第一篇：内蒙古大学基因工程大实验思考题
本科生基因工程实验
(记录及课后思考题)
姓名: 学号: 专业:
完成日期:2012年9月9日
指导老师:
一、质粒DNA的小量制备
1.影响最终质粒产量的主要因素有哪些？ ① 与菌的生长状况有关
② 和提取时的温度有关，需要低温 ③ 加溶液Ⅱ、Ⅲ时操作要温和
④ 要用酚和氯仿的混合液多次抽提去除蛋白质 ⑤ 要用冰乙醇沉淀
2.提取到的质粒纯度将直接影响到以后的酶切效果，如何操作才能尽可能的避 免蛋白质的污染？
加入酚：氯仿：异戊醇去除蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离。
二、质粒DNA电泳鉴定
1.泳道的质粒DNA有几条带？为什么？
质粒可能会有超螺旋构型，环状构型和线性构型。这三种构型中，迁移率最快的应该是超螺旋的，其次是线性和环状。通常观察到的是超螺旋和环状质粒。2.溴酚蓝的迁移率相当于多少bp的DNA？
在0.7%、1%、1.4%、2%的琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝的迁移率分别与1000bp、600bp、200bp、150bp的双链线性DNA片段大致相同 3.影响本实验结果的因素有哪些？
DNA的长度，结构，胶的浓度，电压等会对实验结果造成影响。
三、质粒DNA的酶切
1.酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响？为什么？
有影响
加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。2.如何估计DNA用量和酶的用量？
DNA样品的浓度（μg / μl）:OD260×稀释倍数×50/1000 1U酶切割1ug的质粒，酶的量不要超过酶切体系的1/10。3.在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费？
将枪头不要插入液体很深部位，刚过液面且可以吸取所需的体积的液体。
四、PCR扩增制备目的基因
1.复性温度是根据什么确定的？
可以根据公式：2（A + T）+ 4（C + G），再减5-10度,一般为55℃-60℃ 当50％的引物和互补序列表现为双链DNA分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的Tm低5℃。
双链DNA中的G+C的比率越高，则双链DNA分离变性的温度也就越高。变性所需的时间与DNA分子的长度 相关，DNA分子越长，在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长。若变性温度太低或变性时间太短，则只能使DNA模板中富含 AT 的区域产生变性，当PCR循环中的反应温度降低时，部分变性的 DNA 模板又重新结合成双链 DNA，从而导致PCR的失败。非特异性条带数增多。
2.引物序列是根据什么设计的？为什么要加上酶切位点序列？ 根据cDNA设计引物，为了更好地与载体连接。3.为什么要在最后延伸10min？
一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物。
4.实验中是否有非特异性扩增产物或引物二聚体带？如何才能消除？
有
①.重新设计引物
②加大模板用量或减少引物用量 ③扩大反应体系
④提高退火温度或Mg离子浓度
五、从琼脂糖凝胶中回收DNA片段
1.为何避免用EB染色及用紫外灯照射欲回收的目的DNA？
紫外照射对DNA有损伤，为了保证DNA的完整性，尽量不用EB染色或紫外照射。
六、目的基因片段与载体连接
1．连接酶的最适活性温度是多少？
37℃
2．为什么要采用14℃下连接？
由于热稳定性较差，因此长时间反应时通常需在14°C下进行 3．如何确定插入片段的用量与质粒载体的用量？
一般参考T4连接酶的说明书，大多数人做的是插入片段：载体=3：1至5：1，是分子数的比值。可以先测出两者的质量浓度（分光光度计或者跑电泳），然后根据分子量大小可以算出。
七、感受态大肠杆菌的制备
1.制作感受态菌的过程中，应注意哪些关键步骤？
①操作是防止污染，这个最容易影响感受态制作的因素。②悬浮沉淀的过程，一定要轻轻悬浮，最好轻摇悬浮。2.CaCl2溶液的作用是什么？为什么要冰冷的？
作用：悬浮菌体
在0～4℃，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球状，转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物黏附于细胞表面，较低的温度也降低了相关酶的活性较好的保存了DNA，冰浴过程中，原来加在溶液中的钙离子和细菌细胞膜结合，在低温下形成液晶结构，这样，在42度热激下，这种液晶结构收缩，将细胞膜扯开孔道，使DNA进入细菌细胞中。
八、感受态细菌的转化
1.影响转化效率的因素有哪些？ ①细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细 胞（一般通过检测 OD600 来控制。DH5α菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是 5×107/ml）；
②所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
③经 CaCl2 处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）； ④化合物及无机离子的影响：Ca2+的基础上联合其他二价金属离子 在（如 Mn2+或 Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；
⑤所使用的器皿必须干净。迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
⑥质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA;⑦一定范围内，转化效率与外源 DNA 的浓度呈正比； 2.白色菌落出现的原理是什么？
由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。
九、转化克隆的筛选与鉴定
1.PCR法筛选的优点和缺点是什么？
酶切法与PCR法PCR可以直接以菌落做模板，比较方便，但有时候有假阳性；酶切鉴定需要提取质粒才能酶切，比较费时，且插入片段里不能有所选酶的酶切位点，在片段序列未知时不宜判定，但在序列已知时相对可靠筛选方案哪个更可靠？
2.酶切法与PCR法筛选方案哪个更靠谱一些？
酶切法，但是比较费时间 3.最终确认克隆的方法有哪些？
①直接筛选：有些载体带有可辨认的遗传标记，能有效地将重组分子与本底区分。
②间接筛选：有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因，当外源DNA插入到抗药基因区后，基因失活，抗性消失。如一质粒有A和B两个抗药性基因，当外源基因插入到B基因区后，便只抗A药而不抗B药。因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。
③核酸杂交：广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上，变性后固定在原位，然后与标记的核酸探针进行杂交。阳性点的位置就是所需要的克隆。
④免疫学方法：如果重组克隆能在宿主菌中表达，就可以用特异的蛋白质抗体为探针，进行原位杂交，选择特异的克隆。
十、外源基因的诱导表达
1.IPTG的作用原理是什么？
E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激 活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表 达 2.为什么要增加抗菌素的用量？
携带载体的菌体在正常情况下，由于自身保护作用，会丢失载体，含有载体的菌体由于代谢负担过重，比生长速率小于空载菌体！含有载体的菌体在表达外源基因的同时，也能表达AMP分解酶类。此类酶可以分解青霉素，降低危害。不含质粒的菌体则无此功能。当菌体接种量很小的时候，不带质粒的菌体生长迅速，很快成为优势菌株，当加入足够量AMP时，就具有选择压力，抑制不带质粒的菌体生长，使得含质粒菌体在种群中占有优势。
十一、SDS-PAGE检测表达蛋白
1，影响表达的因素都有哪些？（1）外源基因的拷贝数（2）外源基因的表达效率
①启动子的强弱
②核糖体接合位点的有效性
③SD序列和起始密码ATG的间距
④密码子组成
（3）表达产物的稳定性（4）细胞代谢负荷（5）工程菌的培养条件
2，如何确定凝胶上的某条蛋白质带就是所要表达的外源基因产物？
电泳检测时，加个空白的大肠杆菌蛋白做对照，根据已知的目的蛋白的大小，再加个蛋白，进行对比，一般来说诱导出来的蛋白浓度明显会高于其他蛋白的.3，pET-his载体为什么必须在BL21(DE3)菌，而不能在DH5α中表达？
大肠杆菌DH5α一般做克隆或保存质粒用，BL21用来做原核表达用。BL21(DE3)菌株用于高效表达含有噬菌体T7启动子的表达载体（如pET系列）的基因，表达效率高。T7噬菌体RNA聚合酶位于λ 噬菌体DE3区，该区整合于BL21的染色体上。DH5α可以表达抗性基因，应该也能表达外源基因，但是我们一般不用该菌作为表达菌，可能与表达量、表达产物活性有关。4，表达产物的形式是包涵体还是可溶性蛋白？如何设计实验判定？
不确定，培养物离心后，加细胞裂解液冷冻，再加PMSF和lysozyme，超声等方法将细菌破碎，离心，分别收集上清和沉淀，常规SDS-PAGE进行电泳，即可以鉴定蛋白是可溶性的还是包涵体。
5，本实验能否判断表达产物一定是GFP蛋白？还需要什么方法？
蓝白班筛选，表达GFP蛋白的为白色菌落。6，如何估计表达产物的分子量? 通过粘度估计，一般是用乌氏粘度计测定特性粘数后折算分子量。
第二篇：基因工程实验方案
实验
一、大肠杆菌质粒的提取与电泳检测
一、实验目的
学习质粒DNA提取的基本原理，理解各种试剂的作用，掌握质粒最常用的提取方法，为基因工程提供载体原料。
二、实验原理
将一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖或表达的工具较载体。细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。质粒是一种独立于染色体外的稳定的遗传因子，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞总，大小从1—200kb不等。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能复制，而宿主即使没有质粒也可以正常存活。但质粒的存在使得宿主细胞具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。常用的质粒载体大小在2.7—10kb之间。如pBR32、pUC系列、pGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。
细菌质粒的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量小，易于复性的特点进行的。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短时间内复性而染色体DNA不能复性。用碱变性方法提取质粒就是利用离子型表明活性剂SDS溶解细胞膜上的脂肪及蛋白，在pH高达12.6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，成了杂乱无章的片段。而相对分子质量较小的质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离，当pH4.8的NaAc或KAc高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA可以完全形成互补链，又恢复到原来的构型。而染色体DNA不能恢复而形成缠连的网状结构，变性DNA与菌体的蛋白质凝聚成块。经过离心，出去的沉淀是变性的染色体DNA和蛋白质杂质，而上清液中的质粒DNA分子，则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。由于乙醇沉淀的时候，不光DNA还有性质相似的RNA也一起被沉淀下来。为了除去RNA，可以利用RNA酶进行处理，其后采用苯酚使RNA酶失活。出去RNA酶活性往往会采用一些复合物如苯酚、氯仿等，并且苯酚不仅使RNA酶失活，还能有效去除菌体的蛋白质等物质。因为只用无水乙醇沉淀，样品中还是混有蛋白质。所以为了获得高纯度质粒，应在无水乙醇沉淀前，先用苯酚进行处理，以便除去其中的蛋白质。
三、实验试剂
1.含质粒的大肠杆菌菌株
LB培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%Nacl、调pH7.2 抗生素：氨苄青霉素：母液100mg/mL，工作浓度100ug/mL 溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。
溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。TE缓冲液（pH=8.0）：10mmol/LTris-Hcl/1mmol/LEDTA 2mg/mLRNase A溶解于10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)、15mmol/LNacl 3mol/LNaAc(pH5.2 苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）、冰冷无水乙醇、冰冷70%乙醇 碱裂解法小量提取质粒DNA步骤如下：
（a）挑单菌落接种于含相应抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜。（b）每管取1ml菌液然后12,000 g离心30 秒，集菌。（c）加200 l溶液I，用振荡器剧烈振荡悬浮菌体。（d）加300 l新配制的溶液II，温和颠倒混匀5次以上。
（e）溶液澄清后立即加入300 l预冷的溶液III，混匀后冰上放置5分钟。（f）4℃、12000 g离心10（或5）分钟。
（g）取上清，加入等体积的氯仿，颠倒混匀后，4℃、12000 g离心10 分钟沉淀蛋白。
（h）吸取上清，加等体积异丙醇，混匀。室温放置10分钟。
（i）12000 g离心10 分钟，弃上清，再用75%(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000 g离心5分钟。
(k)沉淀在37 ℃干燥后后溶于适量水或TE（50ul），（-20°C）保存备用。质粒DNA的检测:取5ul的质粒与2ul的6×上样缓冲液混合后，在0.7%凝胶上电泳检测。
溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。溶液I的作用：
１、任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此可用适当浓度和适当pH值的Tris-HCl溶液。
２、大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。
溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。
既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。加入溶液III后出现大量沉淀，这与SDS的加入有关系。这其实是十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。
琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带。其实这三条带以电泳速度的快慢排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。
实验
二、DNA片段（PCR或者酶切）的体外连接感受态细胞的制备重组质粒的转化阳性克隆的筛选（抗性筛选、蓝白斑筛选）
大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）
此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。1.取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉 淀尽量干燥；
2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl 溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，剧烈振荡；
3.加入200µl 新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管 口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 II接触，不要涡旋，置于冰浴中；
4.加入150µl预冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5mlH2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟； 5.在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；
6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转 速离心5分钟；
7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；
8.加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将 开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～ 10分钟），用适量的ddH2O溶解；
9.用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟； 10.电泳鉴定。
乙醇沉淀DNA 1.加入1/10体积的乙酸钠（3mol⁄L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其 最终浓度为0.3mol⁄L；
2.加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟； 3.12,000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；
4.加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸 去管壁上所有的液滴；
5.于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干； 6.加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。
酶切
1.酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。2.在离心管中加入如下成分： 10×Buffer 1μl 待切样品xμl 酶 0.5-1μl 加水补足10μl 3.混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。
4.将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间 适当延长。
5.用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶 切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。）
连接
1.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。2.在离心管中加入如下成分： 10×连接Buffer1μl 待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）连接酶0.5-1μl 加水补足10μl 3.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。
4.将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求 而定，一般为22℃1-3hr或16℃连接过夜）。
连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。
感受态细胞的制备
1.挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18℃剧烈震荡，直到A600 达到0.6。
3.将培养物转移到50ml离心管中，4℃4,000rpm/min 离心10min。同时在冰浴 上配置TB溶液。
4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。
5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB（1/3体积的起始培养 液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min 离心10min。
6.弃上清，沉淀重悬于4mlTB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。
7.加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。8.将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。
9.取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落 生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。
注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理 0.1MK-Pipes(pH=6.7)的配制：
称取3.02gPipes粉末溶于80mlddH2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时 当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。
转化
1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2min。4.加入0.9mlSOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。
5.将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当
抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。
i.注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。ii.当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1MIPTG 和40μl 20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。
重组子的筛选和鉴定
重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR进行鉴定，阳 性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR产物。
1.用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml含适当抗生素的LB培养基中，37℃摇 床培养过夜。
2.次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min离心，弃上清，加入20μl ddH2O和 20μl 酚/氯仿，震荡混匀，13,000rpm×5min离心。
3.取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA作为阴性对照，根据质粒大小 初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。4.用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。
5.选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl体系。酶切样品 进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。
6.酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。7.若用PCR法鉴定，则在第2步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应，每管反应体系最低可少至10μl，PCR产物电泳，能得到所需条带的样 本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。
第三篇：基因工程实验小结
基因工程实验小结
基因工程实验同以前的实验有所不同，它有很明显的特点。首先是微量操作，所有的实验药品和试剂都是在1.5ml和0.5ml的离心管中进行，转移、加样都是使用移液器进行操作。其次是反应条件要求比较严格。冰浴是实验的关键操作步骤，对于DNA等具有生物活性的物质均需冰浴低温保证其不失活；实验中所用试剂均需较高的纯度，实验中的痕量污染、空气污染等都会影响实验结果，尤其是PCR反应，它对DNA浓度和纯度均有严格的要求。另外，此次的实验是综合实验，每个基础实验联系在一起才有意义，每个实验的结果好坏直接影响下一个实验的结果。而且有些实验的结果并不能直接观察，需要在下一个实验中体现证实。实验所用部分仪器也是以前从未接触过的，如电泳仪，PCR扩增仪，高速冷冻离心机，恒温摇床等。
此次实验主要完成的实验有：大肠杆菌DNA提取，PCR扩增，质粒的连接，感受态细胞制备与转化和α-互补筛选细菌克隆。其中前一个实验的结果均为下一个实验的材料，前两个实验通过琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，后三个实验通过特定平板培养的菌落形态鉴定实验结果。由于实验起初对各种仪器和操作不熟悉，导致DNA的SDS法分离纯化结果不佳，PCR产物凝胶成像不是很清楚，经过进一步的分析和操作熟悉，后面的实验结果均良好。由于影响实验结果的因素很多，所以实验中必须每一步都应仔细认真完成。
通过此次实验，完成了基因工程中的基本操作，使我们在学习完《基因工程》理论知识后对抽象的概念、仪器、步骤等有了具体的认识，加深了记忆和理解。
第四篇：大学基因工程论文
浅析基因工程技术的应用现状
动物医学专业
任课教师
指导教师姓名
摘要: 基因工程作为一门理论性与实践性较强的学科,其方法与技术已经渗透到现代生命科学的各个分支领域,成为生命科学的一门核心技术。基因工程包含许多独特的实验方法和技术,不仅内容丰富,涉及面广,实用性也强。基因工程是通过DNA 重组技术, 获得具有特殊生物遗传性状和功能的遗传工具生物体, 基因工程技术广泛应用于农业、医学、食品工业等。本文就基因工程的应用现状综合阐述。关键词 : 基因工程;应用现状
Shallow gene engineering technology application status Student majoring in Veterinary Medicine
Yinxunqiang
Tutor
Minlingjiang Abstract: Genetic engineering as a door the theory with practical strong subject, the method and technology has penetrated into the modern life science of each branch, become life science and a core technology.Genetic engineering contains many unique experiment method and technique, not only rich content, broad and practical also strong.gene engineering is obtained through DNA recombinant technology, with special biological genetics and function of the genetic tools organisms, genetic engineering technology, widely used in agriculture, medicine, food industry etc.This paper genetic engineering application status of comprehensive elaboration.Key words:
gene engineering, DNA recombinant technology,Application status
0.前言
基因工程技术是一项极为复杂的高新生物技术, 它利用现代遗传学与分子生物学的理论和方法, 按照人类所需, 用DNA 重组技术对生物基因组的结构和组成进行人为修饰或改造, 从而改变生物的结构和功能, 使之有效表达出人类所需要的蛋白质或人类有益的生物性状[1]。基因工程从诞生至今, 仅有30 年的历史, 然而, 无论是在基础理论研究领域, 还是在生产实际应用方面, 都已取得了惊人的成绩。首先,基因工程给生命科学自身的研究带来了深刻的变化。目前科学家已完成了多种细胞器的基因组全序列测定工作。其次, 基因工程具有广泛的应用价值, 能为工农业生产、医药卫生、环境保护开辟新途径。
1.基因工程
1.1 概念
基因工程(又称DNA 重组技术、基因重组技术), 是20 世纪70 年代初兴起的技术科学, 是用人工的方法将目的基因与载体进行DNA重组, 将DNA 重组体送入受体细胞, 使它在受体细胞内复制、转录、翻译, 获得目的基因的表达产物。这种跨越天然物种屏障, 把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力, 是基因工程技术区别于其他技术的根本特征。1.2 基因工程研究内容
(1)从复杂的生物有机体基因组中, 经过酶切消化或PCR 扩增等步骤, 分离出带有目的基因的DNA 片段。
(2)在体外, 将带有目的基因的外源DNA 片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上, 形成重组DNA分子。
(3)重组DNA 分子转移到适当的受体细胞, 并与之一起增殖。
(4)从大量的细胞繁殖群体中, 筛选出获得了重组DNA 分子的受体细胞克隆。(5)从这些筛选出来受体细胞克隆, 提取出已经得到扩增的目的基因, 供进一步分析研究使用。
(6)将目的基因克隆到表达载体上, 导入寄主细胞, 使之在新的遗传背景下实现功能表达, 产生出人类所需要的物质。2.基因工程的广泛应用
2.1 在农业上的应用
2.1.1 抗除草剂的植物基因工程
资料表明, 每年杂草造成的经济损失占农作物总产值的10%-20%左右尽管除草剂的使用, 对大规模机械化耕作, 减少劳力开支和提高量有极为重要的作用, 但一般除草剂的选择性较差, 即除了杀草以外, 还会将作物杀死。现在利用生物技术, 将能抵抗除草剂的基因转移到植物中, 获得抗除草剂的植物, 如美国的孟山都公司将除草剂草甘磷的靶酶(EPSPS)的cDNA 克隆转入油菜[2] , 目前, 已获得的抗除草剂作物有大豆、棉花、玉米、水稻和甜菜等20 多种。2.1.2 抗虫的植物基因工程
生物防治害虫的工作已经开展多年, 主要是利用苏云金杆菌中的毒蛋白(结晶蛋白)对害虫有毒害作用, 使用这些杆菌来控制害虫。现在, 人们可以通过克隆这些毒蛋白的基因(Bt 基因)并把这些基因转移到植物细胞中, 从而获得能抗虫的转基因植物。目前, Bt 基因已被转入烟草、番茄、马铃薯、水稻、玉米及棉花等多种植物中。1996 年转Bt 基因棉花在美国种植66 万hm2 经中国农科院棉花所引进在华北试种两年, 在多点表现突出, 在完全不喷杀虫剂的情况下, 单产仍然高于喷撒2-3 次杀虫剂的中国推广棉花[3] , 显示出了控制棉铃虫的极好前景。2.1.3 动物转基因育种
动物基因工程研究主要集中在改良家畜、家禽的经济性状和通过转基因动物进行药物或蛋白质的生产等方面, 目前已取得了显著的成就, 先后培育出转基因猪、羊、牛和鱼等, 另一种转基因猪是带有人体基因的猪, 这种转基因猪客望能解决人体移植动物器官的遗体排斥问题。随着动物基因工程技术的逐渐成熟和转人体血红蛋白的基因猪、转人体血清蛋白的基因山羊等的问世, 不仅能生产出大量人类所需的血红蛋白、白蛋白等药物而且为动物育种开辟了一条全新的途径。
2.2 在医学上的应用 2.2.1 基因工程药物 利用基因工程技术开发新型治疗药物是当前最活跃和发展最快的领域。自1982 年世界第一个基因工程药物---重组胰岛素投放市场以来, 基因工程药物就成为制药行业的一支奇兵, 每年平均有3-4 个新药或疫苗问世, 开发成功的约50 个药品, 诸如人胰岛素、忍尿激酶、人生长激素、干扰素、激活剂、乙肝疫苗等广泛应用于治疗癌症、肝炎、发育不良、糖尿病和一些遗传病上, 在很多领域特别是疑难病症上, 起
到了传统化学药物难以达到的作用[4, 5, 6]。为治愈癌症正在研制的用单克隆抗体制成的“生物导弹”, 就是按照人类的设计, 把“生物导弹”发射出去, 精确的命中癌细胞, 并炸死癌细胞, 而不伤害健康的细胞, 比如专门用于肿瘤的“肿瘤基因导弹”等。可见, 生物工程药物将成为21世纪药业的支柱。而脱氧核糖核酸或者基因疫苗的问世, 变革了机体的免疫方式。如今, 人们翘首关注困扰人类的艾滋病病毒疫苗的早日问世。
尽管目前诱变育种技术仍是改良微生物工业生产菌种的主要手段,但是基因工程技术在改良工业生产菌种方面已有成功的报道。最常见的是将控制药物合成关键步骤的酶基因克隆,通过适当的载体转移到原生产菌中,以使控制限速步骤的酶水平,从而提高产量。Malmberg等[7]构建了一种带有编码赖氨酸ε-氨基转移酶基因(lysine-ε-aminotranster-ase,LAT)这种控制Streptomyces clavuligerus生物合成头霉素C的限速步骤的关键酶的基因(lat)的高拷贝质粒,并转入这种头霉素产生菌,使LAT提高活力提高了4倍,在2 L发酵罐中产生头霉素的能力是原来的2倍,重组菌胞外LAT产物α-氨基己二酸的积累量也比原受体菌高。伊维菌素(ivermectins)是一个市场很大的抗虫
抗生素,其前体阿弗米丁(avermectins)的产生菌种的发酵液中有8个以上的组分,其中只有B1a组分才是制备伊维菌素的原料。Ikeda等[8]经过近十年的努力,已将阿弗米丁的生物合成基因簇全部搞清,并经过诱变与DNA重组,获得了仅产阿弗米丁B2a单一组分和B1a、B2a组份的重组工程菌,这不仅大大提高了阿弗米丁有效组分的发酵效价,且给提取、精制、半合成等后处理工序带来了很大的便利。可以预见,随着对各种工业生产的微生物药物生物合成途径的深入了解以及基因重组技术的不断进展,应用基因工程方法定向构建高产菌株的成功实例将越来越多。在抗生素发酵过程中供氧往往是一个限制因素,充足的氧气供给是药物工业发酵稳定和提高产量,降低成本的关键。传统的解决方法如增加通气量等对设备要求高,能量消耗大。20世70年代末在专性好氧菌透明颤(Vitreoscilla)中发现了血红蛋白(VHb),它能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上。于是人们想到了将其基因Vgb克隆到其它微生物中,以促进微生物在低氧条件下生长。
1988年Khosla等[9]从Vitreoscilla中分离出Vgb基因并将之转入大肠杆菌(E·coli),提高了大肠杆菌在溶氧量低于5%时对氧的利用率。目前已用克隆表达VHb的方法提高了放线紫红素、头孢霉素C、红霉素等产生菌及青霉素酰化酶基因工程菌的产量[10]。血红蛋白基因工程的研究和应用,必将对抗生素工业和其它重组药物发酵工业的节能等带来美好的前景。作为半合成头孢菌素类抗生素重要原料的7-氨基头孢烷酸（7-ACA),目前国内外仍以化学裂解头孢菌素C的工艺路线为主。国内外已报道可用经由GL-7-ACA的二步法(化学/酶法或二步酶法)来生产7-ACA,与化学裂解法相比不仅收率提高,且能大大减少环境污染,简化生产工艺。但二步法中关键的GL-7-ACA酰化酶在假单胞菌中表达量低而且分离纯化困难,限制了这种方法的应用。通过将GL-7-ACA酰化酶基因转入大肠杆菌中表达恰好可以解决这一问题[11]。最近又报道可将编码2个酶的基因直接转入头孢菌素C的生产菌种中,使其在发酵时直接产生7-ACA。调节基因在药物的生物合成中也起着重要作用,增加调节基因的基因量能够大幅提高药物产量。Hopwood等将放线紫红素生物合成的一个调节基因actⅡ导入原产生菌,尽管基因的拷贝数仅增加了2倍,放线紫红素的产量却增加了30~40倍。某些抗生素生产菌的产量不高,是由于其自身对该抗生素的抗性不高。因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,增加菌种对自身产生的抗生素的抗性,可能增加抗生素的产量。例如,将氨基糖苷-6-乙酰转移酶基因导入卡那霉素和新霉素产生菌,由于提高了对氨糖类抗生素的抗性,产量提高了2~6倍 2.2.2 基因治疗
基因治疗是指由于某种基因缺陷引起的遗传病通过转基因技术而得到纠正。临床实践已经表明: 基因治病已经变革了整个医学的预防和治疗领域。比如白痴病, 用健康的基因更换或者矫正患者的有缺损的基因, 就有可能根治这种疾病。现在已知的人类遗传病约有4000种, 包括单基因缺陷和多基因的综合症。运用基因工程技术或基因打靶的手段, 将病毒的基因杀灭, 插入矫正基因, 得以治疗、校正和预防遗传疾病的目的。目前, 基因治疗已扩大到肿瘤、心血管系统疾病、神经系统疾病等的治疗[12]。人类也已成功实现了肾、心、肝、胰、肺等器官的移植, 也有双器官和多器官的联合移植。
基因治疗有两种途径: 一是体细胞的基因治疗, 一是生殖细胞的基因治疗。由于生殖细胞的基因治疗操作技术异常复杂, 又涉及伦理缓行之理充足, 故尚无人涉足[13]。基因工程是20 世纪生命科学中最伟大的成绩, 开辟了生命科学的新纪元。经过几十年的发展, 基因工程技术已成为一个巨大的朝阳产业, 它可以超越动物、植物、微生物之间的界限, 创造出新的生物类型。基因工程不仅在医学上应用广泛, 而且也广泛应用在工业、农业、冶金、环保、资源、能源、畜牧渔业等领域, 为人类的丰衣足食和健康长寿提供了持续的实用价值很高的产品, 发展前景极为广阔。
参考文献：
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第五篇：大学物理化学实验思考题答案总结
大学物理化学实验思考题答案总结
【引用】大学物理化学实验思考题答案总结
2011-06-21 10:36:50| 分类： 化学实验 |字号 订阅
本文引用自天使折翼《大学物理化学实验思考题答案总结》 液体饱和蒸气压的测定
1．测定液测量体饱和蒸气压的方法有哪些？我院物理化学实验室采用的是什么方法？
答：(1)静态法：在某一温度下直接饱和蒸汽压。
(2)动态法：在不同外界压力下测定沸点。
(3)饱和气流法：使干燥的惰性气体通过被测物质，并使其为被测物质所饱和，然后测定所通过的气体中被测物质蒸汽的含量，就可根据道尔顿分压定律算出此被测物质的饱和蒸汽压。
采用静态法测定乙醇的饱和压。
2．等压计U型管中的液体起什么作用？冷凝器起什么作用？为什么可用液体本身作U型管封闭液？
答：(1)U型管作用：①封闭气体，防止空气进行AB弯管内； ②作等压计用，以显示U型管两端液面上的压力是否相等。
(2)将U型管内封闭液蒸气冷凝，防止其“蒸干”
(3)封闭液作用是封闭和作等压计用，可用液体本身作封闭液。若用其它液体作封闭液，则平衡时a球上方的气体为封闭液蒸气和乙醇蒸气的混合气体，测定结果偏高。
3．开启旋塞放空气入体系内时，放得过多应如何办？实验过程中为为什么要防止空气倒灌？
答：(1)必须重新排除净AB弯管内的空气。
(2)AB弯管空间内的压力包括两部分：一是待测液的蒸气压;另一部分是空气的压力。测定时，必须将其中的空气排除后，才能保证B管液面上的压力为液体的蒸气压。
4．如果升温过程中液体急剧气化，该如何处理？
答：缓慢放入空气，使系统压力慢慢升高，以保持等压计两液面平齐，以免使等压计内的乙醇急剧沸腾，使液封量减少。
二．二元液系相图
1．在“二组分气液平衡相图的测定”实验中，作标准溶液的折光率－组成曲线的目的是什么？
答：从标准溶液的折光率－组成曲线上可以得出某沸点下的气相组成和液相组成。
2．在“二组分气液平衡相图的测定”实验中，收集气相冷凝液的小槽的大小对实验结果有无影响？
答：若冷凝管下方的凹形贮槽体积过大，则会贮存过多的气相冷凝液，其贮量超过了按相平衡原理所对应的气相量，其组成不再对应平衡的气相组成，因此必然对相图的绘制产生影响。
3．每次加入蒸馏瓶中的三氯甲烷或乙醇是否应按记录表规定精确计量？
答：不一定。绘制沸点－组成图时，不必精确知道系统组成。需要精确知道的数据是不同系统组成时的沸点、气相组成和液相组成，而气液两相组成可通过折光率－组成标准曲线得到。
4．如何判定气－液两相已达到平衡？
答：将液体缓慢加热，当液体沸腾回流一段时间，且体系温度计读数稳定时，可判定气－液两相已达到平衡。
三．电动势的测定
1．为什么不能用伏特表测定原电池的电动势？
答：电池的电动势不能用伏特计测量，其原因是：
(1)用伏特计测量，有电流流过电池，电池的内阻电压降使所测电动势偏低；
(2)有较大电流通过电极时，电极极化作用使电极电势偏离平衡电极电势，测得的电动势小于电池的可逆电动势；(3)有电流通过电池时，电池会发生化学反应使溶液的浓度改变，导致电动势的改变，从而破坏了电池的可逆性。
2．对消法（或补偿法）测电动势的原理是什么？画出该实验的测量线路图，并指出实验中常用到哪些仪器？
答：（1）利用对消法（即补偿法）可以使电池在无电流（或极微弱电流）通过的条件下测得两极间的电势差，这时电池反应是在接近可逆条件下进行的，这一电势差即为该电池的平衡电动势。
（2）电路图
（3）UJ—25型高电势电位差计、检流计、工作电池、标准电池、待测电池、正负电极和温度计
3．电位差计、标准电池、检流计及工作电池各有什么作用？
答：电位差计：利用补偿法测定被测电极电动势；
标准电池：提供稳定的已知数值的电动势EN，以此电动势来计算未知电池电动势。
检流计：指示通过电路的电流是否为零；
工作电池：为整个电路提供电源，其值不应小于标准电池或待测电池的值。
4．测电动势为何要用盐桥？如何选用盐桥以适合不同的体系？
答：（1）对于双液电池电动势的测定需用盐桥消除液体接界电势。
（2）选择盐桥中电解质的要求是：①高浓度（通常是饱和溶液）；②电解质正、负离子的迁移速率接近相等；③不与电池中的溶液发生反应。具体选择时应防止盐桥中离子与原电池溶液中的物质发生反应，如原电池溶液中含有能与Cl-作用而产生沉淀的Ag+、Hg 离子或含有能与K+离子作用的ClO－离子，则不可使用KCl盐桥，应选用KNO3或NH4NO3盐桥。
5．在测定电动势过程中，若检流计的指针总往一个方向偏转，可能是什么原因？
答：若调不到零点，可能的原因有：
（1）电池（包括工作电池、标准电池和待测电池）的正负极接反了；
（2）电路中的某处有断路；
（3）标准电池或待测电池的电动势大于工作电池的电动势，超出了测量范围。
四．蔗糖水解
1．本实验是否一定需要校正旋光计的读数？
答：不一定。数据处理时利用 对 作图得直线，在同一台旋光仪测定时，的差值与旋
光计的零点校正无关。
2．为什么配蔗糖溶液可用粗天平衡量？
答：本实验只需要记录αt～t数据，根据 作图求得反应速率常数k，数据处理时不需要知道蔗糖溶液的精确初始浓度，故配蔗糖溶液可用粗天平衡量蔗糖。
3．如何测定α∞？
答：将剩余的混合液置于55℃左右的水浴中温热 30分钟，以加速水解反应，然后冷却至实验温度，测其旋光度，此值即可认为是α∞。
4．本实验的关键步骤是什么？如何减少误差？
答(1)温度对反应速度影响较大，所以整个过程应保持恒温。用水浴加热反应液测α∞时，温度不宜过高，以免产生副反应，溶液变黄，加热过程应同时避免溶液蒸发使糖的浓度改变，从而影响α∞的测定。
(2)由于反应初始阶段速率较快，旋光度变化大，一定要注意时间的准确性。
(3)根据反应温度，可适当增加HCl的浓度，以缩短反应时间。
五．乙酸乙酯皂化反应速率常数的测定
1．配制乙酸乙酯溶液时，为什么在容量瓶中事先加入适量的蒸馏水？
答：避免乙酸乙酯挥发。在容量瓶中事先加入适量的蒸馏水，可以使加入的乙酸乙酯很快溶于水中形成溶液，减少了乙酸乙酯的损失。
2．为什么要使两种反应物的浓度相等？如何配制指定浓度的乙酸乙酸溶液？
答：(1)为了处理问题方便，在设计这个实验时将反应物CH3COOC2H5和NaOH 取相同的初浓度a作为起始浓度。在此条件下存在下式：，以 对 作图可得一直线，其斜率等于，由此可求得反应速率常数。(2)找出室温下乙酸乙酯的密度，进而计算出配制100mL 与NaOH同浓度的乙酸乙酯水溶液所需的乙酸乙酯的毫升数V，然后用1mL 移液管吸取VmL 乙酸乙酯注入100mL 容量瓶中，稀释至刻度即可。
3．为什么要使两溶液尽快混合完毕？开始一段时间的测定时隔期为什么要短？
答：(1)实验过程中，要记录不同反应时间时体系的电导率，因此两溶液要尽快混合，且在混合时开始按下秒表计时。
(2)反应在开始一段时间内，体系的电导率下降较快，因此这段时间测定的时间间隔期要短。
4．为何本实验要在恒温条件下进行，而且乙酸乙酯和氢氧化钠溶液在混合前还要预先恒温？
答：温度对反应速率常数k影响很大，故反应过程应在恒温条件下进行。
5．本实验注意事项：
答：(1)本实验需用电导水，并避免接触空气及灰尘杂质落入。(2)配好的NaOH溶液要防止空气中的CO2气体进入。
(3)乙酸乙酯溶液和NaOH溶液浓度必须相同。(4)乙酸乙酯溶液需临时配制，配制时动作要迅速，以减少挥发损失。
六．表面张力的测定
1在表面张力测定的试实验
中，为什么毛细管尖端应平整光滑，安装时要垂直并刚好接触液面？
答：(1)气泡形成半球形时曲率半径R和毛细管半径r相等达最小值，附加压力达最大值，由公式 可求出被测液体的表面张力。故为得到半球形气泡，毛细管尖端应平整光滑。(2)如果毛细管尖端插入液下，会造成压力不只是液体表面的张力，还有插入部分液体的压力。
2．本实验的关键在什么地方，如何减少误差？
答：(1)仪器系统不能漏气。(2)所用毛细管必须干净、干燥，应保持垂直，其管口刚好与液面相切。(3)读取压力计的压差时，应取气泡单个逸出时的最大压力差。
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