风机风量自动报警装置论文[精选多篇]

第一篇：风机风量自动报警装置论文

一．现行工况

我公司混合料工序所用的混合剂是工业用酒精，由于酒精属于易燃易爆物，同时它又具有挥发性，所以该工序是我公司的安全重点保护区。我公司已采取了一些防范措施，如共投入使用十台抽风风机，因针对的是易燃易爆气体，因此要求可靠性极高。若其中一台风机故障跳闸或者是停转，将会导致气体排放不畅；必然引起危险气体的浓度接近或超过燃点（爆点），这很可能会造成严重的事故。

二．系统要求

现场十台风机的出口均配备有电节点压力表，其中五台风机采用检测风机的风量来判断出风机的故障点。只要系统的电机或风机出现各种故障，系统将立即自动发出声、光报警，提醒操作人员进行维修和处理。

三．系统运行原理

该系统的大致配置如下图：

四．系统运行原理

风机的出口处安装有电节点压力表，因此只要设定好相应的上下限压力值，即可直接将风机的运行情况（通过风压反映）送到PLC中进行检测。

若没有电节点压力表，或者使用风量传感器的方式，则可以使系统的风量检测更为直接准确。无论风机，或者是风机的电机出现任何故障时，系统均可以直接从风量上检测到故障，同时系统将相应的给出报警信号，因为是采用最直接的检测方式，所以可靠性大大增加了。

五．系统特点

该系统中采用了PLC和人机界面，对故障的处理非常完善、可靠。

1、信号采集准确可靠

系统将直接根据排风管的风量大小（通过风量传感器）和风压大小（电节点压力表）判断系统的运行情况。当风机的电机出现故障（睹转或者是空载）时，系统的风量会发生很大的变化，同时若系统的风机反转时系统同样可以发出故障报警信号。

因为采用了风量和风压双测量的方式，因此若风量或者是风压检测回路中的一个出现故障时系统均可以正常运行，而故障回路可以在人机界面上进行屏蔽。

故障检测点检测到风量信号后，在PLC中进行检测和对比。在人机界面上各种对比信号均可以进行设定，系统灵敏度的调整更加方便快捷。

2、故障处理智能化

系统采用PLC作为控制元件，系统的故障处理可以充分做到智能化控制。即若系统有备用风机时，系统可以直接将备用电机启动，保证系统运行的安全性。而故障风机退出运行过程的同时，在人机界面上以及柜体上均采用声光报警的信号进行报警通知相关人员进行维修处理。

3、高可靠性

该系统的可靠性主要体现在以下几个方面：

首先，系统采用性能稳定的PLC作为控制器件，PLC内部含有硬件看门狗电路，当系统出现当机（即死机）情况时，系统的硬件看门狗电路，与软件没有关系，可以自动将系统复位后继续运行。

再次，系统采用风量和风压双重检测的方式，系统可靠性得到了很大的提高。

4、系统显示直观

系统采用人机界面显示风机和电机的运行状态，而且人机界面上可以以曲线的图形方式，显示和给定风量的保护点，直观明了。

5、报警功能完善

系统报警的形式较多，报警功能完善。

系统的报警功能，不但可以以声光的方式远传到值班室，而且可以通过MODEM以拨号的方式直接将风机运行情况，故障情况发送到固定的BB机上，实现无人职守的控制状态。

六．系统配置

该系统采用S7-200系列PLC，6.4寸黑白屏

配件名称配件型号数量备注

PLC主机西门子S7-200；216CPU1两个串口，无Mordem功能可采用214CPU

PLC数字量模块继电器输出32个8入8出、1个8入

PLC模拟量模块4模拟量输入20~5V；0~5V

安全隔离栅WOS13.5-15VDC5

人机界面PWS-1711STN16寸单色屏

风量传感器风量风速传感器5风量输入4~20mA变送输出

UPS电源UH11-1KVA纯在线式，延时半小时

低压电器指示灯、按钮、中间继电器等上海二工、正泰

第二篇：双风机、双电源、自动切换及瓦斯、风电闭锁技术

双风机、双电源、自动切换及瓦斯、风电闭锁技术 在东庞矿瓦斯涌出异常区掘进工作面的应用与改造

张智峰1

白胜民2 摘要：

关键词：

近年来，随着矿井先进技术设备的引进，生产能力的增加，生产水平的延伸，东庞矿自2000年以来多处出现高瓦斯异常涌出区，北翼六采区、2603、2604、2605、2606、2607工作面，九采区2900轨道下山、2900皮带下山、2900北翼辅助轨道下山掘进期间平均瓦斯绝对涌出量超过2.5m3/min，由此，可见东庞矿正处于低瓦斯矿井向高瓦斯矿井发展的过渡时期，据国家煤矿安全监察局统计，低瓦斯矿井爆炸突出约占总瓦斯爆炸次数的60%以上，而掘进发生瓦斯爆炸的次数占80%以上。针对上述严峻的形势，东庞矿通过不断技术创新改造，在掘进、通风、机电技术方面积累了一套极为完善的验收，基本形成了掘进安全装备系列化，以2607轨道巷掘进采用双风机、双电源和风机自动切换及风电、瓦斯电双闭锁技术为实例，杜绝了瓦斯爆炸事故，该技术的应用与改造经验，以其所有借鉴。

1、工作面概况

2607工作面位于二水平六采区，主采2#煤层。上部为已采的2603采空区，左右两侧为实体煤，2607为倾斜布置开采的倾斜长壁综采工作面，倾斜掘进长度800米，工作面斜长165.5m，煤层平均厚度约4.3米，煤层倾向4--16度，可采储量为86.4万吨。

工作面平均瓦斯绝对涌出量超过2.5m3/min，煤尘爆炸指数为33.72--34.86%，具有爆炸性，2#煤层属于二类自燃三类可能自燃煤层，自燃发火期为12--18个月，煤层具有自燃倾向性。

巷道均采用锚梁网沿为煤层顶板支护，规格宽×中高=4.5×3.5m，供风距离1000m ,经计算局扇风量不得小于550m3/min。

2、双风机、双变频器选型及配套风机控制 2.1双风机的选型交频选型 根据风量计算，2607轨道巷采用的两台2BZK--NO6-3/60对旋轴流式局部通风机供风一台，一台备用，设一趟直径800mm高强度柔性风筒，利用双级变频器调节风量，满足工作面风理要求。实现节能降耗延长电机使用寿命。

（1）风机主要技术参数：ZJT-30型隔爆兼本安智能变频调速。电机功率（KW）30×2

全压效率%>80 全风压（Pa）900--650

噪音dBA<85

风量m3/min 625--350

风筒直径（mm）800 转速（r/min）2950

单级送风距离（mm）2500；

双级送风距离（mm）3500。外形尺寸 长×宽×高： 2860×786×1060（mm）

质量（kg）1340（2）变频带器主要参数 2.2风机控制开关选型

根据《规程》规定“低压电动机的控制设备应具备短路、过负荷、单相断路、漏电闭锁保护装置”和电机功率30kw，风机控制开关选用邢台金牛电控设备厂生产的QBZ-80D开关。

变频调速装置和QBZ-80D开关的推广使用，延长了电机的使用寿命，大大降低了烧电机造成停风瓦斯积聚事故。

3、双电源自动转换及专线加装试验开关 3.1双电源供电设置

专用双源的实现方法为，一路为风机专用线路即从专用高压开关变压器_专用风机馈电开关_风机控制开关，另一路由本工作面低压动力电源提供，应注意的是采区变电所高压侧其动力电源与风机专用电源不在同一进线上，即在高压侧就采用双路，以便减少高压故障引起大面积停电事故。当专用线路任一风机停止运转将自动切换到同等供风能力的风机，时间约3--5秒，继续向工作面供风。备用风机的电源接在闭锁开关的主风机的电源由专线供电为正常掘进供风。

3.2风机供电自动切换装置（如图）3.3局部通风机专线加装试验开关

为避免每天试验检漏继电器引起风机专线停电，采用和风机专用馈电并联一个同等型号的试验开关，实现风机专线不停电，不停风。

4、风电、瓦斯电闭锁安全监控系统设置 该工作面主局部通风机执行风电、瓦斯电双闭锁，备用风机不执行。实现双闭锁的方法：采用KFD-3型井下分站，及配套的风机开停传感器（KJC-90型电气设备开停传感器）和KG9701型智能低浓度沼气传感器和KDD-1型远程断电仪与闭路开关进行联锁，实现双闭锁。（如图）

KFD-3型井下分站是KJ90煤矿给监控系统的主要配套设备，具有数据采集、存储、处理、显示、断电控制、红外遥控及远距离通讯等功能，该分站的电源接在风机专用线路的电源侧。

KTC-90型电气设备开停传感器是利用磁感应原理，通过测定风机负荷电缆周围磁场有无，间接测量风机的开停工作状态，KG9701型智能低浓度沼气传感器可以连续自动地将沼气浓度转换成标准电信号，输给分站，并且有就地显示沼气渡度，超限声光报警断电功能，测量范围0-4.0%CH4 4.2矿井安全监控系统

利用KJ90与KFD-3井下分站以及配套设备形成矿井安全监控系统，按程序系统具有时实、监测瓦斯浓度变化，风机运转状态以及按设定进行报警、显示、存储、打印、报表等功能，该系统将国际先进的传感技术与计算机技术应用到通风上，给整个系统的通风安全水平带来了质的飞跃，保证了矿井掘进期间的安全生产。

5、安全技术措施 5.1设计要求：

双风机、风电、瓦斯电闭锁以及KJ90的配套设备等，由通风部门设计，设计中要有监测设备布置图、供电系统图和风电、瓦斯电闭锁系统图，图中要有明确的设备编号、型号、要有明确的探头报警浓度、断电浓度、复电范围及复电浓度等。

5.2验收试验

局部通风机及监控设施必须在开掘工作面开口施工前进行验收，否则严禁运转使用。局部通风机及监测设施安装完毕后，通风区应立即提出申请，由调度室组织，通风区、安检科、机电科、动力科等有关职能科室和采掘开施工单位共同参加进行验收。做好验收和试验记录，并填报“东庞矿高瓦斯地区风电、瓦斯电闭锁的试验报告”。验收和试验记录中必须有：风机及仪器的安装地点、型号、功率、编号、验收试验人员、验收试验内容、存在的问题等内容。未经验收或验收不合格的风机及监测设备，应立即进行整改，否则不得投入正常使用。

由安检科组织。调度室、通风区、动力科等生产单位参加，每周必须对风电、瓦斯电闭锁进行一次试验，并校核其精度，报警情况等，检验人升井后，填写工作记录，存档备查。

两台局部通风机同时向一个掘进工作面供风的，各台局部通风机必须同时与工作面电源连锁。即当任何一台局部通风机发生故障停止运转时，必须立即切断工作面电源。当主局部通风机发生故障停机，副局部通风机投运后，工作面禁止进尺作业，只有当主局部通风机故障排除并恢复正常运行后方可进行进尺作业风机故障的排除或更换风机工作必须在8小时内完成。

6.结语

东庞矿通过对瓦斯涌出异常区掘进工作面实行“双风机、双电源、风机电源自动切换、三专两锁技术”以及利用KJ90 配套设备与全矿的安全监控系统（调度室）联网将瓦斯浓度，风机运行状况、断电、复电等参数进行实时监视，并能随时打印出来，实现了掘进工作面的安全生产，特别是为低瓦斯矿井向高瓦斯矿井过渡时期出现的瓦斯涌出异常区掘进工作面在瓦斯机电治理上提供了可供借鉴的成功经验。

作者简介：张智峰（1958—）。男，河北威县人，河北金牛能源股份有限公司东庞矿安检科副科长，助理工程师。

第三篇：建厂十周年论文：化工一二硫风机改造

化工厂一硫车间一、二系统风机控制系统改造

杨泉文,毕庆宏,蔺永强

（金川集团自动化工程公司，甘肃 金昌 737100）

摘 要：本文就化工厂一硫车间一、二系统风机控制系统改造的背景现状和技术方案等内容

进行了详细地阐述，以便将这一成果更好地推广应用于类似的生产工艺控制当中，为大型运转设

备的安全运行提供借鉴。

关键词：风机控制系统技术改造

Sulfur workshop one , two system wind machine navar once

reforms chemical plant

Yang Quan wen , Bi Qing hong , Lin Yong qiang

(Jin Chuan Automation Engineering Company of Corp., Gansu Province Jin Chang City 737100)

Abstract: Content such as current situation and technology scheme has carried out the main body

of a book with regard to the background that one chemical plant sulfur workshop one , two system wind

machine navar reforms expounding detailedly , has controlled middle , has provided to safe large-scale travel equipment operation so that extension applies this one achievement to the similar productive technology better to draw lessons.Keywords: Wind machine , navar , changes its technology

0前言

风机的控制系统是风机的重要组成部分，它承担着风机监控、自动调节、等重要任务，它主要由监控系统、主控系统、变桨控制系统几部分组成。从风机控制系统本身的要求来看，有它的特殊性和复杂性。从硬件来讲，风机控制系统随风机一起安装在接近自然的环境中，工作有较大振动、大范围的温度变化、强电磁干扰这样的复杂条件下，因此其硬件要求比一般系统要高得多。从软件来讲，风机要实现完全的自动控制，必须有一套与之相适应的完善的控制软件。主控系统、变桨系统需要协同工作才能实现稳定运行，这需要在这几大部件中有一套先进、复杂的控制算法。

化工厂一硫车间一二系统风机控制系统在运行近15年后，日益暴露出系统老旧、软件版本低、操作系统淘汰、备件停产无法储备，特别是原系统缺乏事故追忆报警记录趋势和功能，给风机的安全运行和维护检修带来极大的不便和隐患。

1风机控制系统概况

风机的控制系统是风机的重要组成部分，它承担着风机监控、自动调节、等重要任务，它主要由监控系统、主控系统、变桨控制系统几部分组成。现阶段随着自动化控制系统的多元化，管理控制一体化等技术在工业自动化领域的发展。控制系统的智能化、分散化、网络化，以成为工业自工动化领域的发展趋势。

本文就本次技术改进的主要部分进行阐述，即风及控制系统组成部分中很重要的一部分功能——事故追忆记录。在事故发生以后，可以调出相应的事故追忆记录，通过趋势显示或数据一览的形式对所记录的

1数据进行分析。将各系统中保护动作情况在画面中显示出来，找出事故发生的根源；通过分析各系统中保护动作信号，确认系统首要事故原因。同时信息一览中记录系统中的报警信息、报警恢复信息、状态变位信息、操作员操作、按照时间的先后顺序进行记录，提供按照时间和内容查询两种方式。通过信息一览可以查出事故发生前后系统中的报警信息、操作记录等可能与事故有关的重要信息。操作员操作记录可以准确的记录每一台操作站发出的操作指令信息，包括指令发出时间、操作对象、操作指令变化及操作员站号等具体内容。通过对操作员操作的分析可以清楚的判定是否由于误操作或其他因素造成事故的发生。趋势显示功能是在操作员站上画出数据在一段时间内的趋势图形。在同一幅图形中可以同时有多个数据的趋势，在屏幕上以不同的颜色加以区分比较，趋势显示功能主要用于分析数据在一段时间内的总体变化过程，可以方便的观察某一数据在一段时间内的最大值、最小值、变化速率、有无突然变化等情况。还可以将几个相关数据放在同一图形中，比较这些数据的变化规律，判断是否由于某一数据的变化导致其他参数的相应改变，造成事故现象。

通过PLC系统准确、详实的记录，可以帮助分析人员尽快查明事故原因，排除机组故障。在以后的运行中吸取经验，保证机组的安全稳定运行。现状及存在的主要问题

化工厂一硫车间一、二系统建成运行已经有将近15年了，当时风机的控制系统采用的是贝加莱的PLC控制系统和显示屏，运行到现在来说软件版本已经很低无法升级，而且系统硬件的生产厂家已经停止生产，造成备件无法储备，已经影响到系统的正常的运行。尤其是最近两年频繁出现故障，多次处理之后，备件已经消耗殆尽，厂家也停止生产该类的备件，进备件比较困难。而且风机发生故障时，一硫酸系统的生产无法正常组织。

还有它的软件平台采用的是windows98操作系统，而现在windows98操作系统已经淘汰了，如果遇到程序有问题或丢失，必须重新用windows98系统运行该软件，才能把备份的程序重新下载到控制器。

另外原来的风机控制系统不具备事件记录和测点参数变化趋势曲线图，在正常运行时，如遇突发故障风机保护起作用，使风机跳车，在PLC的显示屏上无法查出是什么原因造成风机跳车，也没有历史曲线可以查，使得风机跳车原因无法进行科学准确的分析，不但在事故的分析和处理上带来了不必要的麻烦，在仪控设备的故障处理上也很难判断处理和预防，风机发生误跳的情况很难避免，这样对大型设备的安全运行带来了不安全的因素。

针对上述情况，科学合理的优选自控设备，减少维护人员的工作量，并为风机故障的分析和处理提供了科学可靠的依据。因此有必要对一硫酸系统一、二系统风机控制系统进行技术改造，确保风及控制系统的正常安全运行，使其满足工艺控制和监测的需要，达到控制和监测的最佳效果。

3技术改造的主要内容

3.1整体思路

根据一硫一、二系统现有PLC的现状和存在的主要问题，以及目前集团公司自动化技术水平和实际应用情况，我们可以结合现有的最新的风机控制系统的情况进行技术改进，使改造后达到同类风机有着同类同技术水平的控制系统，不但便于生产运行，也便于维护检修。

ABControlLogix5000 PLC控制系统在简单易于使用的环境下，实现了卓越的性能，堪称业内典范。一硫酸车间的另外两台新风机的配套控制系统都是采用AB公司的Logix 5000控制系统，那么我们改进一、二系统两台风机的控制则也采用同样控制系统，这样做的好处有是备件统一、逻辑相近、维护方便。

3.2 技术方案

3.2.1根据工艺要求，为实现风机的最佳控制和监测需要，将现有的贝加莱风机控制和监测系统升级改进为AB的PLC风机控制系统，在操控平台上采用便于升级和维护的工业平板电脑PPC-1507T，并通过DP通讯方式传递给DCS控制系统。并将辅助油泵和紧急油泵原来的电气控制台控制方式，改为运用工业平板电脑进行控制，使控制更加安全可靠为风机故障的分析和处理提供科学可靠的依据。

3.2.2 采用AB的PLC Logix5000系统来取代原有的贝加莱PLC系统，现场的测点和电缆利用原有的，原有的风机柜拆除，重新加工两个风机柜，采用平板电脑进行监控和控制，从设计、出图到相对应的组态以及

安装和调试投运均独立完成。

PLC系统配置的要求如下：

（1）控制器，负荷峰值：<40％；

（2）系统电源冗余配置；

（3）要与现用的一硫主控制系统和利时SmartPro通讯；

（4）数字量信号通过继电器隔离接入系统；

（5）提供软件及使用授权，软件具有离线仿真和在线修改功能。

优点：适合顺序、过程、传动和运动控制的模块化、高性能控制平台，每个ControlLogix处理器可以执行多个控制任务，减少所需要的控制器个数，这样，排错更快。可以分别触发多个周期任务以便达到更高的性能水平。

图一 改造后的 PLC图二现场工业平板电脑PPC-1507T

ControlLogix平台是机架式模块化安装。ControlLogix I/O是背板安装的。电源直接安装在ControlLogix I/O机架的左端。ControlLogix I/O机架有4、7、10、13或17槽之分。模块的安装完全和槽号无关；任何模块都可以安装在ControlLogix I/O机架的任意槽。ControlLogix I/O 模块的最大通道数是32通道。每个模块的可卸端子块的机械键控防止向模块施加错误的电压。不需要断开连线就可以更换 I/O 模块。

风机控制柜内置罗克韦尔PLC可编程控制系统，通过面板和平板电脑进行人机交互，实现风机运行过程中的全部控制，要求安全、稳定、可靠。

3.2.3主要控制功能有：

1）控制功能中包括风机的仪表控制系统和风机紧急油泵、辅助油泵、润滑油加热器、主电机绕组加热器等风机低压设备电气控制。

2）风机的检测数据采集,风机与高压控制的联锁,以及风机紧急油泵 辅助油泵 润滑油加热器的联锁控制全部由风机的PLC控制完成。

3）来自风机高压控制柜的风机运行电流、风机降压运行、风机正常运行、报警等信号首先通过PLC的I/O模块进入到PLC系统,可在风机显示面板画面组态显示,同时在LCP柜盘面上设计相应直观的允许启动信号指示灯.4）风机PLC与硫酸系统的DCS控制系统通过PROFIBUA-PA进行通讯,在DCS组态相应的控制和画面,可在DCS系统上监视风机的所有参数和风机及油泵的运行情况, 同时可在DCS系统上和PLC上对风机的前导向进行调节控制和无扰动控制切换。

5）利用AB的PLC Logix5000系统强大的软件功能，实现对测温、震动信号的智能判断，过滤虚假的跳车信号，降低设备由于误信号引起的跳车次数，提高风机的作业率。

6）由于硬件升级以后，人机界面通过平板电脑来实现，具有强大的数据存储能力和软件扩展能力，方便地实现了开停车条件的直观显示，使人机界面更加友好。

3.2.4事故报警及安全装置

风机机组的允许运行条件由PLC控制系统提供，可实现对电机的差动保护、速断保护、零序接地保护、低电压保护、相序保护（相序检测，保证正确相序）、电动机过负荷保护，对风机机组实现仪控故障保护。

3.3 达到的效果

跟以前相比实现了风机控制和监测系统的平稳升级，升级为平板电脑控制，使风机控制和监测系统更

加准确、可靠，为风机故障的分析和处理提供科学可靠的依据。增加了对风机上仪表参数的历史趋势监测，跳车故障的显示，对于检查故障提供了准确的判断依据。

3.3.1 将现有的贝加莱风机控制和监测系统升级为AB的PLC风机控制系统，独立完成风机控制系统复杂的控制算法，实现风机远程操作，远程监控。内部安全联锁控制，保护风机在非正常情况下运行的安全性。

3.3.2 自己设计控制柜，合理布置控制柜走线，完成监控系统、主控系统、变桨控制系统三系统之间的通信及布线实现风机控制和监测系统的平稳升级。

3.3.3 将原有modbus通信改为DP通信提高了完成监控系统、主控系统和控制器之间的通信稳定性。

3.3.4 将紧急油泵和辅助油泵由电气操作台台控制，升级为平板电脑控制，使风机控制和监测系统更加准确、可靠，为风机故障的分析和处理提供科学可靠的依据。

3.3.5 科学合理的优选自控设备，减少维护人员的工作量，仪表维护更方便，便于开车前的检查和出现故障的检查，也便于操作人员在现场检查设备和现场操作。

3.3.6 增加了历史趋势的储存功能，便于进行数据分析，查找出现故障的根本原因。

4结语

对一硫酸系统一、二系统风机控制系统进行技术改造后，满足工艺控制和监测的需要，达到控制和监测的最佳效果，完全达到了改造前预期的效果。此次改造从2010年2月完成后，运行至今，在正常运行时，如遇突发故障风机保护起作用，使风机跳车，在显示器可以查出是什么原因造成风机停车，还有历史曲线可以查，这样对大型设备出现的问题可以直接查找问题所在，缩短了处理故障的时间。在改造后运行的2年当中，一旦发生风机跳车情况，跳车的原因在平板电脑上都有明确显示，查看历史趋势后问题显得很明确，所以能及时处理问题，将造成正常生产的影响减到最低程度。

参考文献

[1] AB PLC可编程序控制器用户手册

作者简介：

杨泉文，男，仪表工程师，现从事自动化仪表技术工作，电话0935-8827832，E-mail:yqw@jnmc.com

第四篇：自动生成论文目录的方法

[转] 论文自动生成目录的方法，大四的

写毕业论文的注意了：怎样自动生成目录（以后要用，怕没了，转过来自己看）

微软WORD这个软件大家都很熟悉，但有不少功能我们并没有用到，其中不乏非常实用的。今儿个我给大家介绍一下如何用WORD自动生成目录。这对那些用WORD写书，写论文的朋友很有帮助。

优点：用WORD根据文章的章节自动生成目录不但快捷，而且阅读查找内容时也很方便，只是按住Ctrl点击目录中的某一章节就会直接跳转到该页，更重要的是便于今后修改，因为写完的文章难免多次修改，增加或删减内容。倘若用手工给目录标页，中间内容一改，后面页码全要改是一件很让人头痛的事情。应该自动生成的目录，你可以任意修改文章内容，最后更新一下目录就会重新把目录对应到相应的页码上去。

步骤：（以下内容在WORD2003中操作，其它版本WORD略有差别，但大同小异。）

1．在[格式]中选[样式与格式]

2．出现右边的一条“样式格式”栏，这里面主要就是用到标题1，标题2，标题3。把标题1，标题2，标题3分别应用到文中各个章节的标题上。例如：文中的“第一章 制冷概论”我们就需要用标题1定义。而“1.1制冷技术的发展历史”就用标题2定义。如果有1.1.1×××那就用标题3来定义。

3．当然标题1，标题2，标题3的属性（如字体大小，居中，加粗，等等）可以自行修改的。修改方法：右键点击“标题1”选“修改”，会弹出修改菜单，您可以根据自己的要求自行修改。

4．用标题1，2，3分别去定义文中的每一章节。定义时很方便，只要把光标点到“第一章 制冷概论”上，然后用鼠标左键点一下右边的标题1，就定义好了；同样方法用标题2，3定义1.1；1.1.1；依此类推，第二章，第三章也这样定义，直到全文节尾。

5．当都定义好后，我们就可以生成目录了。把光标移到文章最开头你要插入目录的空白位置，选[插入]--[引用]--[索引和目录]

6．选第二个选项卡[目录]，然后点右下的确定。就OK了。

上图就是自动生成的目录

7．当你重新修改文章内容后，你需要更新一下目录，方法是：在目录区域内，点右键，选[更新域]

8．当选[更新域]后，会出现上图的选框，选第二个“更新整个目录”点确定。就OK了。

第五篇：单克隆抗体的制备论文 (自动保存的)

摘 要

单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。本文主要讲述制备单抗的实验过程，并对实验结果及其影响因素进行分析。

关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞

Abstract

The monoclonal antibody technology is the modern life sciences research important tool, has the indispensable function in the gene and the protein structure and the function research aspect.In recent years, along with the molecular biology technology's development, presented the embedment monoclonal antibody and by the transgene mouse, the bacteriophage demonstrated that the technology, the ribosome demonstrated the technology and the covalence demonstrated the technology produces monoclonal antibody.These technologies effective addressing monoclonal antibody questions and so on mouse source.This article mainly prepares Shan Kang the new technology to the above several kinds to make a summary and analysis of factors.Keywords:antibodi,monoclonal, neoplasms,cell fusion,lymphocyte

目录

1.前言....................................................................................................................4

1.1国外现代生物技术产业发展的现状............................................................4 1.2我国现代生物技术医药产业发展的现状.....................................................4 2.文献综述.............................................................................................................5

2.1单克隆抗体的概念.....................................................................................5 2.2单克隆抗体的主要特点..............................................................................5 2.3单克隆抗体的应用..................................................................................6 3实验方法.............................................................................................................9

3.1材料和方法：..........................................................................................9

3.1.1材料..............................................................................................9 3.1.2.方法............................................................................................10

4.结果与讨论.......................................................................................................11

4.1细胞融合结果的差别..............................................................................11 4.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用...................................................12

4.3加入巨噬细胞的用量和时间..................................................................13 4.4不同源的巨噬细胞.................................................................................14 4.5细胞加入的量.........................................................................................15 4.6骨髓瘤细胞株的比较..............................................................................16 4.7融合剂的比较.........................................................................................17 4.8细胞融合温度的比较..............................................................................18 4.9各种营养液的比较.................................................................................19 4.10细胞换液的方案...................................................................................20 4.11微量培养...............................................................................................20 4.12无血清培养液.......................................................................................21 5.结论..................................................................................................................22 6.参考文献..........................................................................................................24 7.致谢..................................................................................................................2

1.前言

现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。

1.1国外现代生物技术产业发展的现状

自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。

1.2我国现代生物技术医药产业发展的现状

现代生物技术医药产业化进程：我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容，经过十多年的努力，特别是近五年来，现代生物技术医药产业有了突破性的进展，到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产，据初步统计，1997年的工业总产值约20亿（包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内）。目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业，其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力，陆续投入生产。因此，可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。

本文主要介绍了单克隆抗体的制备过程及应用。

2.文献综述

2.1单克隆抗体的概念

抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

2.2单克隆抗体的主要特点

1)由于来于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同；

2）由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此，单克隆抗体具有高度特异性；

3）产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。2.3单克隆抗体的应用

作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。

作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。

作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。

增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。

作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：

(1)诊断各类病原体

这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。

(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测

用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。

(3)检测淋巴细胞表面标志

用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。

(4)机体微量成分的测定

应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。3实验方法

3.1材料和方法：

3.1.1材料

a．盐溶液：将NaCl8克，KClO4克，Na2HPO4·2H2O1.77克，NaH2P04·H 692O0．克，葡萄糖2克，酚红0.001克，溶于1000ml双蒸水中，pH7.2。高压115℃，15分钟，保存于室温。

标准培养液；RPMI1640，DMEM或者Iscove„s培养液，加入10％灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清)，贮存于4℃。在使用前加入2％100×谷酰胺，1％100×丙酮酸钠，1％100 ×抗菌素(青霉素和链霉素各10000单位／m1)，0.05％0.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。

选择性培养液：即所谓HAT培养液，100× HAT培养液，100×H：Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM，必须在45℃溶解完全。100×A：Aminopterine氨基喋呤为0.04mM．必须在45℃溶解于稀释NaOH溶液中，然后再用HCI中和。

I00×T；Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室温中溶解。然后各溶液分别除菌过滤，分装5m1一支，-20℃保存。HAT和HT的营养液都必须在应用前配制，方法把100×贮存液按1％加入营养液即成。

细胞冻存液：为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜，混匀。此时细胞株必须生长良好[1]。b、骨髓瘤细胞株

BALB／c小鼠骨髓瘤细胞株，经过克隆纯化P3×63Ag8(简称×63)和其衍生株SP—2／0，SP—2／0不产生球蛋白，此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育，这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶，分别装入4ml或12ml营养液，通入气体为10％CO 2、7％O2和83％N2，37℃恒温培养。3.1.2.方法

a、小鼠免疫

成年BALB／c小鼠各种性别均可，用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射，作为首次免疫。7一12周后，再给200血凝单位病毒腹腔注射，作为加强免疫。

在加强免疫后4—5天，即可进行细胞融合，处死小鼠、无菌取脾，把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中，然后把细胞悬浮液转入15ml离心管中，毛细管吹打，然后至室温中10分钟，让其自然下沉，吸出大约9ml上清液，不要搅动底下的沉淀块，然后用TURK溶液作白细胞计数。

b、腹腔内巨噬细胞的采取

把成年BALB／c小鼠处死，剥开腹部皮肤，用4—5ml的标准培养液或0.34M(＝11.6％)的蔗糖溶液注入腹腔，用18号针头从耻骨联合处，直接插入，把针头朝向肝右叶上方，然后轻轻按摩腹部，再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.5—3×105的巨噬细胞(m￠)，这些细胞可收集于塑料管中，用任何一种标准培养液洗细胞，并于30分钟内用完。c、大孔培养

24孔培养板，每孔可容2m1培养液，培养于37℃，含7%CO2/DA大气恒温箱中。湿度为85—95％。

换营养液时，分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上，吸出大约lml的血营养液，然后用一个小口的25m1吸管，分别加入预热的新鲜营养液。

如果细胞长得很密，可以用2ml吸管吸出培养液，转种于小瓶中，一般1.5ml细胞悬浮液可接种25㎝2的小瓶，当小瓶中细胞长至单层时，即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法，维持杂交瘤细胞。d、微量培养法

平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液，细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时，第一步可转入24孔培养板的二个孔中，加入1m1培养液，然后按24孔培养板处理。

4.结果与讨论

通过体内单克隆抗体培养的到以下结果，下面是对细胞融合的实验结果进行的分析，并对实验数据进行讨论。

4.1细胞融合结果的差别

用5×107的BALB／c小鼠脾细胞与5×106骨髓瘤细胞进行融合，方法按Kohler和Milstein（1975，1976)的方法，每批细胞融合物分装到24个培养孔，培养28天，记录活细胞每孔多余104者为阳性，结果如表1所示。

表1 各次细胞融合结果的差别

实验

脾号

阳性

孔

数3／24

0／

20／

223／ 22

2／

8／

24／ 2

824／24 3

0／24＋0／24

0／24＋0

／

18／24＋2

／

1／24＋0

／

2表1中融合的结果波动很大，结果理想时，所有的培养孔可以都是阳性，而不理想时则为0，而唯一确实可靠的结论是：只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。这些培养孔看起来十分清亮，在最初培养的第一周内，很少细胞碎片，而且这些巨噬细胞一直可存活到实验的结束。但巨噬细胞的存在并不是唯一的因素，在实验4、7、8和11中应用了每个培养孔加入1×104的巨噬细胞，获得理想结果，而相同地在实验3，12中也应用1×104巨噬细胞，结果却不理想。

4.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用

接下去一个实验，除了在实验的当天给每个培养孔加入2×104的巨噬细胞外，其他方面都按Kohler和Milstein的方案进行，结果见表2 细胞融合物的准备，接种和判定都按表1方法进行、本实验按表2所列于实验当天加入巨噬细胞。

表2 巨噬细胞对杂交细胞的作用

实验

脾号

阳性孔数

不加巨噬细胞

加巨噬细胞 2

2／24

24／24

8／23

21／24

24／24

24／24

24／24

24／24 4

0／24＋0／24

23／24

0／24＋0／24

24／24 11

18／24＋21／24

22／24 12

1／24＋0／24

24／24

由表2可得，巨噬细胞的效果十分明显，表现在相同的脾脏9和10，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。再如脾5，脾

6、脾12未加巨噬细胞时只有极少数杂交细胞克隆生长，而加入后几乎是90—100％都产生了杂交细胞的克隆。另外，在这个实验中，虽然脾12的细胞融合物在对照组中已加过了104巨噬细胞(参阅表1)但其效果并不理想，而当第二次加入另一个小鼠的巨噬细胞时，获得理想结果，说明前面的巨噬细胞是无效果的，为了避免遇上无效的巨噬细胞影响结果，应该合并3—4只小鼠的腹腔洗出的巨噬细胞，作为喂养细胞。

4.3加入巨噬细胞的用量和时间

可以将投入实验的脾细胞的量减少10倍，其他方法则按照K6hler和M11stein(1975，1976)的方法进行。不同剂量的巨噬细胞和不同时期加入的实验结果见表3。

表3 影响巨噬细胞的有关因素

加入日期

每孔加入巨噬细胞量

阳性孔数

0

33×103

43×104

5-0

0

0

0

0

0

1

0 21

0

1Ca

4

0

0

0

0

2合计

0

--

表3说明按照Kohler和Milstein(1975、1976)的方法，取一只BALB／c小鼠脾细胞5×106和骨留瘤细胞5×108进行融合。融合当天称为“0”天，每天收集小鼠腹腔巨噬细胞，并按各需要量加入培养孔，培养28天后，计算24个培养孔中，活细胞多于104的阳性孔[2]。

4.4不同源的巨噬细胞

巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长，结果如表4

表4 用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞的比较

动物来源

每个培养孔加入巨噬细胞数

总阳性数

3×103

3×10

4105

小鼠BALB/c

52117

小鼠C57BL/6

小鼠C3H

0

321

小鼠Outbred(杂种)7

大鼠Rat

121

豚鼠Guinea pig

0

巨噬细胞来自各种动物如表4所列，每种动物各取了3只进行脸皮灌洗，合并其巨噬细胞在细胞融合前一天接种于各培养孔，第25天时计数24个培养孔的阳性数、(活细胞多于104者为阳性。)．

另外，还试验了已经建株的巨噬细胞系和在实验室中长期传代的巨噬细胞株，这些细胞都来自BALB／c小鼠。

4.5细胞加入的量

脾细胞参加细胞融合的用量，通过脾细胞限量试验可以得到结果，结果见表5。

表5 限量脾细胞杂交试验

实验

参加融合的脾细胞数

2×106

4×106

374 14

由表5可知4×106的脾细胞结果较好，细胞融合数较多。取BALB／c小鼠牌细胞，分别用下表所列的脾细胞量与5×106x 63骨朗瘤细胞融合，接种于24孔培养板中，细胞融合的前一天，每孔接种2×104腹腔巨噬细胞。培养24天后，每孔活细胞数多于104者为阳性孔。4.6骨髓瘤细胞株的比较

细胞融合时脾细胞和骨髓瘤细胞数如表6所列，接种于24孔塑料板，每孔并含2×104巨噬细胞，第28天记录活细胞数大于104者为阳性。

表6 骨髓瘤细胞株的比较

骨髓瘤细胞

参加融合的脾细胞数

总阳性孔

数

3×106

X63

3×106

107

3×107

237 Sp2/0

3×108

0

0107

0

43×107

表6说明，选择合适的骨髓瘤细胞株，产生克隆的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。用骨髓瘤细胞x 63作为细胞融合的亲代细胞，后来产生的存活的杂交细胞抹，实际上都带有亲代骨髓细胞瘤细胞基因密码，因而各杂交细胞株产生的抗体（针对免疫原的)，都是球蛋白分子的混合物，上面带有一个片段，就是所需要的链的结合物。4.7融合剂的比较

在细胞杂交时用同一种骨髓瘤细胞和同一种小鼠脾细胞，但PEG作用后的杂交细胞存活数比经仙台病毒作用的存活数要少，所以我们选用不同厂牌和分子量的PEG作细胞融合试验，表上所列数据，为培养23天后，计数24孔培养孔中的阳性孔，结果如表7所示。

表7 PEG聚乙二醇比较表

产品来源

细胞融合方法

总阳性孔

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

BDH200

0

0 Merck200

0

Serva200

0

0

0

0 Baker1000

0 BDH1000

0

Koch-Light1000 5

3数 Merch1000 GK 12

3Serva1000

1Merck20000

由表7说明，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应。但分子量太大阳性数也会有所下降，因为它们过份地粘稠，甚至加热至45℃时，也会粘在管壁上，但当高压时加入等量的盐水则较为稳定。4.8细胞融合温度的比较

脾细胞和骨髓瘤细胞在应用前都泡在水浴中，洗细胞时也都用低温离心机(2℃)。偶尔有一次制备细胞时没有进行冷处理，而洗脾细胞时离心沉淀也在室温进行，得到较多的杂交细胞株，这样重复试验，室温比常规的4℃和0℃往往结果好，见表8。

表8 温度对细胞融合的影响

实验

0-4℃

20℃

5×106

5×10 6

1/24

8/24

4/24

21/24 2

5/24

27/48

15/48

46/48 3

3/24

15/24

5/24

22/24 4

4/24

14/24

6/24

24/24 总阳性孔数

113

脾细胞数如表8所列，分别与5×106FO细胞融合，融合温度有0℃一4℃和20℃，在培养2l天时，活细胞数多于104为阳性。4.9各种营养液的比较

各种营养液与血清的比较分成几个实验进行，列于表9。

表9 各种营养液的比较

参加细胞

DMEM＋10%血清

RPMI＋10%血清

Iscove`s＋10%血清骨髓瘤细胞 脾细胞 马

牛

胎牛

马

牛

胎牛

马

牛

胎

牛

X63（5×10 6）10 6

0

5×10 6

5×10 6

5×10 6 20

15 17

20

脾细胞(三只小鼠脾细胞混合物)和骨髓瘤细胞的用量如表9所列，接种于24孔培养板，每孔并含有3×104的巨噬细胞，第23天确定阳性培养孔数，本实验包括三个内容：脾细胞的用量，RPMI培养液和I scove` s培养瓶三种血清的比较。由表9可知：DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。x 63的融合物在培养液中若用10％马血清虽然可以，但并不是常常都很理想。为了避免以后需要克隆限制杂交细胞的数量，我们常规应用Iscove` s培养液，也选用RPMI1840，因为它的缓冲能力较强，不完全依赖于合适的气体环境。Sp2/0(2×107)10 6

0

0

0

0

0

FO(5×10 6)10 6

4.10细胞换液的方案

表10 不同细胞换液方案比较

实验

换液方案

下列各天出现的阳性孔数

总阳性

6 8 10 12 14 16 20 24 28 Ⅰ

0

0

Ⅱ

0

07

Ⅲ

1数

Ⅰ

0

0

04

Ⅱ

0

410

1Ⅲ10 14 15

1516 17

表10试验了在细胞融合后，直接加入HAT选择培养波，让其直接暴露于高浓度的氨基喋呤中，比较结果，把细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。

4.11微量培养

表11 在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养

细胞融合物

培养板 FO细胞

脾细胞

标准板

微量5×10 6

2×10

板

6×10 6

15×10 6

10 7

2×10 6

6×10 6

15×10

2×10 7

2×10 6

6×10

15×10

表11可知，微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔，最高可达106，细胞融合混合物为6×106。脾细胞和107FO骨髓瘤细胞，接种整个微量培养板可希望获得12—16个杂交瘤细胞抹。

高度免疫的BALB／c小鼠脾细胞和FO骨髓瘤细胞融合，用50％PEG 4000作为促进剂，细胞数皆列于下表，分别接种于24孔培养板(每孔含有2×104巨噬细胞于2mIHAT)和微量培养板(即96孔板，每孔含有3×103巨噬细胞于0.25HAT培养液中。)于第21天计算阳性数[3]。

4.12无血清培养液

检测杂交瘤细胞株的产物常规是应用其细胞培养瓶其中含有血清，也有胎牛血清。对检测工作来说并不希望有这些东西，因为往往会干扰测定，或者对某些测定带来较高的基础值，也会造成单克隆产品分离和纯化的困难、我们试用了标记氨基酸或无血清培养液以取得在这种条件下的单克隆抗体。

用MEM作基础，加入标记物可获得理想的结果，可以从商业购得缺乏亮氨酸的MEM，原液的配制：无亮氨酸的MEM 45ml，加入[14C]亮氨酸5m1[14C]leucinc(250uCi)、lml10％葡萄糖和0.5m120％牛血清蛋白，4℃备用，在使用前临时配制应用液，即10ml原油十0.2m1100×谷酰胺十0.10m1100×丙酮酸钠十0.2m1100×V itra—mines十 0.1m1100×抗菌素和0.01ml 0.1M硫乙二醇，接种106活细胞于此培养液中，37℃，过夜，此时最好应用玻璃管并加塞[4]。

在实验中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛(GuiL—bert and lscove，1976Iscove和M elches，1978)，其中含有转移素transferrin和血清蛋白为唯一的蛋白成份，虽然配制这种培养液比较麻烦，但能支持杂交细胞抹继续生长和分泌抗体、每天能产生纯抗体10-20mg。

5.结论

通过小鼠免疫培养，腹腔内巨噬细胞的采取，微量培养，大孔培养，可得到一定量的杂交瘤细胞，同时分析了实验的一些影响因素，结果如下。

（1）.各次细胞融合结果的差别，只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。

（2）.巨噬细胞对杂交细胞的作用，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。

（3）.加入巨噬细胞的用量和时间，投入实验的脾细胞的量减少10倍，培养28天后，活细胞多于104的阳性孔。（4）.用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞，巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长

（5）.限量脾细胞杂交试验可知脾细胞加入量为4×106时，结果较好，细胞融合数较多。

（6）.骨髓瘤细胞株的比较中，选择合适的骨髓瘤细胞株（x63），产生单克隆抗体的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。

（7）.融合剂 PEG聚乙二醇的比较中，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应，但分子量太大阳性数也会有所下降。

（8）.细胞融合温度的比较中，室温比常规的4℃和0℃往往结果较理想。

（9）.各种营养液的比较，DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。

（10）.不同细胞换液方案比较中，细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。

（11）.在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养，可知微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔。

（12）.在无血清培养液中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛。

6.参考文献

[1]齐香君，现代生物制药工艺学[M]，化学工业出版社，2003.9 [2]甄永苏等，抗体工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [3]李元等，现代工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [4]张和君，单克隆抗体细胞免疫反应技术[M]，云南科技出版社，1985.2 7.致谢

本课题在选题及研究过程中得到杜老师的悉心指导。在杜老师的精心指导下，为我们开拓研究思路，顺利完成论文。杜老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，给以我们终生受益无穷之道。对杜老师的感激之情是无法用言语表达的。