细胞培养步骤

第一篇：细胞培养步骤

细胞培养前需要准备的物品

提前开启37℃水浴锅和超净台的紫外灯；

灭菌吸头、1.5mL的离心管、空玻璃瓶；

无菌的15mL、50mL离心管；

无菌的10cm培养皿、16孔板、32孔板、96孔板、培养瓶等。

5mL、10mL的移液管；

橡胶手套、普通移液器、电子移液器、装有99.9%-100%CO2钢瓶

70%酒精、DMEM培养基（37℃提前温浴）、FBS血清、二抗生素（10,000Unit/mL penicillin和10,000ug/mL Streptomycin混合液）、0.05% typsin-EDTA（上述培养细胞所用试剂都用GIBCO的产品，国产的产品没有办法保证质量）细胞培养步骤

1.取一瓶液体DMEM培养液（GIBCODMEM液体低糖培养基）、FBS血清、二抗，在放入超净台前用70%的酒精消毒；

2.向500mL的DMEM培养基中加入55mL的FBS血清，至终浓度为10%，再向其中加入双抗生素，一般保证抗生素的单位达到100Units（即500mL培养基中加入5mL 10,000单位的双抗生素，如果用于保藏的细胞培养最好不加），放置于4℃冰箱中保藏待用；

3.细胞培养使用前培养基应先放入37℃水浴中温浴，提前打开超净台的紫外灯杀菌，然后从水浴锅中取出培养基，喷上70%酒精后放入超净台中待用；

4.从液氮中取出冻存管，立刻放入37℃的水浴锅中晃动，直至细胞冻存液完全溶解；

5.将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5mL培养液，轻轻吹打混匀；

6.将细胞悬液经500rpm/min离心5min，弃上清液。

7.向细胞沉淀内再加入适量培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养皿中进行培养。

8.取出在培养箱中培养的细胞（一般BMSCs传代3次左右就不太好了，所以较难培养）显微镜下观察细胞的生长状态，在超净台中吸去表面的培养基，此时加入少量的培养基清洗一下，然后向培养基内加入1-2 ml 0.05%胰蛋白

酶后放入37℃培养箱中处理1-2分钟使细胞与培养皿脱离。

9.取出培养皿，观察胰酶处理的效果，一般以视野中出现均匀的单细胞为宜，如果有多个细胞聚集的现象可以继续处理1-2分钟，然后吸去胰酶，加入适量的培养基进行终止胰蛋白酶活性，用电子移液器套移液管进行吹打，使细胞悬浮。

10.显微镜下观察细胞悬浮程度，最好是可以看到均匀的单细胞，如果有多个细胞聚集的现象可以用手动移液器进行吹打。

11.向事先准备好的培养皿中加入8-9ml的培养基（此过程加入的培养基的量与加入细胞时所带入的培养基的量有关），一般10cm的平板中总量有10ml的培养基。向含有培养基的培养皿中加入1-2ml的细胞悬液，然后放入细胞培养箱内

注意事项：

1.加入FBS血清时要考虑血清本身的体积，使FBS血清的终浓度达到10%；

2.FBS血清和二抗生素提前1天放入4℃的冰箱中融化，可以用50mL无菌的离心管分装，以免多次融化造成血清变性。每50mL的离心管中最多装入40-45mL的FBS血清，因为血清冻存后会膨胀；

3.冻存管中的细胞溶化过程要迅速，减少DMSO对细胞的破坏作用；

第二篇：动物细胞培养总结! !!!

动物细胞培养总结 一．实验准备

1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装

离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。

蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。

过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。

过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。

玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。（2）消毒灭菌

1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。

2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。

玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。2.无菌间消毒及设备检查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。

用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。设置温度和二氧化碳。

紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。3.细胞培养用液的配置及分装

RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水，NaHCO3溶于水后，过滤除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。

双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。两溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。

二．操作步骤 注意事项：

1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。

2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。

3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。

4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。开始工作：

1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。

2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。1.细胞复苏

提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。

将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。

关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。

戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。(注意：这一步对细胞存活率至关重要。既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。封上封口膜。

低俗离心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。37度恒温箱中培养。第二天观察细胞生长情况。培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。2传代培养

附着型胞(adherentcell)传代培养

离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。

轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（0.25%为1X胰酶），37℃作用数分钟。等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。）

轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍台子，灭酒精灯。

3细胞换液

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。

用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。旋紧瓶盖。将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。

4细胞冻存 1>准备工作：

提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。

进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30，过后，关闭紫外灯，通风10min。从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基，血清37度水浴。取出室温放置的DMSO。找到防水的医用胶布，滤菌膜，针管和所需枪头饭盒等物品，喷一遍酒精，放入台子照紫外。2>开始工作：

实验前在更衣间换上紫外照过的白大褂和拖鞋。戴上橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。酒精擦拭胰酶、PBS缓冲液、培养基放入超净台。过火镊子取出离心管于试管架，剪好封口膜备用。用滤菌膜和针管过滤DMSO以除菌。

75%无血清培养基，20%的血清，5%过滤除菌的DMSO，混匀配制成所需的冻存液。

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，挂壁残液注意用酒精棉擦去，用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量胰酶约2ml，弃掉枪头。消化数分钟，等待期间，用过火镊子从饭盒中取出冻存管和管盖标记好细胞名称和冻存日期，直立于台面备用。

用微量枪加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。离心5min，1000转/min。

细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。用微量枪将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。用微量枪将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口膜封口，防水医用胶布再缠一圈，标签时间，细胞名称。

冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 铺板和细胞计数

用传代方法制成细胞悬液。倒掉培养基，用PBS液洗涤后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培养液吹打制成待测细胞悬液转至离心管，封上封口膜，离心1000r/min,5min。

等待离心其间，取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，将盖玻片盖在细胞计数槽上，使覆盖细胞计数板上的上下两个“十字”区域。取一只新的15ml离心管，做好标记，摆放好。离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，加入全培养液吹散沉淀细胞成细胞悬液，拧紧管盖，上下颠倒混匀。用枪吹打混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取1ml细胞悬液移入新的15ml离心管，加入4ml完全培养液，即稀释五倍，吹打混匀细胞悬液，上下颠倒混匀细胞悬液。

上下颠倒混匀新15ml离心管内细胞悬液，计数前将待测液吹打均匀，用微量枪从新15ml离心管中取出细胞悬液（约10μl），滴入计数板上盖玻片的一侧缝隙旁，虹吸作用液体会吸入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数，注意滴入悬液量不能太大致使细胞悬液流入旁边的槽中），镜下观察细胞，数出计数板四角大方格中的细胞数（16个小格×4个大格），用计数器计数（约200个）

细胞数 万个/mL原液=（4大方格细胞数之和/4）×稀释倍数（常稀释5倍，若细胞过多不能数清则加大稀释倍数，不断调整新离心管中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。）每皿/瓶需铺板50-100万个细胞，根据细胞计数算出每皿所细胞悬液需毫升数，加入悬液时注意混匀，不得有气泡，吸时注意每次枪尖是否都吸满液体。每皿加入细胞悬液后，用含血清培养基补足至2ml/皿/瓶。24h后观察细胞长至八成满时即可加药处理。

6检验判断细胞状态与加药处理

细胞复苏或传代后24内不可传代，传代4小时后开始贴壁。1>培养基颜色澄清度：

正常生长的细胞培养基澄清透明，倾斜使培养基聚集，对着灯看可透光，若出现丝状沉淀或倾斜培养基对着灯看出现浑浊不透光且镜下细胞之外的部分有密密麻麻的小黑点，很可能是染菌，应弃掉。若镜检在细胞之外部分有一些浑浊，可能因为细胞代谢旺盛分泌物堆积，或者因为消化时间不够以至于过度强硬吹打细胞，造成细胞损伤产生大量细胞碎片，应换液。

新鲜培养基呈粉红色，代谢代谢旺盛的细胞的培养基会变黄，此时若细胞贴壁应换液，若此时细胞已长满，应传代。2>密度：

细胞密度过低，镜下观察稀稀疏疏，则生长缓慢，甚至死亡。较大的细胞密度可促进细胞之间相互作用，促进细胞增殖生长。密度过大，密密麻麻，部分细胞不能伸展成圆形，必须传代，此时不传代，一两天后细胞状态持续不好，开始死亡，镜检漂浮细胞增多。3>状态：

镜下观察细胞，当左右上下移动镜头时漂动的是未贴壁细胞或死细胞，固定不动的是贴壁细胞，贴壁细胞是活细胞。

状态良好的贴壁SY5Y细胞有圆形的胞体和细细分支的突触，突触分明。状态不好的SY5Y细胞，突触不明显，看不到什么细细的分支，甚至成圆形。

消化时快离壁的细胞呈亮亮的圆形。

加药前应提前计算好药品浓度体积，根据实验处理要求的浓度换算出每皿应加药品稀释液体积和无血清培养基体积，列成表格以备加药时明确操作。将药品储备液稀释成稀释液，再与相应体积的无血清培养基在离心管中混合好。加COS时，倒掉含血清培养基，PBS荡洗一遍，加以混合好的药品。加COS 3小时后加Ab，Ab须提前37度水浴5小时，加药时采用半数放液法，弃去1ml原培养基，加入1ml已混合好的药品。

第三篇：细胞培养技术总结

血清使用问题的总结

一、血清灭活问题。

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗？ 答：不是必须的，看做什么实验了。

2、问：四季青胎牛血清灭活是56℃30分钟吗？

答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

3、问：我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗？

答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。

4、问：我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体，是不是会影响转染？我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗？细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么？

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。

5、问：(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗？有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有关系吗？

答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80℃，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

你可以摸索一下，血清从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

问：(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗？ 答：正常。

二、血清灭活时温度问题。

1、问：因为实验室水浴锅失控，血清灭活时，温度到了61.7℃，这血清还能用吗？

答：多长时间啊？短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时，还照样用。

2、问：我灭活胎牛血清时，用的电磁炉，定在了70℃，本来说调温度到56℃再放血清的，后来忘了，就把血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了，不知道这样对血清有没有影响？

答：常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不大，要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，此外，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

三、血清的制备方法问题。

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备过程？

答：自己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话，用静置析出方法就行。

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活，我想用大鼠的血，不知道要不要灭活？

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心，取上清，在无菌过滤，也可灭活，然后分装冻存，用时再配。

3、问：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤？

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。灭活一般不会对血清中的一些因子损伤的。

四、血清的保存问题。

1、问：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月还能用吗？ 答：只有试试了，如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以，先少用点看看。养细胞系应该没问题，原代不行。

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室温下一晚行吗？100毫升培养瓶加多少培养基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用？相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝试。

答：需要长期保存的胎牛血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1个月。

五、FBS可否代替人AB型血清？

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清，但是我觉得很多代理商都没有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类，但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)。但是我又不能够TRY。因为细胞因子确实太贵了，所以咨询一下。谢谢！答：你最好照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂)。细胞培养的影响因素很多，特别是培养基的成分。

六、血清和培养基的种类及品牌问题。

1、问：细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢？周围有人用PAA或Hyclone的，这两种跟Gibco或sigma出品的差别大吗？ 答：如果是长得非常快得细胞如pa317，293，c6等恶性肿瘤细胞，一般得国产血清就可以，如果是原代培养的细胞，最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清，Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季青和甘肃民海(中美和资)不错。有些细胞(如：sf9，293还有其他一些元代细胞)，用Gibco的比其他两种好很多，会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的还要看产地。

2、问：最近要订一瓶胎牛血清，实验室之前都在用小牛血清，没有买过胎牛血清。请问哪个公司的好一些？问过试剂公司，有两种：一种是PAA的(分普通级和优级)，一种是Hyclone的(只有普通级，而且是新西兰产的)。试剂公司推荐使用PAA优级的，但看好多文献都用Hyclone的，公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请问用的哪种胎牛血清比较好？

答：民海的效果还不错，要是不放心国产的，那就买进口的。进口的好多公司都有，新西兰产的效果一般。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

3、问：四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别？培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些？ 答：用无支原体胎牛血清就可以啦。

4、问：SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清？ 答：我一直用GIBCO的1640，你可以买含HEPES的1*10L的包装，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。请查阅： www.xiexiebang.com

七、培养基血清浓度问题。

问：在1640里加血清时加多了，90ml里加了20ml血清，约为18%，以前都是加10ml的，查了网上多建议用10%-15%，有关系吗？

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大，建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好，但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

八、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可以，效果是否有保证？这样确实能节省不少血清的。答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。10%的FBS完全培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问：我胰酶的用量是0.08%，并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊，难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗，还有，我的BRDU只用到48小时就不用了，因为担心其损伤太大，可以持续用多久呢？

答：我用10%FBS终止的，然后差速1h，然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu，心肌细胞还是比较多和稳定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就会有搏动。

九、牛血清污染噬菌体的问题。

1、问：有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染，以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够除去噬菌体？

2、问：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌体，它对细胞培养到底有什么影响？ 暂无回答。

十、问：MTT加药的时候加不加血清？加药时要用无血清的培养基吗？ 答：我的药就是用含血清的培养基稀释的，不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用，无形中对细胞造了一个serum-free的模型，细胞在提内本来就是有血清供应，如果该药物都不能对抗，那该药物就没有什么临床价值了，这是我的理解。

十一、AB血清的制备问题。

问：本人想从人的外周血中分离AB血清的，用于B淋巴细胞的培养。谢谢大家给点建议。人的血，来之不易啊。答：是AB血型人的血清吗？这种血清即没有抗A型抗原抗体，也没有抗B型抗原抗体。分离血清时将采集的血液注入试管中，待血液凝固后离心分离血清。可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固，减少凝固时间。离心可在2500～3000rpm，10min，足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可。分离血清的量可按采集血液的50%左右计算，因为红细胞占总血液的50%左右。当然整个过程要注意无菌操作。

十二、PC12细胞培养所用血清问题。

问：我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞，需要灭活的马血清，可现在买血清很困难，好像是海关有封锁，代理商这么说的，我原定购买的Gibco的horse surum，现在无法买到了，好容易找到一个目前可以进血清的公司Hyclone，有一种Donor Equine serum是马血清吗？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是这个。我当时是在鼎国(重庆办事处)买的，100ml大概140元，具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜。另外：我买了以后灭活的。

十三、血清或培养基产生了颜色或沉淀的问题：

1、问：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分钟灭活后出现了白色少量絮状沉淀，是不是污染？还能不能再用？血清的生产日期是2006年7月(现在是2007年6月11日)。

答：应该问题不大。你可以取少量血清放入培养皿中，37℃过夜培养看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

2、问：我用MTT法测细胞的增殖，用DMSO裂解细胞，发现把DMSO加入到孔中就会形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培养基，由于没有离板子的离心机，所以没有去除培养基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培养基没有看到有这种情况。该怎么解决？

答：为什么要用离心机离心呢？难倒你养的是悬浮细胞吗？如果是贴壁细胞的话直接将MTT倒掉，再加DMSO即可，我们就是这么做的，效果很好！并且测细胞的增殖的话如果不去掉MTT就加DMSO的话误差应该很大！有时不一定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的时间或以及其他成分有关！

3、问：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解冻后没有混匀直接分装，结果使得前面的几管是清亮的，后面就带有棕色的，不知有没有影响？估计有什么影响？前面的成分好还是棕色的成分好啊？

答：肯定有。最好还是重新混合重新分装，我觉得有效成分会集中在棕颜色部分。

问：(2)为什么会出现棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因为红蛋白的含量高些的缘故吧。问：(3)血清灭活之后可以存放吗？我的是前天灭活的，但是没有加到培养基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用吗？还是再次灭活啊？ 答：当然可以，如果多的话，分装后最好放在－20℃，下次用时再解冻，也不用再灭活。最好用一管拿一管，少许血清可以放在4℃。分装时还要注意不要装得太满，以免溢出污染。

十四、问：悬浮细胞培养时能否加血清？如果加了会有什么结果？为什么悬浮细胞培养时就不能加血清？

答：血清是细胞培养基中重要的培养成份之一，对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时，我们通常会加入10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。一般说来，牛血清包括以下成分：生长因子(如激素，白细胞介素等)，他们可以促进细胞生长；贴附因子，他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培养的细胞除外)；蛋白质(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作为营养物质，又可以中止胰酶的作用；还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。因此，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，血清是必不可少的。除非因实验要求无血清培养时，例如：为使细胞同步化时，我们会采用无血清培养的。单纯的说悬浮细胞培养不能加血清就没有太多的道理了。

十五、Gibico的胎牛血清内是否含糖？

问：我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖对我实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问，回答我糖浓度少于5μg/ml，因此基本可认为是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科，结果却是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。难道是检测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗？(另起茶水验尿事件？)检验科没有给我回答。答：应该是不含糖的。请参照gibco的网站：http://www.xiexiebang.com/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差，我想可能是样本不一样，需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

十六、关于中和消化液需要的血清量。

问：用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和。具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少？

答：做了很久的试验，真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来，这个应该也没有固定的比值。血清的品种都是不同的，成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系？我们消化细胞的时候，如果是传代，细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培，这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养，我一般都使用全培进行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2，一般我养细胞的时候，会用国产的比较便宜的血清配制全培，专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧，再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉，血清便宜，离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点，仅供参考。

十七、血清中的悬浮物问题。

1、问：发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点，培养液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以为是胶原虫。本打算换液，换液前特意看了下前些天配的培养液，肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多)，于是放在镜下观察，新鲜培养液中有一些悬浮的小颗粒，不多。(培养液是R1640+20%牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的小牛血清拿出观察，肉眼可见5、6个白色小小球状的物质，在血清瓶稍靠下的部位悬浮。镜下观察，也有少量的不知什么物质的东西漂浮。小牛血清是Hyclone新西兰的，标签上写已经经过2μm滤膜过滤处理。根据上述培养液的情况，是否说明培养液已被污染？如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物，哪怕是极少量的？根据上述血清的描述，是不是说明血清也存在问题，还能用吗？补充：细胞培养以来生长状态就不好。买血清的时候厂家说明不用灭活，所以未灭活。

答：(1)血清应该-20℃保存，解冻血清时，请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物。(2)血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白在血清解冻后，也会存在于血清中，亦可造成沉淀物。(3)若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清，再放回冷冻，若存放于4℃时，请勿超过一个月，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(5)排出了血清的原因，在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见，如果细胞死的太多，影响较大建议更换培养液。

2、问：今天在配培养液时，发现血清里面有小碎片样的漂浮物，血清仍然清亮，不浑浊。不知道是什么，问了实验室的学长，说仍然可以用，但还是不放心，没有用血清。求助园子的各位达人，这可能是血清出了什么问题？我的血清用了一个月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培养液配置时Votex不够，当时是清亮的，但过一段时间会析出来；(2)真菌污染。

十八、污染和过滤的问题。

1、问：怀疑血清染菌，想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤？对血清性质有多大影响？有做过的么？

答：可以过滤的，血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌。想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦，只要放置于37℃过夜就可以了，如果有微生物污染会变浑浊的，如果还是澄清的就说明没有问题的。实验室中血清很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤，一般而言如果制备1-2瓶培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清。如果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中，使用0.22微米的大滤膜一起过滤。

2、问：我怀疑我用的完全1640培养液被污染了，准备重新过滤消毒，过滤后是否需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：完全1640培养液被污染了，如果是支原体的话，过滤没有作用，支原体可以通过滤膜。我们用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分装100-200ml，现用现配因为血清比1640要贵，如果你想过滤的话，建议你加原比例血清，因为血清不会很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因。

3、问：加好了血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗？ 答：建议不要用了。在加了双抗的情况下已经污染，那么细菌污染的可能性会较小了。一般的过滤除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问：我准备把使用的完全1640培养液重新过滤一遍，不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜，过滤后是否还需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：可以透过，但是随着液体量的增多会很慢，如果不加压会比较麻烦，还有最好用低蛋白吸附的，不然损失是比较大的。

十九、更换无血清培养基后细胞大量死亡的问题。

问：我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞，在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的，转染效率也可以接受。但是寒假一回来就发生了怪事：细胞在有血清的培养基中长的好好的，一换无血清的培养基就死亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来。但是原来我换无血清培养基，就算放那里10个小时都是没问题的啊。已经换了不同批次的培养基，甚至吸管什么的都换过了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺，或者重新配液，转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境，建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂质体的毒性很大，如果有质粒参与对细胞损伤更大，如果Lipofectamine2000在常温放置过，对细胞更大，假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度，湿度。

二十、完全培养液的相关定义。

问：“完全培养液一词”，是指加了血清的培养液吗？我在做含药血清的实验，涉及到血清添加量的问题。所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答：原液是指配置后过滤除菌。不完全培养液是指不含有血清的原液，其他成分已补充。完全培养液是指不完全培养液加入血清后称完全培养液。二

十一、血清相关知识总结。使用胎牛血清的注意事项：

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里常会遇到的问题，仅供大家参考：

1、保存血清最好的方法： 建议血清应保存在-5℃ 至-2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损：

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、何谓热灭活：

一般是以 56℃，30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有 : 溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于胎牛血清的灭活： 有必要做热灭活吗？ 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！

6、血清相关知识： 如何避免沉淀物的产生？

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作 :(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

第四篇：HSC-T6细胞培养及鉴定实验报告

HSC-T6大鼠肝星状细胞培养及鉴定实验报告

前言

肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的名称有多种多样，如肝贮脂细胞（fat-storing cell，FSC）、脂细胞（1ipocyte）、维生素A贮存细胞（vitamin A-storing cell）、窦周细胞（perisinusoidal cell）、Ito细胞等。HSC位于Disse间隙内，紧贴着肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SEC）和肝细胞。其形态不规则，胞体呈圆形或不规则形，常伸出数个星状胞突包绕着肝血窦。此外，HSC还伸出胞突与肝细胞、邻近的星状细胞相接触。HSC胞质内有1～14个直径约1.0～2.0μm的富含维生素A和甘油三酯的脂滴，胞浆中有丰富的游离核糖体、粗面内质网及发达的高尔基复合体。胞核形态不规则，由于脂滴的挤压，常致细胞核有一个或多个凹陷，核内可见1～2个核仁。正常肝脏中HSC的数目很少，只占肝细胞总体数目的5%～8%及总体体积的1.4%，但HSC的立体分布和伸展足以覆盖整个肝窦微循环。

正常情况下HSC表现为富含Vitamin A脂滴的静止型，其功能主要有：

（1）代谢和贮存Vitamin A：肝脏储存有体内80%左右的维生素A，对体内维生素A的代谢起着重要作用。视黄醛在小肠内酯化后被运输到肝脏并与特异的视黄醛结合蛋白结合，然后转运到邻近的HSC储存。

（2）储存脂肪：正常HSC胞质内的脂滴含有大量的甘油三酯，为肝细胞提供能源。（3）合成和分泌胶原及糖蛋白、蛋白多糖等基质成分。目前的研究认为，HSC是正常及纤维化肝脏中细胞外基质（extra cellular matrix，ECM）的主要合成细胞。正常肝脏中HSC合成的胶原以Ⅰ型、Ⅲ和Ⅳ型为主，其合成量是肝细胞的10倍、内皮细胞的20倍以上。HSC还能合成纤维连接蛋白、层连蛋白和粗纤维调理素等糖蛋白成分，以及硫酸皮素、硫酸软骨素和透明质酸等蛋白多糖。

（4）合成基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase, MMP）及其组织抑制剂（tissue inhibitor of metallo proteinase，TIMP）:正常情况下，HSC能分泌多种胶原酶和基质降解蛋白酶如基质金属蛋白酶MMP-

1、MMP-2等以降解各种细胞外基质，同时分泌组织金属蛋白酶抑制剂TIMP-1防止胶原过度降解，使肝脏ECM的合成和分解处在一个动态平衡中。

（5）表达细胞因子及受体：正常情况下，HSC可以分泌肝细胞生长因子（HGF），参与肝细胞再生的调控。此外，HSC还能表达少量的转化生长因子（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板衍生的生长因子（Platelet derived growth factor，PDGF）和胰岛素样生长因子（IGF）等，同时HSC能表达TGF-β1的II、III型受体和PDGF受体的α亚单位等。

（6）参与肝窦血流调节：HSC伸出胞突包绕着肝窦，通过其纤长突起的收缩功能调节肝窦内微循环，从而影响着肝脏的血流分布和门静脉压力。

一、材料与方法

1.实验材料

1.1实验材料

大鼠肝星状细胞株HSC-T6购自与中国科学院上海细胞所。

1.2主要仪器

CO2细胞培养箱：上海力康仪器有限公司 Smart Cell HF-90 生物安全柜：上海力康仪器有限公司 HF1200LC 台式高速冷冻离心机：上海力康仪器有限公司 Neofuge 15R 台式低速离心机：上海飞鸽仪器有限公司 TGL-16GB 荧光倒置显微镜：日本尼康公司 Eclipse TS100-F 显微镜：日本尼康公司 E200 病理图文分析系统（工作站）：上海千屏公司 恒温水浴锅：上海精宏仪器厂 DK-80 液氮罐：成都金凤仪器厂 YDS-50-125-20℃低温冰箱：合肥美菱公司 DW-HL388 单子分析天平（0.01mg）：德国梅特勒 AB304-S 手动单道移液器：德国Eppendorf公司 Research plus

1.3主要试剂 名称

PBS磷酸盐缓冲液粉剂 胎牛血清 DMEM培养基 0.25%胰酶

货号/批号

PBS0060, Lot#13061706 16000044，Lot#1183723 C11995599BT，Lot#8113238 25200056，Lot#1268598

厂家

福州迈新生物技术开发有限公司 美国Life technologies公司 美国Life technologies公司 美国Life technologies公司 美国Hyclone公司 美国Santa Cruz公司 青霉素-链霉素双抗（10000U）SC30010，Lot#J130071 小鼠抗a-SMA单克隆抗体

小鼠两步法免疫组化试剂盒 浓缩型DAB试剂盒 FITC标记山羊抗小鼠二抗 油红O染色试剂盒 苏木素染液 油酸 中性树胶

KIT9902，Lot#1301319902 DAB0031，Lot#1307290031 D027

20120702

福州迈新生物技术开发有限公司 福州迈新生物技术开发有限公司 北京中衫金桥有限公司 南京建成生物工程有限公司 福州迈新生物技术开发有限公司 西安化学试剂厂 中国上海标本模型厂

2.实验方法

2.1试剂配制及抗体稀释

10%血清完全培养基：10ml的胎牛血清加入90ml的DMEM培养基中，添加1ml的青-链霉素双抗溶液。

0.2mM的油酸完全培养基：1ml的20mM的油酸加入99ml的完全培养基中。a-SMA抗体工作液：a-SMA一抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。FITC标记的山羊抗小鼠二抗工作液：FITC标记的山羊抗小鼠二抗（200μg/ml）取20μl加入到980μl的PBS中。

20%DMSO细胞冻存液：2ml的DMSO溶液加入8ml的完全培养基中。

油红O染液：油红O储存液与双蒸水以3:2的比例混合，并用滤纸进行过滤，使用前2h内配制。

2.2 HSC-T6细胞培养基本操作方法

细胞传代：观察培养瓶（25cm）中细胞贴壁融合达90%时，即可进行细胞的传代，操作步骤如下。开启生物安全柜紫外消毒30min，以75%乙醇擦拭台面灭菌，并预先准备3个细胞培养瓶（25cm）、15ml离心管、无菌过滤的PBS、0.25%胰酶溶液、完全培养基，取出长满细胞的培养瓶，倒空瓶中的培养基，加入2ml过滤灭菌的PBS缓冲液反复冲洗2遍，倒空PBS缓冲液，每瓶中加入1ml的0.25%的胰酶溶液，使胰酶溶液平铺在细胞层面上，缓缓摇动细胞培养瓶，待细胞70%脱落时加入1ml的完全培养基终止胰酶的消化作用，并用吸头反复冲洗培养瓶底将未脱落的细胞冲洗下来，转移液体至15ml的离心管中，1800r/min离心5min，小心吸弃离心管中的液体，并用1ml的完全培养基重悬沉淀的细胞，倒置显微镜下观察细胞调整合适的细胞密度接种到培养瓶中,37℃，饱和湿度，5%CO2细胞培养箱中培养，6h后持续观察细胞贴壁状态，待细胞达到50%～70%贴壁融合时倒空瓶中培养基，重新加入5ml的22含0.2mM油酸的完全培养基，继续培养。

细胞冻存：消化、离心、重悬步骤同细胞传代，取1ml的细胞重悬液，加入1ml的20%DMSO的细胞冻存液颠倒混匀，并移至2ml的冻存管中，冻存管中细胞经4℃（20min）、-20℃（20min）的程序降温后，转移至液氮中冻存。

细胞复苏：从液氮中取出冻存的细胞，立刻置于37℃水浴中快速晃动冻存管使细胞快速解冻，倒置显微镜下观察细胞密度并接种到培养瓶中，37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养。

2.3 HSC-T6细胞a-SMA免疫组化染色

细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，待细胞达到50%贴壁融合时，进行a-SMA免疫组化实验，步骤如下：

2.3.1 细胞固定：培养皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和甲醇，置于-20℃进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.3.2细胞通透化：

培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室温放置20min后弃去通透液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.3.3封闭

用免疫组化笔在培养皿中划圈，并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min，然后取出PBS漂洗3次，每次5min。2.3.4一抗孵育

培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50μL，4℃孵育过夜，经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5min。2.3.5二抗孵育

培养皿中滴加Elivision试剂盒中的增强剂1滴（大约50μL），并于室温孵育20min，PBS漂洗3次，每次3min，然后每张组织切片滴加Elivision试剂盒中的二抗1滴（大约50μL），37℃孵育30min，PBS漂洗3次，每次3min。2.3.6 DAB显色

培养皿中滴加新鲜配制的DAB溶液50μL，室温孵育10min，显微镜下观察有细胞中有明显的棕黄色颗粒状沉淀时，立刻将组织切片放入自来水中漂洗以终止反应。2.3.7苏木素复染

苏木素复染3min，自来水冲洗使培养皿中的细胞核返蓝。2.3.8封片

培养皿中滴加甘油，并以盖玻片封片。2.3.9观察拍片

在正置光学显微镜下观察HSC-T6细胞胞浆中alpha平滑肌激动蛋白染色，并于40倍、100倍、200倍下拍照。

2.4 HSC-T6细胞a-SMA细胞免疫荧光

细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，待细胞达到50%贴壁融合时，进行a-SMA细胞免疫荧光实验，步骤如下：

2.4.1 细胞固定：培养皿中加入1ml 1:1的冷的丙酮和异丙醇，置于-20℃进行细胞固定，20min后弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.4.2细胞通透化：

培养皿中加入1ml的0.2%曲拉通100溶液，室温放置20min后弃去通透液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.4.3封闭

用免疫组化笔在培养皿中划圈，并在圈中滴加山羊血清50μL 37℃孵育20min，然后取出PBS漂洗3次，每次5min。2.4.4一抗孵育

培养皿中滴加稀释后的小鼠抗a-SMA单克隆抗体50μL，4℃孵育过夜，经过夜孵育后取出用PBS漂洗3次，每次5min。2.4.5二抗孵育

培养皿中滴加50μL稀释后的FITC标记的山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min。2.4.6观察拍片

设置荧光倒置显微镜激发波长为488nm，观察细胞alpha-平滑肌肌动蛋白荧光显色，并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。

2.5 HSC-T6细胞油红O染色

细胞接种于直径33mm的细胞培养皿中，并以含0.2mM油酸的完全培养基进行干预，使

细胞富集脂肪滴，细胞待细胞达到50%贴壁融合时，进行油红O染色实验，步骤如下： 2.5.1 细胞固定：培养皿中加入4%多聚甲醛溶液，室温固定30min，弃固定液，用PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.5.2油红O染色：

培养皿中加入1ml新鲜配制的油红O染液，室温放置10min后弃去染液，PBS反复漂洗3遍，每次5min。2.5.3苏木素复染

培养皿中加入1ml苏木素染液室温染色30s，弃去苏木素染液，以双蒸水漂洗3遍，每次5min，加入1ml的自来水反蓝。2.5.4封片

培养皿中滴加一滴甘油并以盖玻片封片。2.5.5观察拍片

正置光学显微镜下观察肝星状细胞胞浆中红色脂肪滴染色，并在100倍、200倍、400倍视野下拍照。

2.6 HSC-T6细胞Vitamin A脂滴荧光观察

设置荧光倒置显微镜激发波长为328nm，观察培养的HSC-T6细胞胞浆中Vitamin A脂滴荧光。

二、结果与分析

1.HSC-T6细胞培养传代的形态学特征基本情况

HSC-T6细胞株培养5-8代时能观察到细胞较大，呈多边形、多核，且胞浆富含脂滴及Vitamin A形态（见图1），8代以后继续培养HSC-T6细胞表现为肌成纤维样细胞的形态学特征，即HSC-T6贴壁后即开始伸展，胞体增大呈不规则的多边形，并伸出许多伪足与其他HSC-T6细胞相连形成片状（见图2）。HSC-T6细胞大量增殖，细胞密度变大后，细胞形态变小，略呈梭形的多边形，且有伪足与相邻细胞相连，在培养表面均匀的分布(见图3)。

A

B

C

D

图1 5-8代HSC-T6细胞形态特征

A、B：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，100×； B、C：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200×

（箭头所标示处为多核的HSC-T6细胞）

A

B

C

D

图2 8代后HSC-T6细胞形态特征

A、B：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，100×； B、C：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200×

（箭头所标示处为多核的HSC-T6细胞）

A

B

C

D

图3 HSC-T6细胞密度加大时形态特征

A、B：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，100×； B、C：荧光倒置显微镜下，HSC-T6形态，200×

2.HSC-T6细胞鉴定

2.1 HSC-T6细胞脂肪滴油红O染色

含0.2mM的油酸的完全培养基使HSC-T6细胞富集脂滴，并用油红O染液染色，光学正置显微镜下观察胞核呈蓝色，胞浆中有点状红色，为脂滴着色（见图4）。

图4 HSC-T6细胞脂滴的油红O染色 400×

2.2 HSC-T6细胞Vitamin A脂滴紫外激发的自发荧光

HSC-T6细胞中的脂滴在328nm紫外波长的激发光下发出极易淬灭的蓝绿色荧光（见图5）。

图5 HSC-T6细胞Vitamin A脂滴328nm紫外激发荧光 200× A、B：暗场Vitamin A脂滴荧光； C、D叠加场Vitamin A脂滴荧光

2.3 HSC-T6细胞a-SMA免疫组化

HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，细胞爬片显示HSC-T6细胞胞浆均可见棕黄色颗粒状沉淀，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫组化染色为阳性。

A B C D 图6 HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色（A：100×； B、C、D：400×）

2.4 HSC-T6细胞a-SMA免疫荧光

HSC-T6细胞株为激活的肝星状细胞，a-SMA免疫荧光显示HSC-T6细胞胞浆均可见FITC的激发的绿色荧光，alpha-平滑肌肌动蛋白免疫荧光为阳性。

A1 A2 B1 B2 C1 C2

D1

图6 HSC-T6细胞a-sma免疫组化染色

D2（A1、B1、C1：荧光倒置显微镜下明场观察 200×；A2、B2、C2：荧光倒置显微镜下490nm激发，荧光观察200×；D1荧光倒置显微镜下明场观察 400×；C2：荧光倒置显微镜下490nm激发，荧光观察400×）

第五篇：实验总结-细胞培养方法

一、培养细胞常用配置

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超净工作台常规配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏 步骤：

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。

7.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8.将培养瓶放入培养箱内培养

注意事项：

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。

5.冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液

6.复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

8.原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

三、培养液的更换

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸 5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。6.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7.将培养瓶放入培养箱内培养

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。

四、细胞传代

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。

5.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。8.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿内吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。

9.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

10.将培养瓶放入培养箱内培养。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。

五、细胞株的保存

原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

实验步骤：

选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

5.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。6.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min 8.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定数量备用 9.弃去培养基，用冻存液进行重悬混匀后，将1ml含有细胞的冻存液移入冻存管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。

10.将培养基，胰酶瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8.将冻存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱内3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌内长期保存。或直接放入梯度降温盒内，放入-80℃冰箱内过夜后最后存放于液氮罐内。（梯度降温盒内为甲醇，使用5次需要更换，每次使用需做好标记，使用前需恢复常温）

六、细胞转染

RNA干扰（RNA interference, RNAi）:  是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常录;

 PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。

作用机制

1)其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

4)siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

5)RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

脂质体转染原理：

1.脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体 2.阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达

DNA转染步骤

1.转染前一天接种细胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到90-95%每孔。

2.转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。

4.B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5.B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6.将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7.孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8.第二天看细胞状态来决定是否换液。9.同时设立细胞对照组，空白转染组。

siRNA转染步骤

1)转染前一天接种细胞于6孔板（40x104），2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到50-60%每孔。

2)转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。（siRNA按照说明书稀释）4)B液：脂质体（RNAimax）使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5)B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6)将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7)孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8)第二天看细胞状态来决定是否换液。9)同时设立细胞对照组，空白转染组。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上进行转染实验

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀释液，取附赠的DEPC水至管内，打开离心管前先离心，将附在管壁上的冻干粉离心下来 2)溶解时滴加适量的DEPC水后盖上管盖，震荡溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分别标记GAPDH，NC，NV-FAM，三个片段名称，从管内吸取20ul的稀释液分装后

4)将稀释液至于-80度冰箱保存。

 转染前一天，在6孔板上接种40x104AGS cell，再取一个35mm培养皿接种40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生长培养基。使细胞在转染的时候有50-60%的融合率

 从细胞中除去生长培养基

 每个孔中加入1.5ml新鲜不含血清的培养基，并准备如下混合物 1)A液：(取7个EP管，分别标记空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三个片段)。在250ul的opti-mem终加入100pmol siRNA（稀释好的siRNA浓度为20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均匀

2)B液：（取一个EP管标记RNAiMAX），RNAiMAX 使用前摇匀，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀释RNAiMAX混匀后并在室温下温育5min 3)混合A液和B液，混匀B液后吸取256ul至A液中室温下温育20min  将混合物混匀后加入到含AGS的6孔板与35mm培养皿中，每孔终体积为2ml，则加入混合液500ul，并轻摇混匀  在37℃的二氧化碳培养箱中培养5-6小时  更换含血清的培养基并培养细胞24-48小时 24-48小时后收细胞跑WB，看沉默效果