第九章 酶免疫技术
第一节 酶免疫技术的特点
它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。
一、酶和酶作用底物
（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。
用于标记的酶应符合：1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。
2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。
3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。
4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。
5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。
（二）常用的酶
1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。
RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。
酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。
2.碱性磷酸酶（AP）：大肠杆菌来源的AP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜AP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种AP的活性高于前者。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。
（三）常用的底物
1.HRP的底物
（1）邻苯二胺（OPD）：是HRP最为敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。OPD应用液稳定性差，易变色，需新配制后在1小时内使用，显色反应过程需避光，而且具有致癌性。
（2）四甲基联苯胺（TMB）：TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长450nm。TMB稳定性好，成色无需避光，无致突变作用，是目前ELISA中应用最广泛的底物。缺点是水溶性差。
（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）。
2.AP的底物
常用对-硝基苯磷酸酯（p-NPP），p-NPP经AP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。
3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物
常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。
二、酶标记抗体或抗原
（一）酶标记抗体或抗原的制备
标记方法应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定，应避免酶、抗体（抗原）以及酶标志物各自形成聚合物等。
1.戊二醛交联法：同源双功能交联剂。
（1）一步法：连接AP。
①优点：操作简便、有效，重复性好。
②缺点：交联时分子间比例不严格，大小不一，影响效果。
（2）二步法：连接HRP。
先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。
优点：酶标志物质量较均一，标记效率也较一步法高。
2.改良过碘酸钠法
HRP标记抗体或抗原的最常用方法。
（二）酶标记物的纯化及鉴定
常用的纯化方法有葡聚糖凝胶G-200/G-150过柱层析纯化和50%饱和硫酸铵沉淀提纯等。
常用免疫电泳或双相扩散法进行鉴定。
1.出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫活性。
2.沉淀线经生理盐水漂洗后，滴加酶的底物溶液，若沉淀线上显色，则酶标记物中的酶活性仍保留。
三、固相载体
除均相酶免疫测定外，各种非均相酶免疫测定反应最后都需要分离游离和结合的酶标记物。
固相抗体或抗原就是把抗体或抗原结合到固相载体的表面上，是酶免疫技术中将游离和结合的酶标志物迅速分离的最常用方法。
（一）固相载体的要求 结合抗体或抗原的容量大；可将抗体或抗原牢固地固定在其表面，经长期保存和多次洗涤也不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性，而且为使反应充分进行，最好其活性基团朝向反应溶液，固相方法简便易行，快速经济。
（二）固相载体的种类和选择
1.塑料制品：聚苯乙烯塑料最常采用。抗原或抗体以非共价或物理吸附方式结合到此载体上。
主要缺点是抗体（抗原）结合容量不高、固相抗体（抗原）脱吸附率较高且不均一，孔间变异大，重复性差，从而影响测定的灵敏度、精确度及检测范围。
目前采用非共价和化学偶联共价吸附方法进行抗原或抗体的固相化可改善上述缺点
2.微粒：易与抗体（抗原）形成化学偶联，且结合容量大。均匀地分散到整个反应溶液中，因此反应速度快。可制成磁化微颗粒。自动化检测中常用。
3.膜载体：常有硝酸纤维素膜（Nc）、玻璃纤维素膜及尼龙膜等通过非共价键吸附抗体（抗原），广泛用于定性或半定量斑点ELISA的固相载体。
（三）包被与封闭
1.包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程。普遍使用的聚苯乙烯载体，将抗原或抗体溶于缓冲液（常用为pH9.6的碳酸盐缓冲液）中，加于ELISA板孔中4℃过夜。包被好的固相载体在低温可放置一段时间而不失去免疫活性。
2.封闭：包被的蛋白质浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色致本底偏高，在这种情况下，需用1%～5%的牛血清白蛋白或5%～20%小牛血清再包被一次，消除此干扰，此过程称为封闭。
第二节 酶免疫技术的分类
包括两种：
酶免疫组织化学技术：用于组织切片或其他标本中抗原的定位。
酶免疫测定技术（EIA）：用于液体标本中抗原或抗体的定性和定量。根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标志物分离，EIA一般可分为均相和异相两种类型。
一、均相酶免疫测定
利用酶标志物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结合和游离酶标志物分离的情况下，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。该法主要用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定，均相法的优点是适合于自动化测定，但反应中被抑制的酶活力较小，需用灵敏的光度计测定，反应的温度也需严格控制。
（一）酶放大免疫测定技术（EMIT）EMIT的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原。当与抗体结合后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。反应后酶活力大小与标本中的半抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。
（二）克隆酶供体免疫分析（CDEIA）DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如β-D半乳糖苷酶）分子的两个片段，大片段称为酶受体（EA），小分子称作酶供体（ED），两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法。
标本中的抗原和酶供体（ED）标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不再能与酶受体（EA）结合，而游离的ED标记的抗原上的ED可和EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活性，酶活力的大小与标本中抗原含量成正比。
二、异相酶免疫测定
是目前应用最广泛的一类标记免疫测定技术。
（一）异相液相酶免疫测定 主要用于检测样品中极微量的短肽激素和某些药物等小分子半抗原。酶标志物具有更好的稳定性，且无放射性污染。
1.平衡法：将待测样品抗原、酶标抗原及特异性抗体进行一次性温育，待反应达平衡后，测定离心沉淀物（酶标抗原抗体复合物）中加入酶底物液后的呈色吸光度值。
2.非平衡法：先将样品（或标准品）与抗体混合反应达平衡，然后加入酶标记抗原继续温育一段时间，测定离心沉淀物（酶标抗原抗体复合物）中加入酶底物液后的呈色吸光度值。
（二）固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验（ELISA）。
第三节 酶联免疫吸附试验
一、基本原理
把抗原或抗体结合到固相载体表面，测定时将受检样品和酶标记抗原或抗体与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物；洗去未结合成分；加入底物后，底物被固相载体上的酶催化变成有色产物。故：
①固相的抗原或抗体；
②酶标记的抗原或抗体；
③酶反应的底物三种试剂为反应必备。
二、方法类型及反应原理
（一）检测抗原的方法
1.双抗体夹心法：属于非竞争结合，检测抗原最常用的方法，检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。原理是先将特异性抗体与固相载体连接；加入待测标本，形成固相抗原抗体复合物；再加入酶标抗体形成双抗体夹心，洗涤；加底物显色，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量检测。
如血清标本中有类风湿因子（RF）存在，则可出现假阳性反应，因为RF是一种抗变性IgG的自身抗体，它能与多种动物的变性IgG的Fc部分结合，因此RF就可作为固相抗体和酶标抗体之间的桥接抗原。
双抗体夹心法只适用于二价或以上的较大分子抗原的测定，不能用于小分子半抗原的检测。
2.双位点一步法：针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇，包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。测定时将待测抗原和酶标抗体同时加入，温育、洗涤，加入底物显色。若待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应，显色降低，甚至假阴性。必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。
3.竞争法
用于测定小分子抗原，如药物、激素等。原理为先用抗小分子的特异性抗体包被固相，然后同时加入待测样本和酶标记的小分子，两种小分子竞争与固相上的抗小分子的特异性抗体结合，温育一定时间后洗涤，加入酶底物显色。
特点是：
①酶标记抗原与样品或标准品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力；
②反应体系中，固相抗体和酶标抗原是固定限量，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和；
③免疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量（酶活性）与样品或标准品中非标记抗原的浓度成反比。
（二）检测抗体的方法
1.间接法：最常用的方法，属非竞争性结合试验。原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人IgG，在固相上即形成固相抗原-待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。多用于检测IgG类型抗体。
2.双抗原夹心法
此法可检测各类抗体，因此双抗原夹心法的灵敏度和特异性要高于间接法。其原理及操作步骤类似双抗体夹心法，也可采用一步法。由于机体产生抗体IgG的效价有限，一般不会出现钩状效应。
临床上乙型肝炎表面抗体的测定常用此法。
3.竞争法
一般抗体检测是较少采用，当相应抗原材料中含有与抗人IgG反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种方法测定抗体，目前临床运用较多的是乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）的检测。
竞争抗体与待测抗体的特异性及亲和力越接近，则测定的可靠性越强。
4.捕获法又称反向间接法
主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。原理：先将针对IgM的二抗包被于固相载体，加入待测标本，其中IgM类抗体可被固相抗体捕获，再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记特异性抗原的抗体，形成固相二抗-IgM-抗原-酶标记抗体复合物，加底物显色后，即可对待测标本中IgM是否存在及含量进行测定。
第四节 酶免疫测定的应用
几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可用酶免疫测定检测。
均相酶免疫测定主要用于药物和小分子物质的检测。
非均相免疫测定中的ELISA在多种物质的检测中被广泛的使用。
实战演练
目前酶免疫技术中应用较广、提纯较简便的酶是
A.脲酶
B.碱性磷酸酶
C.葡萄糖氧化酶
D.辣根过氧化物酶
E.半乳糖苷酶
『正确答案』D
『答案解析』HRP是目前在酶联免疫吸附试验中应用最为广泛的标记用酶。
酶放大免疫测定技术（EMIT）主要用来检测
A.抗原
B.抗体
C.半抗原
D.不完全抗体
E.抗原抗体复合物
『正确答案』C
『答案解析』酶放大免疫测定技术（EMIT）主要用来检测半抗原。
以下关于酶标记抗体或抗原不正确的是
A.过碘酸盐氧化法只用于HRP的标记
B.未标记上的游离的抗体与酶标记抗体竞争固相上的抗原
C.制备的标记物无须纯化，因为游离的酶或未标记上的抗原或抗体成分在测定过程中被洗掉
D.制备的结合物需要纯化
E.标价物需要鉴定
『正确答案』C
『答案解析』每批制备的酶标志物都要进行质量和标记率的鉴定，质量鉴定包括酶活性和抗体（抗原）的免疫活性鉴定。常用免疫电泳或双相扩散法，出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫活性。沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，则表示酶标记物中的酶活性仍保留。也可直接用ELISA方法测定。
关于酶联免疫吸附试验（ELISA）错误的是
A.属于液相和固相酶免疫测定
B.固相常用聚苯乙烯反应板
C.通过洗涤除去未结合成分
D.底物显色
E.既能定性又能定量分析
『正确答案』A
『答案解析』酶联免疫吸附试验（ELISA）属于固相酶免疫测定。
酶免疫技术中最常用的固相载体是
A.聚氯乙烯
B.聚苯乙烯
C.硝酸纤维素膜
D.琼脂糖
E.尼龙膜
『正确答案』B
『答案解析』酶免疫技术中最常用的固相载体是聚苯乙烯。
酶免疫技术中悬浮在溶液中具有液相反应速率的固相载体是
A.聚氯乙烯
B.聚苯乙烯
C.硝酸纤维素膜
D.磁性微粒
E.尼龙膜
『正确答案』D
『答案解析』酶免疫技术中悬浮在溶液中具有液相反应速率的固相载体是磁性微粒。
将抗原或抗体固相化的过程称为
A.吸附
B.包被
C.封闭
D.标记
E.交联
『正确答案』B
『答案解析』将抗原或抗体固相化的过程称为包被。
ELISA技术中，最常用来检测抗体的方法是
A.双抗体夹心法
B.间接法
C.竞争法
D.捕获法
E.应用生物素和亲和素的ELISA
『正确答案』B
『答案解析』ELISA技术中，最常用来检测抗体的方法是间接法。
下列有关双位点一步法ELISA的叙述中，错误的是
A.使用针对同一抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作为酶标抗体
B.一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗体
C.采用高亲和力的单克隆抗体将提高测定的敏感性和特异性
D.可使标本和酶标抗体同时加入
E.标本中抗原过高时，会出现钩状效应
『正确答案』A
『答案解析』双位点一步法：在双抗体夹心法基础上，进一步发展了双位点一步法。该法是针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。但当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应（hook
effect），显色降低，严重时可出现假阴性结果。必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。这是应用此法必须要注意的问题。
ELISA技术中待测孔（管）显色颜色的深浅与待测抗原或抗体呈负相关的是
A.双抗体夹心法
B.双位点一步法
C.间接法测抗体
D.竞争法
E.捕获法
『正确答案』D
『答案解析』ELISA技术中待测孔（管）显色颜色的深浅与待测抗原或抗体呈负相关的是竞争法。
双位点一步法钩状效应产生是因为
A.标本中的抗原不纯
B.洗涤不充分
C.孵育时间过长
D.酶标抗体过量
E.标本中的抗原浓度过高
『正确答案』E
『答案解析』双位点一步法钩状效应产生是因为标本中的抗原浓度过高。
用一种标记物可检测多种与抗原相应的抗体的ELISA方法是
A.双抗体夹心法
B.间接法
C.竞争法
D.双抗原夹心法
E.双位点一步法
『正确答案』B
『答案解析』用一种标记物可检测多种与抗原相应的抗体的ELISA方法是间接法。
关于ELISA竞争法的叙述中，正确的是
A.只用于检测抗原
B.待测成分优先于酶标记物与固相结合C.被测物含量多则标记物被结合的机会少
D.待测管显色颜色越淡表示被测物含量越少
E.只用于检测抗体
『正确答案』C
『答案解析』关于ELISA竞争法的叙述中，正确的是被测物含量多则标记物被结合的机会少。
ELISA间接法中固相上包被的是
A.抗体
B.不完全抗体
C.抗原
D.抗抗体
E.酶标抗体
『正确答案』C
『答案解析』ELISA间接法中固相上包被的是抗原。
临床上检测IgM抗体常用的ELISA方法是
A.双抗体夹心法
B.间接法
C.竞争法
D.双抗原夹心法
E.捕获法
『正确答案』E
『答案解析』捕获法，又称反向间接法。主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，目前最常用的是病原体急性感染诊断中的IgM型抗体。
酶免疫技术分为两类酶免疫测定，它们是
A.均相和异相
B.固相和液相
C.酶免疫组化和酶免疫测定
D.均相和固相
E.异相和液相
『正确答案』C
『答案解析』酶免疫技术分为两类酶免疫测定，它们是酶免疫组化和酶免疫测定。
ELISA一般不用于检测
A.病原体及其抗体
B.Ig、补体、肿瘤标志物等蛋白质
C.非肽类激素
D.药物
E.半抗原
『正确答案』E
『答案解析』ELISA一般不用于检测半抗原。半抗原一般用均相酶免疫测定法。
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