生物辅料

生物辅料指的是在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。这些生物原料均应按照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》所规定的质量标准要求进行检验，达到相应的质量标准后方应用于生产。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制10％浓度的稀释液作为样品，进行酶联免疫测定，均不得出现非特异性反应。

对于标记用酶，应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检定方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

（三）化学原材料

参照《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别进行检验。主要的检测指标包括：溶液外观、一般盐类检测、溶液pH值检测、溶解情况检测、干燥失重的检测、炽灼残渣等。

主要化学原材料的供应商要求相对固定，不得随意发生变更。化学原材料在购入时，原材料的生产商必须提供该批次化学原材料的质量质量保证材料和质量检验报告，其质量标准应达到生产所需的质量标准。

（四）其他物料

1、酶标板（1）外观

明亮处用肉眼观察板条的外观质量。如有欠注、飞边、肮脏、表面光洁度差，底部有波纹及划伤等应剔除。

（2）吸附能力和精密性

用一定浓度的正常人IgG包被板条，再用一定浓度的抗人IgG酶结合物吸附，通过显色反应，双波长酶标仪（主波长450nm，参考波长630nm）读数。计算CV值，批内CV≤5％，批间CV≤10％。

2、液体试剂装量瓶

包括阴阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等液体组分，均应有相应的装量瓶，并建立相应的质量控制标准，如不同的液体试剂所用的装量瓶规格、装量瓶的颜色、瓶盖的颜色等。

3、其他材料

包括试剂瓶标签、粘胶纸、铝箔袋、衬垫、可密封塑料袋、说明书、干燥剂和包装外盒等，均应符合相应质量控制标准，如数量、规格等。

（五）企业质控品 企业质控品包括阴阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、灵敏度、精密性（均一性）等质控样品，对于定量检测试剂，还包括线性质控品样品。如该产品具有国家标准品或参考品，应使用国家标准品（参考品）进行标化；若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则企业参考品的质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批复的第一家试剂的质量标准。

企业质控品的基质应与诊断试剂的待测样品的基质基本一致，如待测样品为血清/血浆，质控品基质也应为血清/血浆。

三、试剂盒各组分的生产

酶联免疫诊断试剂盒主要组分的生产包括酶标记物的制备及滴配过程（酶工作液浓度确定）、各种工作溶液的配制、包被酶标反应板、分装及包装等步骤；并通过产品的半成品检定和成品检定两个质控过程来完成。

（一）各种工作液的配制

酶联免疫诊断试剂研制生产过程中所用的工作液一般包括：包被液、封闭液、阴性阳性对照、样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液、终止液等，对定量检测试剂，还包括标准品（或校准品）溶液。若阴性阳性对照或其他液体组分涉及生物安全性问题，制备时应在相应的生物安全实验室完成。

各种工作液在配制过程中应严格按质量标准中的配方进行配制，充分混匀确保液体中的各种成分均匀，同时进行相应的质量检验并达到质量标准后，方可使用或者分装。对于定量检测试剂，其标准品（或校准品）溶液应该在量值上具有溯源性。

应对配制过程及配制的液体进行的质量控制，主要包括酶结合物的功能性实验及稳定性；各种溶液的外观、pH值及电导率的测定等；酶作用的底物应测定在无相应酶的情况下自身显色的情况，并制定合理的限定指标；终止液应对其终止酶促反应的能力进行测定。

（二）包被酶标反应板

包被前应对酶标反应板进行质量检验，如尺寸、外观、包装、吸附性能、精密性等，并记录酶标反应板的批号、数目、标识。酶标反应板经检验合格后方能用于包被。不同批号的板条不能混用。

选择经检定合格的包被原料（如抗原、抗体等），经一定的方法确定最佳包被浓度和酶结合物工作浓度，按照诊断试剂的生产规程，配制包被缓冲液、封闭液，经检验合格后，包被酶标反应板，经干燥后，已包被的酶标反应板用铝箔纸封闭（内置干燥剂），抽真空后，保存于28℃。

应对包被过程进行相应的质量控制，如包被用原料（抗原或者抗体等生物活性原料）的质量检验、包被液和封闭液的质控（如配方、外观、pH）、包被过程的监控（包括包被和封闭的体积、温度、湿度、时间等）、包被均一性检验、干燥过程的监控等。

（三）分装和包装 样品稀释液、洗涤液、酶结合物或酶稀释液、底物或底物缓冲液等溶液应严格按照质量标准中的量进行无菌处理后再分装，分装量的误差应小于<5%。

分装及包装均应按照相应的SOP的要求进行。包装前，应严格检查试剂盒的品名、批号等，核对各试剂盒各组分的数量，并在关盒前进行复核。

四、质量控制

（一）半成品质量控制

1、半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。

2、半成品检验

利用上一批检定合格的试剂盒的相应组分，对本批生产出的各种试剂盒组分分别进行检验，检验结果达到产品的质量标准。

半成品检验，一般使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化后的质控品。若某类试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，但该企业参考品的质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批复的第一家试剂的质量标准。

检测所抽样的半成品的试剂盒性能，包括阴阳性参考品的符合率、灵敏度（最低检出量）、精密性等，均应达到相应质量标准的要求，对精密性，一般情况下CV不得高于15％（采用竞争抑制法的诊断试剂CV不得高于20％）。对定量检测试剂，同时应分析其线性相关系数和校准品检测结果的准确性。

企业应该具有对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。

（二）成品质量控制

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检定用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批酶联免疫诊断试剂报批批量最低要求：达到1万人份/批。

1、检验（1）成品检验

一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到质控品的质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，但其质量标准不能低于国家药品监督管理部门已经批复的第一家试剂的质量标准。

（2）稳定性试验

在批放行前，每一批酶联免疫诊断试剂需具备稳定性研究资料。

第四篇：体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则(化学发光报批稿)

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则——发光免疫分析试剂生产及质量控制技术指导原则（报批稿）

2009-05-15 09:00 发光免疫分析试剂是指利用特异的抗原抗体反应等生物学原理，利用发光信号的强弱来判断样本中相应抗原或抗体是否存在来进行检测的一类试剂。主要包括化学发光（酶促、非酶促），电化学发光和时间分辨荧光等法。

该指导原则主要适用于利用发光分析技术对蛋白质等被测物质进行检测的第三类试剂生产及质量控制，第二类试剂的生产及质量控制可参考该指导原则执行，国家食品药品监督管理部门将依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本原则

（一）研制、生产用的各种原料、辅料应当制定相应的质量标准，并符合有关法规的要求。

（二）诊断试剂的生产企业应具备相应的专业技术人员、仪器设备以及适宜的生产环境，获得《医疗器械生产许可证》；同时，生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求建立相应的质量管理体系，形成文件和记录，加以实施并保持有效运行；生产企业还应该通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。企业应对试剂的使用范围做出明确规定，并经国家药品监督管理部门批准。

（三）诊断试剂的研制应当按照科学、规范的原则组织研发，各反应条件的选择和确定应符合基本的科学原理。

（四）研制生产过程中所用的材料及工艺，应充分考虑可能涉及的安全性方面的事宜。

（五）试剂生产和质量控制的总体目标：保证产品使用安全，质量稳定，工艺可控，使用有效。

二、原材料质量控制

（一）主要生物原料

与产品质量最密切相关的生物原料主要包括各种天然抗原、重组抗原、单克隆抗体、多克隆抗体以及多肽类、激素类等生物原科。这类原料可用于包被酶标反应板、标记相关酶（辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等）、中和反应用抗原或抗体、制备校准品（标准品）等。一般按工艺要求对这类生物原料进行质量检验，以保证其达到规定的质量标准。主要生物原料若为企业自己生产，其工艺必须相对稳定；若购买，其供应商要求相对固定，不能随意变更供应商，如果主要原料（包括工艺）或其供应商有变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

主要生物原料的常规检验项目一般包括：

1．外观

肉眼观察，大部分生物原料为澄清均一的液体，不含异物、浑浊或摇不散的沉淀或颗粒；或者为白色粉末，不含其他颜色杂质；特殊生物原料应具备相应外观标准。

2．纯度和分子量

主要经SDS-PAGE 电泳后，利用电泳扫描仪进行分析，也可用其他适宜的方法，如高效液相法等。根据所检测生物原料的分子量选择适宜聚丙烯酰胺凝胶浓度进行电泳。一般每个电泳道加样量为5μg，电泳后的凝胶可用考马斯亮蓝染色或银染法染色。染色后的凝胶用电泳扫描仪分析原料的纯度和分子量，纯度应达到相应的质量标准，分子量大小应在正确的条带位置。

3．蛋白浓度

蛋白浓度可通过Lowry法、280nm 光吸收法、双缩脲方法等进行检测。

4．效价

效价的测定一般根据蛋白含量测定结果，通过倍比稀释法进行。效价应达到规定的要求。

5．功能性实验

功能性实验是指生物原料用于试剂盒实际生产中的情况，一般考查使用该原料的试剂盒的灵敏度、特异性和稳定性等，并比较其与上批次原料的相关性。

（二）生物辅料

生物辅料一般指在生产过程中作为蛋白保护剂用途的一类生物原料、主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白等。这些生物原料的质量标准应符合2000年版的《中国生物制品主要原辅材料质控标准》规定的标准要求，并且要适合于本企业的生产。

建议作以下检验：

1.牛血清或羊血清

外观：为浅黄色澄清稍粘稠的液体，无溶血或异物

无菌试验：将血清直接37℃度放置7天，放在明亮处观察，不得出现混浊或沉淀。

总蛋白含量：用双缩脲法测定，蛋白含量不小于32mg/ml。

球蛋白含量：取待测血清1ml，采用饱和硫酸铵法进行沉淀，沉淀溶于0.85%NaCl溶液，至1ml，用Lowry方法测定，蛋白含量应≤2mg/ml。

2.牛血清白蛋白：

外观：应为浅黄色、黄色或乳白色的冻干粉末，无吸潮，无结块，无肉眼可见的其它杂质颗粒。

溶解性：将牛血清白蛋白配成10%溶液，在18-26℃时，溶解时间应不大于15分钟。1%牛血清白蛋白水溶液的pH值应为6.5?7.1。

总蛋白含量：用双缩脲方测定，质量标准为≥95％。

总蛋白中的BSA含量：采用硝酸纤维素膜电泳法，其标准为≥95%。

BSA的净含量：总蛋白含量乘总蛋白中的BSA含量，其标准为≥90%。

3.酪蛋白：

酸度应符合生产所需的质量标准。

4．标记用酶

应在产品的质量标准中明示所使用的标记用酶的名称（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等），同时应根据不同生产厂家的检验方法和质量标准进行检验，酶的纯度RZ值（OD403nm/OD280nm）应大于3.0。

对于小牛血清或山羊血清、牛血清白蛋白以及酪蛋白等，还应进行功能性实验，即以其为原料配制一定浓度的稀释液作为样品，进行测定，均不得出现非特异性反应。

生物辅料的供应商同样要求相对固定，不得随意变更供应商。

（三）化学原材料

化学原材料的质量标准，包括外观、一般盐类检测、溶液pH值、重金属检测、溶解情况、干燥失重、炽灼残渣等，均应符合《中国生物制品主要原辅材料质控标准（2000年版）》分析纯级别的要求，并且要适合于本企业的生产。

1．无机类：主要包括有氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氯钠等。

2．有机类：主要包括有吐温20、三羟基氨基甲烷等。

3.特殊化学原料：Eu-DTTA，鲁米诺等。

Eu-DTTA纯度分析与鉴定：要求Eu-DTTA各功能团符合分子结构，纯度在96%以上。

（四）其他原辅料

1．微孔板条

外观：明亮处用肉眼观察板条的外观质量应无划痕、破损、飞边、肮脏、表面光滑。板条与微孔反应条塑料框架应配合合适。

材质：微孔反应板条每孔加200?L增强液，用发光免疫分析仪检测其荧光值，平均本底荧光值≤1500。

吸附能力和精密性：用一定浓度的蛋白包被微孔板条，检测荧光值，CV值结果应符合相关产品的功能性质量标准，一般批内CV≤5％,批间CV≤10％。

2．其他

粘胶纸、铝箔袋、说明书、包装外盒、瓶子和干燥剂等应参照国家食品药品监督管理局颁布的《体外诊断试剂说明书编写指导原则》和《医疗器械说明书、标签和包装标识管理规定》建立相应质量控制标准。

三、试剂盒各组分的生产

发光免疫分析试剂主要组分的生产包括包被反应板、标记物制备、各种溶液的配置、冻干、分包装等步骤；并通过产品的半成品检验和成品检验两个质控过程来保证其质量符合规定。

(一)固相载体的制备（因不同产品使用的包被载体有很大区别，在此以标准96孔微孔反应板为例进行描述）

1．包被板的准备

准备经检验合格的包被板，记录批号、数目、状态标识。

质控项目：尺寸，外观，包装。

2．包被液的配制

配制包被缓冲液，加入包被的抗体或抗原至工作浓度，混合均匀，即成所需的包被液，工作浓度的包被液应在规定时间内使用。

质控项目：包被缓冲液配方，pH值，包被物成份。

3．包被板的包被

包被液按工艺要求加入包被板。记录所包被的包被板数量。

质控项目：包被体积，温度，时间，过程监控。

4．洗板工作液的配制（按各单位工艺要求，可以不洗板）

按配方配制洗板工作液。

质控项目：洗板工作液配方，pH值。

5．封闭液的配制

按配方配制封闭液。

质控项目：封闭液配方，pH值。

6．洗板和封闭

包被完成后，抽去孔内包被液，用洗板工作液洗板后（按各单位工艺要求，可以不洗板），加入封闭液。

质控项目：封闭体积，温度，时间，过程监控。

质检项目：封闭前检验包被均一性。

7．抽干

封闭后的反应板，抽干孔内液体。

质控项目：过程监控。

8．干燥

反应板应按工艺的要求进行干燥。质控项目：温度，湿度，时间，过程监控等。

9．密封包装

将干燥后的反应板用铝箔袋密封包装，内放干燥剂（按各单位工艺要求，可以不放）。

质控项目：密封性能，标示及效期等。

10．反应板（半成品）检验

对装袋密封后的反应板进行抽样检验，外观、板内变异、板间变异。

(二)滴配过程

1．酶结合物的制备（根据各产品实际情况，该步骤可不进行）

采用常规过碘酸钠——乙二醇法将相关的抗体（或抗原）标记辣根过氧化物酶（或其他酶），酶标记后的抗体（或抗原）应加入适当的保护剂保存于低温。

质控项目：标记方法，过程控制。

2．酶结合物的鉴定

(1)功能性实验

将酶结合物用酶稀释液稀释后，用于产品的滴配，其结果应符合相关试剂盒的质量标准。

(2)稳定性

将酶结合物用酶稀释液稀释，进行2-8℃，及热稳定性实验，滴配结果应符合相关试剂盒的质量标准。

3．酶结合物稀释液

按酶结合物稀释液的配方配制，存放在2-8℃保存，并于规定时间内使用。

质控项目：酶结合物稀释液配方，pH值。

4．酶结合物工作浓度的滴配

取酶结合物，用酶结合物稀释液稀释到不同的浓度，用已制备好的反应板进行滴配。测定系列标准品及相应的质控品，确定使体系达到最优的酶结合物工作浓度。

5．酶结合物工作液配制

将所需量酶结合物和酶结合物稀释液按滴配浓度混合均匀。

质检项目：分装前检验，用配套的反应板进行检验，外观、灵敏度、质控品测定值、定量产品应作校准品线性检测。

6．酶结合物工作液的分装

按工艺要求分装酶结合物工作液。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

7．酶结合物工作液（半成品）检验

对分装后的酶结合物工作液进行抽样检验，外观、分装量、灵敏度、校准品剂量-反应曲线线性、质控品测定值。

(三)校准品、阴/阳性对照或质控品的制备

1．稀释液

按稀释液的配方配制，存放在2?8℃或-20℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：稀释液配方，pH值。

2．校准品、阴/阳性对照或质控品的配制

校准品、阴/阳性对照或质控品的配制应具有量值溯源性，可参照国家标准品、WHO标准品或其他级别的标准物质进行配制。

质检项目：分装前检验，准确性、剂量－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

3．校准品、阴/阳性对照或质控品的分装

按工艺要求分装校准品、阴/阳性对照或质控品。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量。4．校准品、阴/阳性对照或质控品（半成品）检验

对分装后的校准品、阴/阳性对照或质控品进行抽样检验，外观、分装量、准确性、剂量－反应曲线线性（定量产品）、质控品测定值。

(四)化学发光底物的制备

1．底物缓冲液

按底物缓冲液的配方配制，存放在2-8℃保存，并于有效期内使用。

质控项目：底物缓冲液配方，pH值。

2．化学发光底物（氧化剂和发光剂）的配制

分别按氧化剂和发光剂的配方在底物缓冲液中加入相应的氧化剂和发光剂

质控项目：氧化剂和发光剂配方。

质检项目：分装前检验，本底、发光强度。

3．化学发光底物（氧化剂和发光剂）的分装

按工艺要求分装化学发光底物（氧化剂和发光剂）。

质控项目：分装前确认试剂名称、批号、数量，分装量，封装后密封性。

4．化学发光底物（半成品）检验

对分装后的化学发光底物进行抽样检验，外观、分装量、本底、灵敏度、发光强度。

（五）铕标记物的制备

针对不同的标记生物原料，确定不同的标记制备工艺，包括铕-DTTA与标记生物原料的比例，标记温度和标记时间、标记得率的计算标准等。在实际操作过程中要求严格按照SOP进行操作

（六）冻干

各种冻干品都需建立各自的冻干工艺，冻干品外观应该呈现疏松的粉末状固体，具有一定的形状，复溶完全、迅速，呈澄清透明液体。

（七）分装、灯检和贴签

分装量用减重称量法进行测量，把质量换算成体积后进行分装量的控制。灯检是目测检查各组分的色泽、分装量以及是否混浊、有杂质等。

（八）包装

根据试剂盒包装SOP要求及说明书的要求，以流水线操作形式进行包装。包装时应严格检查品名、批号、装量，认真核对各物料数量，并在关盒前进行复核。

四、质量控制

（一）半成品质量控制

1．半成品抽样

检验人员按试剂的批号，根据抽样申请单抽取规定数量的半成品各组分，作号标记、待检。

2．质控品的要求

用于半成品质量控制的质控品包括阴/阳性样品符合率，灵敏度（最低检出量），特异性，检测范围，定量曲线的线性，精密性，稳定性等指标，如具有国家标准品或参考品的产品应使用国家标准品（参考品）或经国家标准品（参考品）标化的企业参考品进行检验。如无国家标准品（参考品），可采用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

3．半成品检验

根据各个试剂盒的企业标准或者制检规程进行半成品的检验，检验指标一般包括准确性、灵敏度、特异性、精密性、相关性等，均应达到相应的质量标准。企业应对每一批试剂的半成品进行稳定性研究。试剂盒各组分应留样，2?8℃定期作稳定性考核，同时作37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

（二）成品质量控制

1．成品抽样

产品包装完成后，质检人员根据试剂的批号、实际包装量、抽样申请单的要求进行抽样，同时填写抽样数量和抽样日期，并且由抽样人签名。抽样数量应包括检验用数量和留样数量。质检人员同时应检查相关原始记录。

每一批试剂的报批批量应至少为10000人份。

2．成品检验

一般使用国家标准品（参考品）对成品进行检验，并达到国家标准品（参考品）的质量要求。若该诊断试剂没有国家标准品（参考品），则使用企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

在批放行前，每一批发光类诊断试剂应完成37℃热稳定性试验，试验结果应符合产品的质量标准。

第五篇：体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则-核酸扩增

体外诊断试剂生产及质量控制技术指导原则——核酸扩增法试剂生产及质量控制技术指导原则（报批稿）

2009-05-15 09:00

核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而检测特定核酸序列或筛查特定基因的检测技术，如聚合酶链反应（PCR）、连接酶链反应（LCR）、转录依赖的扩增反应（TMA）等。核酸扩增法检测试剂是基于核酸扩增检测技术的体外诊断试剂，目前已经用于病原体检测、特定疾病的早期诊断和体内物质的型别鉴定等不同领域。

本指导原则仅适用于核酸扩增法检测试剂的生产及质量控制，其他类核酸检测试剂可参照相关内容。国家药品监督管理部门依据科学技术发展的需要，适时组织修订。

一、基本要求

（一）核酸扩增类检测试剂的生产企业应获得《医疗器械生产许可证》。研制、生产用的各种原料、辅料等应制定其相应的质量标准，并应符合有关法规的要求。

（二）试剂生产企业应具有与其技术要求相适应的人员、厂房、设施和仪器设备以及适宜的生产环境，配备满足核酸提取和扩增检测以及操作人员防护所需的设备。建立专用实验室，实验室应当严格分区，人员和物品应当单向流动，以最大限度地防止实验过程中样品之间的污染和避免扩增产物的污染。生产用于病原微生物核酸检测的生产企业应建立符合生物安全要求的设施和措施。

（三）试剂生产企业应按照《体外诊断试剂生产实施细则（试行）》的要求，建立相应的质量管理体系，并应通过《体外诊断试剂生产企业质量管理体系考核评定标准（试行）》的考核。

（四）核酸扩增类检测试剂的引物设计应当符合核酸检测设计的要求，扩增体系应设定合理的内标和外标，试剂需设置抗污染的特定措施，扩增产物须进行确证研究。

（五）企业使用新型原材料时，应提供与通行原材料比对研究结果及相关资料。使用未列入上述标准的化学试剂，应不低于分析纯。

二、原材料

应提供主要原材料如引物、探针、企业参考品或标准品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量标准等的相关研究资料。若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；如主要原材料来自市场（从其他单位购买），应提供的资料包括：对物料供应商审核的相关资料、购买合同、供货方提供的质量标准、出厂检定报告，以及该原材料到货后的质量检验资料。主要原材料（包括生产工艺）或其供应商发生变更，应依据国家相关法规的要求进行变更申请。

核酸类检测试剂的包装材料和耗材应无DNase和RNase污染。

（一）脱氧三磷酸核苷（dNTP）

核酸的组成成分，包括：dATP、dUTP、dGTP、dCTP和dTTP。应为HPLC纯、PCR级，无DNase和RNase污染。—20℃保存。

（二）引物

由一定数量的dNTP构成的特定序列，通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化。

冻干粉，序列正确，合成量应达到试剂生产要求。纯度应达到电泳级（PAGE）或HPLC级，不含杂带。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱。

应作HPLC分析和紫外光吸收分析。以紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm的比值在1.6—2.0之间，可视为合格引物。—20℃保存。

（三）探针

是指特定的带有示踪物（标记物）的已知核酸片段（寡聚核苷酸片段），能与互补核酸序列退火杂交，用于特定核酸序列的探测。通常采用DNA合成仪人工合成，合成后经聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他适宜方法纯化，在5'+'-端(和/或3'+'-端)进行标记，如荧光素报告基团或其他发光标记物，在3'+'-端标记荧光素淬灭基团，并经HPLC或其他适宜方法纯化。

冻干粉，纯度应达到HPLC纯。应提供合成机构出具的合成产物的质检证明，如HPLC分析图谱；应对探针的核酸序列及标记的荧光素或化学发光物进行核实，并作HPLC分析。应以可见—紫外分光光度计进行200—800nm扫描，在260nm处应有吸收峰。另外，根据标记荧光素的不同，还应该在荧光素的激发波长处有吸收峰，如FAM荧光素在494nm、TET荧光素在521nm、TAMRA荧光素在560nm处有特异的吸收峰，杂交探针在493nm、625nm、685nm处有特异的吸收峰，检定合格后入库。避光、—20℃保存。

（四）DNA聚合酶

如Taq DNA聚合酶。应具有DNA聚合酶活性，无核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50%活性。—20℃保存。

（五）尿嘧啶糖基化酶（UNG）

具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，IU UNG在 37℃处理3分钟后，103拷贝以下含U模版应完全降解，不能产生扩增产物。—20℃保存。

（六）逆转录酶

具逆转录酶活性，无核酸内切酶活性。—20℃保存。

三、生产工艺

核酸扩增类检测试剂的基本生产工艺通常包括：配制工作液、半成品检定、分装和包装。配制工作液的各种原材料及其配比应符合要求，原材料应混合均匀，配制过程应对pH、电导率等关键参数进行有效控制。

工艺研究的资料应能对反应体系涉及到的基本内容，如样本类型、样本用量、试剂用量、反应条件、校准方法、质控方法、临界值的确定、稳定性和有效期，提供确切的依据。

四、质量控制

（一）半成品质量控制

1．按批号抽取规定数量的半成品。

2．以参考品 / 对照品进行半成品质量控制。如果产品具有国家标准品或参考品，应以其进行检定。如果产品不具有国家标准品或参考品，应根据规定制备相应的企业参考品，企业参考品的制备应有规范的质量控制程序，以保证产品的安全性、有效性及质量可控，其质量应不低于国家食品药品监督管理局已经批准的同类产品的质量。

3．半成品检定内容包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度。检测结果应符合质量标准的要求。

4．半成品检定合格后，按试剂盒组成及时进行分装和包装。

（二）成品质量控制

1．每一批核酸扩增类检测试剂报批批量应不低于3000人份。

2．产品完成包装后，应根据生产量进行抽样和生产记录审核。

3．以参考品 / 对照品或参考品，进行成品质量检验。结果应符合要求。

4。成品检验的内容应包括：阴/阳性参考品符合率、灵敏度、特异性、精密度、线性和稳定性。

5．试剂批放行前，应对需要进行稳定性考核的试剂成分，在特定温度或条件下进行稳定性试验。稳定性试验可采用加速破坏试验。