染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结

第一篇：染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。

（二）、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65度处理4h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理4h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2h。13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：a.low salt wash buffer—-one wash b.high salt wash buffer—–one wash c.LiCl wash buffer——one wash d.TE buffer——two wash

15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。第三天：

（一）、DNA样品的回收

17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度处理2h。

19、DNA-片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

二、技术总结

（一）、关于细胞

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。

一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！

抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！

这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作

希望尽可能的保持低温（4度）。

沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。

虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联

虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA-片段的回收

需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验中应注意的细节问题

本文来自互联网搜索，仅供参考使用，最好实验条件需要自己摸索：

1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。

2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。

3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。

4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。

5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。

6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。

7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）

8、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。

9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。

10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。

Upstate生物技术公司chip试剂盒英文Protocol ChIP assay: Chromatin immunoprecipitation assay was performed according to the protocol of ChIP assay kit(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).1, For cells cultured in 2D, about 1—2×107 S1 cells were growth in 100mm dish, and were cross-linked by adding formaldehyde to final concentration of 1% and incubated in room temperature for 10 minutes.For cells growth in 3D, cells were isolated from EHS using PBS/EDTA, and also cross-linked as cells growth in 2D.2, Wash cells twice using ice cold PBS containing protease inhibitors(1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A).Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use.PMSF has a half-life of approximately 30 minutes in aqueous solutions.3, Scrape cells into conical tube, Pellet cells for 4 minutes at 2000 rpm at 4℃.4, Cells were washed with PBS and resuspended in ChIP lysis buffer(1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH8.0)add protease inhibitors(inhibitors: 1mM PMSF, 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A)..After incubated 10 minutes on ice, cells were sonicated to shear DNA to lengths between 200 and 1000 basepairs being sure to keep samples ice cold.5, Centrifuge samples(part A, step 7)for 10 minutes at 13,000 rpm at 4℃, and detected the OD260 of the lysates.6, Sonicated lysates were then diluted to OD260 2 with ChIP dilution buffer().60 ul protein A-agarose beads(Upstate Catalog # 16-157)was added to sonicated lysates and rotated at 4 for one hour to reduce the non-specific dinding.7, Pellet agarose by brief centrifugation and collect the supernatant fraction, 20ul of lystates were taken out as input control.9, Add the immunoprecipitating antibody(the amount will vary per antibody)to the 2ml supernatant fraction and incubate 2h at 4℃ with rotation.For a negative control, perform a no-antibody immunoprecipitation by incubating the supernatant fraction with 60 microliters of Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose Slurry for one hour at 4℃ with rotation.10, Pellet agarose by gentle centrifugation(700 to 1000 rpm at 4℃, ~1min).Carefully remove the supernatant that contains unbound, non-specific DNA.Wash the protein A agarose/antibody/histone complex for 3-5 minutes on a rotating platform with 1ml of each of the buffers listed in the order as given below: Low salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl);High salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl);LiCl buffer(0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% SDC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH8.0);TE buffer(20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA pH8.0).11, Elute the histone complex from the antibody by adding 250 microliter elution buffer(1%SDS, 0.1M NaHCO3)to the pelleted protein A agarose/antibody/histone complex from step 10 above.Vortex briefly to mix and incubate at room temperature for 15 minutes with rotation.Spin down agarose, and carefully transfer the supernatant fraction(eluate)to another tube and repeat elution.Combine eluates(total volume=approximately 500 microliters.)12, Add 20 microliters 5M NaCl to the combined eluates(500 microliters)and reverse histone-DNA crosslinks by heating at 65℃ for 4 hours.Note: Include the input DNA from this step.13, Add 10 microliters of 0.5M EDTA, 20 microliters 1M Tris-HCl, pH 6.5 and 2 microliters of 10mg/ml Proteinase K to the combined eluates and incubate for one hour at 45℃.14, Recover DNA by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation.Addition of an inert carrier, such as 20 micrograms glycogen, helps visualize the DNA pellet.Wash pellets with 70% ethanol and air dry.15, Resuspend pellets in an appropriate buffer for PCR or slot-blot reactions.PCR or slot-blot conditions must be determined empirically.

第二篇：关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

ChIP实验原理

在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

ChIP实验步骤

第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。

（二）、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2h。13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液：a.low salt wash buffer----one wash b.high salt wash buffer-----one wash c.LiCl wash buffer------one wash d.TE buffer------two wash

15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。

第三天：

（一）、DNA样品的回收

17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度处理2h。

19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

ChIP技术总结

（一）、关于细胞

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！

抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！

这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作

希望尽可能的保持低温（4度）。

沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。

虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联

虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA片段的回收

需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

第三篇：Millipore ChIP实验说明书

ChIP实验操作手册

阳性对照抗体是兔抗乙酰化组蛋白H3抗体（可检测人，鼠和四膜虫）。阴性对照是正常的兔IgG。对照引物mix是检测166 bp人体GAPDH启动子序列的（both end-point and real-time quantitative PCR）。用启动子特异性引物进行PCR时建议用来分析富集度较高的DNA片段。

需自己准备的材料：

 细胞， 自己要检测用的ChIP抗体， 37%的甲醛， Taq DNA聚合酶（PCR用）， dNTPs，2.5 mM each， SYBR-Green for qPCR， DNase and RNase-free sterile H2O。

引物设计：

 Primer Length：24 nt

 Optimum Tm：60°C Optimum GC：50% Amplicon size：100-700 bp Detailed Chromatin Immunoprecipitation Protocol

A.In vivo Crosslinking and Lysis

开始前准备：

 150 mm培养皿中装20 ml培养基，让细胞铺板率达到80~90%。

 HeLa细胞数大约有107个，可用来制备10次独立的免疫沉淀反应。

 细胞数量可以根据抗体的性能进行缩放。例如提供的对照抗体能够用105个细

胞来进行ChIP实验。为了确保抗体的性能，此protocol用了106个细胞来进行ChIP实验。

 将PBS和培养皿放在冰上（步骤3和6）。

 每块150 mm培养皿准备42 ml 1×PBS（4.2 ml 10×PBS加37.8 ml水）并放

在冰上。

 将Nuclear Lysis Buffer放在室温下使SDS充分溶解。

 取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温下解冻（步骤3和13使用）。该溶液

中含有DMSO在18.4℃以下就会冻结。

1、加550 μl 37%的甲醛（或1100 μl新鲜的18.5%甲醛）到20 ml细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。

 甲醛的终浓度为1%。尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录B）。

2、室温下孵育10 min，不要振荡细胞。

3、取出2 ml冰冷的PBS，每ml PBS中加5 μl Protease Inhibitor Cocktail II。

4、加2 ml 10×Glycine到培养皿中将未反应的甲醛消除。

5、晃动混匀并在室温下孵育5 min。

6、将培养皿放在冰上。

7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。

8、加20 ml冰冷的PBS来洗涤细胞。

9、除去PBS，再用PBS洗涤一次。

10、加2 ml含1×Protease Inhibitor Cocktail II的冷PBS到培养皿中。

11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。

12、4℃ 800 g（900~1000 rpm）离心5 min沉淀细胞。

13、准备好0.5 ml cell Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。

14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80℃中保存）。

15、用准备好的0.5 ml cell Lysis Buffer重悬细胞。

16、冰上孵育15 min，每5 min漩涡振荡一下细胞悬液。

 可选：孵育之后，用Dounce匀浆器将细胞悬液匀浆化10次以促进核释放。17、4℃ 800 g（900~1000 rpm）离心5 min。

18、准备0.5 ml Nuclear Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。

19、离心后除去上清，用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer重悬细胞。

 107个HeLa细胞建议加0.5 ml Nuclear Lysis Buffer。如果细胞浓度不同可以相

应的改变用量，因为裂解液和细胞的比例会影响细胞的裂解效果。

20、如果已经确定了最适的超声处理条件，继续B部分，否则，看附录A。

B、Sonication to Shear DNA

选择最佳的超声条件来打断交联的DNA，使其长度为200~1000 bp。

1、需要的话，从步骤A-17中取5 μl细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。

2、在冰上超声处理细胞裂解液。（条件摸索）

3、4℃ 10000~15000 g（~12000 rpm）离心10 min除去不溶解的沉淀。

4、有需要的话，可以取出5 μl打断的DNA电泳检测超声效果。

5、将上清液吸到一个新的离心管中，分为50 μl一份。

 每50 μl包含106个细胞的裂解产物，可以用来做一次免疫沉淀反应。 打断的交联染色质可以在-80℃中保存3个月。

C、Immunoprecipitation(IP)of Crosslinked Protein/DNA

开始该步骤之前：取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温融化（步骤3用）。

1、准备足够的稀释液（含蛋白酶抑制剂），放在冰上。

 每个IP实验需要450 μl Dilution Buffer和2.25 μl Protease Inhibitor Cocktail II。 测试样品包括：阳性对照Anti-Acetyl Histone H3，阴性对照Normal Rabbit IgG，和自己实验用的抗体。建议增加一个与自己所用抗体同源的阴性对照IgG。2、50 μl打断的交联好的染色质放在冰上。

 若用同一样品进行多个免疫沉淀反应，可将0.5 m样品放在一管中进行实验。

3、加450 μl稀释液（含Protease Inhibitor Cocktail II）到50 μl染色质样品中。

4、取出5 μl（1%）上清液作为“Input”并放在4℃直到步骤D-1。

5、加入免疫沉淀抗体和20 μl混匀的protein A magnetic beads。

 阳性对照anti-Acetyl Histone H3，5.0 μg抗体每管。

 阴性对照Normal Rabbit IgG，5.0 μg抗体每管。

 用户使用的抗体和对照，每管加1~10 μg抗体每管（根据抗体效价进行调整）。6、4℃旋转孵育1~ 4 h或过夜。

7、用magnetic separator将Protein A magnetic beads沉淀下来并除去上清。

8、用0.5 ml下列冷的缓冲液洗脱Protein A bead-antibody/chromatin complex，每次在旋转台上孵育3~5 min以清楚磁性，并小心的除去上清。

a、Low Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-154), one washb、High Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-155), one washc、LiCl Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-156), one wash

d、TE Buffer(Cat.# 20-157), one wash

D、洗脱Protein/DNA复合物和反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。

1、在室温下解冻Proteinase K和ChIP Elution Buffer(w/o Proteinase K)，确保SDS完全溶解了。为所有的IP管和Input管准备最终的的洗脱液。

 每管用的洗脱液：100 μl ChIP Elution Buffer(不含蛋白酶K)，1 μl Proteinase K。2、62℃振荡孵育2 h3、95℃孵育10 min。

4、将样品冷却至室温。

5、用磁铁分离beads并将上清液移到一个新的管子中。

E、DNA Purification Using Spin Columns1、取出Spin Filter到Collection Tube中。

2、加0.5 ml Bind Reagent “A”到每个100 μl的DNA样品管中并混匀。

 5倍体积的Bind Reagent “A”用于1倍体积的样品，可能有沉淀，但不影响。

3、将sample/Bind Reagent “A”混合液转移到Spin Filter中。

4、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

5、将Collection Tube中的离心液除去。

6、将Spin Filter放回Collection Tube。

7、加500 μl Wash Reagent “B”到Spin Filter中。

8、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

9、除去Collection Tube中的离心液。

10、把Spin Filter放回Collection Tube中。

11、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

12、除去Collection Tube中的液体。

13、将Spin Filter放到一个干净的Collection Tube中。

14、将50 μl Elution Buffer “C”加到Spin Filte的膜上。

15、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

16、除去Spin Filte，洗脱液就是纯化的DNA，可以用于检测或存于-20℃。

第四篇：ChIP实验中的细节

1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。

2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。

3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。

4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。

5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。

6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。

7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）

8、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。

9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。

10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。

11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。

第五篇：现代教育技术 实验总结

实验报告

课题名称：资源检索

参与人员：12小组全体人员---指导老师：赵老师

实验过程：我们小组的每个成员都按照赵老师的要求，分别查找并访问与英语教学及师范教育相关的资源库，且利用其提供的数字化资源学习和检索了与本专业内容相关的资料。我们每个成员还分别访问了中国知网，并在中国知网上找了一些与英语教学相关的学术论文。实验目的：熟练运用数字化图书资源

心得体会：本实验名为信息及信息检索，在本实验的完成过程中，首先，我们小组的每个成员都按照要求进行了操作，基本达到了实验目的(熟练运用数字化图书资源)随着因特网和计算机的普及，教师这个职业也不再像人们传统印象中的那样，只需要教师，黑板和粉笔等就能很好的完成教学任务，达到教学目标。现代教育对教师的要求更高。其中，运用网络快速检索有效信息变得尤为重要。

在本实验中，我们小组每个成员利用我校数字图书馆网站中提供的数字资源对与英语教学有关资源在资源库里进行了检索。（泰克贝思师范教育专题数据库、环球英语多媒体数据库、超星数字图书馆）。这些数据库提供的资源非常丰富，类别很全。我们利用这些数据库进行查找或者检索一些信息就非常方便快捷了。随后，我们登录了中国知网，在知网上检索了一些与教育相关的学术论文，以便于日后能够在此网站快速查找到所需资源。面对互联网时代，信息资源的丰富化、多样化和复杂化，从繁琐的信息资源中获取我们需要的信息变得尤为重要。尤其是在教师专业化的背景下，教育技术能力已经成为教师专业能力结构的重要组成之一。所以，掌握并熟练运用数字化图书资源是非常重要。以上就是本小组对此次实验的心得体会。