动物细胞培养总结! !!!

第一篇：动物细胞培养总结! !!!

动物细胞培养总结 一．实验准备

1.实验器械、器皿的清洗和消毒（1）清洗和包装

离心管(1.5ml，2ml,15ml)若干，冻存管若干放进铝饭盒，用牛皮纸包裹，系紧棉绳，用笔在饭盒上和牛皮纸上标记盒内所装物品名称、数量、日期和所属人名称。

蓝枪头两盒，黄枪头白枪头各一盒用牛皮纸包裹，用棉绳扎紧。取适量蒸馏水于4L玻璃瓶，瓶盖拧松半圈。

过滤器，250ml玻璃瓶，500ml玻璃瓶用自来水毛刷洗涤剂刷洗，蒸馏水润洗，烘干。

过滤器两部分分别包裹，先将瓶口部位用锡纸包裹后，再罩以牛皮纸，再用棉布密包起来，用棉绳扎紧。

玻璃瓶拧下瓶盖，瓶身浸酸。浸酸时应注意安全，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁以便浸酸结束后清洗耐酸手套，防止走动时酸液滴到地板上不好清洗。瓶口慢慢沉入液面下，注意缓慢降低瓶身，使液体慢慢浸入瓶内，以免产生气泡溅出酸液，发生危险。浸酸时器皿要充满酸液，勿留气泡，浸泡过夜。取出瓶身时，须穿戴耐酸手套和白大褂，注意保护好面部和身体裸露部分，提前备好一盆水在旁，取出后将瓶身放入盆内水中在转移至水池边清洗，以免酸液滴落地板不好清洗。换水洗几次，待水澄清后开始冲洗，每瓶都用自来水灌满，倒掉，重复15次，再用蒸馏水漂洗5次，去离子水漂洗3次，烘干备用。（2）消毒灭菌

1>全自动高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，放入物品，瓶类物体须拧松盖子后放最上面一筐，盖上灭菌锅盖，拧紧盖子至温度显示栏的左上角有一红点亮灯，按start开始升温。若灭有无菌水或玻璃瓶待降温至常温再打开，打开后立即拧紧，无菌水瓶口封上封口膜。若没灭瓶类物品，降温至80度左右即可打开灭菌锅，须戴上线手套取出。

2>手提式高压灭菌锅：插电源，打开开关，检查水位，若水位不足加蒸馏水补足，检查设定是否为121度20分钟，放入物品，盖上灭菌锅盖，注意导气管一定插到锅底并不能堵塞，用手对称地拧紧锅盖螺栓，再用扳手继续拧紧。加温升压之前，先打开排气阀门，加温约半小时后见排气阀处开始排残留在锅内的冷空气，排气五分钟，关闭排气阀，继而开始升压。灭菌后不要立即打开气阀放气以免水汽喷出。待自然降温至常压才能打开气阀。

玻璃瓶须拧紧，饭盒，枪头灭菌后放入烘箱烘干备用。2.无菌间消毒及设备检查

用84消毒液拖地，用原液按照1：29的比例兑水，抹布、拖把擦洗。配400ml 75%酒精于盆中，用酒精棉仔细擦拭CO2培养箱，超净台，超净台内物品，显微镜，桌面，若培养箱内未培养细胞可以再打开高温灭菌模式将培养箱灭菌一次。

用蒸馏水擦拭清洗水浴锅内壁，注意底座不要沾水。检查CO2总压力表，若读数不足四分之一提前预定CO2瓶，换瓶时需要扳手。CO2培养箱最下层的增湿盘须定期观察加水，将增湿盘内注入1/2无菌蒸馏水，并将盘直接放置在培养箱中央。启动培养箱，培养箱接通电源，增湿盘加水，连接好气体供给，检查有无漏气，输入系统设置。设置温度和二氧化碳。

紫外照射无菌间30分钟，注意屋内不要有人以及培养基等试剂。3.细胞培养用液的配置及分装

RPM1640培养基配制：将干粉型RPM1640培养基溶于总量1/3的去离子水中，再用1/3水冲洗包装内2次，倒入培养基中，以保证所有干粉都溶解成培养液，根据产品说明的要求和实验补加谷氨酰胺和NaHCO3 ,倾斜三角瓶轻轻放入转子，用磁力搅拌器搅拌2h。用泵使培养基在超净台内通过灭菌的过滤器，过滤除菌，分装后置4度冰箱保存备用。使用前调pH至7.0，加双抗于培养液中浓度为1%，使用时加胎牛血清10%FBS.胎牛血清FBS的处理：使用前应做热灭活处理，即通过加热的方法破坏补体，将胎牛血清放入56度水浴中30分钟，其间要不时轻轻晃动，使受热均匀，防止沉淀析出。分装前提前2天放4度冰箱解冻，溶解完全后于超净台内分装为25ml每管，留2管放四度备用，余下放-20度冻存。配制含血清培养基或冻存液前务必提前一天取出分装后的血清四度溶解备用，血清融化很慢。

5%NaHCO3溶液配制：5g NaHCO3，100ml蒸馏水，NaHCO3溶于水后，过滤除菌。0.25%胰蛋白酶液200ml在超净台内分装成每管1ml或2ml，封口膜封口，-20度备用。

双抗溶液配制：80万单位青霉素加4ml灭菌D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。100万单位链霉素加5ml灭菌的D-Hanks液，即成20万单位/ml溶液。两溶液各取0.5ml混合，加入9mlD-Hanks液，则成含青链霉素各1万单位/ml，分装后置于4度冰箱保存备用。

二．操作步骤 注意事项：

1、所有实验用的器械，仪器灭菌，消毒，烘干。

2、打开溶剂，培养瓶瓶盖时，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下。

3、用完溶剂，培养瓶时，瓶口及瓶盖也要在酒精灯上烤一下。

4、所有物品放入超净台需用酒精棉擦拭，包括手伸出窗口拿取物品再回到窗内时需要重新用酒精棉擦拭。开始工作：

1、实验前换紫外照过的白大褂和拖鞋。

2、戴橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。

3、取待用的细胞，旋紧瓶盖。

4、胰酶消化缓慢时可以将细胞置于5%CO2、37度培养箱中1min-2min，目的是提高酶活性，促进消化。1.细胞复苏

提前预冷离心机，设参数为4度，1000r/min,5min。

将枪头，装有离心管的饭盒，垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时取出无血清培养基和含血清培养基37度水浴加热。

关闭紫外，打开风机，升高窗高，点燃酒精灯，用镊子从饭盒中取2个15ml离心管放至试管架，每管加入3ml无血清培养基，提前剪好2条封离心管的封口膜备用。

戴上橡胶手套再套上线手套，用镊子从液氮中取出塑料冻存管，用手拿冻存管迅速浸入37度水浴中，剧烈急速摇晃冻存管，因为有防水胶布缠裹不用担心进水染菌，使其急速融化，注意管内冻存细胞的融化情况。基本转为液态时将冻存管取出，摘下线手套，冻存管转移至超净台内，用酒精擦手，擦拭冻存管尤其管口，撕下胶布和封口膜，再擦拭管口，整个溶解过程尽量在30s至1min内完成。(注意：这一步对细胞存活率至关重要。既要尽快融化以减少融化过程对细胞的损害，又要尽可能减少细胞在较高温度停留的时间以减少DMSO对细胞的毒害，切不可将冻存管放在烧杯内不管。)打开冻存管管盖，逐滴加入1ml无血清培养基，轻柔地将冻存管内的细胞悬液吸取出来，转移至已备好的离心管内，轻轻摇混匀，盖上管盖，轻轻地上下颠倒混匀。封上封口膜。

低俗离心1000r/min,5min。小心地吸出上清液，要求上清液尽可能吸走，同时又不触及管底沉淀的细胞。（较高要求时可以用手指轻弹离心管管底，将细胞团分散，加入10ml无血清培养基混匀离心10min弃上清再洗一次，有助于减少DMSO残留。）加3至5ml培养液至沉淀的细胞，轻轻摇晃使分散成细胞悬液，将细胞转移至培养瓶中，拧紧盖子，转移至培养箱中再反旋拧松半圈，以利于瓶口内外进行气体交换，注意取出培养瓶时须先拧紧瓶口。37度恒温箱中培养。第二天观察细胞生长情况。培养基瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。收好物品，擦一遍台子，灭酒精灯。2传代培养

附着型胞(adherentcell)传代培养

离心法提前预冷离心机，设置好参数4度，1000r/min,5min。倒液法不需要。

将灭菌枪头，装有离心管的饭盒，新培养皿/瓶,垃圾盒放入超净台，酒精棉擦一遍超净台台面和移液器尤其枪口，以防别人用枪时不慎沾染脏污堵塞枪口。超净台和房间照15分钟紫外，照紫外的同时从冰箱取出PBS,胰酶，含血清培养基于37度水浴加热。关闭紫外，打开风机和照明，升高窗高，点燃酒精灯，将所需试剂先擦瓶底，放在台子上再擦侧壁一圈，擦瓶口瓶盖，撕下封口膜，再仔细擦一遍瓶口。用喷过酒精的塑料筐将细胞培养瓶拧紧盖子拿到超净台旁的椅子上放平放稳，每三瓶/皿一摞拿入超净台先擦最下面一个的底部，擦好后放在台面上，擦一摞的侧面一圈，在分别擦底面顶面瓶口，直到所有培养瓶各个面及瓶口擦好，注意不要擦到有marker标记字迹的部位，酒精会擦掉字迹，若擦到字迹待酒精干后立即补写上以防事后记不清。

轻轻倒掉旧培养液，注意不要使液体倒流回来冲击细胞，挂在外壁的残留液滴用酒精棉擦掉,培养瓶可以轻轻翻转瓶子使细胞生长的面在上，顶面在下，液体留至顶面后直接倒掉液体。加1ml PBS，注意枪冲着不长细胞的培养皿侧壁或翻转培养瓶朝瓶的顶壁或侧壁打入PBS，尽量不碰到瓶口或培养皿，若怀疑碰壁，弃掉枪头。轻轻摇晃培养皿或瓶，使PBS沾到所有细胞，洗涤细胞一遍，轻轻倒掉PBS。

加入0.25%胰蛋白酶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，若是高倍胰酶先稀释（0.25%为1X胰酶），37℃作用数分钟。等待消化期间准备好新的培养皿/瓶，每25cm2小皿/瓶加入2ml含血清培养基。消化中的皿盖好盖子或瓶拧紧盖子，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状，有10%细胞漂动时，倒掉胰酶溶液，加入1ml(25cm2小皿/瓶)含血清之新鲜培养基终止胰酶作用。(若细胞将要分离而呈现圆粒状且80%细胞漂动，则不移去胰酶，在胰酶作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止胰酶作用，吹打成细胞悬液转移至离心管，封上封口膜，离心后再吸掉上清液。）

轻轻摇晃培养瓶使细胞自瓶壁脱落，以吸管上下轻轻吸放数次以打散细胞团块，注意吹打时有系统性的将所有面积都打到不要集中只吹打一处而一些地方没吹打到，吸和吹时枪头都不要离开液面以减少气泡，气泡多破裂时对细胞有冲击且会增加体积不利于操作，培养瓶吹打时操作角度小不方便，用倒液法（10%细胞漂动即倒掉胰酶加含血清培养基终止消化）时吹打细胞要用二档多吹打几次，用皿或离心法（80%细胞飘动不弃胰酶直接加含血清培养基再离心弃上清）时细胞很容易脱落，可以用一档轻轻吹打，保证所有面积都吹打到即可。混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，拧紧瓶盖，镜下观察细胞数量多，培养液澄清，若细胞密度过低将影响生长可适当补充细胞悬液，若细胞密度过大将影响迅速生长一天后即需传代，可根据实验适当添加培养基或细胞悬液使生长速度符合预期，转移至CO2培养箱，拧松半圈瓶盖，37度培养。试剂瓶瓶盖过火，拧紧后封上封口膜。密封收好物品。擦一遍台子，灭酒精灯。

3细胞换液

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，把培养瓶放回原处。

用微量枪加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。

用微量枪加入适量的细胞培养液于培养瓶中。旋紧瓶盖。将细胞置于5%CO2、37度培养箱，反旋拧松瓶盖半圈，培养。

4细胞冻存 1>准备工作：

提前一天将血清FBS从-20度取出放在4度冰箱解冻。选取对生增生期细胞（镜下密密麻麻，胞体突触明显），在收集细胞24h前换液一次。

进入细胞室前，首先用75%酒精擦试工作台，接着紫外灭菌30，过后，关闭紫外灯，通风10min。从冰箱中取出胰酶、PBS缓冲液、培养基，血清37度水浴。取出室温放置的DMSO。找到防水的医用胶布，滤菌膜，针管和所需枪头饭盒等物品，喷一遍酒精，放入台子照紫外。2>开始工作：

实验前在更衣间换上紫外照过的白大褂和拖鞋。戴上橡胶手套，75%乙醇擦手，然后用75%乙醇擦一下台面，点燃酒精灯。酒精擦拭胰酶、PBS缓冲液、培养基放入超净台。过火镊子取出离心管于试管架，剪好封口膜备用。用滤菌膜和针管过滤DMSO以除菌。

75%无血清培养基，20%的血清，5%过滤除菌的DMSO，混匀配制成所需的冻存液。

取待用的细胞，旋紧瓶盖。

弃去旧的培养液，挂壁残液注意用酒精棉擦去，用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量的PBS缓冲液，缓慢荡洗一下细胞，然后将PBS缓冲液弃掉。用微量枪朝不长细胞的侧壁或顶部打枪，加入适量胰酶约2ml，弃掉枪头。消化数分钟，等待期间，用过火镊子从饭盒中取出冻存管和管盖标记好细胞名称和冻存日期，直立于台面备用。

用微量枪加入适量的完全培养液冲洗（吹散细胞）细胞，将瓶底粘着的细胞吹散下来，再将细胞悬液移入的离心管中，封口，标签。离心5min，1000转/min。

细胞离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液。用微量枪将冻存液平均加入离心管中，混匀离心管中细胞冻存液。用微量枪将含细胞的冻存液移入冻存管中，封口膜封口，防水医用胶布再缠一圈，标签时间，细胞名称。

冻存，需缓慢冻存，先放置4度冰箱20min，然后放置-20度冰箱30min，再置于-80度冰箱过夜，最后置于液氮灌-196度中保存。5 铺板和细胞计数

用传代方法制成细胞悬液。倒掉培养基，用PBS液洗涤后，0.25%的胰蛋白酶液消化，加入培养液吹打制成待测细胞悬液转至离心管，封上封口膜，离心1000r/min,5min。

等待离心其间，取细胞计数板，盖玻片酒精擦拭，均在酒精灯上烤一下，将盖玻片盖在细胞计数槽上，使覆盖细胞计数板上的上下两个“十字”区域。取一只新的15ml离心管，做好标记，摆放好。离心毕，拆封，瓶口及瓶盖在酒精灯上烤一下，弃去上清液，加入全培养液吹散沉淀细胞成细胞悬液，拧紧管盖，上下颠倒混匀。用枪吹打混匀离心管中含完全培养液的细胞，再从离心管中取1ml细胞悬液移入新的15ml离心管，加入4ml完全培养液，即稀释五倍，吹打混匀细胞悬液，上下颠倒混匀细胞悬液。

上下颠倒混匀新15ml离心管内细胞悬液，计数前将待测液吹打均匀，用微量枪从新15ml离心管中取出细胞悬液（约10μl），滴入计数板上盖玻片的一侧缝隙旁，虹吸作用液体会吸入盖玻片下（不能有气泡，不然会影响细胞计数，注意滴入悬液量不能太大致使细胞悬液流入旁边的槽中），镜下观察细胞，数出计数板四角大方格中的细胞数（16个小格×4个大格），用计数器计数（约200个）

细胞数 万个/mL原液=（4大方格细胞数之和/4）×稀释倍数（常稀释5倍，若细胞过多不能数清则加大稀释倍数，不断调整新离心管中细胞悬液的细胞浓度，直至镜下观察细胞数目符合要求。）每皿/瓶需铺板50-100万个细胞，根据细胞计数算出每皿所细胞悬液需毫升数，加入悬液时注意混匀，不得有气泡，吸时注意每次枪尖是否都吸满液体。每皿加入细胞悬液后，用含血清培养基补足至2ml/皿/瓶。24h后观察细胞长至八成满时即可加药处理。

6检验判断细胞状态与加药处理

细胞复苏或传代后24内不可传代，传代4小时后开始贴壁。1>培养基颜色澄清度：

正常生长的细胞培养基澄清透明，倾斜使培养基聚集，对着灯看可透光，若出现丝状沉淀或倾斜培养基对着灯看出现浑浊不透光且镜下细胞之外的部分有密密麻麻的小黑点，很可能是染菌，应弃掉。若镜检在细胞之外部分有一些浑浊，可能因为细胞代谢旺盛分泌物堆积，或者因为消化时间不够以至于过度强硬吹打细胞，造成细胞损伤产生大量细胞碎片，应换液。

新鲜培养基呈粉红色，代谢代谢旺盛的细胞的培养基会变黄，此时若细胞贴壁应换液，若此时细胞已长满，应传代。2>密度：

细胞密度过低，镜下观察稀稀疏疏，则生长缓慢，甚至死亡。较大的细胞密度可促进细胞之间相互作用，促进细胞增殖生长。密度过大，密密麻麻，部分细胞不能伸展成圆形，必须传代，此时不传代，一两天后细胞状态持续不好，开始死亡，镜检漂浮细胞增多。3>状态：

镜下观察细胞，当左右上下移动镜头时漂动的是未贴壁细胞或死细胞，固定不动的是贴壁细胞，贴壁细胞是活细胞。

状态良好的贴壁SY5Y细胞有圆形的胞体和细细分支的突触，突触分明。状态不好的SY5Y细胞，突触不明显，看不到什么细细的分支，甚至成圆形。

消化时快离壁的细胞呈亮亮的圆形。

加药前应提前计算好药品浓度体积，根据实验处理要求的浓度换算出每皿应加药品稀释液体积和无血清培养基体积，列成表格以备加药时明确操作。将药品储备液稀释成稀释液，再与相应体积的无血清培养基在离心管中混合好。加COS时，倒掉含血清培养基，PBS荡洗一遍，加以混合好的药品。加COS 3小时后加Ab，Ab须提前37度水浴5小时，加药时采用半数放液法，弃去1ml原培养基，加入1ml已混合好的药品。

第二篇：《动物细胞培养》教学反思

动物细胞培养教学反思

杨建波

赛课已经结束，但我的表现并不好。首先，引入新课不够精彩，没有激发学生的求知欲。我觉得应该以演员SELINA演习时皮肤大面积烧伤,治疗通常是取健康皮肤进行自体移植，但对于大面积烧伤病人来讲，健康皮肤很有限，如何来治疗该病人作为问题引起同学们讨论，引出这节课的主要内容——动物细胞培养。在此之前学生已经学过了植物组织培养，因此我先回顾植物组织培养的原理并提出了一个问题：动物细胞培养能否像植物组织培养那样最终培养成新个体？引导同学们思考两者之间的异同。在讲述培养过程时，学生阅读课本自主总结和借助课件展示过程，帮助学生理解培养的过程及把握注意事项。本堂课上完后，我发现了自己有不少缺点和不足，需要在以后的教学中加以改正：1．没有充分发挥学生的主体地位。新课程的理念是要转变教师和学生的角色，让学生成为课堂的主导者，而本节课仍然以传统的教学模式为主，仍然是教师为主体。在实际教学过程中，主观的想引导学生探究问题，思考问题，得出结论，而事实上学生回答问题答不到点子上，我就匆匆的把答案公布了，没有真正做好引导工作。2．没有充分调动学生的积极性。课堂教学的气氛对整堂课的教学质量是至关重要的，纵观整节课，学生对问题的思考、回答等积极性不高。3．时间安排不够紧凑。导致最后讲动物细胞培养技术的应用时时间紧，讲得比较匆忙。当然本节课的成功之处是采用了多媒体教学，使课堂的知识容量比较大，对前面学过的内容可以比较快的复习，真正做到温故而知新。

第三篇：第八章 动物细胞培养和生长过程

第八章

动物细胞生产和培养过程

8.1背景

尽管先前有许多调查者研究了动物细胞在试管中的习性。但是。1949年，这种能产生有用物质的动物细胞首次被利用。在当时，J.F Enders 证明了脊髓灰质炎病毒在培养的动物细胞中可以生长，而这种细胞源于灵长类动物的神经和非神经组织中。

简洁的总接一下这一伟大的探索工作，开始与19世纪80年代早期。根据论证白细胞能在躯体外分裂。这种细胞是通过观察注入在血清、淋巴或腹水中以切成片状的动物组织所得。（1907年）Ｒ．Hａｒｒｉｓｏｎ的悬在下面的淋巴当中的（蝌蚪骨髓）组织方法。而这种盖玻片密封在一个中间挖空的载玻片上。这项伟绩（１９１３年）由Ｃａｒｒｅｌ所继承和发展。他研发了一种维持外来物质特别是细菌培养的复杂方法，其他人很少有这种能力，然而，截至１９２８年，培养基的发展促进动物细胞的增长以至于Ｍａｉｔｌａｎｄｓ能够在装有切碎的老鼠或小鸡胚胎的试管中培养病毒。ｅｎｄｅｒｓ在脊髓灰质炎的工作中运用此方法。脊髓灰质炎的作用是有他和他的同事通过使用抗生素获得相当多的帮助，这些抗生素在十年前是非常流行的，２０世纪５０年代早期Salk发明的脊髓灰质炎疫苗是由猴子的肾和睾丸细胞在试管培养中生产的。一旦这种技术被确立，培养中生长的小鸡或其他原始的胚胎细胞生产其他疫苗。【麻疹病毒（１９５８年）。流行性腮腺炎病毒（１９５１年）、腺病毒（１９５８年）】

８．２从动物细胞培养中获得的不同产物

动物细胞过去是现在仍然是从培养动物细胞中获得最具有商业性的产物，目前，每年生产大约１．５＊１０９剂量的口啼疾疫苗，近似于纽卡斯尔病和马立克氏病的家禽疫苗。人类病毒疫苗以每年１０８剂或者较低一点的速度在运用。干扰素生产的过程也是一大规模，接近或超过这些运用于兽医疫苗的情况下，然而有利于具体的合成杂交瘤细胞相对于免疫学方面是毫无疑问的，在未来的十年里是举足轻重的。表８。１中列出已经或者可能在培养动物细胞过程中获得的主要产物，这并不是唯一的产物，而是表现着主要产物以及能在这些区域内获得的物质的类型。

８．３产物生产方法的综述

图８。１到８。３概括的描述了对于动物细胞培养体系中产物的发展。它包括三个阶段，第一个阶段是准备阶段，第二阶段是动物细胞培养阶段，第三阶段是产物的产生阶段。早某种体系上（荷尔蒙和免疫生物产物）最后一阶段是区别于单元细胞的生产方式。然而在其它方面，最后一阶段跟病毒细胞培养的传染有关或与诱生剂有关。（如干扰素，见表８。３）

对生产经营的很多努力涉及到质量控制系统，与此同时，在线和离线检测在生物技术领域中随处可见。质量控制测试的设计不仅能够确保使用的物质能够促进细胞或产物的发展，还能确保他们摆脱外来的生体，例如，污染物

图表８。２清楚的表明生长培养基的准备工作是一项艰难而又需要专门的技术的过程，当培养基所确定的组份容易控制时，最有困难的两种组份是水和血清。

水可以从多种资源中获得，甚至蒸馏和去离子作用后，水也可能包含着对细胞生长不利的物质。对此，格陵兰冰岛底部所融化的病是一种很有用的参考物质，贮备水的缺乏带来一些困难。细菌能在室温蒸馏水中达到１０５单元的含量，同时远离组成的变量，这种细菌的产物少部分可能是有毒的，在８０C贮藏的水通常被攻克，在这个温度下表面将无菌。

也可以制备没有血清的培养基，但并非所有的细胞可以再生。然而这种细胞培养基的结合对密封材料的产生没有多大用处。

以去除免疫球蛋白成分的血清在病毒生产体系方面最有用这种病毒生产体系是通过当地生产的血清包含的对生产病毒的抗体的一种体系，虽然买的和做实验的血清的价格不菲，但是室内生产是有可能的，血清质量的控制的彻底性对可靠的重复运转是很有必要的。在零下２０C贮存预先测试的血清是经常可取的，因为他能够代替新鲜血清质量减退的这些时光，（通常夏天较容易）。牛胎血清经常被应用于细胞生长发面，但是牛胎血清既贵又罕见。带有噬菌体支原体这样的物质也是最可靠的。也能成批成批的管擦牛胎血清的生长特性，由于来自幼地鼠地肾的细胞，９０％利润从成年牛的血清也可以得到。动物细胞能生长在两种不同类型的培养基上，如果多数动物细胞首次被运用到表层或者固体基质。那么他们可以被诱导分裂，正好相反，一些可能在悬浮液中被诱导自由生长，前者被称为单层细胞，应为他们在基质上形成一层厚壁细胞，即使在连续培养的添加组织也能形成，依赖基质生长的细胞被称为是悬浮细胞或非贴壁依赖性细胞。

我们认为只是生长的单层细胞比悬浮细胞有特别少的致癌基因（能使细胞致癌的基因序列），因此对于人类的消耗，这种细胞被用于生产物质，多种也证明此种 细胞比在悬浮液中的生长的细胞有能力生成更多的病毒毒性。但是如病毒或是产物从悬浮生长的细胞生产制造，那么多数过程会相对容易些，兽医所使用的产物按这种方法所得（脚嘴病毒），同时也包括a-干扰素以及有关杂交瘤细胞的免疫学生物特性。尽管在选择测试体系方面，后两种产物所使用的细胞被证明是可以致癌的，但是在生产阶段不会有什么危害，或者是优先使用单位细胞的产物。在表8.2中，有一个对于单层细胞使用有利和不利条件的总结。我们可以得出结论，在细胞类型方面能够生产商业性细胞是很有必要的。并且也需要两种必要的但不同的技术，下面将陈述两种不同的技术。

8.4单层细胞培养系统

获取基质的生产细胞系统可以被划分为两种类型，一种是增加设备单元的数量以扩大进程；另一种是多重和过程。通过增加设备的尺寸来实现扩大

8.4.1单层细胞生长的多重过程

传统的来讲，固定的玻璃瓶或者是培养皿内已经生成了单层细胞，这种瓶子有许多结构，被命名为brockway，roux ,Carrel,Baxter或Medical Flats，钠玻璃可能被使用，但是硼硅酸盐会更受欢迎，因为他尽管越复杂，但越坚硬越容易修理。那玻璃瓶也许会单独使用，但是经常固定在搁架上便于运输。能够使细胞生长在瓶的内表面而不是瓶底的系统，它的发展同样是滚瓶系统的发展。尽管所使用的矩形瓶和十字型瓶也能够转动，但是对于这个系统，圆柱型瓶被广泛使用，有许多瓶子能够达到180cm长，滚筒上边放着瓶子，而这样的滚筒放在机械支架上。一套标准的设备可以转动12个瓶子，6~10套支架可以组成一个生产单元，在意大利布雷西亚的Zooprofilattico Sperimentale大学学院有7000个瓶子在每四个培养箱里可同时转动。再次，滚动瓶系统被发展到了极限，对于已大量瓶子为媒介的细胞和病毒的生长同时还要保持无菌培养，所以这种增长是很难克服的，布雷西亚单元高度的自动化装置提高了这种方法的经济可行性。

8.4.2单层细胞生长的单元程序

20世纪60年代中期，关于单层细胞的培养单元程序得到发展，同时单元程序的发展现在已变成一项易于接受的首选的实用技术。最近，其他方面的创始人重新检查了这一系统的许多细节，结果跟随最近的发展，不同的系统将在下边描述

根据可靠的成功的多重过程的运转，被设计取代他们的单元模式跟随多重系统的基本模式，这样，在器皿中的一套弹簧片单元程序得到发展，同时使人联想到一架子的瓶子，这样的系统有一次性的聚苯乙烯、聚碳酸酯和钠玻璃组成。后期的发展是采用一叠盘子同时以直接构造的形式转动他们，要么以水平的形式转动他们，后期系统正在扩大密集利用的情况下，目前作为B或纤维素细胞干扰素的一种方式，在清理与细胞培养运行期间，这种系统的扩大反映着一系列工程技术困难与操作问题，按照这种方式装入容器的表层数量很有限，却有两种结果：

（a）磁盘双方都被使用，（b）以稀释形式生产产物正如生长培养基冲洗过后，而培养基要么达到饱和程度，要么至少半饱和程度，总共达到外面容器的容积。从已经发展的大范围多试管细胞的繁殖，我们看到了滚瓶系统的发展，系统达到2001量的大规模发展，近期的一套细胞大量生长的设备，Gyrogen有一排平行的试管组成，这种试管是从1001的量结合外界圆柱形壳在外部力量的驱动下转动。这套昂贵的设备可用来生产，但是是否合理的利用能得到经济上有力的价值好没有被证实。半空纤维中的试管收缩是唯一导致生物量的发展。对小规模来讲，在外界纤维以细胞生长的方式刺激动物组织结构或者通过纤维腔来促使营养培养基的渗漏。这是非常有可能实现的，在两种意义上，这种系统有些优势，正如废弃物质（含有细胞毒素），和产物能够从细胞当中分开，这种细胞是通过纤维的半透膜产生的。最近，这种自然系统已经发展到了0.21，同时在良好的发展计算机控制和检测系统得到了商业化的应用和发展。

目前，为了细胞和产物的生产，许多项目组利用填充层，例如B干扰素，口蹄疫病毒和猪水疱病病毒。经过玻璃球瓶内的聚苯乙烯小白球随着弹簧不锈钢带的变化而变化，然而，伴随着大多数便利的集中在辅助培养基贮藏中控制活性（PH和二氧化碳），通过循环流动的培养基，最基本的填充曾在多数系统中是很普通的，他们相对容易和扩展，这是由于处理圆柱形填充的机械故障很容易得到排除处理，正如玻璃作为一种基质。操作的可靠性得到提高，同时实验室研究的 在玻璃表层和细胞之间的关系也没有改变，更愿意不来说，当在一个熟悉的基质中形成产品时，控制新的生物产品的生产者几乎没有多大问题。

很显然，静态填充床没有他们自己的问题。跨层的斜度是相同的，检测培养细胞有一些难度，但不能放在显微镜下观察。通过检测循环的培养基的成分，（细胞生长的葡萄糖浓度，细胞分裂的乳酸脱氢酶活性好最终病毒解体），尽管后边的问题容易处理，但是不均一的多项系统问题仍然存在。

A．J.van Wezel发展了对于单层动物细胞生长的同种系统。1967年它表明细胞以火胶棉镀膜能生长在0.2mm的葡聚糖纤维素A50颗粒上，凭借微小的搅动，这种颗粒可以成悬浮状态，相对密度为1.05，同时当系统从它本身的方式搅拌时，细胞可以吸附在这种为载体上，由于这些最初的观察，众多的观察者已经表明可以达到5001的量。生长在为载体上的细胞产生物质是有可能的。最新报告表明，来自非洲的猿猴肾细胞脊髓灰质炎病毒的产量是存在一个现代的为载体表面。其他为载体有聚苯乙烯、聚丙烯甚至是玻璃微球体。然而，在大多数情况下似乎葡聚糖为载体提供了最合适的基质。

众多研究者已经能够成功可靠的用为载体系统来操作，然而，有些研究人员的实验还有很大的困难，涉及到研究者所希望生成的特殊细胞任然有些困难。特殊细胞本身是集体组成的产物，以及他生成次生产物的方法问题。源于其他合适设备与不合适设备的不当使用以及培养基选择的不恰当问题上。这些选择阶段或者是细胞与玻璃粉。首次关键性的联合或者时候起贴壁细胞的可重复性。

总之，对于基质有要求的细胞的生产，在此环境下，微载体成为首选方法。而且操作良好并且可靠，但是玻璃球的填充层能够提供一个可靠的后补系统。其他系统也会有一定的位置，为准备一种独特的细胞类型能够生长和生产产物提供的特殊的环境。

8.4.3悬浮细胞的生产过程

悬浮动物细胞的培养过程不同于细菌的培养，一条近期的评论描述了许多需要检测和控制的参数，所使用的设备是一个有较低的搅拌和通风度相当标准的发酵器。把传统方法当作一个系统，并且此系统已经增大到8000L。来自于幼地鼠肾细胞货真不同细胞的用于口啼疫病毒的商业产物，如此规模得益于仓鼠，也就是所谓的2FFA-3.同样，有Nsmalwa淋巴细胞所产生的a-干扰素，目前以同样的规模的相似设备来生产。搅拌驱使系统的最基本的修改等同于气升式发酵罐的运用。通过在发酵罐底部引进气泡来提供三料的混合。因为这些在移动也提上是非常有效的而且不会破坏细胞。传统的喷射会对动物细胞引起严重的破坏，这种喷射通过产生一些小的气泡试图增加气泡的表层区域的面积。溶氧水平在标准状况下本身下降15%一下或者上升到溶氧量以上才会有害。但在气液接口处的相互作用的细胞可能会导致细胞活性的损失。令人惊奇的是，起因于叶轮的飞快的速度造成的物理搅拌似乎没有多大伤害，然而，对于相关参数的效应和数量的研究中需要被保留着。

当传统的的不锈钢槽作为科技的主导时。科技不发达的国家可能会修改一些系统。对此通过外磁条力量来驱动，101搅拌瓶可以制造出许多有用的疫苗，（每年均有5*106剂）。印度尼西亚的泗水市安装了此系统。在此地，每个月将产生250000剂疫苗。同样Polgolla和斯里兰卡基本设备的安装也很到位。

生产细胞还是为这些细胞收集信息，动物细胞的连续培养是可行并且有用的方式。最近研究已经表明了在系统的计算机在线监测和控制的优势。购买相应的计算机硬件设备也比较容易。

然而动物细胞的连续型生产利用以及具有商业吸引力的细胞产物还，没有实现。

8.5后期过程

当动物细胞应用于原材料生产时，许多后期过程等同于蛋白质化学技术的其他领域。仍然考虑到存在些更多的独特细节的操作系统。例如，过滤、筛选操作，离心分离操作（适速），沉降操作，包析发的层析操作以及浓缩干燥（反渗透法），这些普通的加工技术很难应对，生物病毒物质的钝化，整个病毒颗粒活性子单元的产生以及用于有用物质的形成具有划时代意义。而这种划时代是以动物细胞为根据的独特的处理工程。

8.5.1钝化作用

尽管许多疫苗是由易感染的病毒粒子形成，但是一些被杀死或钝化。钝化在确保接受着没有没有危险是非常重要的，钝化药物通常使用甲醛，然而用B—丙醇酸内酯来钝化狂犬病毒。进来。用亚胺（乙炔和吖丙叮）来钝化脚口疾病病毒。然而亚胺会使脚口疾病病毒的结构发生轻微的变化。甲醛与衣壳体交联形成更稳定的结构。其他钝化法的紫外线辐射和缩水甘油醛，在所有钝化方法中，确保钝化的病毒具有单分散性是非常重要的，以至于失活剂不能阻止病毒在中型团块中有效的钝化。

8.5.2亚基的形成

病毒疫苗必须考虑接受疫苗者的危险，如果不适当的钝化可能会形成亚基。依靠亚基的裂解最终将会形成一小部分致疾病的病毒。能够形成亚基的病毒有狂犬病毒，肝炎病毒、单纯性疱疹、巨细胞病毒和流感病毒。近来，尝试从流感病毒中分离血凝素糖蛋白免疫原表明疫苗的有效性了、，尽管有效性和天然病毒不同，到目前为止，研究表明从病毒中分离出的糖蛋白的竞争性比原始病毒低。但当足够的材料管理可以得到足够的保护反应。8.5.3产品配方

活的病毒疫苗通常包含1~4种不同类型的病毒。每剂有10活性病毒，有些材料需要冷冻干燥保存再生物保护剂中像流感病毒，人或牛的牛痘病毒或血清蛋白谷氨酸盐和磷酸盐离子。另一方面，杀死的病毒疫苗大约10为一剂.这些混合物被称为佐剂，佐剂有强效的生物免疫原特性。佐剂的化学组成是不均等的，像强心苷、皂素、各种铝盐（氢氧化物，硫酸盐。磷酸盐）和一些确定的油脂，与水中悬浮的病毒均匀的发生生物交联结合形成水油乳状混合物。油水乳状物在含有去垢剂的无机盐水溶液中经过第二次乳化作用。这些物质的作用许多是一致的，他们促使身体和化学免疫系统最大速率合成大量的有用抗原。

8.6 基因工程动物细胞和细菌

在原核细胞和真核细胞中插入确定的核酸序列的能力对于细菌和动物细胞具有很广泛的意义。作为一种产物，蛋白质能够插入特定的核酸。而基于动物细胞的活的病毒疫苗形成过程不可能取代基于基因工程细菌的过程。这是清楚的，一些动物细胞生产的胰岛素和一些α-干扰素商业上用原核生物生产。另外一些像用于口蹄疫病毒

3的死的病毒疫苗，骨髓灰质炎和各种干扰素商业上可以在细胞类型生产。然而，基因工程动物细胞能够使蛋白质糖基化成为更受欢迎的基质用于人生长激素，马血溶性酶诱导物，组织血纤维蛋白溶原激活剂的生产。我们目前看到了备受争议的生物技术产业新时代的开端。现在自信的预测未来的发展前景还很难，但是这些多潜力的方法必将给我们将来制造生物产品带来很大的冲击。

第四篇：细胞培养技术总结

血清使用问题的总结

一、血清灭活问题。

1、问：加到培养基中的血清必须灭活吗？ 答：不是必须的，看做什么实验了。

2、问：四季青胎牛血清灭活是56℃30分钟吗？

答：如果用于培养大多数的肿瘤细胞，血清一般是不需要灭活的，这样可以有效保存血清中的生长因子。但是如果用于培养一些表面具有补体受体的细胞，如内皮细胞，血清是需要灭活，一般是56℃，30min。

3、问：我要做滋养细胞培养，胎牛血清要灭活吗？

答：进口的一般都已灭活，国产的不一定，最好还是灭活一下再用较安全。

4、问：我用病毒上清转染细胞，培养用的血清需要灭活吗？因为血清中可能有些补体和抗体，是不是会影响转染？我想未灭活的血清中含些抗体补体可能会和病毒相结合，影响转染，正确吗？细胞是单核细胞白血病细胞，病毒是病毒包装细胞PT67收集的病毒上清。为什么要用无血清培养基加病毒孵育几小时，目的是什么？

答：血清一定要灭活，可以先用无血清培养基加病毒孵育几小时以后再加血清。避免杂蛋白对病毒和宿主结合过程的干扰，一般是2-6小时，根据细胞的状态决定。血清不一定需要灭活，灭活的目的是将血清中的补体灭活！这要根据实际情况而定，如果没有把握那就灭活吧，也不麻烦56度半个小时。

5、问：(1)我买的是杭州四季青的新生牛血清，要灭活吗？有些说法是需要，有些说直接解冻后就可以加入到培养基中；我配制胰蛋白酶液，用的是D-PBS，有关系吗？

答：关于血清的热灭活，是很多人感兴趣也存在一定争议的话题。大多数实验室将血清的热灭活还是作为常规来执行，因为有两个作用，第一是灭活补体，第二是灭活血清中可能存在的支原体。但是实验者并没有考虑热处理对血清中的生长因子、氨基酸等成分带来的负面影响。

我在实验室处理血清的时候，有一次水浴箱在灭活过程中出现故障，温度升高到80℃，血清变成了凝胶状，我重新处理了另外一份血清，将两份血清对比，发现高温直接影响到血清所含的抗体蛋白。在56℃下灭活半小时以上，肯定也会对里面的蛋白起到破坏作用。下次有机会我做个延长灭活时间的实验试试，看看到底有多大的影响。热灭活之后，血清放在四度冰箱久了，就会有沉淀产生，这常常会被认为是微生物污染或者是黑胶虫污染。为了验证到底有没有污染，常常又会把血清放置37℃温育，但是血清中的蛋白会进一步析出，最后还是要做镜检，无菌培养试验，和革兰氏染色试验，非常麻烦。

我看过一份资料，里面提到70%的实验者认为灭活是理所当然的。常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等。其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。随着血清采集、处理、加工工艺的提高，许多早先认为是热灭活的原因已经不再成立，只有少数对血清进行热灭活的研究者在实验中证实了这一步骤的有效性和必要性。有人比较过11个不同细胞株，发现其中热灭活对6 个细胞株(HBAE，MDBK，Vero，成纤维细胞，MRC-5)的生长带来负面影响，三个细胞株(FOX-NY，MDCK和CHO-K1)不受热灭活的影响，而只有两个细胞株(Balb/3T3，Sp2/0Ag14 hybrid)，在热灭活之后，细胞生长有轻微的改善。所以，在正常的操作下，热灭活通常对细胞的生长没有明显的促进作用。

你可以摸索一下，血清从-20℃冰箱拿出来之后在常温解冻，然后混匀分装成两份，一份灭活，一份不灭活，比较这两种血清对细胞是否有影响。然后再确定是灭活还是不灭活。这个过程最多也就一个星期。同时你还要考虑血清灭活与否对你后续的实验有没有影响。

问：(2)分装后的血清从-20℃取出放4℃让其液化，却见血清比较混浊，有沉淀产生，这属正常吗？ 答：正常。

二、血清灭活时温度问题。

1、问：因为实验室水浴锅失控，血清灭活时，温度到了61.7℃，这血清还能用吗？

答：多长时间啊？短时间应该可以吧，我有一次加热了一个多小时，还照样用。

2、问：我灭活胎牛血清时，用的电磁炉，定在了70℃，本来说调温度到56℃再放血清的，后来忘了，就把血清放进去了，所以灭活的温度肯定超过56℃了，不知道这样对血清有没有影响？

答：常规灭活建议的温度在45℃到62℃之间，而时间则从15分钟到60分钟不等，其中最常用的手法是56℃热处理30分钟。看看你养的细胞是什么，一般的话估计问题不大，要是很珍贵的细胞还是慎重一点啊。热灭活目的是为了去除血清中补体等对热敏感的物质，在对补体灭活以外，热处理同时也对血清中可能存在的支原体具有灭活作用。现在好像不主张热灭活，热灭活经常给血清产品带来负面影响，对血清的加热经常导致血清中沉淀的产生，此外，有研究结果证实热灭活步骤减弱了胎牛血清和小牛血清对细胞的促粘附作用。

三、血清的制备方法问题。

1、问：我的实验需要自己制备一些血清用于培养细胞，有没有人知道用于培养细胞的血清需要怎样的制备过程？

答：自己制备血清当心污染啊。如果无菌条件好的话，用静置析出方法就行。

2、问：一般我们用得胎牛血清用前还要灭活，我想用大鼠的血，不知道要不要灭活？

答：你直接把采来的血液在离心管里4℃过夜，离心，取上清，在无菌过滤，也可灭活，然后分装冻存，用时再配。

3、问：如果灭活会不会对血清中的一些因子有损伤？

答：加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。灭活一般不会对血清中的一些因子损伤的。

四、血清的保存问题。

1、问：2006年6月到期的GIBCO胎牛血清到2007年5月还能用吗？ 答：只有试试了，如果一直在-20℃冻着来者，应该还可以，先少用点看看。养细胞系应该没问题，原代不行。

2、问：请问我自然溶化好的胎牛血清和1640培养基今天用不上，明天用，我不想放到冰箱里，放在室温下一晚行吗？100毫升培养瓶加多少培养基呢？

答：可以放4℃。4-5ml。

3、问：4℃冰箱内保存3个月的胎牛血清，能否继续使用？相关细胞和其它试剂的代价比较高，不敢轻易尝试。

答：需要长期保存的胎牛血清必须要保存在-20至-70℃的低温冰箱中，4℃冰箱中保存时间不要超过1个月。

五、FBS可否代替人AB型血清？

问：我现在在做人的外周血b淋巴细胞的培养，文献上要求用人的AB型血清，但是我觉得很多代理商都没有。我想FBS代替，但不知道可否，我先是担心免疫排斥之类，但是我查了些资料后，应该不会(我觉得)。但是我又不能够TRY。因为细胞因子确实太贵了，所以咨询一下。谢谢！答：你最好照文献的做。除非你系列实验证明你用代用品的结果与文献的相同(你还是要用到文献的试剂)。细胞培养的影响因素很多，特别是培养基的成分。

六、血清和培养基的种类及品牌问题。

1、问：细胞培养的胎牛血清用哪个公司的产品比较好呢？周围有人用PAA或Hyclone的，这两种跟Gibco或sigma出品的差别大吗？ 答：如果是长得非常快得细胞如pa317，293，c6等恶性肿瘤细胞，一般得国产血清就可以，如果是原代培养的细胞，最好应用胎牛血清或类标准胎牛血清，Hyclone公司血清的质量不如GIBCO(同类血清)。国产的杭州四季青和甘肃民海(中美和资)不错。有些细胞(如：sf9，293还有其他一些元代细胞)，用Gibco的比其他两种好很多，会大大加速试验进度。对于其他一些细胞(如：vero，MDCK，pk)四季青，Hyclone的小牛血清足矣！另外，Gibco的还要看产地。

2、问：最近要订一瓶胎牛血清，实验室之前都在用小牛血清，没有买过胎牛血清。请问哪个公司的好一些？问过试剂公司，有两种：一种是PAA的(分普通级和优级)，一种是Hyclone的(只有普通级，而且是新西兰产的)。试剂公司推荐使用PAA优级的，但看好多文献都用Hyclone的，公司说是因为现在Hyclone的都不是美国进口的了。请问用的哪种胎牛血清比较好？

答：民海的效果还不错，要是不放心国产的，那就买进口的。进口的好多公司都有，新西兰产的效果一般。Hyclone和Gibco的都还可以。民海的似乎比四季青的要好些。复蒙的感觉也不错。

3、问：四季青“无噬菌体、低内毒素胎牛血清”与“无支原体胎牛血清”的区别？培养肿瘤传代细胞用哪一个比较好些？ 答：用无支原体胎牛血清就可以啦。

4、问：SKBR-3细胞培养用哪种型号的1640培养基及胎牛血清？ 答：我一直用GIBCO的1640，你可以买含HEPES的1*10L的包装，胎牛血清也是用的GIBCO，10%就行。请查阅： www.xiexiebang.com

七、培养基血清浓度问题。

问：在1640里加血清时加多了，90ml里加了20ml血清，约为18%，以前都是加10ml的，查了网上多建议用10%-15%，有关系吗？

答：我认为一般来说血清浓度的较大波动对细胞的状态影响较大，建议再加90ml1640调成10%。血清浓度大当然细胞状态感觉要好，但是高浓度的血清可能改变细胞的基因表达谱，影响后续实验的结果。10%的浓度培养鼻烟癌细胞很好。

八、心肌细胞原代培养时血清的使用问题。

1、问：在进行心肌细胞原代培养时，需要用含血清的培养基中止胰酶的消化作用，我现在使用的是含血清10%的培养液，但近日看北医一个细胞培养的课件发现，有用1%血清培养液进行中止消化的，想问一下，1%的是否可以，效果是否有保证？这样确实能节省不少血清的。答：关于心肌细胞元代培养的FBS问题：

(1)1%的血清完全培养基可不可以，得看你胰酶的用量。但是在心肌细胞元代培养就不行。10%的FBS完全培养基效果都不太好，开始心肌细胞元代培养需要高浓度的FBS，20%左右，但这就有出现另一个问题，在FBS完全培养基中，成纤维细胞呈优势细胞，须得在培养基加入适量的BrdU以抑制其生长，纯化心肌细胞。

(2)FBS的作用不仅仅是拿来中和胰酶，只是FBS中的一些蛋白质如α-巨球蛋白等有抑制胰酶活性作用。

(3)元代心肌细胞培养的FBS使用，有讲究：刚开始使用20%左右的高浓度的FBS，后逐渐递减为无血清的DMEM/F-12培养基培养。

2、问：我胰酶的用量是0.08%，并混和了0.08%的胶原酶。FBS要高浓度递减是否是说的在细胞培养中啊，难道在消化时终止也需要如此高的浓度吗，还有，我的BRDU只用到48小时就不用了，因为担心其损伤太大，可以持续用多久呢？

答：我用10%FBS终止的，然后差速1h，然后还是用10%FBS的HG-dmem养的，没有用brdu，心肌细胞还是比较多和稳定的，我第3天就可以用，第2天晚上看就会有搏动。

九、牛血清污染噬菌体的问题。

1、问：有谁知道小牛血清制造过程中怎样能够避免噬菌体的污染，以及对已污染噬菌体的牛血清怎样能够除去噬菌体？

2、问：我也想知道，我用的血清中大部分都有噬菌体，它对细胞培养到底有什么影响？ 暂无回答。

十、问：MTT加药的时候加不加血清？加药时要用无血清的培养基吗？ 答：我的药就是用含血清的培养基稀释的，不含血清的培养基对细胞有毒性或抑制作用，无形中对细胞造了一个serum-free的模型，细胞在提内本来就是有血清供应，如果该药物都不能对抗，那该药物就没有什么临床价值了，这是我的理解。

十一、AB血清的制备问题。

问：本人想从人的外周血中分离AB血清的，用于B淋巴细胞的培养。谢谢大家给点建议。人的血，来之不易啊。答：是AB血型人的血清吗？这种血清即没有抗A型抗原抗体，也没有抗B型抗原抗体。分离血清时将采集的血液注入试管中，待血液凝固后离心分离血清。可将采集的血液放在37℃水浴箱中促进血液凝固，减少凝固时间。离心可在2500～3000rpm，10min，足可以分离血清。分离后将血清吸出保存即可。分离血清的量可按采集血液的50%左右计算，因为红细胞占总血液的50%左右。当然整个过程要注意无菌操作。

十二、PC12细胞培养所用血清问题。

问：我正准备购买上海细胞所的未分化的PC12细胞，需要灭活的马血清，可现在买血清很困难，好像是海关有封锁，代理商这么说的，我原定购买的Gibco的horse surum，现在无法买到了，好容易找到一个目前可以进血清的公司Hyclone，有一种Donor Equine serum是马血清吗？

答：Hyclone的Donor Equine serum可以用，我以前用的就是这个。我当时是在鼎国(重庆办事处)买的，100ml大概140元，具体不记得了。当时是看它比别的进口的马血清便宜。另外：我买了以后灭活的。

十三、血清或培养基产生了颜色或沉淀的问题：

1、问：我用的是四季青的胎牛血清，56℃30分钟灭活后出现了白色少量絮状沉淀，是不是污染？还能不能再用？血清的生产日期是2006年7月(现在是2007年6月11日)。

答：应该问题不大。你可以取少量血清放入培养皿中，37℃过夜培养看看就知道是否污染了。血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。

2、问：我用MTT法测细胞的增殖，用DMSO裂解细胞，发现把DMSO加入到孔中就会形成乳白色(用的含胎牛血清的1640培养基，由于没有离板子的离心机，所以没有去除培养基直接加的DMSO)。以前用含小牛血清的培养基没有看到有这种情况。该怎么解决？

答：为什么要用离心机离心呢？难倒你养的是悬浮细胞吗？如果是贴壁细胞的话直接将MTT倒掉，再加DMSO即可，我们就是这么做的，效果很好！并且测细胞的增殖的话如果不去掉MTT就加DMSO的话误差应该很大！有时不一定就是血清的原因，可能跟你的MTT放置的时间或以及其他成分有关！

3、问：(1)GIBCO胎牛血清500ml，今天解冻后没有混匀直接分装，结果使得前面的几管是清亮的，后面就带有棕色的，不知有没有影响？估计有什么影响？前面的成分好还是棕色的成分好啊？

答：肯定有。最好还是重新混合重新分装，我觉得有效成分会集中在棕颜色部分。

问：(2)为什么会出现棕色呢？

答：血清中的棕色多一些可能是因为红蛋白的含量高些的缘故吧。问：(3)血清灭活之后可以存放吗？我的是前天灭活的，但是没有加到培养基里，而是放在冰箱里，那下次可以直接用吗？还是再次灭活啊？ 答：当然可以，如果多的话，分装后最好放在－20℃，下次用时再解冻，也不用再灭活。最好用一管拿一管，少许血清可以放在4℃。分装时还要注意不要装得太满，以免溢出污染。

十四、问：悬浮细胞培养时能否加血清？如果加了会有什么结果？为什么悬浮细胞培养时就不能加血清？

答：血清是细胞培养基中重要的培养成份之一，对细胞生长有广泛影响。在细胞培养时，我们通常会加入10%的血清。血清的质量对细胞培养的成功至关重要。一般说来，牛血清包括以下成分：生长因子(如激素，白细胞介素等)，他们可以促进细胞生长；贴附因子，他们可以促进细胞的贴壁，往往只有细胞贴壁才能增值(悬浮培养的细胞除外)；蛋白质(如血清白蛋白，球蛋白等)，既可以作为营养物质，又可以中止胰酶的作用；还有很多成分不明的物质。血清还可以起到解毒作用，如脂肪酸、重金属和某些蛋白酶的毒性。血清还可以是细胞免受机械损伤。因此，无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，血清是必不可少的。除非因实验要求无血清培养时，例如：为使细胞同步化时，我们会采用无血清培养的。单纯的说悬浮细胞培养不能加血清就没有太多的道理了。

十五、Gibico的胎牛血清内是否含糖？

问：我想做糖诱导细胞凋亡的试验。细胞培养液里加入了20%的胎牛血清。因此胎牛血清里是否含有糖对我实验的培养液糖终浓度影响比较大。今天打电话问GIBCO公司的技术顾问，回答我糖浓度少于5μg/ml，因此基本可认为是不含糖。但我今天把胎牛血清送到我们医院检液科，结果却是：6.2mmmol/l(葡萄糖氧化酶法)。难道是检测人血清的血糖浓度的方法不能用于检查牛血清吗？(另起茶水验尿事件？)检验科没有给我回答。答：应该是不含糖的。请参照gibco的网站：http://www.xiexiebang.com/content/sfs/brochures/B_08A00_0619_FBS_bro.pdf。第五页我做了个记号。直接点击链接就可以看到它的说明书页面。我想我们肯定要以公司的说明书为准。至于为什么检验科测起来有误差，我想可能是样本不一样，需要用标志品矫正有关。具体需要检验科的战友解释了。

十六、关于中和消化液需要的血清量。

问：用胰蛋白酶消化细胞后，需要用血清中和。具体这种中和作用所要求的胰蛋白酶和血清之间的比例是多少？

答：做了很久的试验，真的没有想过胰酶和血清的对应关系。不过细想下来，这个应该也没有固定的比值。血清的品种都是不同的，成分必然有差异，如何能确定其与胰酶的比值关系？我们消化细胞的时候，如果是传代，细胞变形后，吸出胰酶直接加入适量的hanks液或者全培，这个量看自己的喜好和吹打细胞方便而定。一般都可以中止消化的。不会存在继续消化的事情。如果是从组织上消化细胞做原代培养，我一般都使用全培进行中止，而且加的很多，0.25%的胰酶，用10%血清，按1:2的比例应该是足够的。当然全培是2，一般我养细胞的时候，会用国产的比较便宜的血清配制全培，专门用于中止消化，这样有几个好处：一是中止消化的效果应该好于hanks液吧，再是也有利于维持细胞活性。而且这部分液体会被离心去掉，血清便宜，离心掉了不会心疼。而养细胞的时候用好血清。个人观点，仅供参考。

十七、血清中的悬浮物问题。

1、问：发现培养的细胞瓶中背景有许多的小黑点，培养液中也有一些漂浮的物。看了之前的帖以为是胶原虫。本打算换液，换液前特意看了下前些天配的培养液，肉眼发现培养液中有悬浮的颗粒状物质(不多)，于是放在镜下观察，新鲜培养液中有一些悬浮的小颗粒，不多。(培养液是R1640+20%牛血清+1%双抗)于是又将分装在4℃保存的小牛血清拿出观察，肉眼可见5、6个白色小小球状的物质，在血清瓶稍靠下的部位悬浮。镜下观察，也有少量的不知什么物质的东西漂浮。小牛血清是Hyclone新西兰的，标签上写已经经过2μm滤膜过滤处理。根据上述培养液的情况，是否说明培养液已被污染？如果是正常的血清是不是在镜下不应该看到杂物，哪怕是极少量的？根据上述血清的描述，是不是说明血清也存在问题，还能用吗？补充：细胞培养以来生长状态就不好。买血清的时候厂家说明不用灭活，所以未灭活。

答：(1)血清应该-20℃保存，解冻血清时，请按照的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大实验显示非常容易产生沉淀物。(2)血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白在血清解冻后，也会存在于血清中，亦可造成沉淀物。(3)若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清，再放回冷冻，若存放于4℃时，请勿超过一个月，储存在2－8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白，可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。

(4)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(5)排出了血清的原因，在考虑实验用品和无菌操作的问题。

(6)细菌病毒、衣原体、黑胶虫污染也很常见，如果细胞死的太多，影响较大建议更换培养液。

2、问：今天在配培养液时，发现血清里面有小碎片样的漂浮物，血清仍然清亮，不浑浊。不知道是什么，问了实验室的学长，说仍然可以用，但还是不放心，没有用血清。求助园子的各位达人，这可能是血清出了什么问题？我的血清用了一个月不到，四季青的。

答：可能的原因：(1)培养液配置时Votex不够，当时是清亮的，但过一段时间会析出来；(2)真菌污染。

十八、污染和过滤的问题。

1、问：怀疑血清染菌，想用滤膜过滤一下，可否自己用0.22μm滤膜过滤？对血清性质有多大影响？有做过的么？

答：可以过滤的，血清当出厂时都是0.22μm或0.1μm过滤除菌。想证明有没有染菌不用过滤这么麻烦，只要放置于37℃过夜就可以了，如果有微生物污染会变浑浊的，如果还是澄清的就说明没有问题的。实验室中血清很难直接过滤，一般要加到培养基中再过滤。我们实验室制备培养基时，都使用滤膜过滤，一般而言如果制备1-2瓶培养基，一个滤膜及一支30ml注射器可以过滤50ml小牛血清。如果大量制备培养基也可以将血清加到培养基中，使用0.22微米的大滤膜一起过滤。

2、问：我怀疑我用的完全1640培养液被污染了，准备重新过滤消毒，过滤后是否需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：完全1640培养液被污染了，如果是支原体的话，过滤没有作用，支原体可以通过滤膜。我们用1640液，都是配液后保留500ml，然后其他的分装100-200ml，现用现配因为血清比1640要贵，如果你想过滤的话，建议你加原比例血清，因为血清不会很容易通过滤膜。最主要的还是找到可能污染的原因。

3、问：加好了血清双抗的培养基由于污染了再过滤后还能用吗？ 答：建议不要用了。在加了双抗的情况下已经污染，那么细菌污染的可能性会较小了。一般的过滤除不能去除病毒或者部分真菌的污染的。

4、问：我准备把使用的完全1640培养液重新过滤一遍，不知道培养液中的血清成分是否能通过滤膜，过滤后是否还需要补充胎牛血清？如需又如何补充？

答：可以透过，但是随着液体量的增多会很慢，如果不加压会比较麻烦，还有最好用低蛋白吸附的，不然损失是比较大的。

十九、更换无血清培养基后细胞大量死亡的问题。

问：我使用Lipofectamine2000转染成骨细胞，在转染前要换上无血清的培养基。本来条件模的好好的，转染效率也可以接受。但是寒假一回来就发生了怪事：细胞在有血清的培养基中长的好好的，一换无血清的培养基就死亡。大概4个小时就能看到较多的细胞飘起来。但是原来我换无血清培养基，就算放那里10个小时都是没问题的啊。已经换了不同批次的培养基，甚至吸管什么的都换过了，但是就是不行，是怎么回事？

答：(1)两周后的培养液应补加谷氨酰胺，或者重新配液，转染时应不含抗生素。

(2)确认操作方法和环境，建议检查一下。

(3)Lipofectamine2000，脂质体的毒性很大，如果有质粒参与对细胞损伤更大，如果Lipofectamine2000在常温放置过，对细胞更大，假期冰箱是否断过电。

(4)培养箱的温度、c02浓度，湿度。

二十、完全培养液的相关定义。

问：“完全培养液一词”，是指加了血清的培养液吗？我在做含药血清的实验，涉及到血清添加量的问题。所以想弄明白文中所指的“完全培养液”是否是含药血清。

答：原液是指配置后过滤除菌。不完全培养液是指不含有血清的原液，其他成分已补充。完全培养液是指不完全培养液加入血清后称完全培养液。二

十一、血清相关知识总结。使用胎牛血清的注意事项：

血清是细胞培养中最重要的元素之一。下面是实验室里常会遇到的问题，仅供大家参考：

1、保存血清最好的方法： 建议血清应保存在-5℃ 至-2O ℃。然而，若存放于 4 ℃ 时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。

2、如何解冻血清才不会使产品质量受损：

建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃ 冰箱使之溶解，然后在室温下使之全溶。但必须注意的是，溶解过程中必须规则地摇晃均匀。

3、血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理：

血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血渭解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。

若您欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g稍微离心，上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。

4、何谓热灭活：

一般是以 56℃，30 分钟来处理已解冻的血清，因为此加热步骤，可以使补体去活化，而补体所参与的反应有 : 溶细胞活性，平滑肌的收缩，肥大细胞和血小板组胺的释放，增强吞噬作用，淋巴细胞、巨噬细胞的趋化和激活。

5、关于胎牛血清的灭活： 有必要做热灭活吗？ 实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒立显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在 37℃ 环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。

因此我们建议您，若非必须，您可以不需要做热处理这一步。如此一来，不但节省您宝贵的时间，更确保您血清的质量！

6、血清相关知识： 如何避免沉淀物的产生？

我们建议您在使用血清的时候，注意下列的操作 :(1)解冻血清时，请按照所建议的逐步解冻法(-2O℃至4℃至室温)，若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃)，实验显示非常容易产生沉淀物。(2)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。

(3)请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。(4)血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。

(5)若必须做血清的热灭活，请遵守56℃，30 分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。

第五篇：实验总结-细胞培养方法

一、培养细胞常用配置

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超净工作台常规配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏 步骤：

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。

7.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8.将培养瓶放入培养箱内培养

注意事项：

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。

5.冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液

6.复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

8.原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

三、培养液的更换

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸 5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。6.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7.将培养瓶放入培养箱内培养

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。

四、细胞传代

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。

5.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。8.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿内吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。

9.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

10.将培养瓶放入培养箱内培养。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。

五、细胞株的保存

原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

实验步骤：

选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

5.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。6.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min 8.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定数量备用 9.弃去培养基，用冻存液进行重悬混匀后，将1ml含有细胞的冻存液移入冻存管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。

10.将培养基，胰酶瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8.将冻存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱内3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌内长期保存。或直接放入梯度降温盒内，放入-80℃冰箱内过夜后最后存放于液氮罐内。（梯度降温盒内为甲醇，使用5次需要更换，每次使用需做好标记，使用前需恢复常温）

六、细胞转染

RNA干扰（RNA interference, RNAi）:  是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常录;

 PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。

作用机制

1)其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

4)siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

5)RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

脂质体转染原理：

1.脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体 2.阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达

DNA转染步骤

1.转染前一天接种细胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到90-95%每孔。

2.转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。

4.B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5.B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6.将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7.孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8.第二天看细胞状态来决定是否换液。9.同时设立细胞对照组，空白转染组。

siRNA转染步骤

1)转染前一天接种细胞于6孔板（40x104），2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到50-60%每孔。

2)转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。（siRNA按照说明书稀释）4)B液：脂质体（RNAimax）使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5)B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6)将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7)孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8)第二天看细胞状态来决定是否换液。9)同时设立细胞对照组，空白转染组。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上进行转染实验

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀释液，取附赠的DEPC水至管内，打开离心管前先离心，将附在管壁上的冻干粉离心下来 2)溶解时滴加适量的DEPC水后盖上管盖，震荡溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分别标记GAPDH，NC，NV-FAM，三个片段名称，从管内吸取20ul的稀释液分装后

4)将稀释液至于-80度冰箱保存。

 转染前一天，在6孔板上接种40x104AGS cell，再取一个35mm培养皿接种40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生长培养基。使细胞在转染的时候有50-60%的融合率

 从细胞中除去生长培养基

 每个孔中加入1.5ml新鲜不含血清的培养基，并准备如下混合物 1)A液：(取7个EP管，分别标记空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三个片段)。在250ul的opti-mem终加入100pmol siRNA（稀释好的siRNA浓度为20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均匀

2)B液：（取一个EP管标记RNAiMAX），RNAiMAX 使用前摇匀，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀释RNAiMAX混匀后并在室温下温育5min 3)混合A液和B液，混匀B液后吸取256ul至A液中室温下温育20min  将混合物混匀后加入到含AGS的6孔板与35mm培养皿中，每孔终体积为2ml，则加入混合液500ul，并轻摇混匀  在37℃的二氧化碳培养箱中培养5-6小时  更换含血清的培养基并培养细胞24-48小时 24-48小时后收细胞跑WB，看沉默效果