生物专业发酵工艺学总结

第一篇：生物专业发酵工艺学总结

名词解释：

1.（生产酒精）辅助原料：不直接用于酒精生产，制造糖化剂或补充氮源

3.排乏汽：在间歇蒸煮过程中，每隔一段时间将锅内气体放出一部分，此过程叫排乏气。为保证醪液受热均匀和高的蒸煮质量，要进行剧烈和彻底的搅拌，同时，排出一些有害气体。

4.糖化：用淀粉质原料生产酒精时，在酒精发酵前，要将淀粉全部或部分转变成可发酵性糖，这过程叫糖化。5.糖化剂：促使淀粉转化成糖的生物催化剂。

6.液体曲：讲曲霉菌在液体培养基中进行通风培养，使它生长和产酶得到含酶培养液叫液体曲。

7.糖化率（％）=还原糖／总糖×100％

8.酒化酶：参与G→C2H5OH+CO2的反应的所有酶和辅酶的总称。包括己糖磷酸化酶，烯醇化酶，脱羧酶，氧化还原酶，及磷酸化酶。10.蒸馏：利用液体混合物中挥发性不同而分离组分的方法。粗馏：将发酵成熟醪中挥发性物质与非挥发性物质分离的过程。精馏：将粗酒精进一步除杂和提纯的过程，也就是将酒精与其他挥发性物质分离的过程。

11.大曲：是酿制大曲酒的糖化发酵剂，在制曲过程中让自然界中的各种微生物富集到淀粉原料制成的曲胚上，经过人工培养形成各种有益的酿酒微生物菌系和酶系，再经过风干储存成为成品大曲。12.酒醅：已经发酵好的原料，也叫香醅，含有一定量的酒精与香味物质。13.醅（醅子）：固态发酵法白酒生产中蒸完酒的酒醅 14.甑（甑桶 甑锅）：固态酿造白酒间歇蒸馏的传统设备 15.渣子（米渣子）：在白酒生产过程中，粉碎后的原料 16.大渣：加入新原料多的酒醪或醅子 17.小渣：加入少量新原料的酒醅或醅子 18.回活（回糟）：不加新原料的醅子

19.排：从新原料投料到发酵结束，蒸酒这一个生产小周期叫一排。20.立渣：新建的窖池第一次投产发酵叫做立渣。

21.麸曲酒：以高粱；薯干；玉米为原料，以麸曲为糖化剂，以纯种培养的酵母为发酵剂，生产的蒸馏酒。

24.啤酒：以大麦为主要原料，以淀粉质的谷类为辅助料，加入适量的酒花，生产出含有Co2，具有泡的，具有酒花香味和爽口的苦味，营养丰富，风味独特的酿造酒

27.酒花油：多种芳香物质的总称，浅黄色油状液体，蒸馏后黄色油状物

28.浸麦度：经过制麦之后大麦的含水率。=大麦吸收水量+大麦原水量/浸后大麦重量*100%。

29.溶解：指麦粒中胚乳结构发生的化学和物理性质的变化

30.麦芽的溶解：在发芽过程中，随着E的逐步形成，蛋白E作用于细胞间的Pr，半纤维素E作用于胚乳细胞壁，使胚乳细胞壁成为网状结构，随后淀粉E，PrE进入细胞内进行一系列的水解反应，便胚乳细胞松软，这个过程称为麦芽的溶解 31.Pr的休止：糖化过程中Pr的分解过程

32.Pr的休止温度：糖化过程中Pr的分解温度

Pr的休止时间：糖化过程中Pr分解所需的时间。

33.煮出糖化法：利用生物与物理作用，使物料糊化，使物质分解和溶出。

34.发酵度：发酵过程中消耗浸出物浓度下降的百分率（可发酵型糖）。

35.啤酒澄清：指啤酒与所含的固体粒子分离的过程叫啤酒澄清。36.啤酒的稳定性：啤酒是多种成分不稳定的胶体aq，容易受外界因素的影响而发挥变质，啤酒抵抗外界因素的影响而保持酒质不变的能力叫啤酒的稳定性。

37.啤酒的非生物稳定性：啤酒排除物理化学因素的影响而保持酒质不变的能力。

38.啤酒的生物稳定性：啤酒不被杂菌污染或不残留酵母细胞，防止产酸和再发酵的能力，叫啤酒的生物稳定性。

39.糊化：温度升高60~80℃（α—淀粉酶作用）淀粉颗粒的体积膨胀至原体积50~100倍，淀粉分子间的联系减弱，引起淀粉颗粒的部分解体，形成了均一；粘稠的液体，淀粉颗粒结构从有规则的层状结构成网状结构。

40.液化：温度大于130℃，支链淀粉完全溶解，网状结构被彻底破坏或粘度较低的流动性醪液。

41粉碎比：粉碎前物料的最大直径与粉碎后物料的最大直径之比X=D/d。

42间歇蒸煮：从投料到成醪在一个容器内进行的操作叫间歇蒸煮。43回流比：R=回流量/产品量，最适R：3-4.44蒸馏酒：凡是用水果，乳糖，糖类，谷物等原料经过酵母菌发酵后，蒸馏得到无色透明的液体，再经陈酿和调制制成的透明的含酒精浓度大于20%的酒精性饮料。

45制麦：由原料大麦制成麦芽的过程，是啤酒生产的开始。46煮沸强度：每小时蒸发出水分的百分率。=混合麦汁数量-最终麦汁数量/混合麦汁数量*煮沸时间*100%。47发酵度：浸出物浓度下降的百分率。简答： 第一编 1.酒精生产的原料在工艺上的要求：凡是含有可发酵性糖或者可以转变为可发酵性糖的物质都可以作为酒精生产的原料。

原料：1.淀粉质原料（谷类、薯类、废糖蜜）2.糖质材料。3.纤维质材料 4.其他

常用原料的化学组成和作用：A.碳水化合物（淀粉、纤维素，蔗糖、麦芽糖，G/F）作用：1.提供微生物所需的碳源、氮源。2.生成酒精，含量增多酒精增多。B.蛋白质经过蛋白质酶水解成肽和氨基酸，被微生物利用。……（7页）常用原料淀粉质及特点（7页）2.酒精生产原料的清理目的：除去沙石，铁钉，杂草，绳头以防损伤机器，堵塞管路，泵，阀门，溢流管。3.酒精生产原料粉碎的目的：①原料中的淀粉是植物体内的贮备物质，受植物组织和细胞壁的保护，既不溶于水也不易和淀粉酶接触，通过粉碎增大物料表面积，提高热处理效益，有利于酶的作用；②粉末状的物料加水调浆后便宜流动输送。方法：1.干法粉碎：锤式粉碎机2.湿法粉碎

4.原料粉碎工艺的影响：粗粉碎的原料要采用快速加热的方法，细粉碎原料要采用缓慢加热的方法。

5.原料预热的目的：①植物组织和细胞在一定温度和压力下，吸水膨胀破裂，淀粉变成溶解的糊液，易于受酶的作用，水解成可发酵性糖；②杀死附着于原料表面的微生物，使糖化发酵在纯种情况下进行；要求：①质量均匀②灭菌要彻底③少生成有害物质④减少损失。要求：1.质量均匀 2.灭菌彻底 3.减少有效成分的损失 4.少生成有害物质

淀粉的溶解和膨胀：1.膨胀：淀粉是一种亲水性的胶体，遇到水后水分子在渗透压的作用下渗入淀粉颗粒内部，使淀粉分子体积和质量增加。水化阶段：吸水20%-25% 放热。膨胀节段：吸水是原来的几倍体积质量增加，吸热，淀粉链打开。2.糊化：温度70-80度，吸水量是原来的50-100倍。糊化使淀粉间的联系减弱，引起淀粉颗粒的部分解体，形成均一粘稠的液体—无限膨胀。3.液化：糊化后温度升高达到130度以上，支链淀粉几乎全部溶解，网状结构被彻底破坏，淀粉溶液变成粘度低的流动性醪液。水热处理中原料的变化（14页）

6.水热处理中糖分的变化：①己糖在高温情况下，产生5-羟甲基糠醛，继续反应生成有机酸和色素类物质；②戊糖脱水可以产生糠醛；③焦糖化反应：糖在接近熔化温度下加热形成褐红色无定形水解产物—焦糖，造成原料的损失，对酵母生长不利；④AA+低分子糖→类黑素影响糖分变化的因素：a.氨基糖反应的速度与还原糖的种类，反应的温度，浓度有关，温度高浓度高，反应速度快；b.果糖最容易焦化，高浓度糖容易教化，局部过热容易焦化，蒸煮的压力越高时间越长，焦糖越多。降低糖分损失的措施：a.在调降预热阶段尽量避开淀粉酶的最适作用温度50~60℃，；b.适当加大加水比；c.加强搅拌；d.采用低温短时间蒸煮工艺。7.排乏汽的作用：为保证醪液受热均匀和高的质量要进行剧烈和彻底搅拌同时排除一些有害气体（甲醇）。

8.与糖化有关的酶种类的特点：㈠淀粉酶⑴α-淀粉酶（液化酶；内切酶；淀粉-1,4-糊精酶；）作用方式：在淀粉链内部，任意切割α—1,4糖苷链，将淀粉长链迅速水解为短链以糊精和低聚糖，然后慢慢水解成G或果糖，使醪液粘度迅速下降，不能切割—α—1,6键及其附近的α—1,4键。①特点:a.耐热（90℃以上不失活）b.不耐酸c.使醪液粘度下降,产生液化现象.②应用:原料粘度大,醪液浓度高时可以加入该酶.⑵淀粉1,4—葡萄糖苷酶（糖化酶；外切酶）作用方式：从淀粉非还原性末端开始，每隔一个G单元切一次。作用于α—1,4键，也能作用于α—1,6键，或其附近的1,4键。（缓慢）⑶淀粉1,4—麦芽糖苷酶（β—淀粉酶）作用特点：从淀粉的非还原性末端开始，每隔两个G单位切一次，水解的产物主要是麦芽糖，不能水解α—1,6键，所以产物中一定有糊精。⑷界限糊精酶：专门水解α—1,6键。㈡转移葡萄糖苷酶G+G（E）→α—1,4麦芽糖（可发酵）/α—1,4异麦芽糖（不可发酵）；G+麦芽糖→α—1,4潘糖（不可发酵）㈢其他酶：①PrE：水解蛋白质→胨，肽，月示，AA。②磷酸脂酶：磷酸糊精→G+H3PO4。③单宁酶。4.果胶酶：理想糖化剂菌种：要求：含有较多糖化酶，液化酶的含量中等或略少，含有β—淀粉酶和界限糊精酶，一定量的PrE单宁酶，不含或少含转移葡萄糖苷酶，能够耐较高的酸度。9.影响曲霉的生长和产酶的因素： ㈠菌种本身的性能。（内因）

㈡培养基的组分（外因）1.碳源：是微生物生长的能源，是贮藏物质的原材料，是菌种细胞的骨架物质。种类：淀粉；糊精；低聚糖；G（F）；果糖酶活力顺序：淀粉>糊精>低聚糖>G>果糖 直接使用淀粉→工艺上培养曲霉菌的M不需要糖化，蒸煮或冷却直接接种原因：目的获得大量淀粉酶，是诱导酶，必须有底物存在时才能够大量产生，所以M不需要糖化。

2.N源：酶本身是一种特殊的蛋白质，所以氮源是构成或菌体和酶的主要成分。在一定范围内氮源含量越高，菌丝生长旺盛，E产量增加。①常用的氮源：1有机氮：豆饼，米糠，麸皮。2.无机氮：①NaNO3 NA+→NaOH+酸→中和，pH变化不大→对α—淀粉酶形成有利。②（NH4）2SO4酸度下降，PH上升对糖化酶的形成有利

C/N影响PH变化：C/N增高，ph下降，酸度增加 糖化酶增加，液化酶降低；C/N下降ph升高酸度下降，液化酶上升，糖化酶下

降。

3.无机盐

①功能：是菌体的组成分，可以调节渗透压ph值，氧化还原电位，作为酶的活性集合组成分，或者可以维持酶的活性。

4.水分：功能：在微生物代谢过程中，营养物质的输送和热量的排除。水分含量：液体曲：80-88%，固体曲：48-50%

（三）培养条件

1.空气：曲霉菌好氧微生物→供氧

①固体曲通风供氧除了曲霉菌呼吸所需要的氧气外还能够驱除菌体的代谢过程中产生的热量和CO2，有利于保持曲料的温度和湿度。②液体曲通风供氧是为了补充营养液中的溶解氧，供给曲霉菌呼吸，溶解氧充足，菌丝生长良好，酶活力高。2.pH：4~7.曲霉生长较好。pH值可以改变质膜和营养物质的渗透性，影响微生物的生命活动，还可以抑制杂菌，影响代谢产物的组成和酶系组成。3.温度：曲霉菌形成淀粉酶的温度比菌丝生长的最适温度要稍高，在工厂里，一直采用前期温度低，后期温度稍高的工艺。4.时间：固体曲20-80小时，液体曲：36-48小时 培养液体曲应注意的问题

1.留种不超过3-4代，留种关键：无菌 2.液体曲马上使用，若不马上使用，首先降温25度以下，保压可贮藏一周，期间酶活力变化不大，酸度略有提高。糖化工艺控制（27页）

10.糖化过程中物质变化：①淀粉：液化、糖化同时进行。②蛋白质：眎、胨、肽、氨基酸；蛋白酶最佳作用条件：PH 4.3～5.0。温度：47℃。③果胶质、半纤维素 传统工艺：水解；新工艺：不变化。④含磷物质：在磷酸酯酶的作用下，磷酸游离出来，温度57度，PH5.5-6.0⑤酸度的变化：糖化醪酸度》蒸煮醪酸度。原因：蛋白质水解→氨基酸。磷酸盐的分解。果胶酸分解产生果胶酸。11.酒精生产对酵母菌种的要求： ①要含有较强的酒化酶、发酵能力强而且要迅速；②繁殖速度要快；③具有较高的耐酒精能力，对本身代谢产物的稳定性高；④抵抗杂菌能力要强、耐酸能力强；⑤对培养基的适应性强；⑥生产性能稳定、变异性小；⑦发酵过程中产生的泡沫少。

（填空）12.酒精酵母的特性：①繁殖速度快。②对醪液浓度的要求：a在含5%（v/v）酒精的发酵醪中，发酵力减弱；b在含12%（v/v）酒发酵醪中，发酵力停止；c生产上，糖化醪浓度16~18Bx。③培养温度：25~30℃；发酵温度：30~33℃。④pH：4.0~6.0繁殖，pH＜3时，活力大大降低；酒母糖化醪PH：5.0—5.5，为了酵母繁殖，抑制杂菌，生产上PH：4.0—4.5.⑤需O2状态：有O2，能生长（TCA/繁殖）→CO2；H2O无O2，能生活（EMP/发酵）→乙醇；CO2。13.酒精酵母中的酶类：⑴酒化酶：参与G→C2H5OH+CO2的反应的所有酶和辅酶总称，包括己糖磷酸化酶，氧化还原酶，烯醇式酶，脱羧酶等，是胞内酶，只有cell健壮，酒化酶含量才高，发酵旺盛。

⑵水解酶：①蔗糖酶：（胞外酶）。②麦芽糖酶：（胞外酶）最适温度：40℃。③肝糖酶：（胞内酶）。

14.酒化醪的制作：a.原料的选择：玉米最好，N、C、无机盐、维生素含量丰富，酵母生长旺盛。瓜干：补加N源，若用不适用的原料，要采用混合原料。B.工艺流程：原料→粉碎→调浆→蒸煮→冷却→（加曲→）→糖化→加营养盐→调酸→杀菌→冷却→酒母糖化醪。C.工艺条件：①加水比：1:4~5，酵母菌适合低渗透状态下生长，12~14Bx。②加曲：高于生产20%。③糖化时间：3~4h，主要为了获得更多的低分子糖、低分子氮。④加营养盐：（只限于薯类）用量0.05~0.1%，发酵时用薯类不用加营养盐。⑤调酸：适于酵母菌生长，抑制杂菌，pH：4.0~4.5。⑥杀菌：温度不能太高85~90℃；30min。⑦冷却：到27-30℃，用来培养酵母菌。

15.复水活化的方法：首先复水活化液杀菌20min，酵母活化液比1：4，最大：1:20①水活化：水是灭菌后的水，38-40℃；14-20min；复水14-20min。原因：因为水没有营养，如果复水时间过长酵母会营养不良容易老化。②糖水活化：2%蔗糖水；10-50倍；38-40℃；15-30min；降温度；30-34℃；活化1-3小时（搅拌）③稀糖化醪活化：5-10倍；浓度4-5BX，38-40℃；复水15min 降温至31-33℃（＜34℃）活化1-3h，投入发酵罐。

16复水活化时应注意的问题：①复水活化时间一般不超过6h②活化后细胞数达到500亿个/g，活菌数》80%③压榨，烘干，烘干之前要加保护剂④复水活化的温度：开始：38-40℃后期：30-34℃ 17.酒精发酵的目的要求：目的：将可发酵糖转化为乙醇和二氧化碳。要求：用最少的原料生产出尽可能多的酒精产品，尽量减少发酵损失。①发酵前期，创造条件，酵母繁殖，占绝对优势②发酵中后期，创造厌氧条件，使酵母在无氧条件下发酵，产生酒精和二氧化碳③发酵过程中要保持糖化酶活力，使糖化醪中的糊化了的淀粉继续分解，产生可发酵性糖，保证后糖发酵顺利进行④要防止杂菌污染，避免因此造成损失⑤注意回收二氧化碳及夹带的酒精

发酵过程三个时期（前期发酵、主期发酵、后期发酵）的特点（36页）

18.酒精发酵副产物的生产：①甘油：生成途径A加入亚硫酸氢钠，大量积累甘油；把发酵醪液PH调到7.6，两分子乙醛发生歧化反应生成乙醇和乙酸。②杂醇油：生成途径A蛋白质水解产生氨基酸，氨基酸脱氨，脱羧产生杂醇油B酵母的代谢产生 ③琥珀酸：酵母代谢的必然产物，对发酵过程影响不大，不影响产品质量 ④

乳酸等有机酸的生成：乳酸就是由杂菌感染生成的 19.发酵工艺方法：（间歇发酵法）①一次加满法，优点：操作简便，便于管理：缺点：发酵的延迟期长；适用范围：锅与罐容积相等的酒精厂②分次添加法，优点：发酵要比第一种方法要旺盛，能够抑制杂菌，发酵迟缓期短；适用范围：锅小罐大的工厂③连续流加法，优点：发酵的迟缓期短，总发酵时间短；适用范围：连续蒸煮，连续糖化的工厂④分割主发酵法，优点：省去了酒母的制作，接入的酵母种子量大，发酵时间可以缩短 总满缸时间不超过8-10小时的原因：若超过8-10小时后加入的淀粉和糊精来不及彻底被转化糖进而生成酒精就到了预定的发酵时间造成发酵成熟醪液残糖高，使淀粉利用率低

6-8小时原因（流加速度快）流加过快（小于6小时）会造成发酵醪液中酵母细胞低，不易造成酵母群体优势，有可能污染杂菌流加过慢，能延长满缸时间，造成后加入糖化醪中淀粉和糖不能充分利用，导致可发酵性糖的损失2 蒸馏的基本原理：（41页）只答拉乌尔定律

20.回流目的：如果精馏塔没有回流，则蒸馏塔板上的酒精，由于不断蒸发而减少，塔板上的酒精浓度会下降，沸点会上升，虽然有进料来补充蒸出的酒精，但不足以维持各层塔板稳定的温度差和浓度差，精馏过程无法进行，酒精浓度难以保证，杂质难以清除。21.杂醇油的分离：①特点：是一元高沸点的混合物，主要包括异戊醇，异丁醇，正丙醇等，以异戊醇为代表，异戊醇占45~75﹪，在79~105℃区域内，在水中的溶解度小于3﹪，以任意比溶于乙醇溶液中，是棕黄色的油状物。②杂醇油在塔内的运动情况：在塔的下部，由于酒精浓度较低，异戊醇的挥发系数大于1，气相中异戊醇的浓度大于液相中异戊醇的浓度，所以异戊醇的运动方向向上。在塔的上部，酒精浓度大于55﹪，异戊醇的挥发系数小于1，液相中异戊醇的含量大于气相中异戊醇的含量，异戊醇的运动方向向下。当酒精浓度是55﹪时候，异戊醇的挥发系数接近1，这样就使得异戊醇聚集在酒精浓度是55﹪附近的塔板上。③杂醇油的提取：在实际生产中，塔的蒸汽压力很难达到均衡，塔内酒精的负荷有变动，且杂醇油本身是混合物，所以它集中分布在几层塔板上。液相取油：进料板上2,4,6块上提取，55~70﹪附近，86~93﹪。气相取油：进料板下2,4,6块上提取，42﹪左右；④杂醇油的分离：液液萃取：水是萃取剂，分离到水占90%，乙醇站8.3%以下，杂醇油站2-3%，达到分离效果，萃取温度：25-30℃.22.成品酒精的提取：①在塔顶往下数4~6层板液相提取原因塔顶酒精浓度最高，杂质的挥发系数最小，液相中杂质含量最高，向下数几块塔板后，酒精浓度稍低，头级杂质的挥发系数增大，液相中杂质含量比塔顶液相中杂质含量降低。所以。。

第二编（白酒、大曲、入窖）

（填空）1.中国白酒：⑴浓香型（窖香型）：泸州老窖，己酸乙酯和适量的丁酸乙酯已经乙酸，丁酸和较复杂的醛类为陪衬。⑵酱香型：茅台52-53°，以4-乙基愈疮木酚和丁香酸等酚类为主，以多种氨基酸和高沸点的醛酮类为衬托，其他酸酯醇为助香成分。⑶清香型：汾酒，65°，乙酸乙酯和乳酸乙酯协调搭配，还有比较多的醋酸和双乙酰等成份。⑷米香型：桂林三花酒，乳酸乙酯，乙酸乙酯，和β-苯乙醇为主体，以醇类为陪衬。5）兼香型，董香型：董酒。己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯作陪衬。6）凤型：西凤酒7）芝麻香型：山东景芝酒8）豉香型：广东玉冰烧9）特型：四特酒。

2.白酒生产对原料的要求：比较多的淀粉和糖，含有一定量的蛋白质（使菌体合成细胞和产生香味物质），含有一定量的无机盐（菌体生长）。原料的作用：1.给微生物提供营养 2.产生乙醇 3.产生香味物质。原料的特点：1.高粱--（香）单宁2.玉米—甜3.大米—净4.大麦—冲5.瓜干—苦6.马铃薯—土腥味7.木薯—氢氰酸 3.白酒生产的辅料：(1)要求：不含或很少含淀粉和糖。(2)作用：吸水，调节淀粉浓度和酸度、酒度，疏松酒醅，便于蒸馏(3)性质：良好的吸水性，含杂志少，新鲜不霉烂，一般不含或很少含营养物质。(4)常用辅料：高粱壳：疏水性一般，含单宁多影响发酵 玉米芯：含五碳糖多，高温蒸煮易产生焦糊味，疏松吸水性最好古壳：疏松吸水性较好，多用于名优酒生产。稻壳：疏松性好，吸水性一般，含硅酸盐多。（5）处理：清蒸处理，除去辅料味，时间不少于30分钟

4.大曲酒生产特点:⑴采用固态配醅发酵⑵采用边糖化边发酵工艺（双边发酵）⑶多菌种混合发酵⑷采用固态甑桶蒸馏。

5.大曲的特点：特点：①采用生料制曲，有利于保存原料中，原有的水解酶类（如小麦中的β-淀粉酶）使它们在酿造过程中仍能发挥作用，同时，有助于那些能够直接利用生料的微生物富集 生长 繁殖。②采用接种（自然）：春末夏初到中秋节前后是生产大曲的最佳时间。③既是糖化发酵剂，又是酿酒原料。④强调使用陈曲，需要经过两到六个月的后熟，成为陈曲之后，才能使用，因为在制曲过程潜入了大量酸性细菌，它们在干燥条件先，会失去繁殖能力或死亡，避免发酵过程中产酸。

（填空）7.泸香型大曲酒生产工艺：原料：糯米高粱；配料：粮醅比：1：4-5；粮糠比17-20% ；大回醅作用：调节淀粉的浓度，酸度，酒度；加入辅料作用：可以疏松酒醅，稀释淀粉，冲淡酸度，吸收水分，保持浆水，有利于发酵和蒸馏。入窖发酵条件：入窖温度：采用低温入窖定温发酵，低温入窖是为了保证酒醅在适宜的温

度下进行缓缓有规律的发酵。入窖淀粉浓度：取决于粮醅比1：4-6 粮糠比1：0.2左右。入窖条件;A.温度，低温入窖，定温发酵。B．入窖发酵的入窖淀粉浓度：取决于粮醅比和粮糖比，经验数据：淀粉浓度下降1﹪，酒醅温度上升1.8℃，冬季：入窖温度16~18℃，根据酵母的生理特性，最高发酵温度是36℃，所以发酵过程中允许温度上升的幅度是18~20℃，允许淀粉浓度下降9-10%，配料时残余淀粉5-7%，在发酵过程中允许淀粉浓度14~17﹪，续渣法发酵入窖淀粉浓度是16~18﹪ C。入窖酸度：冬天1.3度，夏天2度。D.入窖水分：夏天57-58%冬天53-54%

低温入窖原因：曲酒在发酵时，是在固体状态下进行的发酵过程，由于窖壁和酒醅传热系数很小、性能差，发酵过程中产生的热量很难散发出去，只能升高醅的温度，为了控制微生物发酵适宜的温度，不使醅温升得太高，必须根据季节的变化来调节入窖淀粉浓度和入窖温度，采用低温入窖、延缓发酵速度，使酒醅温度不至于迅速升高，协调糖化和发酵速度，维持酶的活性，使边糖化边发酵顺利进行，根据酵母酒生理特性大曲酒发酵最高温度控制在36℃左右，入窖温度受气温高低制约，要坚持低温入窖原则，一般北方16-18第三编℃，平常（啤酒、13-14麦汁、℃，夏季尽可能低。大麦、发芽、干燥、过滤、凝固物、酵母、双乙酰）

清蒸法 混蒸法（见附页）特点（61页）

啤酒生产工艺流程（见附页）大麦种类、结构（见附页）

1.啤酒的辅助原料添加目的：①降低成本。②调节麦汁中糖和非糖的比例，提高发酵度。③降低麦汁中的总氮含量，提高啤酒的生物稳定性。④多酚物质含量少，可以降低色度，提高啤酒的非生物稳定性。正常用量：20-30%。添加辅料应注意的问题：补加淀粉酶；所加的辅料不应该造成过滤困难；所加辅料不应该带来邪杂气味。2.多酚物质在啤酒生产中的作用：主要成分：花色苷 对啤酒酿造有双重作用，在麦汁煮沸及随后的冷却过程中都能与蛋白质结合，凝固沉淀，有利于啤酒的稳定性，另一方面，正是由于多酚物质与Pr结合产生沉淀，所以啤酒中多酚物质残留是造成啤酒浑浊的主要因素之一。

酒花化学成分及作用（64页）异构化作用（64页）

3酒花的烘干与保存：烘干温度：《50℃保存：低温，干燥，隔绝空气，充CO2或氮气，避光。

4.麦芽制备：目的：①通过制麦操作产生各种E，以供制备麦芽汁的催化剂。②使麦粒中的淀粉，Pr在E的作用下，达到适度的溶解。③通过干燥除去绿麦芽多余的水分种生腥味，产生干麦芽特有的色香味。

（填空）大麦的输送方式：1.气流输送2.机械输送

（填空）大麦储藏的目的：新收大麦水分含量高，有休眠期，发芽率低，必须要经多一段成熟期后才能使用，一般周期6-8周方法：地面堆积、立仓

5.浸麦的目的：①除尘，除杂，除微生物。②提高麦料的含水率。③浸出麦皮中的有害成分（多酚物质，谷皮酸，色素）

6.浸麦度对麦芽质量的影响：①浸麦过度：a发芽力削弱，基至引起胚的破坏，发芽率低；b麦粒的呼吸旺盛，麦层温度高，物质消耗大；cE的活力低，制麦损失高。②浸渍不足：a发芽力弱，易生成硬质麦芽；b叶芽根芽生长不足；cE活力低，Pr分解不完全。（填空）7.浸麦理论：⑴水的吸收：通过导管，管胞吸收水分，前期吸水快，后期吸水慢。a：6~10h；吸水快60%；12~14%；30~35%；胚吸水快，胚乳吸水慢，E活力上升。b：10~20h麦粒几乎很少吸水，只有胚，糊粉层吸收极少的水量。c：20h以后若氧充足，吸水量与锓麦时间成正比。⑵吸水速度：a吸水速度与麦粒性质：①颗粒越小，吸水越快②同类大麦含N量越低，吸水越快③粉状粒吸水快b：T越高，吸水速度越快，时间越短；T：14~18℃；﹤20℃。⑶浸麦与通风（供氧）作用:如果麦粒长时间缺氧，将导致分子间的呼吸作用，使呼吸产物积累，造成胚的生命力的破坏。供氧效果：供氧不足：①胚成窒息状态，发芽迟缓不旺盛②麦粒溶解不足③麦层有水果味，酸味④发芽呈早期发热现象。供氧充足：①胚新鲜健康②发芽快，均匀，旺盛，麦粒溶解好③麦粒吸水快④麦粒提高萌发，发芽时间短⑤麦芽中的E活力高。供养措施：浸水通风、泵送、空气休止、喷淋法、冲洗

8.浸麦水中的添加剂：KMnO4，甲醛，石灰，氢氧化钠，碳酸钠，过氧化氢。作用：为有效地清除麦皮中的有害成分，杀死附着在麦粒上的微生物，达到清洗和灭菌的目的。

8发芽的目的：①使麦粒生成大量的各种酶，并使麦粒中一部分非活化酶得到活化并增长②使麦粒达到适度的溶解来满足糖化的需要。

12.发芽过程中的主要酶类㈠①α－淀粉酶；②β－淀粉酶。㈡蛋白E：①内肽E；②外肽E。㈢半纤维素E。㈣磷酸脂E。㈤脂肪E。9.发芽过程中的物质变化： ⑴淀粉：淀粉链总趋势变短，直链淀粉的比例增加，并产生部分低分子糖和糊精⑵半纤维素：胚乳中不断分解，β—葡聚糖水解，粘度降低⑶Pr

①蛋白质分解的意义：大麦中的Pr主要是在发芽中北分解的。糖化 过程的中的Pr分解只是发芽分解的继续远不如发芽时分解的多②Pr的溶解度：麦粒当中的全部Pr分解的程度，一般用可溶解性N和总N的量之比表示③影响Pr分解的主演因素：a：大麦Pr含量高，Pr分解一般交差发芽时温度快，不利于Pr分解 b:发芽T高，Pr分解作用弱，c:空气中的Co2比例上升，Pr溶解度上升，d:侵麦越低，抑制Pr活力提高 e:发芽时间：发芽7天内，Pr溶解度和AA含量会增加 ⑷ 酸度上升，PH变化很小酸度变化的原因：酸性AA。

（填空）10.发芽条件及控制：⑴发芽水分：由浸麦度和发芽时吸收的水分决定 ①浸麦度：43—48%（浅色：43-45%深色：45-48%）②设空调室：人工加潮的方式来保护水分的，湿度φ＞85%。⑵发芽T：20℃以下，13-17℃为宜（T低：发芽慢，周期长；T高：发芽块,但不宜控制）。⑶空气中O2和CO2的比例：①发芽初期：在O2充足的条件下，有利于各种条件内E的形成，如果CO2含量过高，会导致E的活力下降，严重会是麦粒窒息，多以要定期通风，共O2，排CO2②发芽后期：麦层CO2比例要加大，一方面可以抑制麦粒的过分生长，同时有利于麦粒的溶解。⑷发芽时间：发芽温度降低，水分降低，含氧越贫，麦粒生长越慢，发芽时间越长。⑸光线：避免阳关直射，绿色植物光合作用产生的叶绿素，使酒发生红光—形成叶绿素最多；蓝色—形成的叶绿素最少，对E的形成有利。⑹翻拌：散热，疏松麦层

13.绿麦芽干燥的目的：①停止绿麦芽的生长和麦芽的分解。②除去多余的水分，防止腐败变质，便于贮藏。③使麦根干燥，便于脱落除去。④除去绿麦芽的生腥味，产生干麦芽特有的色香味14.类黑素的形成：a水分＞5%；b有低分子糖，低分子N；c 80-90%℃开始形成类黑素；d.100-110℃最适温度；e PH＝5最容易形成类黑素。

（填空）干燥的变化过程（74-75页）

15.除根和贮藏：除根目的：①麦根吸湿行强，贮藏时易腐烂。②易改变啤酒的色泽。③带有不良的苦味。贮藏目的：①干燥操作不当时会产生玻璃质麦粒进过贮藏后会向好的方向转化。②E活力会有所提高。③酸度会有所提高。④贮藏后麦粒会吸水，麦皮会失去原来的脆性，有利于麦汁的过滤。温度小于20度，时间不小于四周。

16.粉碎的方法：①干法粉碎②回潮粉碎③湿法粉碎：优点：a可以改善过滤性能。b缩短糖化周期。c不易产生粉尘。d可以提高侵出率。缺点：a必须现用现粉，不易贮藏。b必须用密闭设备。16粉碎的目的：增加原料的表面积，利于酶的作用，可溶性物质浸出得多。粉碎的要求：①麦芽：麦皮破而不碎，内容物越细越好，既有利于反应速度，又有利于过滤速度②辅料：粉的越细越好。或石膏调整。（5）醪液浓度的影响：用加水比控制：1:2.8-3.5。调整度至14%-18%，<20%，浓度高，糖化速度快慢。

（填空）糖化原理（78页）方法（79页）二次煮出糖化法 18.过滤：目的：在短时间内，将可溶性物质与麦糟分开，以免影响麦汁的色香味，结果得到澄清的麦汁。步骤：过滤①以麦槽为虑层进行麦汁过滤，第一麦汁（过滤麦汁）。②洗糟：用热水洗麦糟，得到第二麦汁，洗涤麦汁。过滤方法：过滤槽法①过滤前清洗设备，铺好筛板，从过滤槽底部，引入78-80℃热水，②泵入糖化醪，静止20-30min③回流操作④过滤⑤洗糟

19.过滤速度的影响因素：①麦汁的组成：β－葡聚糖多，粘度大，过滤速度慢。②醪夜温度的影响，麦汁主要含糖，糖的u和T成反比。③醪液浓度的影响：浓度大，u大，过滤慢。④PH影响：PH=5.5过滤速度最快。⑥麦芽粉碎度：湿法粉碎，麦汁过滤速度快

20.麦汁煮沸的目的：稳定麦汁成分⑴E的破坏，主要停止α-淀粉酶的作用，以稳定可发酵性糖和糊精的比例，时间1-2min。⑵麦汁灭菌。⑶蒸发水分，使麦汁浓度到要求的浓度。⑷Pr沉淀，提高啤酒的非生物稳定性⑸酒花有效成分溶出。

21煮沸过程中的物质变化：⑴Pr的沉淀提高啤酒非生物稳定性①Pr受热变性凝固，氧抑制Pr凝固增加Pr溶解度，为避免此现象加亚硫酸盐。②Pr与单宁形成不溶性的络合物。⑵酒花有效成分溶出：①α-酸异构化，苦味物质溶出，有防腐作用，②香物质的溶出，主要是酒花油。⑶经过煮沸后，麦汁颜色加深。①产生类黑素。②酒花树脂，多酚物质溶出。⑷还原物质的生成。⑸不良气味的挥发：发芽时生成的不良气味，Pr凝固产生的硫化物，其他醛类。⑹杀菌和其他作用：①102-105℃，几分钟灭菌。②破坏全部E。

21.麦汁煮沸工艺条件及影响因素：①蒸煮强度：每小时蒸发水分的百分率。蒸煮强度=（混合麦汁量—最终麦汁量）/（混合麦汁量*煮沸时间）。一般是8~12%，该强度使蛋白质凝固、结块大、效果好。②煮沸时间：常压1~2小时，多用90分钟；煮沸时间短，适

合生产浅色啤酒，煮沸时间长，适合生产深色啤酒。煮沸时间长，蛋白质凝固越多，还原性物质生成越多，酒花利用率提高；但超过2h，颜色深，口味粗糙，蛋白质重新分解，α-酸转变成树脂，酒花利用率降低。③麦汁的ph：生产上5.2~5.6。

22.酒花的添加：①目的：赋予啤酒爽口的苦味，特有的香味，防腐能力提高啤酒的非生物稳定性。②原则：添加剂，先苦后香，先陈后新。（填空）方法：分次分量添加。分三次，第一次，初沸5~15分钟，添加5~10%，作用：防止起沫，用单宁沉淀蛋白质。第二次，25~45分钟，加55~60%，作用：促进a酸的异构化。第三次，结束前5~10分钟，加30-40%，作用：酒花油赋予啤酒香味。

23.麦汁的澄清冷却目的要求：①降低麦汁的温度，适合发酵要求。②麦汁吸收一定量氧，促进酵母繁殖。③析出和分离麦汁中的冷热凝固物，改善发酵条件，提高质量。要求：冷热过程温度恒定无菌。

24.影响冷凝固析出的因素：①蛋白质含量低或蛋白质溶解度低的麦芽析出的冷凝固物。②利用谷类原料作辅料析出少。③粗麦芽粉比细麦芽粉析出少。④糖化醪浓度稀析出少。⑤酒花添加量少，煮沸强度低析出少。⑥冷却温度越低洗出越多。

影响热凝固物形成的因素：1.麦芽质量好，生成热凝固物少2.大麦中蛋白质含量低，生成热凝固物少3.酒花添加量少，生成热凝固物少4.煮沸强度低，析出热凝固物少5.PH低，热凝固物析出少6.麦汁浓度升高，粘度升高，热凝固物析出少

25.麦汁吸氧：①物质氧化吸氧：在高温下，麦汁的还原性物质与氧化合而吸氧，该氧不能被酵母利用。②氧的物理溶解：当麦汁温度冷却到40以下时，氧气会溶解到麦汁中，供酵母繁殖。氧气在麦汁中的溶解度与麦汁的温度、浓度成反比。

物质氧化：麦汁高温吸氧，氧化还原性物质使麦汁颜色加深，澄清时不宜通风，麦汁冷却到40度以下吸氧是适宜的26.啤酒酵母性质有差异的原因（啤酒酵母的分类与特点）：

⑴上面酵母：啤酒酵母，萨土型酵母，弗罗倍儿酵母。①发酵特点：随着二氧化碳的产生，酵母会悬浮在液体中，发酵结束时形成一层棕色的奶油状的泡盖，虽经长时间静止，也很少下沉。②原因：上面酵母出芽后新细胞并不是很快的分开，而是相互粘着，形成5-10个细胞的芽簇，发酵产生的二氧化碳被芽簇包围着，二氧化碳带有负电荷，上面酵母带有正电荷，相互吸引，这些均导致酵母芽簇-CO2气泡团粒比重小于发酵液而漂浮在液面上。③生理特点：细胞呈圆形，易聚集在一起，发酵麦芽三糖的能力比下面酵母快而彻底，发酵温度10~25℃，真正发酵度60~65%，能发酵1/3棉子糖。⑵下面酵母：萨土型酵母，多特蒙德酵母，卡尔斯伯酵母①发酵特点：发酵过程中酵母悬浮在麦汁中，发酵终了时，酵母凝聚成块沉淀于容器底部，形成比较紧密的酵母层。②原因：酵母出芽繁殖后很少有粘着的倾向，而且下面酵母和CO2气泡都带负电，相互排斥，发酵产生的CO2很快脱离酵母细胞而上升，酵母始终漂浮在液体中，发酵结束时，下面酵母由于自身的凝聚性而使细胞凝聚成块，酵母比重是1.07-1.10，大于麦芽汁的比重，所以就自然沉降在容器的底部。③生理特点：卵圆形，成对出现，分散，能发酵全部棉子糖，发酵温度7~10℃，真正发酵度55~60%。

27.凝聚性酵母：⑴旺盛时不凝聚原因：①CO2强烈搅拌，酵母急速运动。②酵母带相同电荷，排斥大。①CO2少，酵母运动停止。②发酵终了，PK 4.2-4.7,接近Pr等电点，酵母带电荷趋于0，酵母不排斥，所以凝聚。

28.啤酒酵母的选择原则：①符合啤酒发酵类型要求。②发酵速度要快，强度要大，周期短，发酵度高。③还原双乙酰的能力要大，要求酿出的酒味道适口，泡沫稳定。④酵母凝聚性要强，使酒液澄清，便于回收酵母。

影响发酵度的因素（见大笔记折页）可发酵性糖的变化、含氮物质的变化、PH的变化

29.双乙酰形成机制：①由α-乙酰乳酸的非E分解反应产生。②活性乙酰+乙酰COA→双乙酰+辅酶A。

30.影响双乙酰形成的因素：①酵母菌：不缺乏呼吸作用，凝聚性好，能够合成缬氨酸来抑制双乙酰合成。酵母贮存期长，会降低双乙酰的还原能力。②麦汁成分：麦汁中可同化N和其他营养物质，要丰富，使酵母生命力旺盛，才能还原双乙酰。③酵母接种量多，双乙酰形成量高。④发酵温度高，双乙酰合成速度加快。⑤溶氧量多，双乙酰形成也会多。⑥染菌后，双乙酰形成量多。

31.降低啤酒中双乙酰含量的措施：①提高麦汁中α—氨基N的含量。②加速α-乙酰乳酸的分解速度，α-乙酰乳酸分解速度《双乙酰还原速度。方法：a.提高发酵温度、b.通风搅拌（加CO2），前者速度比后者增加快c.降低麦汁PH至4.2-4.4。③利用酵母来还原双乙酰，主酵结束时保留一定量酵母细胞。④利用CO2洗涤，排除双乙酰。

33.主发酵期现象：①酵母繁殖期：接种后15~20h。特点：麦汁添加15~20h，池四周开始出现泡沫，直至覆盖整个液面，这是发酵开始，糖度下降，温度升高，移到发酵池。②起泡期：换槽4~5h后特点：麦汁表面出现更多泡沫，逐渐涌向中间，泡沫洁白细腻，厚而紧密，呈菜花状，吹开液面，可以看到无数气泡上升，并将析出物带出液面。每天升温05~0.8.每天耗糖0.3~0.5.维持2到三天不需要人工降温。③高泡期：发酵三天后，特点：泡沫增高，形成卷状隆起，泡沫厚度25~30cm，颜色因酒花树脂，蛋白质单宁氧化物析出而成棕黄色。耗糖每天1.5，最高发酵温度9~10，维持2~3天，人工降温。④落泡期：发酵五天后，特点：发酵力减弱，CO2减少，泡沫回缩，颜色变为棕褐色。耗糖0.5~0.8每天，温度下降0.5每天，维持两天。⑤泡盖形成期：七到八天之后特点：泡沫回缩，液面形成褐色的带有苦味的泡盖，厚2~4cm。耗糖0.2~0.4，需急剧降温。主发酵后要回收酵母：急剧降温，使酵母沉降。

34.为什么麦芽不需要糊化，辅料淀粉需要糊化：大麦在发芽形成麦芽过程中，细胞壁被纤维素酶分解，呈网状结构，淀粉酶和蛋白酶易于进入胚乳细胞内进行水解反应，而辅料淀粉中淀粉颗粒受植

物组织和细胞壁的保护，不易和淀粉酶接触，通过糊化，使淀粉吸水膨胀破裂，淀粉由颗粒状变成糊液，才易于受酶的作用，所以麦芽不需要糊化，辅料淀粉需要糊化。

35酵母添加的条件：低温保存，时间不超过五天，使用代数《7代 36酵母添加的方法：干加法和湿加法

37酵母回收方法：人工回收：中层留种；离心机回收。

38酵母的保存方法：在0.5-2℃条件下保存，降低酵母代谢能力，保存时间《5天，每天洗涤2-3天。

39发酵过程主要的物质变化：糖减少，含氮物质减少，苦味物质1/3物质会损失，PH下降，色度都降低，CO2增加。

40后发酵的作用：1）嫩啤酒残留的可发酵性糖继续被发酵，产生的CO2在密闭容器中不断溶解在酒里达到过饱和状态2）后酵初期产生的CO2，排出罐外时，将酒中所含的生酒味物质排出减少酒的不成熟味觉3）在较长的后发酵期中，悬浮的酵母冷凝物含有酒花树脂在低温低PH情况下，缓慢沉淀，使酒液澄清，便于过滤4）在较低的除酒温度下，易形成蛋白质，多酚物质复合物，逐渐析出而先行沉淀，提高啤酒非生物稳定性。

41锥形罐发酵法的特点：1）适合生产各类啤酒，灵活性大2）采用凝聚型的酵母减少了酒损，简化了酵母回收的排放手续3）罐体外设冷却夹套，前后发酵在一个罐中进行，缩短了发酵周期4）冷却夹套设在罐外，改善了劳动条件，节省机电费用，便于实现仪表自动化5）罐密封，可进行CO2洗涤和回收，发酵周期短，一般15-30天。

42啤酒澄清的要求：酒和CO2损失少，不吸氧，不污染，不影响酒的风味，产量大，质量高。43啤酒澄清的方法：过滤；离心

44啤酒包装杀菌的目的：保证啤酒的生物稳定性，有利于啤酒的长期储存。杀菌要求：在最低杀菌温度和最短杀菌时间内杀灭可能存在的生物污染。（填空）

1.蒸煮过程中的物质变化：蛋白质增加温度升高 CH3OH少量增加。

2.淀粉不需要糖化，原料经蒸煮冷却直接用于培养霉菌，产生淀粉酶。

3.蛋白质酶作用于细胞之间的蛋白质，使细胞游离，半纤维素酶作用于胚乳细胞壁，使之变为网状结构，淀粉酶，蛋白质进入细胞内，作用于细胞内。

4.常压蒸馏得不到无水乙醇，减压蒸馏可以得到无水乙醇。（61页）22.清蒸法特点：将新投入的原料单独蒸煮的方法…… 23.混蒸法特点：将原料和香醅混合在一起，在蒸酒的同时也进行蒸料，前期主要是蒸酒，温度较低（85~95℃），糊化效果并不明显，后期把醅中的酒蒸出来后主要是蒸料，要加大火力，提高温度，促进糊化，排出杂质。

第二篇：生物工艺学知识点总结

生物工艺学期末复习资料

生物工艺学知识点总结

第一章

绪论

1、生物工艺学（biotechnology）：

又称为生物技术，它是应用自然科学及工程学原理，依靠生物作用剂(biological

agents)的作用将物料进行加工以提供产品或社会服务的技术。

特点：多学科和多技术的结合；生物作用剂（生物催化剂）的参与；应用大量高、精、尖设备；建立工业生产过程或进行社会服务。

生物工艺学包含的四大块内容：原料预处理和培养基的制备、菌种的选育及代谢调节、生物反应过程的工艺控制、下游加工。

2、生物催化剂是游离的或固定化的细胞或酶的总称。

生物催化剂特点：

优点：①常温、常压下反应

②反应速率大

③催化作用专一

④价格低廉

缺点：稳定性差

控制条件严格

易变异（细胞）

生物反应过程实质是利用生物催化剂以从事生物技术产品的生产过程(process

engineering)。

3、生物技术研究的主要内容：

基因工程(DNA重组技术，gene

engineering)、细胞工程(cell

engineering)、酶工程(enzyme

engineering)、发酵工程(fermentation

engineering)、蛋白质工程(protein

engineering)、第二章

菌种的来源

1、工业生产常用的微生物

细菌、酵母菌、霉菌、放线菌、担子菌、藻类。

2.工业生产对微生物菌种的要求

培养基成分简单、廉价、来源广。

生长迅速、发酵周期较短，抗杂菌和噬菌体能力强。

目的产物产量高，产物类似物的产量低，且目的产物最好能分泌到胞外，利于产物分离。

对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感。

对溶氧的要求低，便于培养及降低能耗。

菌种遗传性能稳定，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。

3、分离微生物新种的过程大体可分为采样、增殖、纯化和性能测定。

含微生物材料的预处理方法：物理方法（加热）；化学方法（pH）；诱饵法。

诱饵技术：将固体基质加到待检的土壤或水中，待其菌落长成后再铺平板。

分离的效率影响因素

：

1）培养基的养分；

2）pH；

3）加入的选择性抑制剂。

4、高产培养基成分的选择准则：

制备一系列的培养基，其中有各种类型的养分成为生长限制因素（C、N、P、O）；

使用一聚合或复合形式的生长限制养分；

避免使用容易同化的碳（葡萄糖）或氮（NH4+），它们可能引起分解代谢物阻遏；

确定含有所需的辅因子(Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+)

加入缓冲溶液以减小pH变化。

5、代谢控制发酵（Metabolic

Control

fermentation）：用人工诱变的方法，有意识地改变微生物的代谢途径，最大限度地积累产物，这种发酵形象地称为代谢控制发酵，最早在氨基酸发酵中得到成功应用。

6、菌种的衰退表观现象有哪些？

目的产物的产量下降

营养物质代谢和生长繁殖能力下降

发酵周期延长

抗不良环境的性能减弱

7、菌种的衰退的原因

菌种保藏不当

提供不了当的条件或不利的条件

经诱变得到的新菌株发生回复突变

8、菌种的复壮方法：

纯种分离

通过寄主体进行复壮

淘汰已衰退的个体

9、菌种的保藏的原理

根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。

10、菌种的保藏方法：

A

斜面冰箱保藏法

B

沙土管保藏法

C

石蜡油封存法

D

真空冷冻干燥保藏法

E

液氮超低温保藏法

11与生物工程相关性较大的国内主要菌种保藏机构包括：

工业微生物菌种保臧管理中心、农业微生物菌种保藏管理中心、普通微生物菌种保臧管理中心、抗生素菌种保藏管理中心

从自然环境中分离微生物菌种的的工艺过程

12.生物工程专业相关的主要数据库有哪些？

维普中文科技期刊数据库、中国期刊全文数据库、万方系列数据库、science

online、springer

link等。

第三章

菌种选育

1、常用菌种选育方法

（1）自然选育:是指在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变(spontaneous

mutation)而进行菌种筛选的过程。

特点：自发突变的频率较低，变异程度不大。所以该法培育新菌种的过程十分缓慢。

应用：自然选育在工业生产中可以达到纯化菌种，防止菌种衰退，稳定生产，提高产量的目的。

（2）诱变育种:是利用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变率大幅度提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株，以供生产实践或科学研究使用。诱变育种的理论基础是基因突变。

诱变育种的典型流程

常用诱变剂：物理诱变剂、化学诱变剂（碱基类似物、与碱基反应的物质、在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基物质）、生物诱变剂

（3）分子育种（DNA重组、基因工程）：用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新的育种技术。

（4）杂交育种(Hybridization)：

常规杂交育种(Hybridization)：一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖或原核微生物的接合、F因子转移、转导和转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。

原生质体融合技术：通过人工方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，并产生重组子的过程，亦称为“细胞融合”(cell

fusion)。

原生质体融合的基本过程：原生质体形成、原生质体融合、原生质体的再生。

3.抗噬菌体菌株的检出方法：

平板点滴法、单层琼脂法、双层琼脂法。

4、工程菌的不稳定性表现

质粒的不稳定（质粒的丢失、重组质粒的DNA片段脱落）、表达产物的不稳定

第三章

微生物的代谢调节

1、微生物代谢调节方式

概念：微生物在生长过程中机体内的复杂代谢过程是相互协调和高度有序的，并对外界环境的改变能够迅速做出反应,其原则是经济合理地利用和合成所需的各种物质和能量,使细胞处于平衡生长状态。微生物代谢分为初级代谢和次级代谢。

代谢流向的调控分为代谢物的合成和代谢物的降解；通过快速启动蛋白质的合成和有关的代谢途径，平衡各代谢物流和反应速率来适应外界环境的变化。

代谢速度的调控分为酶量（粗调）（酶合成的诱导和酶合成的阻遏）和酶活（细调）（酶活性的激活、酶活性的抑制）

反馈阻遏是转录水平的调节，产生效应慢；影响催化一系列反应的多个酶

反馈抑制是酶活性水平调节，产生效应快。只对是一系列反应中的第一个酶起作用

2、微生物初级代谢调节包括酶活调节、酶合成调节、遗传控制

（1）酶活性的调节（细调）：一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调节其催化反应的速率。酶活调节的影响因素包括：底物和产物的性质和浓度、压力、pH、离子强度、辅助因子以及其他酶的存在等等。特点是反应快速。

酶活性的调节包括：酶活性的激活和酶活性的抑制（反馈抑制）

（2）酶合成的调节：通过调节酶合成的量来控制微生物代谢速度的调节机制。这类调节在基因转录水平上进行，对代谢活动的调节是间接的、缓慢的（3）酶合成的阻遏：在某代谢途径中，当末端产物过量时，微生物的调节体系就会阻止代谢途径中包括关键酶在内的一系列酶的合成，从而彻底地控制代谢，减少末端产物生成，这种现象称为酶合成的阻遏。

末端代谢产物阻遏:由于某代谢途径末端产物的过量积累而引起酶合成的(反馈)阻遏。

分解代谢物阻遏：当细胞内同时存在两种可利用底物（碳源或氮源）时，利用快的底物会阻遏与利用慢的底物有关的酶合成。

这种阻遏并不是由于快速利用底物直接作用的结果，而是由这种底物分解过程中产生的中间代谢物引起的，所以称为分解代谢物阻遏（过去被称为葡萄糖效应）。

3、改变细胞膜通透性的方法

A限制培养基中生物素浓度在1～5mg/L，控制细胞膜中脂质的合成；

B

加入青霉素，抑制细胞壁肽聚糖合成中肽链的交联；

C

加入表面活性剂如吐温80或阳离子表面活性剂(如聚氧化乙酰硬脂酰胺)，将脂类从细胞壁中溶解出来，使细胞壁疏松，通透性增加；

D

控制Mn2+、Zn2+的浓度，干扰细胞膜或细胞壁的形成；

E

可以通过诱变育种的方法，筛选细胞透性突变株。

5、人工控制微生物代谢的两种手段：

（1）生物合成途径的遗传控制

（2）发酵条件的控制

6.生物素对谷氨酸合成的影响

（1）生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，生物素在低于亚适浓度之前，增加生物素有利于丙酮酸的羧化产生草酰乙酸，进而有利于谷氨酸的合成；

（2）生物素是催化脂肪酸生物合成的初始酶乙酰辅酶A羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，再经一系列转化合成脂肪酸，而脂肪酸又是构成细胞膜磷脂的主要成分，因此生物素可间接地影响细胞膜的透性。

第四章

微生物次级代谢与调节

1、次级代谢产物：某些微生物在生命循环的某一个阶段产生的物质，它们一般是在菌生长终止后合成的。其生物合成至少有一部分是与核内和核外的遗传物质有关，同时也与这类遗传信息产生的酶所控制的代谢途径有关。微生物产生的次级代谢物有抗生素、毒素、色素和生物碱等。

2、初级与次级代谢途径相互连接

次级代谢物通常是由初级代谢中间体经修饰后形成的修饰初级代谢中间体的三种生化过程

生物氧化与还原、生物甲基化、生物卤化

3、前体：指加入到发酵培养基中的某些化合物，它能被微生物直接结合到产物分子中去，而自身的结构无多大变化有些还具有促进产物合成的作用。

中间体是指养分或基质进入一途径后被转化为一种或多种不同的物质，他们均被进一步代谢，最终获得该途径的终产物。

4、次级代谢物生物合成的原理

①一旦前体被合成，在适当条件下它们便流向次级代谢物生物合成的专用途径。

②在某些情况下单体结构单位被聚合，形成聚合物。这些特有的生物合成中间体产物需做后几步的结构修饰，修饰的程度取决于产生菌的生理条件。有些复杂抗生素是由几个来自不同生物合成途径组成的。

第五章

发酵培养基

1、培养基通常指人工配制的供微生物生长、繁殖、代谢和合成所需产物的营养物质和原料，同时，培养基也为微生物等提供除营养外的其它生长所必需的环境条件

培养基提供微生物生长繁殖和产物合成所需的碳源、氮源、无机盐、生长因子、水和氧气等

2、工业发酵培养基的要求

：

①培养基能够满足产物最经济地合成②发酵后所形成的副产物尽可能的少

③培养基的原料应因地制宜，价格低廉；且性能稳定，资源丰富，便于采购运输，适合大规模储藏，能保证生产上的供应。

④所用培养基应能满足总体工艺的要求，如不应影响通气、提取、纯化及废物处理等。

3、工业上常用的碳源：葡萄糖、乳糖、淀粉、蔗糖

工业上常用的氮源：无机氮源：氨水，铵盐，硝酸盐等。有机氮源：玉米浆、豆饼粉、花生饼粉、棉籽粉、鱼粉、酵母浸出液等。生理酸性物质，如硫酸铵。生理碱性物质，如硝酸钠。

提供生长因子的农副产品原料：

1)

玉米浆

2)

麸皮水解液

3)

糖蜜

4)

酵母：可用酵母膏、酵母浸出液或直接用酵母粉。

产物促进剂是指那些非细胞生长所必需的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。

4、发酵培养基的设计和优化方法

正交试验设计、均匀设计、响应面分析

正交试验设计：利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验，通过对这部分试验结果的分析,了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。

正交实验数据分析，见教材P112-114例题，表4-16，同时确定因素的主次顺序、各因素的优水平、各因素水平的最优组合。小数点后保留一位。

响应面分析方法：适宜于解决非线性数据处理的相关问题，它囊括了试验设计、建模、检验模型的合适性、寻求最佳组合条件等众多试验和统计技术；通过对过程的回归拟合和响应曲面、等高线的绘制、可方便地求出相应于各因素水平的响应值。在各因素水平的响应值的基础上，可以找出预测的响应最优值以及相应的实验条件。

完整响应面分析方法实验设计通常包括：（1）Plackett—Burman实验设计，（2）最陡爬坡实验，（3）中心组合实验设计三个过程。

第六章

发酵培养基灭菌和空气净化

在发酵工业生产中，为了保证纯种培养，在生产菌种接种培养前，要对培养基、空气系统、消泡剂、流加物料、设备、管道等进行灭菌，还要对生产环境进行消毒，防止杂菌和噬菌体的大量繁殖。

常用的灭菌方法有：干热灭菌法、火焰灭菌法、电磁波射线灭菌法、湿热灭菌法（主要是高压蒸汽灭菌）、化学药剂灭菌法、过滤除菌法等

1.微生物热阻：微生物在某一特定条件下（主要是温度和加热方式）下的致死时间。

2.对数残留定律中各符号的意义。

3.理论灭菌时间的计算

3.1间歇实罐灭菌时间的计算

3.2连续灭菌的灭菌时间计算：

4.灭菌温度的选择：随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分的分解速率常数的增加倍数。即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度提高，培养基营养成分破坏的速度减慢。

高温瞬时灭菌法可以减少培养基营养成分的破坏的原理：

随着温度升高，灭菌速率常数增加的倍数大于培养基中营养成分的分解速率常数的增加倍数。即当灭菌温度升高时，微生物杀灭速度增加较快，而培养基营养成分破坏的速度增加较慢。因此，采用较高的温度，较短的灭菌时间，可以减少培养基营养成分的破坏。

5.影响培养基灭菌的因素

：所污染杂菌的种类、数量、灭菌温度和时间，培养基成分、pH值、培养基中颗粒、泡沫等对培养基灭菌也有影响。

6.无菌空气：指通过除菌处理使空气中含菌量降低至一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。

7.介质过滤除菌是使空气通过经高温灭菌的介质过滤层，将空气中的微生物等颗粒阻截在介质层中，而达到除菌的目的。是大多数发酵厂广泛采用的方法。按除菌机制可分为：

绝对（表面）过滤和深层介质过滤。

介质过滤除菌的机理：空气流通过这种介质过滤层时，借助惯性碰撞、拦截滞流、静电吸附、扩散等作用，将其尘埃和微生物截留在介质层内，达到过滤除菌目的。

第七章

种子的扩大培养

1、种子扩大培养：指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。

这些纯种培养物称为种子

2、种子扩大培养的目的与要求

（1）种子扩培的目的①接种量的需要

②

菌种的驯化

③缩短发酵时间、保证生产水平

（2）种子的要求

①菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短

②

生理性状稳定③菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求④无杂菌污染⑤保持稳定的生产能力。

3、种子罐级数：是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、所采用发酵罐的容积。

种子罐级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2～4级。

4、种子制备分两个阶段：实验室种子制备阶段

生产车间种子制备阶段

好氧微生物菌种扩培常用设备：超净工作台、震荡培养箱、种子罐等。

5、种龄：是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。

接种量：是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。

通常接种量：细菌1-5%，酵母菌5-10%，霉菌7-15%，有时20-25%

青霉素生产的种子制备过程：

安瓿管→斜面孢子→大米孢子→一级种子→二级种子→发酵

第八章

发酵工艺控制

1、微生物发酵的生产水平取决于生产菌种本身的性能和合适的环境条件。

2、发酵过程的代谢变化

从产物形成来说，代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化（培养基和培养条件）和产物形成速率这三者之间的关系。在分批培养过程中根据产物生成是否与菌体生长同步的关系，将微生物产物形成动力学分为①

生长关联型

和②

非生长关联型。

3、发酵方式

（1）补料－分批发酵：指分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的培养方法。

优点在于使发酵系统中维持很低的基质浓度。

低基质浓度的优点：①

可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；②

克服养分的不足，避免发酵过早结束。

（2）半连续发酵：是指在补料－分批发酵的基础上，间歇地放掉部分发酵液的培养方法。

优点：①

可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；②

克服养分的不足，避免发酵过早结束；③缓解有害代谢产物的积累。

（3）连续发酵：指培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的发酵液的培养方法。在这样的环境中培养，菌的生长就受到所提供基质的限制，培养液中的菌体浓度能保持一定的稳定状态。

与传统的分批发酵相比，连续培养有以下优点：

①

维持低基质浓度：可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维持适当的菌体浓度，使不至于加剧供氧的矛盾；

②

避免培养基积累有毒代谢物；

③

可以提高设备利用率和单位时间的产量，节省发酵罐的非生产时间；

④

便于自动控制。

4、发酵控制参数

按性质分类：物理参数、化学参数、生物参数

按检测手段分类：①直接参数：⑴在线检测参数

⑵

离线检测参数

②间接参数

5、发酵热

发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。

Q发酵=Q生物+

Q搅拌-

Q蒸发-

Q显-

Q辐射

生物热(biological

heat)是菌体生长过程中直接释放到体外的热能，使发酵液温度升高。

搅拌热(agitation

heat)是搅拌器引起的液体之间和液体与设备之间的摩擦所产生的热量。

6.pH值对发酵的影响

（1）影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；

（2）影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而微生物对这些成分的吸收；

（3）pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。

7、引起发酵液pH值异常波动的因素

pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件

pH下降：

①

培养基中碳、氮比例不当。碳源过多，特别是葡萄糖过量，或者中间补糖过多加上溶氧不足，致使有机酸大量积累而pH下降；

②

消泡剂加得过多；

③

生理酸性物质的存在，铵被利用，pH下降。

pH上升：

①

培养基中碳、氮比例不当。氮源过多，氨基氮释放，使pH上升；

②

生理碱性物质存在；

③

中间补料氨水或尿素等碱性物质加入过多。

8、临界氧浓度(critical

value

of

dissolved

oxygen

concentration)

：指不影响菌的呼吸所允许的最低氧浓度。如对产物形成而言便称为产物合成的临界氧浓度。

呼吸强度又称氧比消耗速率，是指单位质量的干菌体在单位时间内所吸取的氧量，以

Q

O2表示，单位为mmolO2／(g干菌体·h)。

耗氧速率又称摄氧率，是指单位体积培养液在单位时间内的吸氧量，以r表示，单位为mmol

O2／(L·h)。

9、引起溶氧异常下降，可能有下列几种原因：

①

污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉，可能使溶氧在较短时间内下降到零附近，如果杂菌本身耗氧能力不强，溶氧变化就可能不明显；

②

菌体代谢发生异常现象，需氧要求增加，使溶氧下降；

③

某些设备或工艺控制发生故障或变化，也可能引起溶氧下降，如搅拌功率消耗变小或搅拌速度变慢，影响供氧能力，使溶氧降低。

10、泡沫的形成及其对发酵的影响

在大多数微生物发酵过程中，通气、搅拌以及代谢气体的逸出，再加上培养基中糖、蛋白质、代谢物等表面活性剂的存在，培养液中就形成了泡沫。

形成的泡沫有两种类型：

一种是发酵液液面上的泡沫，气相所占的比例特别大，与液体有较明显的界限，如发酵前期的泡沫；

另一种是发酵液中的泡沫，又称流态泡沫(fluid

foam)，分散在发酵液中，比较稳定，与液体之间无明显的界限

大量的泡沫引起的负作用：

发酵罐的装料系数减少、氧传递系统减小；

增加了菌群的非均一性；

造成大量逃液，增加染菌机会；

严重时通气搅拌无法进行，菌体呼吸受到阻碍，导致代谢异常或菌体自溶；

消泡剂的添加将给提取工序带来困难。

泡沫的消除

调整培养基中的成分（如少加或缓加易起泡的原料）或改变某些物理化学参数（如pH值、温度、通气和搅拌）或者改变发酵工艺（如采用分次投料）来控制，以减少泡沫形成的机会。

采用菌种选育的方法，筛选不产生流态泡沫的菌种，来消除起泡的内在因素。

采用机械消泡或消泡剂来消除已形成的泡沫。

常用的消泡剂有4大类：

天然油脂类、脂肪酸和酯类、聚醚类、硅酮类

11、造成染菌的主要原因

设备渗漏

空气带菌

种子带菌

灭菌不彻底

技术管理不善

第九章

生物反应动力学

1.微生物反应动力学

研究各种环境因素与微生物代谢活动之间相互作用随时间而变化的规律。

具体研究内容：微生物生长过程中质量的平衡；发酵过程中菌体的生长速率、基质消耗速率和产物生成速率的相互关系

；环境因素对这三种速率的影响。

2.分批发酵工艺中缩短和消除延迟期的方法有：

增加接种量、采用最适种龄、选用繁殖速度快的菌种以及尽量保持接种前后所处的培养基介质和条件一致。

3.Monod方程的参数求解：

µmS

KS+S

µ=

S:限制性基质浓度mol/m3；KS:饱和常数mol/m3

例：在一定条件下培养大肠杆菌，得如下数据：

S(mg/l)

153

221

μ(h-1)

0.06

0.24

0.43

0.66

0.70

利用MONOD方程作图如下，求在该培养条件下，求大肠杆菌的μmax，KS和td?

解：据图可知，：

1/µmax=0.95；KS/µmax=90；根据

可以求得：

μmax＝1.1

(h-1);

KS＝99mg/L，td＝ln2/μmax＝0.63h

4.连续培养动力学

稀释率：单位时间内加入的培养基体积占发酵罐内培养基体积的分率

5.细胞的物料平衡

单级连续培养的细胞物料平衡方程如下：

根据单级连续培养的细胞物料平衡方程，按照比生长速率μ和稀释率D的大小关系，讨论培养罐内细胞浓度和营养物质浓度的变化情况。

答：

μ

D:

则

dX/dt

>0，培养罐内细胞浓度不断增加，营养物质浓度随之减少

μ

D：则dX/dt

<0，罐内细胞浓度不断减少，最后导致X趋近0.μ

=

D：则dX/dt

=0，细胞浓度不随时间而变化，即培养达到稳定状态。

6.限制性基质的物料平衡

临界稀释率（DC）:

发生洗出时的稀释率。

操作的稀释率不是可以随意改变的，而有一个限度。超过此稀释率时连续培养就无法进行，临界稀释率取决于加料中的限制性基质浓度，即细胞在此培养基中能达到的最大比生长速率。DC=

μmS

/(KS+S)

第十章　下游加工过程概论

1、下游技术（工程）

（downstream

processing）：对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。

2.发酵液的特点

1）含水多，产物含量低；

2）含菌体蛋白；

3）溶有原来培养基成分；

4）相当多的副产物和色素；

5）易被杂菌污染或使产物进一步分解；

6）易起泡，粘性物质多。

3、整个下游加工过程应遵循下列四个原则

1)

时间短；2)

温度低,（选择在生物物质的温度范围内）；3)

pH适中;4)

严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角）。

4、一般下游加工过程可分为4个阶段

1)培养液（发酵液）的预处理和固液分离；2)初步纯化（提取）；3)高度纯化（精制）；4)成品加工。

5、下游加工过程的一般流程

第十二章

发酵液的预处理和固液分离方法

1、改善发酵液过滤特性的物理化学方法：

调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。

2、凝聚——指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；常用的凝聚剂电解质有：硫酸铝

Al2(SO4)3•18H2O（明矾）；氯化铝

AlCl3•6H2O;三氯化铁

FeCl3;硫酸亚铁

FeSO4·7H2O

；石灰；ZnSO4；MgCO3

絮凝——指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。工业上使用的絮凝剂可分为三类：

1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；

2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；

3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。

目前最常见的高分子聚合物絮凝剂有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物

3、杂蛋白的去除方法有沉淀法、变性法、吸附法

4、固液分离的方法：重力沉降、浮选、旋液分离、介质过滤、离心。

5、根据过滤机理，过滤操作可分为澄清过滤和滤饼过滤。

第十三章

细胞破碎

1、细胞破碎的阻力：

细菌破碎的主要阻力:肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；

酵母细胞壁破碎的阻力:主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；

霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。

2、常用破碎方法

机械法：珠磨法（固体剪切作用）、高压匀浆法（液体剪切作用）、超声破碎法（液体剪切作用）、X-press法（固体剪切作用）。

非机械法：酶溶法（酶分解作用）、化学渗透法（改变细胞膜的渗透性）、渗透压法（渗透压剧烈改变）、冻结融化法（反复冻结-融化）、干燥法（改变细胞膜渗透性）

3、破碎率的测定方法

1）直接测定法

2）目的产物测定法

3）导电率测定法

第十四章

沉

淀

法（Precipitation）

1、固相析出技术：通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物溶解度降低，以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术。

结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体称为结晶法。

沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体称为沉淀法。常用的沉淀法：盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。

2、盐析(Salt

induced

precipitation)：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。原因如下：

1）无机离子与蛋白质表面电荷中和，形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，使蛋白质分子之间的排斥力减弱，从而能够相互靠拢；

2）中性盐的亲水性大，使蛋白质脱去水化膜，疏水区暴露，由于疏水区的相互作用导致沉淀；

Ks盐析法：在一定pH和温度下，改变体系离子强度进行盐析的方法；

β盐析法：在一定离子强度下，改变pH和温度进行盐析；

常用的盐析用盐：

硫酸铵、硫酸钠，磷酸盐，柠檬酸盐。

3、有机溶剂沉淀：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。

原理：

（1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。

（2）有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。

常用的有机溶剂沉析剂：

乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析；

丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；

4、等电点沉淀：调节体系pH值，使两性电解质的溶解度下降，析出的操作称为等电点沉淀。

原理：蛋白质是两性电解质，当溶液pH值处于等电点时，分子表面净电荷为0，双电层和水化膜结构被破坏，由于分子间引力，形成蛋白质聚集体，进而产生沉淀。

第十五章

膜

过

滤

法

1、膜过滤法指以压力为推动力，依靠膜的选择性，将液体中的组分进行分离的方法。基本原理是筛孔分离过程。在压差的推动下，原料液中的溶剂和小的溶质粒子从高压的料液侧透过膜到低压侧，所得到的液体一般称为滤出液或透过液，而大的粒子组分被膜截留。包括微滤（MF）、超滤（UF）、纳滤（NF）和反渗透（RO）四种过程。

在工业上用得最广的膜材料是醋酸纤维素和聚砜。

浓差极化：当溶剂透过膜，而溶质留在膜上，使膜面浓度增大，并高于主体中浓度，这种浓度差导致溶质自膜面反扩散至主体中，这种现象称为浓差极化。在超滤中，为减少浓差极化，通常采用错流操作。

膜的污染：膜在使用中，尽管操作条件保持不变，但通量仍逐渐降低的现象。

污染原因：膜与料液中某一溶质的相互作用；吸附在膜上的溶质和其它溶质的相互作用。

膜污染的消除：污染必须通过清洗的办法才能消除。经清洗后如纯水通量达到或接近原来水平，则认为污染已消除。

减轻膜污染的方法

1）预处理

2）改变膜的表面性质

市售的超滤器大致有四种型式：管式、中空纤维式、螺旋卷绕式和平板式。

2.将下列表示相同意义的词连线

separation

factor

分离因子

membrane

separation膜分离

ion-exchange

离子交换

Biotechnology生物技术

Metabolic

Control

fermentation

代谢控制发酵

Downstream

Processing

下游工程

Chromatographic

Resolution色谱分离

Biocatalyst，生物催化剂

Orthogonal

experimental

design

正交实验设计

response

surface

analysis响应面分析方法

Inducible

enzyme

诱导酶

末端代谢产物阻遏(End-product

repression)

分解代谢产物阻遏(Catabolite

repression)

代谢工程（metabolic

engineering)

临界氧浓度(critical

value

of

dissolved

oxygen

concentration)

补料分批培养（feed-batch

culture，FBC）

细

胞

破

碎

Cell

Disruption

高压匀浆法（High-pressure

homogenization

盐析(Salt

induced

precipitation)

微滤(Microfiltration，MF)

超

滤

(ultrafiltration，UF)

反渗透（Reverse

osmosis，RO）

纳滤(nanofiltration,NF)

正相色谱（Normal

Phase

Chromatography，NPC），反相色谱（Reversed

Phase

Chromatography，RPC），第十六章

溶剂萃取和浸取

1、溶剂萃取

利用一种溶质组分（如产物）在两个互不混溶的液相（如水相和有机溶剂相）中竟争性溶解和分配性质上的差异来进行分离操作的。

2、“相似相溶”原理分子之间可以有两方面的相似：一是分子结构相似，如分子的组成、官能团、形态结构的相似；二是能量(相互作用力)相似，如相互作用力有极性的和非极性之分，两种物质如相互作用力相近，则能互相溶解。与水“相似”的物质易溶于水，与油“相似”的物质易溶于油就是相似相溶原理的表现。

3、分配定律和分离因数

（1）分配定律：在一定温度一定压力的条件下，溶质分配在两个互不相溶的溶剂中，达到平衡时溶质在两相中的活度之比为一常数。如果是稀溶液，活度可用浓度代替，则达到平衡时溶质在两相中的浓度之比为一常数。称之为分配系数K，（2）分离因数

3、乳化和去乳化

乳化：一种液体（分散相）分散在另一种不相混溶的液体（连续相）中的现象。乳化的结果可能形成两种形式的乳浊液：一种是水包油型（O/W），另一种为油包水型（W

/

O）。

生产过程出现的乳浊液是水包油型（O/W），还是油包水型（W

/

O），主要由表面活性剂的性质决定。

4、双水相萃取：在一定条件下，水相也可以形成两相(即双水相系统)甚至多相。于是有可能将水溶性的酶、蛋白质等生物活性物质从一个水相转移到另一水相中，从而完成分离任务。

常用聚合物双水相系统：聚乙二醇－葡聚糖、聚乙二醇－无机盐系统

双水相萃取的优点：

1）使固液分离和纯化两个步骤同时进行，一步完成；

2）适合热敏物质的提取，主要是胞内酶；

3）亲水性聚合物加入水中，形成两相，在这两相中，水分都占大比例（85～95％），这样生物活性蛋白质在两相中不会失活，且以一定比例分配于两相中。

第十七章

离

子

交

换

法

1、离子交换原理及分类

离子交换树脂是一种不溶于酸、碱和有机溶剂的固态高分子材料。是一类带有官能团的网状结构的高分子化合物，其结构有三部分组成：不溶性的三维空间网状骨架，连接在骨架上的官能团和官能团所带的相反电荷的可交换离子。骨架上的活性离子在水溶液中发生离解，可在较大的范围内自由移动，扩散到溶液中，同时，在溶液中的同类型离子也能从溶液中扩散到骨架的网格或孔内。当这两种离子浓度差较大时，就产生一种交换的推动力，使它们之间产生交换作用，利用这种浓度差的推动力使树脂上的可交换离子发生可逆交换反应。

树脂按活性离子分类，活性离子是阳离子（和阳离子发生交换）就称为阳离子交换树脂；如果是阴离子，则称为阴离子交换树脂。

2、树脂的命名

根据离子交换树脂官能团的性质，将其分为强酸(0)、弱酸(1)、强碱(2)、弱碱(3)、螯合(4)、两性(5)及氧化还原(6)等7类。

3、离子交换树脂的理化性能指标

1）外观；2）交联度；3）化学稳定性；4）机械强度；5）交换量

4、影响离子交换树脂选择性的因素

1）离子价数

离子交换树脂总是优先选择高价离子，而低价离子被吸附时则较弱。

阳离子被吸附的顺序为：Fe3+

>Al3+

>Ca2+

>Mg2+

>Na+，阴离子顺序为：柠檬酸根>硫酸根>硝酸根

2）溶液浓度的影响

树脂对离子交换吸附的选择性，在稀溶液中比较大，而在浓溶液中选择性较小。

3）离子的水化半径

水化半径较小的离子优先吸附。

4）有机溶剂的影响

有机溶剂会使树脂对有机离子的选择性降低，而容易吸附无机离子，可利用有机溶剂从树脂上洗脱难洗脱的有机物质。

5）树脂与交换离子间的辅助力

凡能与树脂间形成辅助力，如氢键、范德华力等辅助力的离子，树脂对其吸附力就大；反之，能破坏这些辅助力的溶液就能容易地将离子从树脂上洗脱下来。

5、离子交换树脂的工作过程：

1）树脂预处理：新树脂装入柱后，先用去离子水浸泡12h左右，使树脂充分吸水膨胀，再用2-3倍树脂体积的10%左右食盐水浸泡4h以上。用水洗净残留的NaCl，再根据树脂类型和使用所需要的型号分别用酸和碱处理，最后调pH值至所需范围。

2）上柱交换交换方式：采用顺流和逆流进行

3）洗脱：用亲和力更强的同性离子取代树脂上吸附的目的产物。

4）树脂的再生：先用清水洗涤，然后用再生剂再生，最后用清水洗至所需pH值。

6.ISEP系统是一种连续的离子交换系统

目前已成功的应用在各种不同的产业领域中。ISEP系统采用多柱(20/30交换柱)吸附以及在稳定状态下连续运行。不需要备用设备；离子交换树脂的再生也不必中断正常的生产。

ISEP系统可以处理杂质浓度较高的物料，保证产品具有稳定的成分和浓度；采用多通道逆向流动再生方式，减少了离子交换树脂及、再生剂和洗涤水的用量。

工作过程：

交换：利用ISEP离子交换系统，对膜滤液中的赖氨酸离子进行吸附，与其他杂质分离，吸附分离下来的废水及杂质排出柱体，吸附饱和的柱体进入洗脱回填区。

回填：通过洗脱液回填压出柱体内的废水和杂质，以提高洗脱液纯度。

洗脱：利用一定浓度的氨水消除酸性，将赖氨酸离子从树脂上解析下来，并使树脂得到再生。

转型：再生柱进入再生区经过稀硫酸转型后在吸附区达到最佳的吸附能力。

第十八章

色谱分离法

1、色谱分离（Chromatographic

Resolution，CR）利用多组分混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子极性、分子形状和大小、分子亲合力、分配系数等）的差别，使各组分以不同程度分布在固定相和流动相中。当多组分混合物随流动相流动时，由于各组分物理化学性质的差别，而以不同的速率移动，使之分离。

特点分离效率高；检测能力强；样品用量少；适用范围广。

2.色谱分离过程：

两种组分的理化性质原本存在着微小的差异，经过反复多次地吸附→解吸→再吸附→再解吸的过程使微小差异累积起来，结果使吸附能力弱的组分先流出色谱柱，吸附能力强的组分后流出色谱柱，从而使各个组分得到了分离。

3.检测器

UV-Vis、荧光、电化学、蒸发光散射、示差折光、质谱等检测器。

4.色谱时间

死时间（Dead

time）：不被固定相吸附或溶解的惰性组分，从进样到出峰的峰顶点之间测得的时间,用tM表示。

保留时间（Retention

time）：从进样到组分峰顶点之间测得的时间，用tR表示。

调整保留时间(Adjusted

Retention

Time)：调整保留时间指组分的保留时间扣除死时间后的时间，5.气相色谱法主要利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异，以气体为流动相，以液体或固体为固定相从而达到分离混合物的色谱方法。

6.液相色谱：

首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。

4.凝胶色谱介质常用的有葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等。

分类

吸附色谱分离是指混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，由于固定相对不同物质的吸附力不同而使混合物分离的方法。

分配色谱是利用混合物中各物质在两液相中的分配系数不同而分离。根据固定相和流动相的极性与非极性的差别，分配色谱可分为正相色谱和反相色谱。

离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。

凝胶色谱以凝胶为固定相，是一种根据各物质分子大小不同而进行分离的色谱技术，又称为分子筛色谱（Molecular

Sieve

Chromatography，MSC）、空间排阻色谱或尺寸排阻色谱（Size

Exclusion

Chromatography，SEC）。

第十九章

蒸发、蒸馏和结晶

1、真空蒸发：冷凝器和蒸发器溶液侧的操作压力低于大气压、此时系统中的不凝性气体必须用真空泵抽出。

目的：降低溶液的沸点。

优点：

(1)溶液沸点低，可用温度较低的低压蒸汽或废蒸汽作加热蒸汽。

(2)溶液沸点低，同样蒸汽所需的传热面小。

(3)沸点低，有利于处理高温下易分解和变质的热敏性物料。

(4)蒸发器的操作温度低，系统的热损失小。

2、多效蒸发：第一个蒸发器(称为第一效)中蒸出的二次蒸汽用作第二个蒸发器(第二效)的加热蒸汽，第二个蒸发器蒸出的二次蒸汽用作第三个蒸发器

(第三效)的加热蒸汽，依此类推。

3、蒸发器的分类：分为膜式蒸发器和非膜式蒸发器两大类。膜式蒸发器又分为升膜蒸发器、降膜蒸发器、旋转刮板蒸发器、板式蒸发器。

4、酒精发酵醪液蒸馏的理论基础是拉乌尔定律。

拉乌尔定律：混合液中，蒸气压高的组分，在气相中的含量总是比液相中的高；反之，蒸气压低的组分，在液相中的含量总是比气相中的高。

5、饱和曲线和过饱和曲线

饱和溶液：溶液恰好饱和，溶质既无溶解也无结晶，即溶质与溶液处于平衡状态，此溶液称为饱和溶液；

未饱和溶液：若添加固体则固体溶解；

过饱和溶液：超过饱和点的溶质迟早要从溶液中沉淀出来。

要使溶质从溶液中结晶出来，须首先使溶液成为过饱和状态，也即必须设法产生一定的过饱和度作为推动力。

6、溶液的过饱和度与结晶的关系：

AB为饱和曲线；CD为过饱和曲线。

AB和CD将图分为：稳定区、介稳区和不稳区。

稳定区：溶液尚未饱和，没有结晶的可能。

介稳区：也不会自发产生晶核，但如已有晶核，则晶核长大而吸收溶质直至浓度回落到饱和线上。

不稳区：能自发产生晶核。

如E点是溶液的原始末饱和状态，E

H是冷却结晶线，F点是饱和点，不能结晶，到达G点时，自发产生晶核。

7、结晶包括三个过程：形成过饱和溶液；晶核形成；晶体生长。

8、接触成核(碰撞成核)：新生的晶核是晶浆(有晶体存在的结晶溶液)中已有的晶体颗粒，在结晶器中与其他固体接触碰撞时产生的晶体表层的碎粒。其中较大的就是新的晶核。

优点：

①动力学级数较低，即溶液过饱和度对成核影响较小。

②在低过饱和度下进行，能得到优质结晶产品。

③产生晶核所需要的能量非常低，被碰撞的晶体不会造成宏观上的磨损。

在工业生产中，接触成核有以下4种方式：

(1)晶体与搅拌螺旋桨间的碰撞；

(2)湍流下晶体与结晶器壁间的碰撞；

(3)湍流下晶体与晶体的碰撞；

(4)沉降速度不同，晶体与晶体的碰撞。

其中以第1种方式为主。

第二十章

典型发酵产品介绍

1、酿造酒包括黄酒、啤酒、葡萄酒，酒精含量比较低。蒸馏酒主要指白酒、白兰地等。蒸馏酒的酒精含量高。

2、红葡萄酒：用果皮带色的葡萄带皮发酵制成，酒色呈深红、鲜红、紫红或宝石红。

白葡萄酒用白葡萄或红皮白肉葡萄的果汁制成，酒色呈浅黄、禾秆黄、金黄色或近似无色。

3、白兰地商标上的英文缩写：X.O（Extra

Old）酒龄（即贮陈期）规定不低于10年。

4、啤酒生产中麦汁煮沸的目的：蒸发水分，浓缩麦汁；钝化全部酶和麦汁杀菌；蛋白质变性和絮凝；酒花有效组分的浸出；排除麦汁中特异的异杂臭气。

5、白酒的四大香型：

米香型：桂林三花酒；发酵完成后经过反复二至三次蒸馏，酒精度数较高，民间过去叫“三蒸酒”、“三熬酒”。酿酒师们总结出了“观花论酒”的经验。当酒度在55°至

60°时，由于液体表面张力，酒面晃动便泛起数层酒花，经久不散。酿酒师们说“起花了，三花！”就接酒。

酱香型

（茅型酒）茅台酒；原料为高粱，曲为纯小麦制高温曲，八次蒸料，八次下曲，八次发酵，八次蒸馏（但仅取酒7次，因为第一次蒸馏出的不作正品，泼回酒窖重新发酵）。

浓香型

（庐型酒）：庐州老窖——产于四川泸州市。千年窖，万年糟，传统的老五甑生产工艺，混蒸，主体香为己酸乙酯。纯小麦制大曲，以糯玉米为原料。根据酒的质量可分特曲、头曲、二曲和三曲。五粮液采用五种粮食（高梁、大米、糯米、小麦、玉米）为原料。

清香型

（汾型酒）：汾酒——产于山西汾阳县杏花村，二次发酵二次勾兑。前次发酵21天，蒸馏，加酒糟，再发酵21天，再蒸馏。清蒸二次清工艺，乙酸乙酯和乳酸乙酯两者的结合为主体香。

6、青霉素生产工艺

青霉素簇和头孢菌素簇是临床上最为重要的抗生素，属于β-内酰胺类抗生素。

青霉素(Benzylpenicillin

/

Penicillin)是指分子中含有青霉烷酸，能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用的一类抗生素。

青霉素的生物合成过程：

在青霉素发酵中，已知产黄青霉利用葡萄糖和氨，经由a—氨基己二酸、半胱氨酸和缬氨酸在三肽合成酶的催化下合成三肽，异青霉素N合成酶催化发生环化生成异青霉素N，再与苯乙酸、苯乙胺、苯乙酰胺、苯乙酰甘氨酸等在异青霉素N酰基转移酶催化进行转酰基反应，产生青霉素G。

（1）常用菌种为产黄青霉。

（2）青霉素G的合成途径

（2）

发酵工艺

（3）发酵控制

①加糖控制一般在残糖将至0.6％左右，pH上升时开始加糖。

②补氮及加前体加硫酸铵、氨水或尿素，使发酵液氮源控制在0.01～0.05％。补前体以使发酵液中残余苯乙酰胺浓度为0.05～0.08％。

③pH控制加酸或碱自动控制pH，一般为6.4～6.6。

④温度控制一般前期25～26℃，后期23℃，以减少后期发酵液中青霉素的降解破坏。

⑤通气和搅拌抗生素深层培养需要通气与搅拌。

⑥泡沫和消泡可用天然油脂如豆油、玉米油或用化学合成消泡剂“泡敌”（环氧丙稀环氧乙烯聚醚类）来消泡。应当控制其用量并少量多次加入。

⑦过滤宜采用鼓式真空过滤器。过滤前加去乳化剂降温。

⑧提炼采用溶媒萃取法，醋酸丁酯（BA）作溶媒。

⑨脱色采用活性炭进行脱色。过滤。

⑩共沸蒸馏或直接结晶

7.酶制剂的生产方法：固态发酵法和深层液体培养法

7.1利用微生物产酶的优点

（1）微生物种类多、酶种丰富，且菌株易诱变，菌种多样。

（2）微生物生长繁殖快，易提取酶，特别是胞外酶。

（3）微生物培养基来源广泛、价格便宜。

（4）可控制酶发酵生产过程，生产可连续化、自动化。

（5）可以利用现代分子生物学技术，选育菌种、增加酶产率和开发新酶种

枯草杆菌BF-7658液体深层发酵生产α-淀粉酶的发酵控制：

工艺流程：

A种子制备：

孢子培养一般采用马铃薯培养基，于37℃下培养72

h，使菌体全部形成孢子即为成熟。

种子培养维持罐温37℃，罐压0.5～0.8

atm，10h后加大通风，当菌体处于对数生长期后期，立刻接种至大罐，种子培养一般14h左右。

发酵控制：

通常采用低浓度发酵和高浓度补料的方法，优点：低浓度可以避免原料中淀粉降解生成的糖过量堆积而引起分解代谢阻遏，有利于pH值控制，延长产酶期。

温度37℃，罐压0.5

atm，通气量0～12

h控制0.5～0.6

VVM，12

h后控制在0.8～1.0

VVM，发酵后期控制在0.9

VVM。

补料体积和基础培养基体积一般为1:3左右。从10

h左右开始补加，一般前期、后期少，中期大，根据菌体的生长情况来调整。当pH低于6.5，细胞生长粗壮时可酌减；当pH高于6.5，细胞出现衰老并有空胞时可酌增。

停止补料后6-8h，温度不再上升，菌体衰老（80%菌体形成空胞），酶活不再提高，发酵即可结束。发酵周期一般为40

h。

提取：工业上回收α-淀粉酶一般采用硫酸铵盐析法。

8.二步发酵法生产维生素C工艺有酸转化工艺和碱转化工艺两种。

维生素C（2,3,4,5,6-五羟基-2-己烯酸-4-内酯）的合成方法主要有莱氏化学合成法和微生物发酵合成法两种。

酸转化设备简单、流程短，但制得的维生素C破坏严重、质量差，设备腐蚀严重，三废多，因此逐渐淘汰。

碱转化虽然流程较长、投资大，但产品质量好，故目前绝大部分工厂均采用碱转化工艺。

1985年转让二步发酵法生产维生素C工艺给世界上生产维生素最大企业－瑞士霍夫曼•罗氏制药公司。——我国医药工业史上首次出口技术。

二步发酵法反应步骤：

D-山梨醇

L-山梨糖

2-酮基-

L-古龙酸

2-酮基-L-古

龙酸甲酯

维生素C钠

维生素C

生物氧化

黑醋菌

混合菌

生物氧化

甲酯化

H2SO4,CH3OH

内酯化

NaHCO3,CH3OH

酸化

H2SO4,CH3OH

二步发酵法的整个生产工艺流程可分为发酵、提取、转化和精制四部分

二步发酵：

第一步发酵中所用菌种为生黑葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter

melagenus），简称黑醋菌。最常用的生产菌株为R-30；

第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。小菌为氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter

oxydans），工业生产过程中使用最多的大菌为2980及152混合菌。

9.谷氨酸发酵

菌种主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属的细菌。这些菌都是需氧微生物，都需要以生物素为生长因子。

谷氨酸发酵过程

发酵初期，即菌体生长的迟滞期

糖基本没有利用，尿素分解放出氨使pH值略有上升，一般为2～4h。

对数生长期

代谢旺盛，糖耗快，尿素大量分解，pH值很快上升，但随着氨被利用pH值又下降；溶氧浓度急剧下降，然后又维持在一定水平上；菌体浓度（OD值）迅速增大，菌体形态为排列整齐的八字形。及时供给菌体生长必需的氮源及调节培养液的pH值至7.5～8.0，必须流加尿素；又由于代谢旺盛，泡沫增加并放出大量发酵热，故必须进行冷却，使温度维持30～32℃。菌体繁殖的结果，菌体内的生物素含量由丰富转为贫乏。这个阶段主要是菌体生长，几乎不产酸，一般为12h左右。

谷氨酸合成阶段

当菌体生长基本停滞就转入谷氨酸合成阶段，此时菌体浓度基本不变，糖与尿素分解后产生的α－酮戊二酸和氨主要用来合成谷氨酸。这一阶段，为了提供谷氨酸合成所必需的氨及维持谷氨酸合成最适的pH7.2～7.4，必须及时流加尿素，又为了促进谷氨酸的合成需加大通气量，并将发酵温度提高到谷氨酸合成最适的温度34～37℃。

发酵后期，菌体衰老、糖耗缓慢、残糖低，此时流加尿素必须相应减少。当营养物质耗尽酸浓度不再增加时，需及时放罐。

发酵周期一般为30多小时。

谷氨酸提取的新工艺

柠檬酸的发酵生产工艺

以糖质原料发酵生产柠檬酸的常用菌种是黑曲霉

黑曲霉柠檬酸的积累机制总结

1)

Mn2＋缺乏抑制了蛋白质合成，导致细胞内NH4＋浓度升高，解除了对磷酸果糖激酶（PFK）的抑制，促进了EMP途径的畅通；

2)

丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制，可以不断地提供草酰乙酸。同时组成型柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸能力。

3)

控制Fe2+含量，顺乌头酸酶活力低，柠檬酸进一步代谢减少，使柠檬酸积累；

4)

柠檬酸积累使pH值降低，在低pH值下，顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，就更有利于柠檬酸的积累并排出体外。

发酵操作方法分为不置换法和置换法两种。

柠檬酸提取方法

考试题型：

填空题10题共10分；选择题10题共10分；判断题10题共10分，英汉词语对照10分；简答4题20分；分析讨论题2题10分；应用题（计算题和工艺流程及发酵控制）2题或3题共30分；

第三篇：生物发酵车间管理制度

发酵车间管理制度（试行）

为促进企业发展，确保产品质量，严肃厂纪厂规，维持良好的生产秩序，提高劳动生产率，确保发酵车间的正常生产，特制定本管理制度：

一生产管理制度：

1.车间员工按时上下班，不迟到不早退，交接班工作提前10分种进行。2.上岗前按要求穿戴好工作服，岗位操作过程中所需的劳保用品准备齐全。3.车间严禁吸烟和酒后上岗，工作期间严禁打闹，禁止脱、串岗，轮换用餐，严禁空岗现象发生。

4.发酵生产操作过程中必须穿戴好所需的劳保用品，防止化学灼伤、烫伤等，尤其是在流加碱以及发酵设备空消和培养基实消时要特别注意。

5.严格按生产质量标准、工艺规程进行操作，重点操作采取二人复核制。6.发酵控制过程中严格操作，不得擅自邀请提高或降低标准，操作过程中如实作好发酵记录，仔细观察操作过程中的现象，防止掉零、顶罐、超温、超压等意外情况发生。

7.操作过程中发生异常情况时，应及时向车间主管人员报告，经确认后，方可进行处理。

8.当班人员工作的内容包括，工艺温度、压力、补料流量、发酵罐液位，观察设备运转，管路、阀门等一雪与生产相关的内容，发现异常及时处理，若班组不能处理及时上报。

9.车间所用工器具、物料等，用完后及时归位，并摆放在指定的区域内。

10.随时保持车间内的环境卫生，发现跑、冒、滴、漏、污及时处理，做好文明、卫生生产。

11.爱惜生产设备和环境设施，认真执行设备保养制度，严格遵守设备运行操作规程。

12.严禁擅自动用各类消防器材，或在消防设施附近堆放其它物品。

13.员工有责任维护车间环境卫生，严禁随地吐痰，乱扔垃圾，在生产过程中要注意节约用料，不得随意乱扔物品，工具、废旧阀门、备件及时退库。

14.操作人员每日上岗前必须将设备及工作岗位清扫干净，保证工作区的卫生整洁，办公文件、记录不得杂乱无章。

15..严格交接班制度，仔细交接生产工艺、设备运行情况，以及工具、现场卫生。16.车间员工和外来人员进入特殊工作岗位应遵守特殊规定，确保人身和生产安全。

17.任何人不得携带违禁物品、危险品或与生产无关的物品进入车间，不得将私人用品放在工作场所。

18.非本公司人员未经公司领导允许，禁止进入发酵车间现场。

二、岗位责任制度：

1、种子组岗位职责：

1）按照生产计划，保证生产种子的正常供应。2）进行菌种的自然分离，保证种子的稳定，做好菌种的优化改良工作。3）进行原材料的小试，保证原料的质量。

4）对种子质量进行分析，找出种子质量波动的原因。5）保证种子的使用安全，防止菌种的流失。6）保证设备使用安全，按SOP进行操作。

7)遵守公司和车间各项规章制度，做好菌种组内环境卫生工作。

2、配料岗位职责：

1）按配料单准确称取各种物料，要求不漏料，不错料，不重料并且称量正确。2）严格按照生产工艺要求对物料进行处理，对配料过程中物料存在的异常情况及时与有关人员联系。

3）按照生产工艺要求将物料顺序加入罐内，操作要认真仔细，不得将物料洒落罐外，以免造成浪费和污染。

4）遵守公司和车间各项规章制度，做好配料现场卫生清理工作。

3、消毒岗位职责：

1）严格按照工艺规程和岗位安全操作法，按时完成生产计划所下达的消毒任务，保证生产能按计划进行。

2）对所消毒的罐批，承担相应的责任。

3）消毒前应做好罐内外的检查、清理、试漏等工作使罐体、管件和阀门等无异常，确保无泄漏。

4）严格按照岗位安全操作法，进行消毒和接（移）种操作，在实际操作过程中，遇到疑难问题立即与有关人员联系，及时解决。

5）准确及时做好各项操作的原始记录和交接班记录。6）做好放罐后与下一岗位的交接工作。

7）放罐后清洗罐内，并进行设备的相关检查。

8）遵守公司和车间各项规章制度，做好工作区域内的卫生清洁工作。

4、看罐岗位职责：

1）坚守岗位，贯彻“勤跑、勤看、勤查”的原则，随时观察发酵情况。

2）注意设备运行情况，控制好罐温、罐压、空气流量、补料流量等工艺参数。3）时时注意发酵培养的各种参数变化，及时记录真实数据，一旦发生异常立即与有关人员联系，并及时解决处理，保证发酵生产的正常进行。4）准确补料，配合化验室取样人员准确取样。

5）遵守公司和车间各项规章制度，做好工作区域内的卫生清洁工作。

三、培训管理制度：

1、车间工程师或工艺员负责员工培训的日常管理工作，培训应有相关记录。

2、车间培训分为外部培训、内部培训，外部培训有公司培训和外聘人员培训，内部培训有车间培训和岗位培训。

3、车间培训内容包括公司级、职能部门制度文件、车间管理制度、岗位操作规程等。

4、车间培训不拘于特定形式。可以采取讲课，现场模拟操作，互动交流等一切模式。

5、车间培训要求全员参加，定期考核培训效果，考核结果纳入绩效考核。

第四篇：生物工艺学实习报告

一． 实习时间：2010年11月21日二．实习地点：河南省濮阳市泓天威药业有限公司三．实习目的：通过参观实习及老师和车间主任的讲解，结合所学理论知识，了

四．实习背景：濮阳市泓天威药业有限公司是以生物发酵制品为主，集科研、生

销售于一体的高技术企业。公司创建于1997年，五．实习内容：观实习，在老师的指导和车间主任的讲解下，通过实地考察、认真学习、观看生产流程等方式，理论联系实际，实践辅助教学。巩固和运用已学的知识，在实践中加深对理论知识的理解，培养独立思考和创造性思维，为以后的实习和工作打下基础。年11月21日这一天，我们怀着期待的心情，经过了将近三个小时的车程，来到了泓天威药业有限公司的办公大楼前。车间主任在我们一到来时就给我们讲了重中之重的安全问题，首先是工厂内部严禁吸烟，以防免发生爆炸等严重事故；其次是要听老师和主任的话，不要乱摸乱碰生产设备，因为有些设备处于高温状态，很容易烫伤人。• 讲完了安全问题后，主任带着我们走进了第一个车间—发酵车间。在这个车间里，我们首先看到了培养基配置罐，这是我们看到的第一个工厂生产设备，我深深地感叹，果然是作为工厂大型生产用的设备，体积真的很大。然后我们上了三楼，看到了二级种子罐，主任给我们讲解了工厂中抗生素的发酵流程，即保藏菌种→三角瓶→摇床培养→种子罐→二级种子罐→发酵罐。• 接着我们到了提取车间，主任告诉我们提取的两种方法，就是溶媒萃取法和树脂离子交换法。溶媒萃取法的过程是放入提取剂，经过预处理和板框压滤机，把液体输送到环保站进行处理，固体为有用部分，该品种效价主要集中在胞内，把菌丝体取出来以后加入溶媒，经过一段时间浸泡，把所需大分子活性成分（溶于有机溶剂，不溶于水）进行除渣，分离出纯正有机相，对其进行浓缩，之后进行结晶（先成盐，再结晶），成盐过程中加入上盐根（马杜霉素铵加上NH4，硫酸安普霉素加上SO4），未结合盐根的初始状态为游离状态，结晶后用分子离心机进行分离，离心后进行烘干，烘干后成细小粉末，然后进行粉碎，最后加入辅料进行包装成为抗生素。树脂离子交换法是发酵液进入提取车间，经预处理后，把阳树脂涂在预处理罐中，在搅拌过程中让树脂在发酵液中悬浮，期间，有效成分会吸附到树脂上，因为树脂密度比水大，所以在吸附完毕停止搅拌后，经过静止，树脂会自然沉降到最底层，上面没有用的液体即残液，需送至环保站进行处理；然后把剩余的树脂收集起来，经过洗涤、漂洗，再用解析剂（含有Na或NH4）把有效成分置换出来，收集的有效成分装入到离子交换柱中，该过程即为装柱。解析下来的有效成分经过阴柱去除色素和其他杂质。此时从阴柱出来的液体已经比较干净，经浓缩和成盐，然后将成盐液进行喷雾干燥，在喷雾干燥塔中将水分瞬间蒸发掉蒸发完后固体物质沉降下来，将该固体物质收集起来即为成品。其中，离子交换柱分为阳柱和阴柱，阳柱内装阳树脂，阴柱内装阴树脂，已经吸附产品（有效成分）的为阳柱，阴柱主要装711树脂，功能为吸附色素和杂质，但不吸附有效成分。看了提取车间后我们上了三楼的预处理车间，在这里我们看到了预处理罐和板框压滤机。• 接着我们去了空压机房，在这里我们了解了实际中的空气灭菌流程，即空气→高空取气管→粗过滤器→空气压缩机→贮气罐→冷却器→过滤器→无菌空气。• 最后我们到了至关重要的一环，就是环保站。环保站之所以重要，就是由于发酵废液中含有太多对环境有害处的物质，如果直接排入河道中就会污染环境，所以为了造福子孙后代，我们必须要把环保这一环做好。环保站包括：高浓度调节池、低浓度调节池、厌氧塔、气浮池、初沉池、反应罐、水解酸化池、综合调低浓度的残液流入到低浓度调节池，高浓度残液经高浓度调节池调节完后进行过滤，剩下的液体和低浓度残液一起经过水解酸化池、污泥沉淀池后进入厌氧塔。液体在厌氧塔中进行厌氧消化，经过厌氧消化后降解大量BOD（即五日生化需氧++2-+

量），同时厌氧菌产生沼气（可回收利用，为厌氧菌提供其在发酵时所需的热能）最后沉淀下来的固体物质经过滤后变为固体废渣，将其进行焚烧。液体经一系列处理后变得较为澄清后排入河道。六．实习总结：实习结束了，感触颇多，作为一名生物工程专业的学生，实习中我感受到了动手能力的重要性，在学校都是学的理论，例如什么，学习各车间物料流程，把理论与实践相结合。同这次实习让我学到了很多东西，对我而言有着十分重要的意义。而且在。通过这次实习，我发现我自己存在不少问题，自己的缺点、不在此我真心的感谢老师和校方为我们提供这次珍贵的实习机会。本实习

物理

第五篇：2013-2014第一学期发酵工艺学实验指导书

实验一酸奶的制作

一、实验目的1.通过酸奶的制作，了解乳酸发酵的基本原理。

2.掌握酸奶的制作技术。

二、实验原理

酸奶是鲜奶经过乳酸菌发酵而制成的乳制品，具备鲜奶的全部营养成分。酸奶含有人体必需的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、乳糖酶和活性乳酸菌等。酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质,经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品。在发酵过程中,鲜牛奶中的酪蛋白遇酸凝固,成为有弹性的凝块,颜色乳白、气味清香、酸甜可口,别具一番风味。乳酸菌具有把奶类中的乳糖，分解成乳酸的功能，称为乳酸发酵。在形成乳酸的同时也产生其他一些酸类物质，从而导致了PH 值的下降，当达到乳类蛋白质的等电点时（如牛奶蛋白质的等电点约在PH4.5 左右），引起蛋白质的沉淀，使原来流动性较大的乳类，因凝固作用而变成类似果冻的胶状物，称之为“凝乳”。

三、实验试剂与器皿

1.菌种：嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌，乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离；

2.培养基：脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖；

3.恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶(200～280mL)、培养皿、试管、300mL三角瓶。

四、实验方法与步骤

1．酸奶的制作

1.1将1%-2% 脱脂乳于80～85℃ 灭菌10～5min，同时加入5%--6%蔗糖，充分混合，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。

1.2将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2%～5%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，随后将瓶盖拧紧密封。

1.3把接种后的酸乳瓶置于40--42℃恒温箱中培养3～4h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃的低温下冷藏24h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH4～

4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

1.4采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。

2注意事项

2.1制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风味和良好口感。

2.2牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。

2.3作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。经品尝和检验，合格的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保存6～7d。

五、实验结果

1.乳酸发酵过程、检测结果及结果分析。

2.将发酵的酸乳品评结果记录。

品评项目：凝乳情况、口感、香味、异味等。

六、分析与讨论

发酵酸乳为什么能引起凝乳？

实验二 甜酒酿的制作

一、实验目的1.通过甜酒酿的制作了解酿酒的基本原理。

2.掌握甜酒酿的制作技术。

二、实验原理

以糯米（或大米）经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。

甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，利用酒药中的根霉和米曲霉等微生物将原料中糊化后的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。

三、实验试剂与器皿

1.材料：糯米、酒药

2.仪器和器具：手提高压灭菌锅，不锈钢丝碗，滤布，烧杯，不锈钢锅。

四、实验方法与步骤

1.洗米蒸饭：将糯米淘洗干净，用水浸泡16-24h, 捞起放于置有滤布的钢丝碗中，于高压锅内蒸熟（约0.1Mpa, 9min），使饭“熟而不糊”。

2.淋水降温：用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至35℃左右，同时使饭粒松散。

3.落缸搭窝：将酒药均匀拌入饭内，并在洗干净的烧杯内洒少许酒药，然后将饭松散放入烧杯内，搭成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。盖上培养皿盖。

4.保温发酵：于30℃进行发酵，待发酵2天后，当窝内甜液达饭堆2/3高度时，进行搅拌，再发酵1天左右即可。

五、实验结果

1.发酵期间每天观察、记录发酵现象。

2.对产品进行感官评定，写出品尝体会。

六、分析与讨论

实验过程中应该注意哪些问题？

实验三 泡萝卜的制作

一、实验目的1.通过泡萝卜的制作了解泡菜的基本原理。

2.掌握泡萝卜的制作技术。

二、实验原理

制作泡菜时，泡菜水中含有乳酸菌、硝酸盐还原菌和其他杂菌。乳酸菌可使蔬菜发酵，能有效控制发酵过程，抑制其他菌类和微生物生长，它保存有大量维生素C、L-乳酸菌，使泡好的蔬菜中的营养易被人体吸收利用；盐浓度高以及酒可抵制杂菌生长，防止泡菜发霉、变质，所以我们在泡菜水中要加盐和白酒；一般我们制作泡菜用的白萝卜等蔬菜含有丰富的硝酸盐，硝酸盐还原菌可以促进硝酸盐还原为亚硝酸盐（一种致癌物质）。亚硝酸盐含量先是不断升高（6天左右亚硝酸盐含量就可以达到最高峰），而在10天后泡菜中的亚硝酸盐含量开始有明显下降,这是由于随着腌制时间的延长，乳酸细菌也大量繁殖，对硝酸盐还原菌产生一定的抑制作用，影响其生长繁殖，并且乳酸菌可以降解亚硝酸盐，所以造成泡菜中

亚硝酸盐的含量后期又有所下降，一般在15-20天内降到安全范围内。所以我们泡菜必须等到15天以后方可食用，最好是20天后。

三、实验试剂与器皿

1.材料：白萝卜、高粱白酒、花椒、辣椒、大料、冰糖、盐

2.仪器和器具：锅，泡菜坛子。

四、实验方法与步骤

1.培养泡菜发酵菌

（1）首先在冷水里放入一些花椒，适量的盐，然后把水烧开.水量在坛子容量的10-20%左右，不要太多。盐比平时做菜时多放一点，感觉很咸即止.花椒放大约20到30粒左右，尽量多放些，那样泡出菜的香.（2）待水完全冷却后，灌入坛子内，然后加一两高粱酒.其它酒不行，泡菜菌其实就是从高粱酒麴来的.（3）放辣椒椒、生姜进去，可多放些，可增加菜的味。且这种菜要保持坛子内一直有，它们有杀菌提味的作用。

（4）2－3天后可注意仔细观察，看青椒周围是否有汽泡形成，开始的时候是一到两个十分细小的气泡，不注意观察几乎看不见.如果有汽泡，哪怕是一个气泡，就说明发酵正常，待青椒完全变黄后，再放2至3天，成了!

（5）泡菜的原汁就这样做好了（泡菜菌培养好了）。泡菜菌属于厌氧菌，注意坛口的密封十分重要.注意事项：坛子内壁必须洗干净，然后把生水擦干，或干脆用开水烫一下也行.绝对不能有生水.为什么不能有生水呢？道理很简单，自来水（生水）里的氯，会杀死泡菜菌

2.泡制

（1）制好的泡菜水先加入大料、冰糖适量。

（2）蔬菜洗干净后，切成大快或条（不要太小），凉干水份.（3）放入培养好的泡菜原汁坛内，萝卜必须完全淹没在水里，然后密封坛口.（4）每加入一次新的菜要加入相应的盐，要适量。如果盐多了，会咸，少了，菜酸。

五、实验结果

1.发酵期间每天观察、记录发酵现象。

2.对产品进行感官评定，写出品尝体会。

六、分析与讨论

实验过程中应该注意哪些问题？

实验四 橘子酒的制作

一、实验目的1.通过橘子酒的制作了解果酒制作的基本原理。

2.掌握橘子酒的制作技术。

二、实验原理

果酒就是通过酵母把果糖和糖份转化成酒精，同时释放二氧化碳的过程。果酒制作时产生的酒精度、甜度和糖分有关，糖份多就能更多转化为酒精，所以酿酒是最好有糖度计的。所谓干型的酒就是糖份完全转化成了酒精，而半干或者甜型的酒则通过提早结束发酵的方法来保留一定的糖份。所以酒是否是甜型的和开始是否加糖完全没有关系，如果一点不加糖，除非你的水果够甜，否则则很难转化成足够的酒精度来维持正常的发酵。

三、实验试剂与器皿

3.1材料：酸甜型的橘子3斤，纯净水1.2L，糖1.4斤，果酒酵母1克，果胶酶1克，酵母营养素1克

3.2仪器和器具：玻璃瓶、锅等。

四、实验方法与步骤

1.橘子去皮，同时用纯净水溶解白糖。

2.把橘子捏碎放入玻璃瓶中，倒入白糖水。

3.用两小勺纯净水分别溶解果胶酶和酵母营养素。

4.将果胶酶水倒入瓶中。

5.将酵母营养素的水倒入品种。

6.活化酵母（把酵母放在杯中，倒入38度－40度的温水，不可超过此温度，搅拌一下后放置15分钟，随后再稍许搅拌一下）。

7.把活化好的酵母溶液倒入玻璃瓶中（记住酵母不能骤冷骤热，所以酵母溶液和橘子糖水溶液的温差不能大于十度）。

8.随后用干净的筷子充分搅拌瓶中的液体和果肉，随后盖上盖子，放置在避光荫凉处，24小时内会开始发酵。

9.接下来是主发酵的过程，主发酵的时间一般5－10天，可根据个人口味尝试酒液决定。喜欢果味重的时间短，喜欢酒味重的时间长。

10.尝到酒液合自己胃口时，主发酵结束，就可以过滤了。

11.把过滤出的酒液装瓶，同样因为还会有余酵，所以不可满瓶。

12.余发酵的过程会不断析出沉淀物，因为沉淀物会影响酒的品质，所以一般2－3天左右过滤一下，直到完全没有沉淀物析出为止。

13.等完全没有气泡和沉淀物产生，发酵就算是完成了，此时的酒可以装瓶饮用了，这时就是比较清新的风格。如果喜欢味道更醇厚的，就装瓶放置一段时间以后饮用。这个可以根据你自己的尝试决定。需要提示的是，这个时期装瓶就要满瓶了，尽量隔绝空气，以免氧化变质。

五、实验结果

1.发酵期间每天观察、记录发酵现象。

2.对产品进行感官评定，写出品尝体会。

六、分析与讨论

实验过程中应该注意哪些问题？

实验五产黄酮内生真菌的筛选

一、实验目的1.学会微生物的筛选方法。

2.熟悉无菌操作。

3.掌握薄层层析技术。

4.掌握微生物的液体发酵操作。

二、实验原理

黄酮类物质广泛的存在于植物中。植物中的内生真菌可产生与宿主植物相同或相似的生理活性物质，因此在前期已经筛选出的油茶内生真菌的基础上进行产黄酮内生真菌的筛选。黄酮类物质的鉴定分为颜色反应鉴定和薄层层析鉴定。初筛使用颜色反应，复筛时使用薄层层析技术，对照标准品，比较Rf值。

三、实验试剂与器皿

1.材料：油茶；

2.实验试剂：PDA培养基（马铃薯，葡萄糖，琼脂。）、乙酸乙酯、甲醇、石油醚、乙醇

3.实验器皿和仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、摇床、培养皿、试管、300mL三角瓶、布氏漏斗。

四、实验方法与步骤

1.菌株活化

将冰箱中保存的10种油茶内生真菌菌株置于28℃恒温培养箱中活化48h。

2.菌株的发酵培养

挑取活化后的菌株转接于PDA平板上，28℃恒温培养倒置配置培养5天，取菌落边缘长势较旺盛处的菌丝接于装量为200ml/500ml的PDA液体培养基中，28℃摇床培养，120r/min，培养5-7天，在相同条件下，做一个阴性对照。

3.有效成分提取

将发酵后的产物用布氏漏斗分离菌丝体和发酵液，保留发酵液。发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，至乙酸乙酯层无色，合并萃取液。在水浴锅中77℃浓缩萃取液，得到浸膏状物质，用2ml甲醇溶解，4℃保存。

4.初筛

将甲醇溶液取1ml于试管中，加入少量镁粉和4-5滴浓盐酸，置于沸水浴中，观察溶液颜色变化。若颜色呈现红色到紫红色，显蓝或绿色，则为阳性。

5.复筛

将初筛的结果用于复筛，用毛细管蘸取少量甲醇溶液和5mg/ml芦丁溶液，点在薄层层析板上，层析用的扩展剂为石油醚：乙醇=1:1，层析至溶剂前沿上升到一半以上，将薄层层析板取出，自然晾干，置于浓氨水下熏蒸几分钟，比较样品斑点与标准品斑点的位置，计算Rf值。

五、实验结果

筛选过程、结果及结果分析。

六、分析与讨论

实验过程中应该注意哪些问题？