免疫组化经验总结5篇

第一篇：免疫组化经验总结

免疫组化

关键词： 免疫 组织化学 细胞2012-03-30 14:41 来源：互联网 点击次数：14044 一，免疫组织化学简介

免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应炕原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

二，免疫组化技术的基本原理

免疫组化技术是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。

免疫酶组化技术是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再借酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位，根据酶标记的部位可将其分为直接法（一步法）、间接法（二步法）、桥联法（多步法）等，用于标记的抗体可以是用免疫动物制备的多克隆抗体或特异性单克隆抗体，最好是特异性强的高效价的单克隆抗体。直接法是将酶直接标记在第一抗体上，间接法是将酶标记在第二抗体上，检测组织细胞内的特定抗原物质。目前通常选用免疫酶组化间接染色法。

三，免疫组化步骤

1，切片，烤片60℃，1h；

2，脱蜡及复水

二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自来水1min，双氧水1min；

3，1份30％H2O2加10份蒸馏水，室温10min，蒸馏水洗3次，每次3min；

4，微波修复

将切片浸入0.01M枸橼酸缓冲液，微波中最大火力（98℃-100℃）加热至沸腾，冷却（约5-10min），反复两次；

5，将切片自然冷却至室温，PBS洗涤3次，每次5min；

6，封闭，5％BSA，室温20min，甩去多余液体；

7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃过夜；

8，PBS洗涤3次，每次3min；

9，滴加二抗，37℃，15-30min；

10，PBS洗涤3次，每次3min；

11，滴加SABC，37℃，30min；

12，PBS洗涤3次，每次5min；

13，1ml蒸馏水中分别滴加显色剂，混匀；

14，DAB显色剂配置好后，滴加于切片，室温，镜下检测反应时间（约5min）；

15，自来水冲洗干净，过蒸馏水；

16，苏木素复染2min，自来水冲洗；

17，脱水

30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

18，树胶封片，镜检。

四，免疫组化常见问题分析

1，石蜡切片在染色过程中出现脱片现象

1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度；

2）用含有多聚赖氨酸的玻片，可以购买到或这自己做；

3）有些组织本身就容易掉片，如骨组织等，操作时冲PBS不要直接冲到组织上，冲到组织上方，让它流下冲洗组织；

4）用高温修复时，温度骤冷也可能引起。

2，边缘效应

1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致.解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织；

2）切片上滴加的试剂未充分覆盖组织，边缘的试剂容易首先变干，浓度较中心组织高而致染色深。解决办法：试剂要充分覆盖组织，应超出组织边缘2mm。用组化笔画圈时，为了避免油剂的影响，画圈应距组织边缘3-4mm。

3，产生组织切片非特异性染色

1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条；

2）一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议试用单克隆抗体看看；

3）内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含血细胞多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色；

4）非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果；

5）DAB孵育时间过长或浓度过高；

6）PBS冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗、二抗或SP孵育之后的浸洗尤为重要；

7）标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

4，免疫组化染色呈阴性结果

1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误；

2）抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复用高火4次*6min试试。有人做过实验，这是最佳的时间和次数。若不行，还可高压修复；

3）组织切片本身这种抗原含量低；

4）血清封闭时间过长；

5）DAB孵育时间过短；

6）细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应；

7）开始做免疫组化，我建议你一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等外的方法问题。

5，背景

1，考虑一抗浓度高；

2，然后调整DAB孵育时间；

3，也要考虑血清封闭时间是否过短；

4，适当增加抗体孵育后的浸洗次数和延长浸洗时间等。

第二篇：免疫组化常用方法介绍及个人经验总结

免疫组化常用方法介绍及个人经验总结、定义

用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学（immunohistochemistry）技术或免疫细胞化学（immunocytochemistry）技术。

2、原理

根据抗原抗体反应和化学显色原理，组织切片或细胞标本中的抗原先和一抗结合，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再用标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素（如链霉亲和素等）结合，最后通过呈色反应或荧光来显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞爬片或组织切片上原位确定某些化学成分的分布和含量。、分类

1）按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、免疫酶标法和免疫金银法等。2）按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。

3）按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中 SP 法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测。、目前几种常用免疫组化方法简单介绍 1）免疫荧光方法

是最早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用较广。

2）免疫酶标方法

免疫酶标方法是继免疫荧光后，于 60 年代发展起来的技术。基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。免疫酶标技术是目前最常用的技术。

本方法与免疫荧光技术相比的主要优点是：定位准确，对比度好，染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。

免疫酶标方法的发展非常迅速，已经衍生出了多种标记方法，且随着方法的不断改进和创新，其特异性和灵敏度都在不断提高，使用也越来越方便。目前在病理诊断中广为使用的有 ABC 法、SP 三步法、即用型二步法检测系统等。

3）免疫胶体金技术

免疫胶体金技术是以胶体金这样一种特殊的金属颗粒作为标记物。胶体金是指金的水溶胶，它能迅速而稳定地吸附蛋白，对蛋白的生物学活性则没有明显的影响。因此，用胶体金标记一抗、二抗或其他能特异性结合免疫球蛋白的分子(如葡萄球菌 A 蛋白)等作为探针，就能对组织或细胞内的抗原进行定性、定位，甚至定量研究。由于胶体金有不同大小的颗粒，且胶体金的电子密度高，所以免疫胶体金技术特别适合于免疫电镜的单标记或多标记定位研究。由于胶体金本身呈淡至深红色，因此也适合进行光镜观察。如应用银加强的免疫金银法则更便于光镜观察。、被检测的物质

组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。、特点

1）特异性强。免疫学的基本原理决定抗原与抗体之间的结合具有高度特异性，因此，免疫组化从理论上讲也是组织细胞中抗原的特定显示，如角蛋白（keratin）显示上皮成分，LCA 显示淋巴细胞成分。只有当组织细胞中存在交叉抗原时，才会出现交叉反应。

2）敏感性高。在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍；现在由于 ABC 法或 SP 三步法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍仍可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化方法越来越方便地应用于常规病理诊断工作。

3）定位准确、形态与功能相结合。该技术通过抗原抗体反应及呈色反应，可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对病理学领域开展深入研究是十分有意义的。、从蛋白水平检测角度，免疫组化技术与 Western blotting、ELISA 的异同

1）Western blotting：蛋白质免疫印迹，也是利用抗体抗原反应原理，结合化学发光等技术来检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法。与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；当然 Western blotting 也可定性和定位（通过提取膜蛋白或核蛋白、胞浆蛋白分别检测其中抗原含量，进而间接反映它们的定位），但敏感性远远低于免疫组化技术。

2）ELISA：酶联免疫吸附试验，也是利用抗体-抗原-抗原结合反应原理来检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测。与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一。

8、免疫组化个人经验总结

1、方法操作不难，最大的难处是出现异常结果时如何解决？这就需要掌握免疫组化实验原理，每一步知道为什么这样做，这样你才敢大胆地改革先前的不对的方法步骤。如抗体孵育条件主要是抗体浓度、温度、时间，这三者一般是相互成反比的（相对），其中浓度是最重要的先决条件，温度决定反应的速度、时间决定反应的量。就拿温度来说，可以有 4 度、室温、37 度，我推荐4 度最佳，反应最温和，背景较浅；而 37 度反应速度较快，时间较短；室温我不太提倡，除非你每次都把环境温度控制在一定的范围，否则，尽量选择前两者。

2、免疫组化最大的优势是定位和定性。相比于其他蛋白检测方法，免疫组化具有定性灵敏度高、定位较直接准确，是定位检测分析首选方法。尤其对于有些因子的转位研究十分有用。

3、免疫组化结果定量分析的前提是高质量的染色切片。免疫组化结果也能定量分析，但必须是背景染色浅而特异性染色较深的情况下，分析最为准确，这种原则可能也是我们日常审稿时判定研究结果的必备条件。

4、免疫组化实验一定要设置阳性对照和阴性对照。阳性对照一般是用肯定表达这种抗原的切片来做；阴性对照一般是用 PBS 或非一抗替代一抗来进行反应，其余步骤均一致。前者是排除方法和实验系统有无问题；后者是排除有无一抗外的非特异性染色。

5、免疫组化的应用广泛，是当前实验研究的最重要方法之一。如今发 SCI 论文时，明显感觉仅靠量化的数据来发文章很难，加一些形态学数据或图片，老外十分欢迎，可能是怕你学术造假吧。当然也不能做假阳性或假阴性结果。

6、免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。

免疫组化技术掌握与否的鉴定标准是同一切片或不同切片中不同抗原均从摸索浓度或条件而做出优良的染色切片。我在平时带教中就发现许多研究生把我已经摸索很成熟的反应条件、浓度、方法步骤，重复运用于同一性质的切片和同一种抗体，做出来后就觉得自己已经掌握了免疫组化方法，更换一种抗体后，居然连二抗的种属来源都拿错了。失败往往促进你去思考试验原理和过程，成功有时也加快你自傲。

7、实验方法需要动手+ 动脑。如今我还不敢说我在免疫组化什么都知道。我只所以今天敢在这里说这说那，这是因为我经过了反复的动手+动脑，把理论原理运用于实践，在把实践中发现的问题带到理论知识中去解决，最终把理论与实践融会贯通。

第三篇：病理切片与免疫组化个人经验总结

免疫组织化学中对载波片和盖波片的处理

（一）载波片的清洁

进行免疫组化染色必须保证载波片的洁净否则常导致非特异性染色和组织脱片现象的出现而新的载波片常有油污等可能影响免疫组化染色的异物。因此必须对载波片进行清洁工作。常用的载波片清洁液是用重铬酸钾、浓硫酸和蒸馏水以不同比例混合配成不同强度的清洁液。

1． 常用清洁液的配制方法：

1．1重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=1：1：10 重铬酸钾10g., 浓硫酸10ml, 蒸馏水100ml 1.2重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=2：3：25 1.3重铬酸钾：浓硫酸：蒸馏水=2：5：25 2载波片的清洁方法

1。1先将载波片用清洁液浸泡12-24h 1．2流水冲洗后再用蒸馏水清洗3-5遍 1。3 95%的酒精中浸泡2h，用纱布擦干

1．4放入60℃烤箱中烤干或者自然晾干储存在玻片盒内备用

（二）载玻片的表面处理

在免疫组化试验中由于实验操作步骤的繁多常引起组织切片或者细胞涂片的脱落，影响检测效果，因此常需要用粘附济对切片进行处理。

1APES黏附剂APES是一种新型玻片黏附剂它的黏附剂机制是通过对玻璃表面的化学修饰改变玻璃表面的化学物理特性使组织切片活细胞成分牢固的贴附于玻璃表面不易脱落并可长期保存。是目前应用最多的组织黏附剂。

1．1APES工作液配制APES1ml丙酮50ml，混匀即可。

1．2切片处理方法1。1。1干警的切片放入盛有丙酮的染色缸中浸泡5min 1．1．2浸入APES工作液停留20-30s 1．1．3纯丙酮洗2次1。1。4放入烤箱37℃过夜1。1。5用干净玻片盒装好室温保存备用一般可存放半年以上

2多聚赖氨酸（poly-l-lycine.pll）多聚赖氨酸水溶液是一种良好的组织黏附剂使用浓度在0。005-0。01％但是由于价格较高在免疫组化中很少用。1．1多聚赖氨酸储备液的配制，将0.5g多聚赖氨酸充分溶于100 ml蒸馏水中，4℃或者-20℃保存备用（pll可反复水融）工作液可将pll原液稀释10-50倍使用 1。2切片的处理方法

1。1。1干净干燥切片浸入pll工作液，停留20-30s 1.1.3用干净玻片盒装好，室温保存备用一般可存放半年以上

（三）盖波片的处理

盖波片的处理方法如上,处理时间可适当缩短,清洁液浸泡2h即可（摘自常双锁主编医学常用实验技术精编）

石蜡切片微波修复抗原染色程序

1载玻片防脱片剂处理：可选择APES或poly-l-lycine。捞片后置烤箱58-60℃30-60分钟以上使切片紧密黏附 2． 切片常规脱蜡至水

3．30％H2O2+蒸馏水10份混合，室温5-10分钟以灭活内源性酶，蒸馏水洗3次 4．热修复抗原：将切片浸入0.01M购船酸盐缓冲液中（PH6。0），电路或微波炉加热之沸腾后断电间隔5-10分钟后，反复1-2次。冷却后PBS（PH7。2-7。6）洗1-2次。5滴加5％BSA封闭液室温20分钟，甩去多余液体不洗。6滴加适当稀释的抗（小鼠或兔IgG）.37℃1h左右或20℃时左右，也可4℃过夜，PBS（PH7。2-7。6）洗2分钟×3次。（一抗的稀释度孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。一般来说阳性染色强度不够时可提高一抗浓度和延长孵育时间背景过高时可降低一抗浓度和缩短孵育时间）

7．滴加生物素化山羊抗小鼠IgG（或兔、人IgG），20-37℃20分钟PBS（PH7。2-7。6）洗2分钟×3次。

8滴加试剂SABC,20-37℃20分钟.PBS（PH7。2-7。6）洗5分钟×4次.9.DAB显色：使用DAB显色试剂盒（AR1022）。取蒸馏水1ml加试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后加至切片,室温显色,镜下控制反应时间,一般在5-30分钟之间.也可自配显色剂显色。蒸馏水洗涤。

0．02M PBS（PH7。2-7。6）配法：

1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g,Na2HPO42.8g, Na2H2PO40.4g.如果用的是含水磷酸盐，应加上分子式中水的含量。

0．02M枸椽酸盐缓冲液：1000ml蒸馏水中加枸椽酸三钠（C6H5Na3O7·2H2O）3g, 枸椽酸（C6H8O7·H2O）0.4g 注意事项：

如果染色背景较高，在SABC反应之后，DAB显色之前，用加水0。01-0。02％TWEEN20的PBS（PH7。2-7。6）洗涤切片4次，单纯PBS洗2次，然后显色。

以上摘自武汉博士德生物工程有限工程公司所产的即用型SABC免疫组化染色试剂和使用说明书。

HE染色方法

1二甲苯I脱蜡10-15min 2二甲苯II脱蜡10-15min 3无水乙醇脱二甲苯1min×2次 4.95％乙醇 5.90％乙醇 6.85％乙醇 7自来水洗2min 8苏木苏染色1-5 min 9自来水洗1 min 10.0.5％-1％盐酸乙醇分化20S 11自来水洗1min 12稀氨水（1％）返蓝数秒，自来水或蒸馏水洗1 min 13尹红染色1-5 min 14自来水洗

15.85％乙醇脱水20S 16.90％乙醇30S 17.95％乙醇I 1 min 18.95％乙醇II 1 min 19.无水乙醇I 2min 20.无水乙醇II2min 21二甲苯I 2min 22二甲苯II2min 23二甲苯III2min 24中性树胶或加拿大树胶封固。结果：

细胞核呈蓝色，钙盐和各种微生物呈蓝染色或紫蓝色，细胞质，肌纤维，纤维结缔组织，红细胞和嗜尹红颗粒呈不同程度的红色。摘自梁晓俐主编病理学基础与实验技术

第四篇：免疫组化对照设计

原则上讲，所有实验都应该设置阳性对照（用以检验染色过程成功），阴性对照（用以检验阳性结果为真阳性），空白对照（用以排除非特异背景染色）。不过，由于样本选取的复杂性，国内多数实验室以及国外多数小实验室，都无法做到规范的阴性对照，所以普遍以空白对照代替阴性对照，而这种方法也在国内外得到承认。1）空白对照：

第一抗体由PBS取代。2）严格的阴性对照： 用已知的确定不表达你所要检测的抗原的其他组织的切片做阴性对照 3）回收实验阴性对照： 已知抗原与相应的第一抗体混合，发生结合沉淀，再用此沉淀抗体复合物进行免疫组化实验，结果为阴性。

4）同型抗体替代对照： 用于第一抗体同种动物的血清或非免疫IGg代替第一抗体结果为阴性。

5）自身对照 在同一切片上，应将不同组织成分中的阴性结果与检测的目的物对照比较 不过目前绝大多数人都是用PBS来代替一抗作为阴性对照，其实质是空白对照，因为这样做如果结果是阴性，也只是排除了二抗引起的非特异而已，但至于一抗是否会产生非特异，那只通过空白对照是不得而知的。因此你就必须做严格意义上的阴性对照。

第五篇：病理科免疫组化技术员培训

病理科免疫组织化学技术员培训及技术操作规范

一、病理科免疫组织化学技术员培训规范：

凡新入我科的病理技术员均需进行免疫组化理论知识的学习、培训，经考核合格、具备病理技术员技士资质后方能从事免疫组织化学染色。

二、病理科免疫组织化学染色操作规范 1.免疫组织化学染色前的准备事项(一)组织切片的制备

常规切片脱蜡至水（组织固定需用10%中性甲醛）(二)抗体的选择、稀释和保存

（1）选择抗体应先了解其反应谱和适用条件〔包括适用切片(石蜡切片抑或冷冻切片)、稀释度和温育时间等〕。

（2）对于未曾使用过的新抗体，应按照有关说明书的提示，以几个不同的稀释度对适宜检材(已知阳性切片/涂片)进行预试验;根据染色阳性表达的程度和检材背景着色程度，确定用于染色的最适稀释度

（3）抗体的原液应于分装后置于一20℃冷室中保存，切勿反复冻存(以免效价 降低)。（4）抗体的工作液可置于4℃冰箱中保存。（5）抗体的稀释。

(1)一般用0.01M PBS(生理盐水磷酸盐缓冲液)，pH值7.2。(2)或用0.05M TBS(生理盐水三经基氨基甲烷缓冲液)，pH值7.6。(3)必要时可按需要加适量小牛血清清蛋白。(三)被检测组织内抗原的修复

（1）经4%中性甲醛之类含醛基固定剂固定的组织，其切片中的抗原决定簇因醛的交联作用而被封闭，从而影响抗原一抗体反应。进行免疫组织化学染色前，对于组织切片进行抗原修复处理，会使组织中的固有抗原尽量多地暴露出来，提升了大部分检测抗体的阳性率和反应强度。有的抗体不需要进行抗原修复。应按抗体试剂说明书的提示决定是否进行被检测组织内的抗原修复。（2）抗原修复缓冲液。

(l)一般为0.01M柠檬酸缓冲液(2.1g柠檬酸溶于100ml蒸馏水中，用2M NaOH调节pH值至6.0)。(2)有些抗体需要特殊修复缓冲液，如高PH值的EDTA(50mM Tris.，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高，10mM EDTA，pH9.0)，或商品化的该高pH修复液等。（3）抗原修复的常用方法。(l)胰蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化。

②滴加一滴0.1%胰蛋白酶液于组织切片上。

③37℃下温育20-40min(温育时间取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短和被检测抗原)。

④蒸馏水冲洗，终止反应。

⑤阻断内源性过氧化物酶。

⑥进行免疫组织化学染色。（配制0.1%胰蛋白酶液时，应将0.1g胰蛋白酶溶于0.1%无水氯化钙水溶液(pH值7.8)中。）

（2)胃蛋白酶消化法: ①组织切片脱蜡、水化.②滴加胃蛋白酶工作液于组织切片上。

③37℃下温育10-30min(一般为10min，可延至30min，取决于组织经4%中性甲醛固定时间的长短).④浸人蒸馏水，终止反应。

⑤进行免疫组织化学染色。用1%胰蛋白酶液37℃下处理20min。(应以 0.1M HCI配制胃蛋白酶工作液。过度的胃蛋白酶消化会使组织结构破坏、切片 脱落。)（3)微波修复抗原法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②将组织切片置于容器(塑料盒或玻璃缸)中，并向其中加人抗原修复液 200ml，盖上具有小孔的盖子。

③将该容器置于微波炉(705-800W)中央加热(95℃)5min，2次(于两次之间，应向容器中添加蒸馏水50ml，严防组织切片干燥)。

④将该容器移出微波炉，置于室温下冷却15-20min。

⑤蒸馏水冲洗。

⑥阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑦用TBS或 PBS液冲洗。⑧进行免疫组织化学染色。(4)热水浴法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②向装组织切片的容器加人足量(例如200ml)抗原缓冲液，置于水浴锅中，加热至95-99℃(不沸腾)预热。

③将组织切片插人已预热的容器内，温育20-40min。

④将该容器由微波炉移出，置于室温下冷却20min。⑤室温下，用TBS、PBS或水洗。

⑥蒸馏水冲洗。

⑦阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑧用TBS或PBS液冲洗。

⑨进行免疫组织化学染色。

（5)压力锅法: ①组织切片脱蜡、水化(硅化玻片或经防脱片胶处理的玻片)。

②向4-5.5L的不锈钢压力锅中加人抗原修复缓冲液(约为锅容积的2/3)，不加阀情况 下加热至沸腾。

③将组织切片插放于金属切片架上，并置于压力锅内沸腾的缓冲液中。

④加阀情况下，将组织切片加压2min。

⑤压力锅自行冷却或以流水冷却减压后，持续20min。

⑥将冷却后的切片取出，蒸馏水冲洗后，置于TBS或PBS液中(以免组织切片干燥)。

⑦蒸馏水冲洗。

⑧阻断内源性过氧化物酶，而后将切片置于蒸馏水中。

⑨用TBS或PBS液冲洗。

⑩进行免疫组织化学染色。

（四）组织切片中内源性酶的阻断

1.内源性过氧化物酶 主要存在于红细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞了嗜酸性粒细胞和组织内。阻断方法:最常用0.3%-0.5%H2O2-甲醇液，作用15-30min，阻断液必须使用时新鲜配制。由于阻断内源性过氧化物酶常同时导致被测抗原变性(使特异性着色减弱)，而大部分组织不含有内源性过氧化物酶，所以阻断内源性过氧化物酶一般不必作为常规步骤。必须阻断内源性过氧化物酶时，可安排在第一抗体反应后进行，以减少抗原的破坏。2.内源性碱性磷酸酶 主要存在于嗜中性粒细胞和内皮细胞。阻断方法:应用1M左旋咪唑，作用15-30min。

3.内源性生物素 肝、胰、肾等的细胞内含有多量生物素或类生物素物质。阻断方法:先将切片浸于卵白素(0.5μg/ml)中15min，以缓冲液洗净后，移浸于生物素饱和溶液中15min，再用缓冲液洗去多余的生物素饱和液;也可应用商供的阻断试剂盒(按说明书操作)。(五)正常血清保护

作为检测试剂的抗体蛋白带有一定的负电荷，免疫组织化学染色时，易与带有正电荷的组织〔特别是纤维组织、变性和(或)坏死的细胞、嗜酸性粒细胞等〕发生静电吸引而导致非特异性染色。去除这种非特异性染色最有效的方法是，在滴加第一抗体前，先滴加用于制备第二抗体动物的非免疫血清或是滴加除制备第一抗体动物以外的其他动物非免疫血清，浓度为1：5-1：20;必要时可滴加2%-5%牛 血清清蛋白。正常血清保护作用时间10-20min。用于阻断非特异性结合的血清不能有明显的溶血。(六)缓冲液

用于稀释抗体，洗涤切片的缓冲液主要有两种。1.TBS(0.05M，pH7.6)，Tris一HCl缓冲液(0.SM，pH 7.6)100ml 8.5%NaCl 100ml 蒸馏水加至 1000ml Tris一HCI缓冲液(0.5M，pH7.6)三经甲基氨基甲烷(Tris)61g HCl 37ml 蒸馏水加至 1000ml 2．PBS(0.IM，pH 7.6)Na2 HPO4 · 12H2O2 29g NaH2PO4 · 2H2O 3g NaCl 85g 蒸馏水加至 1000ml 使用时用蒸馏水稀释10倍即成0.0lM。

二、免疫组织化学染色常用方法(一)直接法 1.脱蜡和水化。

2.3%过氧化氢或0.5%过氧化氢甲醇液，5min。

3.TBS或PBS缓冲液洗涤。4.抗原修复。

5.无关动物正常血清(适当稀释)20-30min。

6.甩去正常动物血清，滴加适当稀释的辣根过氧化物酶标记抗体，或增强的酶标多聚物一步法(Enhanced Polymer One-step Staining，EPOS)抗体于切片上，20-60min。7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.0.04%-0.05%DAB(二氨基联苯胺四盐酸)H2O2液显色5-10min，镜下观察控制显色时间。底物配法:DAB 40-50mg；0.05M TBS(pH 7.6)l00ml；3% H2O2 100-200ml。9.缓冲液洗，流水洗涤。10.苏木精淡染细胞核。11.脱水，透明，封片。(二)间接法

l-5步同“直接法”。

6.滴加第一抗体于切片上，湿盒内温育30-60min。7.TBS或PBS缓冲液洗涤。

8.HRP标记抗体或用增强的酶标记多聚物(Enhanced Labeled一 Polymer Sys-tem，ELPS)抗体滴加切片上，湿盒内温育30min。9-14步同“直接法”的7-11步。(三)过氧化物酶一抗过氧化物酶(PAP)法 1-5步同直接法。

6.适当稀释的第一抗体，湿盒内温育30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.第二抗体，湿盒内温育30min。9.缓冲液洗涤。

10.滴加PAP，湿盒内温育30min。11-15步同“直接法”的7-11步。

双PAP法:上述操作进行到第10步后，再重复7-10步1次，然后继续11-15步。(四)葡萄球菌A蛋白(SPA)免疫酶法 1-5步同“直接法”。

6.第一抗体，湿盒温育30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.酶联SPA，湿盒温育30min。9.缓冲液洗涤。

10-13步同“直接法”的8-11步。(五)ABC法和SABC法

ABC法是卵白素-生物素-酶复合物(Avidin--Biotin--Peroxidase Complex)法的简称。SABC法是链霉卵白素-生物素-酶复合物(Streptavidin一Biotin一peroxidase Complex)法的简称。

l-5步同“直接法”。

6.第一抗体，湿盒温育30-60min.7.缓冲液洗涤。

8.生物素化的第二抗体，30min。9.缓冲液洗涤。

10.ABC复合物或SABC复合物(皆于使用前新鲜配制)，30-60min。11-15步同“直接法”7-11步。(六)LSAB(SP)法

LSAB(SP)法，是标记的链酶卵白素-生物素(Labeled Streptavidin--Biotin)法的简称，操作步骤同“ABC法”，只是以LSAB复合物替代ABC复合物。(七)CSA法

CSA法是催化信号放大(Catalyzed Signal Amplifieation)法的简称。1-5步同“直接法”。6.第一抗体，15-30min。7.缓冲液洗涤。

8.生物素标记的第二抗体，15-30min。9.缓冲液洗涤。

10.链霉卵白素-生物素-HRP复合物(用前新鲜配制)，15min。11.缓冲液洗涤。12.放大液，15min。13.缓冲液洗涤。

14.HRP-StrePtavidin，15min。15-19步同“直接法”的7-11步。(八)二步法Envision System Envision是通过一个多聚葡聚糖骨架联接成一个多聚体。1-5步同“直接法”。6.第一抗体，30-60min。7.缓冲液洗涤。

8.Envision TM，10-30min。9-13步同“直接法”的7-11步。(九)双重免疫组织化学法.Sequential(1)鼠或兔抗体1，30-60min。

(2)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/HRP，30 min。(3)DAB(棕色)，2-10 min。(4)鼠或兔抗体2，30-60 min。

(5)Envision TM，羊抗鼠/羊抗兔/AP，30 min。(6)AP(红色)。2.Simnl一Aaneous(1)混合鼠抗体1和兔抗体2，4℃，过夜或60 min。(2)Envision TM羊抗鼠/HRP和羊抗兔/AP。(3)AP染色。(4)HRP染色。

上述方法除注明温度者外，均可在室温(20-25℃)环境中进行;第一抗体温育后，如有必要可置于4℃ 下过夜。

三、免疫组织化学染色的常用抗体标记物(一)上皮源性标记物 1.一般性标记物

（1）CK(角蛋白)CK亚型:①CK5/6;②CK7;③CK8;④CK10/13;⑤CK18;⑥CK19;⑦CK20。(2)EMA(上皮细胞膜抗原)。

2.特异性和(或)相对特异性上皮标记物

（1）CEA(癌胚抗原，标记胃癌、大肠癌).（2）CA242(肿瘤相关粘液抗原，标记胰腺癌、大肠癌)。

（3）TG(甲状腺球蛋白，标记甲状腺癌).（4）PSA(前列腺特异性抗原，标记前列腺癌)。

（5）PSAP(前列腺特异性酸性磷酸酶，标记前列腺癌).（6）34βE12(标记前列腺底细胞).（7）AFP(甲胎蛋白，标记肝癌、内胚窦癌).（8）Hepatoeyte(标记肝细胞癌)。

(9)β-HCG(β-绒毛膜促性腺激素，标记胎盘滋养层细胞肿瘤、生殖细胞肿瘤).（10）CA125(卵巢癌).（二)间叶源性标记物

主要是Vimentin(vim，波形蛋白)等.（三）肌源性标记物 1.Desmin(Des，结蛋白)2.Actin(肌动蛋白）.3.SMA(平滑肌肌动蛋白).4.MSA(肌特异性肌动蛋白).5.Myosin(肌球蛋白).6.Myoglobin(MG，肌红蛋白)7.Myogen(肌浆蛋白).8.MyoDI(肌调节蛋白).(四)血管源性标记物 FⅧRAg(第8因子相关抗原).CD31 CD34 UEA-l BNH9.(五)组织细胞源性标记物 1.CD68/KP-l.2.Lysozyme(溶菌酶)。3.a1-AT(a1-抗胰蛋白酶).4.a1-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)5.Mac387.淋巴造血组织源性标记物 1.全淋巴细胞

(1)CD45/LCA(白细胞共同抗原）。(2)TdT(末端脱氧核昔酸转移酶)。(3)CD30/Ki-1。2.全B细胞(1)Igκ。(2)Igλ。(3)CD20/L26。(4)CD79a。

(5)BLA36(B淋巴细胞抗原)。3.B细胞亚型(1)CDl0。

(2)CD21(标记滤泡性树突状细胞)。(3)CD23。

(4)CD35(标记滤泡性树突状细胞)。(5)CD38.4.全T细胞(1)CD3。(2)CD5。(3)CD43。(4)CD45RO/UCHL-1.5.T细胞亚型(1)CDla。(2)CD4。(3)CD8。6.NK细胞(1)CD56。(2)CD57/Leu-7。(3)CD16/Leu-11。7.粒细胞和单核巨噬细胞(1)CD11c/LeuM5。(2)CD15/LeuM5。(3)Lysozyme(溶菌酶)。(4)al-AT(al-抗胰蛋白酶)。(5)al-ACT(al-抗胰糜蛋白酶)。(6)CD68.(7)S-100蛋白.(8)Mac387。8.其他

(1)EMA(上皮细胞膜抗原).(2)CD99(尤因肉瘤标记物).(3)ALK-l(间变性淋巴瘤激酶)。(4)HLA-DR。(5)Bel-2。(6)Bel-6。(7)Bel-10。(8)Ki-67。

(9)CyclinD1(周期素D1)。(10)CD25。

(11)CD34。

（七）神经源性标记物 1.S-100蛋白.2.NSE（神经原特异性烯醇化酶）.3.Leu7。

4.Neurofilament(NF，神经微丝蛋白)。5.GFAP(胶质纤维酸性蛋白）

（八）神经内分泌源性标记物 1.激素标记物(1)CA(儿茶酚胺)。(2)5-HT(5-经色胺).(3)垂体激素。

①GH(促生长素)。

②PRL(催乳素)。

③ACTH(促肾上腺皮质激素).④TSH(促甲状腺素).⑤FSH(促滤泡素).⑥LH(促黄体素)。(4)甲状腺。

①TG(甲状腺球蛋白)。

②CT(降钙素)。

(5)甲状旁腺:PTH(甲状旁腺素)。(6)胰岛。

①Insulin(胰岛素)。

②Glueagon(胰高糖素)。

③VIP(舒血管肠肽).④PP(胰多肽).⑤Someitostatin(生长抑素)。

⑥Gastrin(胃泌素)。2.非激素标记物

(1)NSE(神经原特异性烯醇化酶).(2)CgA(嗜铬素A).(3)SY(突触素).3.激素受体（1）ER(雌激素受体）.（2）AR(雄激素受体）.（3）PR(孕激素受体).(九)细胞增殖标记物 1.PCNA(增殖细胞核抗原).2.Ki-67.（十）黑色素标记物 1.S-100蛋白.2.HMB45.3.Melanoma。

(十一）癌基因和（或）抑癌基因 1.bel-2.2.c-erbB-2.3.p53 4.p16(多肿瘤抑制基因)。5.nm23。(十二)病原体标记物

1.Myoeobaeterium Bovis(分枝杆菌，抗卡介苗)。2.HBsAg(乙型肝炎病毒表面抗原).3.HBcAg(乙型肝炎病毒核心抗原).4.HPV(人乳头状瘤病毒)5.HTLV-1(人类T细胞白血病病毒)。