多种细胞的培养方法,步骤,心得,经验(大总结)!

第一篇：多种细胞的培养方法,步骤,心得,经验(大总结)!

多种细胞的培养方法

HePG2细胞和L-02细胞的传代：

HePG2细胞属人肝肿瘤的恒生细胞株，L-02细胞则是人胎肝细胞株，二者所使用的培养基可以是一样的，即最常见的DMEM。一干使用低糖的。

细胞长满培养瓶时既要传代。使用胰酶消化即可。用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶。使用前37度预热，细胞经PBS清洗两遍后，每个中号培养瓶加0.7ml的胰酶，胰酶的量可根据自己培养瓶的大小而定，原则就是能够盖满瓶底。加入胰酶以后，为使酶的活性最大，将培养瓶盖拧紧后放回培养箱中，3分钟左右即用含血清的培养基终止消化。如果在室温情况下消化，时间相应加长，可以在显微镜下观察，当细胞界限已十分清楚，即已分离为单个细胞，且有少量细胞漂起，则要终止消化了。

16HBE细胞株的传代方法：

镜下观察细胞生长融合达70-80%，准备传代。常规开紫外照射超净台20分钟，同时把含10%胎牛血清的MEM培养基、0。25%胰酶、PBS放置37度培养箱中孵育。20分钟后开始传代。先弃掉旧培养液，加PBS洗一次，然后加0。25%胰酶2ml消化（指25乘25cm大小的培养瓶）细胞，镜下观察细胞，细胞突起回缩，细胞变圆，然后将培养瓶放置37度二氧化碳培养箱中孵育3分钟左右（当然时间是随机的，比如：新配的胰酶作用时间短一些，配制时间长的胰酶作用时间会长一些，当然要不断地镜下观察），待细胞大部分消化下来（大部分细胞呈流沙状脱离瓶壁），加4ml含10%胎牛血清的MEM培养基终止消化。反复吹打瓶壁上残留的细胞，并将已消化下来的细胞吹打均匀，然后吸入离心管中1000转离心1分钟，然后弃掉上清，用手指将离心管中的细胞弹打均匀，加新培养基，吹打均匀，分至3个新的培养瓶中，补足培养液。将培养瓶平放，小心移入37度二氧化碳培养箱中培养过夜。次日观察。

胃癌细胞AGS和SGC-7901的培养：

细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了.实验前先把紫外灯打开照30分钟,然后再把鼓风机开10分钟,同时把培养液和胰酶放入37度水浴箱中,千万记住不要盖上水浴箱的盖子.传代时,我一般把培养瓶口过一下火,就直接把培养液到去,再用0.25%的胰酶(不含EDTA)消化.等细胞变圆,细胞间空隙加大就直接把培养液到去,不用离心,然后再吹打,虽说要轻柔,但很难吹打成单细胞悬液,所以稍用力也没有关系.虽然操作不规范,但节省时间,细胞也没有被污染.AAV-293细胞的传代:

AAV-293细胞较喜欢成团生长,比较娇嫩,怕冷,传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶,一次只要拿2-3瓶出来传就可以了,否则细胞很容易死掉.细胞在50-60%传代,细胞生长状态最好.用D-Hank's液配制成0.25%的胰酶消化半分钟左右,弃去胰酶.观察培养瓶是否有针孔样缝隙,如有就可以加入培养液吹打细胞.消化过久,对细胞损害很大,而且成团很难吹打成单个细胞.然后加入含有10%小牛血清的DMEM.轻轻放入二氧化碳培养箱中培养.肺癌细胞（人类），其中绝大部分都是贴壁细胞，具体如：

（１）Ａ５４９（肺腺癌）

（２）ＮＣＩＨ４４６（小肺细胞癌）（３）８０１（非小肺细胞癌）

（４）ＮＣＩＨ４６０（大细胞肺癌）

在消化传代过程中，步骤基本一致：

吸去旧的培养液－＞用Ｈａｎｋｓ＇（１Ｘ）清洗一两次－＞加入一定量的消化液（Ｔｒｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ）－＞置显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞吸去消化液－＞加入一定量的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养液（ＲＰＭＩ１６４０ｗｉｔｈ １０％ ＦＢＳ）．

注意： 吹细胞时尽量多吹边角儿，此处细胞生长的多．另外吸出细胞前要混匀． 另注：消化液的配制方法：

Trpsin-EDTA(1X)--0.25% Trpsin with EDTA-4Na prepared with 2.5g Trpsin(1:250)and 0.38g EDTA-4Na/L in HBSS 小鼠前脂肪细胞（3T3-L1）：

吸弃原培养液-->PBS洗一两次-->加入400ul0.125％胰酶（原代最好加0.05% EDTA）消化-->转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过->吸弃trypsin后37度消化3min-->以完全培液（DMEM+10% FCS＋1/1000Biotin+1/1000泛酸钙-->吸打（枪的吸力调至最小），1：10接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱继续培养（10%CO2 ,37度）

MDBK（牛肾细胞）类型：贴壁细胞

来源：购自武汉病毒所细胞保存中心 由四川农业大学动物生物技术中心繁殖保存 传代步骤：

弃去旧的生长液-->用无钙镁水(CMF)冲洗贴壁细胞数次(视细胞瓶的大小,3--5次)-->剩少许CMF,滴入 ATV 2--3滴-->摇匀细胞瓶中的液体,使ATV均匀的分布到瓶里的没个地方-->放入37度二氧化碳温箱中3--5min消化-->弃去ATV,加入生长液,拍打吸吹下细胞-->镜下观察-->分瓶-->作好记号,放入37度二氧化碳温箱生长

细胞特点:该细胞生长力强,而且快速一般24h就可以张到80%,48h不传就会变的很老,所以该细胞传时要勤点;我感觉MDBK还是很好传的,比以前我传的ST、Vero细胞等要好传一些，且不那么容易死亡，所以是我的一个比较好的选择！该细胞适合接种疱疹病毒（如：伪狂犬病毒）！

BHK-21：

弃除旧的培养液后---用缓冲液冲洗一遍----用0.22%的胰酶消化液消化约两分钟左右可以看到细胞像沙子一样脱落-------赶紧倒掉胰酶加入含10%的牛血清培养液终止消化。但目前国内能找到的BHK-21细胞大部分都有支原体感染，如果是好的BHK-21细胞能做到1比20的分种率。

补充一点关于BHK-21的培养,先用少量胰酶冲洗一下,弃去,再用胰酶消化1min左右,效果会好一些

皮肤成纤维细胞和THP-1细胞：

皮肤成纤维细胞是贴壁生长的。THP-1细胞是悬浮的。

由于我们实验室养细胞的时间也不是很长，所以也只能说说自己平时的操作了。先说皮肤成纤维细胞。当细胞铺满瓶底，也就是细胞与细胞之间没有间隙时，就可以传代了。一般十天左右传一代。先吸弃旧培养液，用D-Hanks液洗两遍，再加入0.25%的胰酶，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后静置两分钟左右，最好是能在显微镜下观察，当细胞之间出现间隙且有一部分细胞呈现圆形后即可。吸去胰酶，加入含血清培养液，摇晃瓶子使培养液覆盖瓶底就行了。因为血清可以终止胰酶的消化。然后吹打瓶底各处使细胞脱落。再分瓶补加培养液。

THP-1细胞的传代就比较简单了。

可以有两种传代方法。如果镜下观察细胞状态很好，没有其它杂质即细胞裂解物之类的，就可以采用直接传代法。传代前将细胞培养瓶直立一个半小时使细胞自然下沉。吸弃上层少量培养液约三分之一，将余下的培养液分成两瓶，再分别补加培养液即可。如果镜下观察觉得培养液中有杂质即可采用离心传代法。如果细胞数目较多可以低速离心约600转离心六分钟，细胞可以沉淀下来而且可以去除细胞碎片之类的杂质。如果觉得细胞数目不多比较宝贵，那就提高转速可以1000转离心六分钟，这样细胞损失很少但可能也有些杂质会一起沉淀下来。离心后去除上清液，加入新的培养液吹打浑匀即可分瓶传代了。目前的方法就这些，希望对新手有所帮助

BHK－21的经验：

吸出培养基，吸得越干净越好，直接加入1ml胰酶（T－25瓶），放到37度培养箱消化。是否需要用hanks 或 pbs之类得缓冲洗细胞并不绝对必要，我都没有洗，感觉应该洗一下更好，但也更麻烦并增加了污染得可能性。如果细胞长得太老，可以先加入1ml胰酶在细胞表面浸润一下就吸出来，然后再加入1ml胰酶消化。胰酶在使用前最好预热到37度。由于胰酶平时保存在4度，反复预热对胰酶的活性不好，我的经验是将胰酶进行分装，尽可能避免胰酶反复冷却加热。消化时间的选择要根据实际情况决定，BHK－21还是比较好消化的，5－15min应该足够了，消化时间太长对细胞不利。可以在显微镜下观察消化情况，必要时可以拍打培养瓶帮助细胞分散，消化结束后直接加入培养基即可，胰酶会被血亲灭活。一般在T－25瓶中留7－8ml培养基培养。在90％单层细胞时，1：4传代2天后可长满。如果使用的培养基偏碱最好先放在CO2培养箱中平衡。细胞生长中注意观察培养基颜色（加入酚红作指示剂），如出现偏黄表明细胞代谢产酸较多，此时如细胞未长满应更换部分或全部培养基以确保细胞状态不受影响。

几种乳腺癌细胞的培养：

我养的细胞都是乳腺癌细胞，就是以下几种，1、MCF-7：是一种很好养的人乳腺癌细胞，培养基用DMEM或RPMI1640均可，10－15％的小牛血清就能长得很好。一般两到三天传一代。传代也很常规。吸出培养基，加入0.25％的胰酶1ml，轻轻晃动培养瓶，使胰酶流遍瓶壁，以去除残余的培养基。再加入2ml胰酶（25ml培养瓶）静置消化2－5min，待细胞缩起变圆，将胰酶吸出加入培养基3ml吹打成单细胞悬液分瓶即可。我一般都不用缓冲液冲洗，而直接用胰酶冲洗一下以去除剩余血清的作用，感觉效果还不错。因为MCF-7消化较快，一般不放到培养箱中消化，以免消化太过。需要注意的是MCF-7生长较快如不及时传代可出现整瓶细胞浮起，一般都来不及抢救。

2、T47D：也是一种人乳腺癌细胞，培养基用DMEM＋10－15％的小牛血清，培养方法与MCF-7差不多，但这种细胞传代时间长了会极难养。我曾养过一株新从美国购置的，两三天传一代，长得很旺。后又从国内购买一株时间较长的，要七天传一代，而且很娇气。

3、MA891 鼠乳腺癌细胞：这种细胞比较特殊的是很难消化，容易消化成一团一团的，如果胰酶的量比常用的多三分之一充分预热并放入培养箱中消化就会好的多。传到15－20代细胞就易长成团，从此生长缓慢，形态改变，需要复苏重养。

95-D细胞的传代:

首先要把0.25%的胰酶和培养液在37度水浴20~30分钟(预热).从培养箱中拿出培养的细胞瓶(一般我是让它长到90%几再传代的),吸去培养液,可用PBS洗两遍.也可不洗.加入适量0.25%胰酶消化(试瓶子的大小而定,如250毫升的瓶子加1毫升就行了),让它都浸湿细胞就可以吸去了.等个三十秒就在手上拍打,不要太用劲.就可以看到细胞脱落了,再加入3毫升左右的培养液吹打(这时加的培养液不要太多,否则难吹打成单个细胞!),制成细胞悬液,再传至消毒的培养瓶中(我一般是1传三,三天后又可以传代了)再加入适量培养液(如250毫升瓶中加入12~14毫升).再放置在37度5%CO2培养箱中培养.在操作过程中要有酒精灯的,瓶口,镊子等可在火上过一下.其他的地方可用75%的酒精消毒.无菌观念要强!

胃癌细胞MKN28和AGS：

80%-90%confluency,吸弃原培养液-->PBS洗一次-->加入400ul0.125％胰酶（10cm）-->转动培养盘，保证整个盘面都被trypsin液润过->37度消化5-10min-->以完全培液（RPMI1640+10% FBS-->吸打,1：5接种，前后左右摇晃培养盘，细胞均匀后放入培养箱培养（5%CO2 ,37度，24h一个周期

L929细胞：

是一种贴壁细胞，贴壁后繁殖迅速，约3－4天传代。切记：不要等到细胞贴的太满，约70－80％即可传代（细胞传代时不能长的太满,70%-80%就可以传了BSZLY2003）。否则细胞容易聚团，再想将其打散很不容易，并且打散后细胞的状态也不好了。我用的消化液是EDTA，新配的感觉特好用，胰酶也用过，但不如EDTA好用。以下传代方法同楼上各位朋友。

另外还有一点建议：细胞传代之前用75％酒精棉球擦一擦手。细胞培养瓶打开前也要擦一下，可以降低污染的几率。

SP 2/0：

是小鼠骨髓瘤细胞株，贴壁生长，科室给学生开实验就用此细胞，所用培养基为1640，用小牛血清，浓度15%生长较好。培养孵箱为37度，5%的CO2。

开始将复苏的细胞传到小培养瓶（如25ml)，由于细胞分泌各种因子及细胞间的相互作用，因此生长较快，1-2天就可进行传代（当然要达到80-90%的融合）。

消化采用0.25%的胰酶，在显微镜下观察，看细胞形态变圆，而且细胞间界限明显后，或有极少数细胞漂浮起来就可终止消化。

吹打时，动作要轻、快，而且吹管中要吸满液体，这样就不会产生气泡，吹打按一定的顺序进行，将瓶子彻底吹打，尤其是边缘和角落。

传代，先将此瓶细胞只传到一个大瓶中，以保证细胞的数量，小瓶也可保留，继续培养。这样3-4天又可进行传代。

mcf-7细胞株：

本人的细胞株购自武汉中国典藏物培养中心（美国ATCC株亚型），培养基是MEM，10％的小牛血清（购自杭州四季青公司）。传代要看细胞数的多少，一般来说10％的细胞，要5天左右，如果90％融合的细胞一传2，3天子代细胞即可传代。传代：偶用的是25ml培养瓶，吸出培养基，6mlpbs冲洗3次，加入0.25％的胰酶2－3ml，胰酶均匀盖满瓶壁，消化2－5min左右（可以同时振摇），细胞缩起变圆，浮起，加入培养基2－3ml，不用太精确，吹打成单细胞悬液分瓶即可。室温下消化即可，因为是成纤维细胞，较为耐受胰酶，消化时间稍长亦可，要注意mcf-7细胞是一种肿瘤细胞，生长规律性差，很容易不均匀，要注意吹打的充分性

HSC-T6（大鼠肝星状细胞系）：

弃培液-->以D-Hanks'液洗两次-->0.05％胰酶消化-->镜下观察细胞变圆（约5分钟）-->以完全培液（DMEM+10% FCS）终止反应-->吹打，1:31:4接种，而且换液间隔不要超过48h，否则细胞容易脱落下来。

血液病细胞。

如Molt－4,Hl－60等：这些细胞的特点是悬浮生长，传代方便，而且适应能力强——————好养！

当细胞生长到约2—8×10（6）后，即可认为进入对数生长期，此时传代好，一般控制在2－5×10（6）之间最好，此时状态最好。传代方法：（传代前的消毒处理略）

直接在细胞悬液中加入一定比例的培养基。比例是根据您的实验时间安排而定，此细胞一般24小时左右可以增长一倍数量，因此，如果现在的浓度为4，您明天要实验，则可1：1传，————2×10（6）。明天同一时间大概就是4左右。

hl－60细胞：生长迅速，必须每天观察，因此如果明天您要4×10（6），今天为4，就必须以1：2～3的传。否则明天就已经因浓度太大而不易实验。

因是悬浮细胞，所以观察时以大小，圆不圆，颗粒多少，成团情况，培养基颜色来观察 vero（非洲绿猴肾cell):贴壁细胞，以25ml小方瓶为例，培养液用的是MEM。MEM的配制：10%小牛血清，1%双抗，3%谷氨酰胺，1~1.5%NaHCO3.传代方法：

1.倒掉培养液，如果细胞脏的话可用PBS洗两次，否则不用。2.胰酶0.25%2ml消化1~3分钟，容易消化.Molt－4：

3.倒掉胰酶，加MEM9~12ml,将贴壁细胞摇至悬浮，并用吸管吹匀，一传三或一传四。4.放置37度，5%CO2孵箱

Jurkat细胞（人外周血白血病T细胞）：是一种悬浮细胞：

1、培养液：RPMI1640，15％小牛血清，2％Na2CO3，1％HEPES，青霉素100IU／1ml，庆大霉素100IU／ml；

2、培养条件：5％CO2，37度，30％湿度；

3、细胞复苏：要快速将冻存管放入37度水中，不断轻轻摇晃，直到细胞完全溶解，加入10ml左右的培养液，800～1000rpm，10分钟离心，之后倒掉液体，加入新的培养基就可以进行培养了；

4、细胞培养：起初进行传代时由于细胞刚刚复苏，长得比较慢，所以可以3～4天传一代，传过两代后，一般2～3天传一代，每次传代后在倒置显微镜下观察细胞形态，在传过几代合适的时候可以进行实验。

5、细胞冻存：1000rpm离心后，弃去液体，加入含有15％DMSO的冻存液，按下列顺序降温：室温→4℃（20分钟〕→冰箱冷冻室（30分钟）→低温冰箱（－80℃ 1小时）→液氮。

6、我在做细胞培养时的一些小经验：

（1）细胞培养箱在每使用1个月最好用酒精擦洗一次，这样可以减少污染；

（2）虽然说加样器放在紫外下照射会不准，但我们还是丢了一把1ml的加样器在超净台，没有拿出来过，我想这样也许会减少污染；

（3）小牛血清我们用的是国产的，所以在一开始的时候加了15％的小牛血清，但细胞总是长不好，后来摸索条件，把小牛血清的量调到了20％，细胞生长旺盛；（4）HEPES虽然贵点，但加上去后细胞会长的不错；（5）在超净台操作前要用0.1％的新洁尔灭或75%酒精擦手

MCF-7细胞：

细胞放在显微镜下观察，细胞无污染、退缩，等其长满培养瓶约70%-80%时即可进行传代操作，具体步骤如下：

1.打开瓶盖，弃上清,2.D-HANK‘S夜（以50ml培养瓶为例，下同）2吸管清洗后弃之；3.加0.25%胰酶2吸管；4.轻摇晃后置入37度温箱；5.3-5分钟后置显微镜下观察，见细胞胞质退缩，变圆；6.吸去胰酶，加含10%FCS的RPMI1640 3吸管；7.用洗管吹打，见细胞脱落，培养液变混，即可吸出加到新的培养瓶中。

注意事项：若胰酶消化超过时间，见细胞已漂浮，切不可直接倒去上清，可直接加等量的含10%FCS的RPMI1640，吹打后加到离心管中离心5分钟，再弃上清，加入培养基进行传代

BALB/c-3T3：小鼠成纤维细胞。

消化过程：倒掉培养基——向培养瓶中加入少量37度预热的0.25%胰酶，转动培养瓶使胰酶浸过瓶底，倒掉胰酶——再向瓶中加入胰酶，加入量以能覆盖细胞为宜，1分钟后倒掉胰酶——将培养瓶置于37度孵箱中——显微镜下观察，细胞开始变形时以含10%小牛血清的DMEM中止消化——吹打成单细胞悬液，1:2~1:3接种，继续培养。

SKOV3细胞传代方法：

自CO2培养箱取出培养瓶－>超净工作台中,以吸管轻轻吹打有细胞的瓶壁，去除生长不好的细胞-->弃去培养液-->加0.04%&<46;EDTA数滴(用0.02%的EDTA不易消化掉)，浸过细胞-->置37℃培养箱10min&<46;左右-->取出，倒置显微镜下观察，细胞变圆回缩，但又未自瓶壁脱落--&<46;>超净工作台中弃去EDTA－>加入含10%新生牛血清的RPMI1640培养基--&<46;>吸管吹打后，1:2或1:3接种。&<46;

293细胞的传代：

通常我是不用EDTA的只用0.25%的胰酶消化一般在细胞约80%汇合时传代加入一毫升的胰酶后可以不用吸出胰酶（前提是用10%以上浓度的血清DMEM培养液）加上胰酶直接拍打至细胞脱落加入少许培养液中和后分瓶然后补加培养液 5%CO2孵箱 37度培养效果不错

HK2的传代（人肾近曲小管上皮细胞)： 以50ml培养瓶为例

1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，胶头滴管移去培养液，可轻轻吹打，移液时不留培养液残余

2、加0.25％胰酶1ml消化37℃约2min，镜下可见细胞基本圆形脱落，加含血清培养液2ml中止消化，反复混悬

3、移入离心管，1200g，5min

4、弃去上清，加入新培养液5ml，再次吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶，镜下可见散在分布圆形细胞

5、入37℃5％CO2孵箱，半天即可再贴壁

caco-2（人结肠癌上皮细胞）：

将Caco-2 细胞培养于高葡萄糖(的DMEM培养基中(1%非必需氨基酸, L-谷氨酰胺（L-glutamine), 培养液含青霉素（penicillin）10,000U/ml-链霉素（streptomycin）10,000ug/ml, 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS)）,长于T-75组织培养曲颈瓶中,通入5%CO2(相对湿度90%),置37℃培养箱中培养。培养介质2～3天更换一次,当细胞达到90%融合后，以不含钙,镁离子的磷酸盐缓冲液(PBS)清洗后与胰酶(0.25%)—EDTA(1mM)于37℃一起孵育至分离(约5～10分钟)。吹打细胞使之脱落，置离心管中1000rmp离心5分钟。细胞重新悬浮于完全DMEM液中以1:3的比例分配至新培养瓶中。即完成传代。

Bel7402和ECV-304：

37度，5％CO2培养箱。

消化前所用物品75％酒精擦拭后放到超净台上，紫外照射30min，同时胰酶和1640培养液（10％小牛血清，杭州四季青）75％酒精擦拭后放入37度培养箱平衡，进无菌室开始传代时取出。来苏水托地，整个房间紫外消毒30min。开风淋30min（时间宁长勿短啊，有一次弄得我的脸暴皮！半个月才缓过来）。Bel7402通常都是弃培养液（我通常是倒，觉得用吸管次数多会增加污染的机会，而我老师意见正好相反，郁闷啊），加入少量胰酶清洗，弃去后，加入胰酶2－3ml，培养箱内放置3min左右，取出，加入培养液中和胰酶，轻轻吹打即可。

ECV－304培养条件同时。操作的时候步骤基本相同，只是加入胰酶消化的时间比Bel-7402稍微长1－2min

卵巢癌的细胞：

包括SKOV3、A2780、3AO、OVCAR3、HRA，几种细胞的特性不完全一样，但是我的传代的步骤是基本一致的：细胞生长至80%汇合时传代，先倒掉培养液，加预先加好双抗的生理盐水或PBS 5-10ml（100ml培养瓶）后轻轻摇晃数次后倒掉，加0.25-0.35%的胰酶2ml，并使其分布均匀（这一点很重要，一定要注意工作台是否平整，否则容易造成胰酶分布不均匀而细胞消化不同步），待细胞间隙变大时终止消化，加含10%血清的培养液（我用的是1640）4ml轻柔吹打，再按照需传代的比例（1：2或1：3）补足培养液后分装至2-3个培养瓶中。若细胞碎片较多，可在消化后不倒掉胰酶直接加含血清的培养液吹打后500rpm离心5min，再用培养液重悬分瓶。消化所需的具体时间依细胞的种类和状态而定，也和细胞的汇合程度有关，一般是80%汇合时最容易消化，若细胞长得太满，消化时间要适当延长，必要时可以将培养瓶移至培养箱内消化。另外，一次性培养瓶要比玻璃培养瓶所需的消化时间稍长。

胰腺癌细胞我所养的是CAP，感觉不太好伺候，尤其是传代时很困难。我一般是在倒掉培养液后，加生理盐水或PBS冲洗，而后加一次胰酶作用3-5分钟，倒掉胰酶，再加2-3ml新的胰酶继续消化，这样加两次的效果好一些，但是吹打的时候还是很困难，总感觉细胞的贴壁能力太强了，明明看见细胞已经变圆了，可就是吹不下来。现在想想可能在胰酶中加EDTA会好一些。

CHO细胞：中国仓鼠卵巢细胞。

1、培养液用的GIBCO的RPMI-1640。里面加10%小牛血清，青霉素+链霉素。消化时用0.25%胰酶。

2、我都是1640配营养液时现加血清和双抗，血清分装后直接由-20度到37度水浴箱中溶掉，没发现血清有沉淀现象。总体积100ml的培养液：90ml1640+10ml牛血清+1ml双抗，无其他物质了。培养过程中没发现有什么问题。

3、传代时，先吸掉培养液，我都不用倒掉的方法，怕由于瓶口而污染，都是慢慢吸管吸出的。然后培养液略微冲洗一下，加胰酶，倒置显微镜下见80%细胞变圆后，吸出胰酶，培养液终止消化。吹打下细胞，按所需稀释比例传代。我现在的CHO细胞状态不是很好，但是疯长，不知道为什么。所以每次传代时，我都是留一滴足够，差不多能稀释20倍了。不知哪个战友也养CHO细胞，多交流。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代：

RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢，普通的方法根本就不可能将它消化下来，这也是养这种细胞最头痛的问题。现将我的一点心得，简介如下： 消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA，实验前加温到37度

以50ml培养瓶为例：

1、细胞贴壁生长，长满瓶底80％时，弃去培养液，加D-HANKS 漂洗两次；2.加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min，镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化，弃消化液加D-HANKS 漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞，按需要分入新的培养瓶；4.入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。

SK-BR-3（乳腺腺癌细胞系）的传代方法：

刚开始养SK-BR-3时，细胞状态不是很好，贴壁也不均匀，于是开始想办法，考虑是不是吹打的不够，或是传得过多，或是其它的什么，后来发现的确如此，细胞的生长状态与传代的方法有很密切的联系。

我的传代方法是：

以50平方厘米培养瓶为例，待细胞长满瓶底70％－80％ 1 吸除或倒掉瓶内旧培养基。PBS 5ml加入培养瓶，轻轻晃动培养瓶，让PBS流遍细胞表面，倒掉。3 PBS 5ml加入培养瓶重复洗一次，倒掉。加入1ml胰蛋白酶消化液，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面，然后置37度5％的二氧化碳培养箱放置5分钟，在显微镜下观察，发现细胞脱壁、变圆即可。5 加入含血清的培养基5ml中止消化，吸取瓶内培养液，反复轻轻吹打瓶壁细胞，确保所有的瓶底都要吹打到。6 吸1/3至1/4的细胞悬液接种至新的培养瓶，然后加8ml的新的细胞培养基，置37度5％的二氧化碳培养箱完成传代。

饲养层细胞STO的传代：

1.当细胞铺满整个平皿(100mm)后,吸弃旧培养液，10mLPBS洗一遍

2.0.25%胰酶（预热20分钟左右）2ml消化，轻轻摇晃，直至肉眼见单层细胞呈块状脱落（或在显微镜下观察细胞之间分离），立刻加5ml(DMEM+10%FBS)终止消化，轻柔吹打8-10次成单细胞。

3.离心1000rpm*5min,弃上清，加DMEM+10%FBS轻柔吹打。

4.将细胞悬液1:4传到100mm细胞培养皿中，每个皿加10ml(DMEM+10%FBS)培养液，正常情况下2-3天就可以长满，期间不用换液。

小鼠ES-R1细胞系传代：

因为我们用饲养层细胞铺皿而不是明胶包被，所以传代之前必须处理饲养层细胞。1.饲养层细胞STO处理：当STO铺满平皿后，向培养液中加入100ul 1mg/mlmitomycinC(toxic, 操作时不要接触，作用是抑制STO增殖)，轻轻摇晃平皿，保证丝裂霉素分布均匀，放置于培养箱中处理2h后，吸弃培养液，10mlPBS洗两遍（目的是把mitomycinC洗净），0.25%胰酶消化，5ml(DMEM+10%FBS)终止，离心1000rpm*5min弃上清，加DMEM+10%FBS后吹打均匀，种到新的100mm细胞培养皿，补齐培养液至10ml。置于培养箱中过夜。2.第二天早上传干细胞：

（1）吸弃旧培养液，10mlPBS洗一遍，2ml 0.25%胰酶消化，边消化边轻轻晃动培养皿，4-5min后镜下观察发现发部分细胞脱落，成小的细胞团块，加8ml DMEM+10%FBS终止消化，轻柔吹打。

（2）然后将液体转移到15ml塑料离心管中，静置10-15min，吸弃上清，加2mlES培养液。

（3）将滴管在酒精灯下拉成非常细的玻璃管，吹打1－2次，尽量将ES吹散

（4）将前一天铺好的STO的培养液吸弃，换成10ml的ES培养液（操作要小心，不然STO很容易脱落），再把塑料离心管中的ES1:3或1:4(视情况而定)传到铺好的STO皿中，前后左右垂直晃动几下，使干细胞分布均匀，置于培养箱中，每天换液，两到三天传代。应该注意的问题：

1.STO不管是在ES传代还是换液过程中都可能因为加液体速度过快而脱落，所以最好靠近培养皿壁先一滴一滴加，避免液体直接打在STO上。2.玻璃管拉得尽量细一些。3.一定要把mitomycin洗干净

HepG2细胞株的传代经验：

首先在倒置显微镜下观察生长融合达80%，不需要长满，就准备传代。倒掉旧的培养基，再用已经高压灭菌过的PBS洗1－2次，我用的是25平方厘米的培养瓶，加入1毫升已经配制好的0.25%胰蛋白酶－0.02%EDTA(0.25%胰蛋白酶是用D-Hanks配制后先用滤纸过滤，再用一次性过滤器过滤除菌，再分装成1ml的小包装，刚好每次用完一个，避免每次反复冻存，会使胰酶的活性下降），加入的量以刚好盖满瓶底为宜。放到倒置显微镜下观察变化，一旦发现细胞开始变园收缩，大约1－3分钟时间，必要时可以吹打帮助细胞分散，就立即加入培养基中和胰酶，如有EDTA最好要离心（800rpm,5min)，弃上清夜，再加入完全培养基吹匀，再分瓶，一般一瓶可以分2－3瓶。放入5%的CO2培养箱，37度培养24小时后观察。

hela细胞的培养条件为: 高糖DMEM培养基,100ml/l胎牛血清;培养液中一般血清含量为10% 传代步骤: 1．倒去细胞培养液(对于小口的培养瓶可采用顷倒方法,对于培养皿,必须用吸管吸出)

2．吸取适量的PBS加入培养瓶中,轻轻振荡后弃去重复一次,以清于血清成分, 利于胰酶消化

3．加入适量0.25%胰蛋白酶（一般100mm培养皿可加入1ml，15cm培养瓶加入5-8滴）转动培养瓶，使其湿润整个细胞房，高温下消化2-3分钟。

翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜出现针孔大小空隙时即可顷去消化液，如消化程度不够可延长消化时间，或置于37°C孵箱中加速胰酶作用如见大量细胞片装脱落，已消化过头，则不能顷倒消化液而直接进行下一步操作 4．加入适量培养液终止消化 吸取瓶中培养液反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下轻轻吹打，混匀，成细胞悬液取样计数，调整细胞浓度为5′10 /ml

15cm培养瓶培养时，吸取1ml细胞悬液加到新培养瓶中，加入4ml培养液，盖好,置37°C孵箱中培养。

传代的天数要以HELA细胞的生长密度为基础,细胞密度大了就要传,应该每天观察HELA细胞,注意其生长状态.HELA细胞的生长分5期: 游离期

细胞经消化分散后，由于愿生质收缩及细胞弹性，细胞成圆形，折光性强，呈悬浮状态。吸附期

接种24小时后，由于细胞的附壁特性，开始贴壁，圆形细胞变成延展状态。繁殖期

细胞快速生长、分裂，形成细胞岛直至细胞单层。维持期

细胞形成单层后生长与分裂减缓、折光性减弱，细胞内颗粒增多，由于代谢物的积累，CO2增多，培养液变黄。衰退期

如不及时换液和传代，由于营养缺乏、代谢物积累，细胞内颗粒进一步增多,立体感差，细胞皱缩、脱落、逐渐衰老死亡。

应该在其维持期和衰退期及时换液.一般而言是4天换一次液.祝你实验顺利!

S180肿瘤细胞的, S180腹水型肿瘤细胞平时可以在小鼠腹腔中转种传代.我们科室保种时就这样的.在有的试验时需在培养瓶中培养一段时间,由于其增殖较快,培养时密度不宜大,一般10*5/ml就够了;通常2天就需换一次液,由于其是悬浮细胞，无须消化,直接离心去上清,PBS洗涤,用含10%小牛血清的RPMI1640培养液就可以了.其要求条件相对较底,一般培养室都能达到.我平时还养小鼠的淋巴细胞,我们养的是混合淋巴细胞,不是单一的细胞株(或系),主要特点是如果需要传代培养要加IL-2(出于经费考虑,我们就用人源IL-2,因为IL-2具有沿种系普向上约束性,而乡下无约束性)50~100u/ ml,换液时可以离心去上清,可以用PBS洗涤两一次,加入含10%小牛血清就可以了,其他注意事项同一般的培养.小鼠成肌细胞C2C12和人横纹肌肉瘤A204细胞的消化传代方法

供大家参考: 1)细胞消化液的配制及存储:我采用的是0.25%Trypsin+0.05%EDTA的消化液,BUFFER采用的是D-Hank's液.配完后分装成4-5ml/tube,于-20度冰箱中储存.2)消化前的处理:当细胞生长至亚融和状态需要传代时,提前半小时将配好的消化液放在细胞培养孵箱中预热,同时将配好的高压无菌的D-Hank's液也进行预热.3)消化细胞:将预热的D-Hank's液洗细胞2次,2ml/25cm2,然后再加入预热的消化液,作用3-5min,并反复振荡,镜下观察.当细胞被消化成单个圆球状时,加入等体积的培养基中止消化,然后反复吹打,将消化后的细胞悬液,全部吸出后置于离心管中离心,1000rpm,10min.4)传代接种细胞:离心完毕后,弃去上面的上清,加入新鲜预热的培养基,并计数,按要求接种的密度接种到新的培养瓶中即可.这种方法的优点是:细胞消化彻底,损伤小,接种均匀,易于控制密度等.hepa1-6和p19细胞。

hepa1-6是小鼠肝癌细胞，p19细胞是小鼠畸形胎瘤细胞，前者须用10%胎牛血清的DMEN养，后者须用10%胎牛血清的FD养，且经常在传代初期出现生长状态不好，要反复洗涤后换液，多观察。

Ecv304细胞的培养

Ecv304细胞也很好培养．用含有10%小牛血清的DMEM培养，一般２－３天长到８０％即可传代，传代是吸去培基，用ＰＢＳ冲洗，加入0.０5%的胰酶＋0.02%的EDTA，３７度消化１分钟，加含有10%小牛血清的DMEM终止消化，吸管轻轻打散细胞，然后加培基放入37度二氧化碳培养箱中培养即可． 小鼠肝癌H22体内传代的详细步骤：

1.腹腔种植小鼠肝癌H22细胞后第5-7天时，将小鼠颈椎脱臼处死，于75%酒精浸泡1-2分钟或腹部消毒。

2.于无菌条件下用5 号针头注射器抽取腹水，并置于10～50 ml离心管内，用生理盐水(NS)10倍稀释，吸管充分吹打均匀，1 000 r/min-1离心5#ml 7 min，倾出上清，按一定比例加入生理盐水，配制成瘤细胞悬液5-10*10^7/ml，0.2 ml/只，接种到小鼠腹腔。3.为简单起见，也可将抽取的腹水用生理盐水做简单稀释（1：2～1：4），0.2 ml/只，腹腔传代。

4.下次传代时，重复以上步骤即可。小鼠肉瘤S180腹腔体内传代同上。

H22小鼠肝癌细胞株

是腹水型细胞株，悬浮生长。液氮冷冻保存。使用时取出复苏，用1640加10%新生牛血清培养，三天后取液计数成1＊108浓度，取0.08ml注入小鼠腹腔，7天左右腹水可用，一般要低速离心去掉巨噬细胞等混杂细胞，腹水得到的细胞比培养瓶中生长的细胞活力高，皮下接种成瘤率为100％。本法传代可靠性高，细胞活力强，致瘤率高。

神经胶质细胞传代经验：

1、倒掉培养液,用D-HANKS洗两次

2、加入0.125％胰酶/0.02％EDTA（1：1），盖满瓶底为宜。

3、将培养瓶放置显微镜下进行观察，发现细胞间隙增大，突起回缩后竖起培养瓶，倒掉消化液。

4、用D-HANKS洗一次，此时动作要轻

5、加入完全培养液，轻轻吹打混匀，接种至培养瓶中。注意： 1、0.125％胰酶/0.02％EDTA的PH值和温度重要，即PH值（7.5），温度（37℃）

2、如果消化速度过快，细胞掉下来，也不要紧，加D-HANKS或完全培养液终止消化，离心1000r/min，10分钟即可

3、轻轻吹打

大鼠肝癌细胞系CBRH7919 是我国自己培养的细胞系，最初是用二乙基亚硝胺诱发的Wistar大鼠肝癌组织传代而成。此细胞系增殖力很强。

传代方法：细胞长到90%以上，弃培养液->0.25%胰酶消化->消化时间1.5-2min->吸弃胰酶->加入1640培养液，10%胎（小）牛血清->传代（一般一传三）

如胰酶消化时间增加，可通过离心沉淀细胞后加入培养液传代，但这样增加传代时间，而且该细胞系粘附性较强，离心后易形成细胞团，且不易分散。

293细胞

293贴壁很不牢，可以不加消化液直接吹打下来，但这样下来的细胞容易聚成团，传代后形态不大好看。可以先倒掉培养液，以D-HANK‘S液轻轻冲洗，再加0.6ml 0.25%胰酶/0.01%EDTA，轻轻润湿细胞后即可弃去，置于镜下观察，很快即可见细胞变圆，加入适量完全培养基终止，轻轻吹打即可。这样细胞既不会消化过头，又极尽吹散。

膀胱癌 T24细胞（贴壁的）。

心得如下：

1、T24长的非常快，传代一般1：5传，每4天需要再传。

2、虽然是永生化细胞，也一定不要等细胞100%汇合再传代，多次这样细胞状态不好，球形增加，还不容易洗掉。

3、要用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化好些，一般1分钟内呈球形，即可混悬细胞了。

4、培养液用10%小牛血清的DMEM或1640都可以。

步骤：吸净培养液，PBS洗2次，加消化液室温一分钟左右，要在显微镜下注意观察，不要过头，球形后，吸掉消化液，加1毫升培养液，吹打混匀，1：5传代。

SMMC－7721，肝癌细胞株：

1、SMMC－7721开始长的比较慢，呈花瓣状，成片后迅速增殖，细胞由于过密开始变小，如果不及时传代，会清楚的看到细胞张成两层，下层细胞大一些，上次呈圆形，小。2、3-4天可以传代，传代时稀释度视情况而定，一般1：3-5

3、用胰酶（0.25%）--EDTA（0.01%）混合消化液消化，消化时间较长，大约5分钟，当细胞过多时时间更长，建议分两次消化，既先消化下来的一部分倒出加培养液（培养液用10%小牛血清的1640)终止，剩下的细胞继续加消化液消化。

步骤：倒净培养液，胰酶洗1次，倒尽，加胰酶消化液置于37度，在显微镜下注意观察，细胞变圆后，倒掉消化液，培养液，吹打混匀，1：3-5传代。

293T,贴壁细胞：在消化传代过程中，步骤如下：

用滴管吸尽旧的培养液－＞用培养基洗一次－＞加入一定量的胰酶（已预热）-＞显微镜下观察，待细胞大部分变圆时，回到超静台－＞用滴管吸尽酶液－＞加入一定量的含血清的新培养液－＞反复吹打细胞－＞再置显微镜下观察，直到细胞全部悬浮起来－＞吸出一部分加入新的培养瓶中－＞最后再补充加入一定量新的培养液，放入培养箱。可用含有血清的DMEM，也可以用含有血清的1640。

HELF(人胚肺成纤维细胞), 这也是一种贴壁生长的细胞,所以传代培养时的大概方法没有什么不同.但这种细胞贴壁贴得不是很紧,所以消化过程中有几点注意事项(本人总结): 1.当倒出原有培养液时,最好将培养瓶反过来,即有细胞的面朝上.2.如用EDTA消化,最好先让其消化3分钟,后每一两分钟看一次.3.每次看时不要太过晃动瓶子,以防细胞成片脱落.如果细胞成片脱落了就比较麻烦了,因为细胞已经脱落,就不得不终止消化,但实际上细胞与细胞间的连接并没有完全断开,吹打也分不开,那样分出来的细胞也就成团,则不利于细胞贴壁及生长.4.如果在终止消化前有细胞脱落,不要浪费,先加Hank's液终止消化,然后离心,收集细胞,再让其生长.5.细胞生长状态好时,一般5-7天可以长满,其间换一次液就可以了.6.但我也遇到过生长不太好的情况,细胞长了12天才长满,且其中有几天几乎没长或出现大量黑色死细胞团,这时不要放弃,只要活细胞不是太少,没有关系.之所以长的慢或有死细胞,大概是消化时EDTA的损伤造成的,细胞恢复活性需要一定时间,且一旦活性恢复,细胞将长得很快.人肝癌BEL-7402细胞传代步骤：

1.弃去旧培养液（可用巴氏吸管吸去，也可直接翻转培养瓶，使培养面朝上，直接倒掉培养液）。

2.PBS冲轻缓漂洗细胞两遍，尽量洗去残余血清，弃PBS液。加0.25%胰酶（以盖满瓶底为标准）于37度条件下消化，倒置相差显微镜下观察，细胞解离程度以细胞突起回缩，细胞间隙增大，细胞近乎缩成圆形为准。4.直接加含血清的1640培养基（或血清)终止消化。

5.用弯头吸管均匀有序的吹打细胞，动作不宜过猛，防止起泡产生。

5.离心5分钟（1000转/分钟），去上清。加入PBS液吹打混匀，再离心一遍。6.用含10％小牛血清的1640培养液重悬细胞，按1：3传代！7.补加培养液至所用培养瓶容积的1/10为准。8.送孵箱培养。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代，RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。我得操作如下：

实验前将DPBS及DMEM加温到37度 使用Flask75培养瓶：

1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS10ml漂洗一至两次；弃去 2.加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞 3.分入新的培养瓶；

4.入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。

卵巢癌细胞SKOV3

贴壁生长，传代步骤： 1.倒掉旧培养液，尽量倒净。

2.如果是50ml的培养瓶，加入约1ml0.25％胰酶中和残留培养液，倒出。也可用D-HANKS液洗一次，可以节约胰酶。

3.再加1ml0.25％胰酶消化，本人体会，新开瓶（指分装的小瓶）使用的胰酶消化能力强，可以减少用量至0.5－0.8ml,已用较久的胰酶如用少了就不管用。

4.镜下观察，如果80％以上细胞都回缩变圆，立刻将培养瓶竖起，防止过度消化。5.倒掉胰酶，用含10％小牛血清1640培养液5ml加入瓶内，按顺序轻吹打，如瓶底由模糊变透亮，说明细胞已从瓶壁吹离。

6.此种细胞生长较快，所以一般按1传5－6传代，按瓶数补足培养液，吹匀后分别接种到新瓶中。

7.根据培养液颜色变化所提示的酸碱度变化，一般2天左右换液一次。

人脐静脉内皮细胞株ECV304：在含体积分数为10%胎牛血清（FPS）的RPMI1640培养液，37℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度条件下培养，3-4d换液传代一次。实验时采用对数生长期细胞。传代时先倒掉旧培养液，用pbs５ml洗两遍，再加入0.25%的胰酶+0.01%edta，加入的量以能覆盖瓶底为准。加入后轻轻摇晃培养瓶使液体覆盖瓶底，然后大约半分钟左右看一次，对着光源观察瓶底细胞黏附面是否有裂缝（如有则在显微镜下可见细胞之间出现间隙且有大部分细胞呈现圆形），倒掉，加入含低浓度血清培养液，然后吹打瓶底各处使细胞脱落。离心后去除上清液，加全培，再分４瓶，补加培养液。这样操作步骤可大大简化，不需要将培养瓶拿出拿进操作台了．

附:消化缓冲液(0.25%)胰蛋白酶：胰蛋白酶干粉1.25g，0.1gEDTA，溶于50ml 10×D-Hanks溶液中，调节至PH 7.6，定容至500ml，22um滤膜过滤除菌，分装后-20℃保存备用

第二篇：细胞培养步骤

细胞培养前需要准备的物品

提前开启37℃水浴锅和超净台的紫外灯；

灭菌吸头、1.5mL的离心管、空玻璃瓶；

无菌的15mL、50mL离心管；

无菌的10cm培养皿、16孔板、32孔板、96孔板、培养瓶等。

5mL、10mL的移液管；

橡胶手套、普通移液器、电子移液器、装有99.9%-100%CO2钢瓶

70%酒精、DMEM培养基（37℃提前温浴）、FBS血清、二抗生素（10,000Unit/mL penicillin和10,000ug/mL Streptomycin混合液）、0.05% typsin-EDTA（上述培养细胞所用试剂都用GIBCO的产品，国产的产品没有办法保证质量）细胞培养步骤

1.取一瓶液体DMEM培养液（GIBCODMEM液体低糖培养基）、FBS血清、二抗，在放入超净台前用70%的酒精消毒；

2.向500mL的DMEM培养基中加入55mL的FBS血清，至终浓度为10%，再向其中加入双抗生素，一般保证抗生素的单位达到100Units（即500mL培养基中加入5mL 10,000单位的双抗生素，如果用于保藏的细胞培养最好不加），放置于4℃冰箱中保藏待用；

3.细胞培养使用前培养基应先放入37℃水浴中温浴，提前打开超净台的紫外灯杀菌，然后从水浴锅中取出培养基，喷上70%酒精后放入超净台中待用；

4.从液氮中取出冻存管，立刻放入37℃的水浴锅中晃动，直至细胞冻存液完全溶解；

5.将细胞冻存悬液转移到离心管内，加入约5mL培养液，轻轻吹打混匀；

6.将细胞悬液经500rpm/min离心5min，弃上清液。

7.向细胞沉淀内再加入适量培养液，轻轻吹打混匀，将细胞悬液转移到培养皿中进行培养。

8.取出在培养箱中培养的细胞（一般BMSCs传代3次左右就不太好了，所以较难培养）显微镜下观察细胞的生长状态，在超净台中吸去表面的培养基，此时加入少量的培养基清洗一下，然后向培养基内加入1-2 ml 0.05%胰蛋白

酶后放入37℃培养箱中处理1-2分钟使细胞与培养皿脱离。

9.取出培养皿，观察胰酶处理的效果，一般以视野中出现均匀的单细胞为宜，如果有多个细胞聚集的现象可以继续处理1-2分钟，然后吸去胰酶，加入适量的培养基进行终止胰蛋白酶活性，用电子移液器套移液管进行吹打，使细胞悬浮。

10.显微镜下观察细胞悬浮程度，最好是可以看到均匀的单细胞，如果有多个细胞聚集的现象可以用手动移液器进行吹打。

11.向事先准备好的培养皿中加入8-9ml的培养基（此过程加入的培养基的量与加入细胞时所带入的培养基的量有关），一般10cm的平板中总量有10ml的培养基。向含有培养基的培养皿中加入1-2ml的细胞悬液，然后放入细胞培养箱内

注意事项：

1.加入FBS血清时要考虑血清本身的体积，使FBS血清的终浓度达到10%；

2.FBS血清和二抗生素提前1天放入4℃的冰箱中融化，可以用50mL无菌的离心管分装，以免多次融化造成血清变性。每50mL的离心管中最多装入40-45mL的FBS血清，因为血清冻存后会膨胀；

3.冻存管中的细胞溶化过程要迅速，减少DMSO对细胞的破坏作用；

第三篇：实验总结-细胞培养方法

一、培养细胞常用配置

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超净工作台常规配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏 步骤：

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。

7.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8.将培养瓶放入培养箱内培养

注意事项：

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。

5.冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液

6.复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

8.原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

三、培养液的更换

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸 5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。6.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7.将培养瓶放入培养箱内培养

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。

四、细胞传代

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。

5.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。8.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿内吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。

9.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

10.将培养瓶放入培养箱内培养。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。

五、细胞株的保存

原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

实验步骤：

选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

5.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。6.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min 8.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定数量备用 9.弃去培养基，用冻存液进行重悬混匀后，将1ml含有细胞的冻存液移入冻存管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。

10.将培养基，胰酶瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8.将冻存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱内3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌内长期保存。或直接放入梯度降温盒内，放入-80℃冰箱内过夜后最后存放于液氮罐内。（梯度降温盒内为甲醇，使用5次需要更换，每次使用需做好标记，使用前需恢复常温）

六、细胞转染

RNA干扰（RNA interference, RNAi）:  是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常录;

 PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。

作用机制

1)其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

4)siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

5)RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

脂质体转染原理：

1.脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体 2.阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达

DNA转染步骤

1.转染前一天接种细胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到90-95%每孔。

2.转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。

4.B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5.B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6.将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7.孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8.第二天看细胞状态来决定是否换液。9.同时设立细胞对照组，空白转染组。

siRNA转染步骤

1)转染前一天接种细胞于6孔板（40x104），2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到50-60%每孔。

2)转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。（siRNA按照说明书稀释）4)B液：脂质体（RNAimax）使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5)B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6)将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7)孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8)第二天看细胞状态来决定是否换液。9)同时设立细胞对照组，空白转染组。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上进行转染实验

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀释液，取附赠的DEPC水至管内，打开离心管前先离心，将附在管壁上的冻干粉离心下来 2)溶解时滴加适量的DEPC水后盖上管盖，震荡溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分别标记GAPDH，NC，NV-FAM，三个片段名称，从管内吸取20ul的稀释液分装后

4)将稀释液至于-80度冰箱保存。

 转染前一天，在6孔板上接种40x104AGS cell，再取一个35mm培养皿接种40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生长培养基。使细胞在转染的时候有50-60%的融合率

 从细胞中除去生长培养基

 每个孔中加入1.5ml新鲜不含血清的培养基，并准备如下混合物 1)A液：(取7个EP管，分别标记空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三个片段)。在250ul的opti-mem终加入100pmol siRNA（稀释好的siRNA浓度为20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均匀

2)B液：（取一个EP管标记RNAiMAX），RNAiMAX 使用前摇匀，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀释RNAiMAX混匀后并在室温下温育5min 3)混合A液和B液，混匀B液后吸取256ul至A液中室温下温育20min  将混合物混匀后加入到含AGS的6孔板与35mm培养皿中，每孔终体积为2ml，则加入混合液500ul，并轻摇混匀  在37℃的二氧化碳培养箱中培养5-6小时  更换含血清的培养基并培养细胞24-48小时 24-48小时后收细胞跑WB，看沉默效果

第四篇：Excel导出多种方法总结

Excel导出

方法一：XML拼接导出

通过stringbuild，将要导出的数据拼接为XML，然后导出。

步骤：

1． 获取数据源

2． 拼xml文件头，给定输出文件格式和编码格式

3． 通过table拼接数据源到xml中

4． 获取导出路径

5． 通过IO流将xml写入，并输出到指定位置

该方法最为简单，但是导出后无法把握内容输出格式（一般为常规格式—HTML）。方法二：Excel对象方法

通过Vs自带的microsoft.Office类创建Excel

步骤：

1． 初始化Excel对象，实例化Excel

2． 定义Application对象，Workbook对象，Worksheet 对象，Range对象

3． 初始化Application对象

4． 创建sheet表，给定表内容格式，5． 绑定数据源，将数据遍历到Excel单元格

6． 给定导出路径导出

7． 异常判断，清空对象，杀掉进程

该方法最为复杂，但是可以直接操作Excel对象，功能丰富，最大却点是创建完成后要处理进程，最大难点是存在Com权限，这对于没有管理员权限的用户难以使用，设置麻烦

方法三：Dataset直接导出

通过Dataset获取数据源，然后拼接到stringbuild可以直接输出

步骤：

1．2．

3．4． 获取数据源 给定输出类型，编码类型 遍历数据 向HTTP输出流中写入取得的数据信息并输出

该方法思路编码都简单，但是在遍历数据时不易处理单元格之间格式而导致，所有数据成一个string输出，并且效率低

方法四：GridView/DataGrid绑定导出

通过GridView或者DataGrid的数据源直接导入到IO中输出

步骤：

1． 初始化GridView、DataGrid

2． 给定GridView、DataGrid样式

3． 绑定GridView、DataGrid数据源

4． 给定输出文件类型和编码类型，文本格式

5． 向HTTP输出流中写入取得的数据信息并输出

该方法效率高，样式丰富，可以设置为文本，较为完美！

第五篇：动物细胞培养总结! !!!

动物细胞培养总结 一．实验准备

1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装

离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。

蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。

过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。

过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。

玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。（2）消毒灭菌

1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。

2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。

玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。2.无菌间消毒及设备检查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。

用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。设置温度和二氧化碳。

紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。3.细胞培养用液的配置及分装

RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水，NaHCO3溶于水后，过滤除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。

双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。两溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。

二．操作步骤 注意事项：

1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。

2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。

3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。

4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。开始工作：

1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。

2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。1.细胞复苏

提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。

将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。

关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。

戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。(注意：这一步对细胞存活率至关重要。既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。封上封口膜。

低俗离心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。37度恒温箱中培养。第二天观察细胞生长情况。培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。2传代培养

附着型胞(adherentcell)传代培养

离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。

轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（0.25%为1X胰酶），37℃作用数分钟。等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。）

轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍台子，灭酒精灯。

3细胞换液

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。

用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。旋紧瓶盖。将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。

4细胞冻存 1>准备工作：

提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。

进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30，过后，关闭紫外灯，通风10min。从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基，血清37度水浴。取出室温放置的DMSO。找到防水的医用胶布，滤菌膜，针管和所需枪头饭盒等物品，喷一遍酒精，放入台子照紫外。2>开始工作：

实验前在更衣间换上紫外照过的白大褂和拖鞋。戴上橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。酒精擦拭胰酶、PBS缓冲液、培养基放入超净台。过火镊子取出离心管于试管架，剪好封口膜备用。用滤菌膜和针管过滤DMSO以除菌。

75%无血清培养基，20%的血清，5%过滤除菌的DMSO，混匀配制成所需的冻存液。

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，挂壁残液注意用酒精棉擦去，用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量胰酶约2ml，弃掉枪头。消化数分钟，等待期间，用过火镊子从饭盒中取出冻存管和管盖标记好细胞名称和冻存日期，直立于台面备用。

用微量枪加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。离心5min，1000转/min。

细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。用微量枪将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。用微量枪将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口膜封口，防水医用胶布再缠一圈，标签时间，细胞名称。

冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 铺板和细胞计数

用传代方法制成细胞悬液。倒掉培养基，用PBS液洗涤后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培养液吹打制成待测细胞悬液转至离心管，封上封口膜，离心1000r/min,5min。

等待离心其间，取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，将盖玻片盖在细胞计数槽上，使覆盖细胞计数板上的上下两个“十字”区域。取一只新的15ml离心管，做好标记，摆放好。离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，加入全培养液吹散沉淀细胞成细胞悬液，拧紧管盖，上下颠倒混匀。用枪吹打混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取1ml细胞悬液移入新的15ml离心管，加入4ml完全培养液，即稀释五倍，吹打混匀细胞悬液，上下颠倒混匀细胞悬液。

上下颠倒混匀新15ml离心管内细胞悬液，计数前将待测液吹打均匀，用微量枪从新15ml离心管中取出细胞悬液（约10μl），滴入计数板上盖玻片的一侧缝隙旁，虹吸作用液体会吸入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数，注意滴入悬液量不能太大致使细胞悬液流入旁边的槽中），镜下观察细胞，数出计数板四角大方格中的细胞数（16个小格×4个大格），用计数器计数（约200个）

细胞数 万个/mL原液=（4大方格细胞数之和/4）×稀释倍数（常稀释5倍，若细胞过多不能数清则加大稀释倍数，不断调整新离心管中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。）每皿/瓶需铺板50-100万个细胞，根据细胞计数算出每皿所细胞悬液需毫升数，加入悬液时注意混匀，不得有气泡，吸时注意每次枪尖是否都吸满液体。每皿加入细胞悬液后，用含血清培养基补足至2ml/皿/瓶。24h后观察细胞长至八成满时即可加药处理。

6检验判断细胞状态与加药处理

细胞复苏或传代后24内不可传代，传代4小时后开始贴壁。1>培养基颜色澄清度：

正常生长的细胞培养基澄清透明，倾斜使培养基聚集，对着灯看可透光，若出现丝状沉淀或倾斜培养基对着灯看出现浑浊不透光且镜下细胞之外的部分有密密麻麻的小黑点，很可能是染菌，应弃掉。若镜检在细胞之外部分有一些浑浊，可能因为细胞代谢旺盛分泌物堆积，或者因为消化时间不够以至于过度强硬吹打细胞，造成细胞损伤产生大量细胞碎片，应换液。

新鲜培养基呈粉红色，代谢代谢旺盛的细胞的培养基会变黄，此时若细胞贴壁应换液，若此时细胞已长满，应传代。2>密度：

细胞密度过低，镜下观察稀稀疏疏，则生长缓慢，甚至死亡。较大的细胞密度可促进细胞之间相互作用，促进细胞增殖生长。密度过大，密密麻麻，部分细胞不能伸展成圆形，必须传代，此时不传代，一两天后细胞状态持续不好，开始死亡，镜检漂浮细胞增多。3>状态：

镜下观察细胞，当左右上下移动镜头时漂动的是未贴壁细胞或死细胞，固定不动的是贴壁细胞，贴壁细胞是活细胞。

状态良好的贴壁SY5Y细胞有圆形的胞体和细细分支的突触，突触分明。状态不好的SY5Y细胞，突触不明显，看不到什么细细的分支，甚至成圆形。

消化时快离壁的细胞呈亮亮的圆形。

加药前应提前计算好药品浓度体积，根据实验处理要求的浓度换算出每皿应加药品稀释液体积和无血清培养基体积，列成表格以备加药时明确操作。将药品储备液稀释成稀释液，再与相应体积的无血清培养基在离心管中混合好。加COS时，倒掉含血清培养基，PBS荡洗一遍，加以混合好的药品。加COS 3小时后加Ab，Ab须提前37度水浴5小时，加药时采用半数放液法，弃去1ml原培养基，加入1ml已混合好的药品。