实验二 植物核酸的提取-教案

第一篇：实验二 植物核酸的提取-教案

授课教师 学生人数 55 课 题 实验二 植物基因组DNA的提取 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学目的 掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理与方法 教学重点 理解每一步实验操作的目的 教学难点 实验操作过程中的一些注意事项 教学过程

一、背景知识

1.DNA在细胞中存在的位臵？植物细胞DNA存在的位臵和动物细胞有何不同？（图）教学用具 多媒体

2.DNA的存在形式

双螺旋结构图

双螺旋结构组成

染色体是怎样形成的？

一级结构（核小体=双螺旋+组蛋白）-二级结构（螺线管）-三级结构（超螺线管）-四级结构（染色体）

真核生物基因组DNA是经过四级包装形成了染色体，先是DNA形成双螺旋结构，再与组蛋白形成核小体（一级结构），压缩7倍，再形成螺旋管（二级结构），压缩6倍，之后再形成超螺旋管（三级结构），压缩40倍，最后超螺旋管压缩形成染色体（四级结构），再压缩5倍，正常细胞中基因组DNA是以染色质（相当于一级结构）形式存在，在细胞分裂的中期以染色体形式存在，真核生物细胞质DNA主要是以裸露的环状DNA形式存在，没有核小体结构。

3.遗传物质核酸除了DNA外还有另外一种，即RNA，它与DNA在结构上的区别？（图）

RNA基本单位中间的五碳糖是核糖，含氮碱基尿嘧啶（U）替代 胸腺嘧啶（T）4.核酸的理化性质

（1）形状：DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。

（2）溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、异丙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。（3）保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。

二、实验目的

1.掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理 2.CTAB法提取植物基因组DNA的实验方法

三、实验原理

1.核酸在细胞中的存在方式，是以核酸-蛋白质复合物的形式存在，如一级结构核小体（图）：DNA螺旋+组蛋白

2.通过低温研钵破坏植物细胞壁

3.加入CTAB溶解细胞膜，CTAB与核酸形成核酸-CTAB复合物，使核酸与蛋白质分离。

4.加入高盐溶液溶解核酸-CTAB复合物，加入蛋白质变性剂使蛋白质变性沉淀出来，离心除去蛋白质。5.加入核酸沉淀剂，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出来，离心得到核酸沉淀。

四、实验仪器 1.水浴锅

2.离心机（12管）：3台 3.研钵：10个

4.移液枪（包括枪头）：1ml、400ul

五、实验材料与药品

实验材料：新鲜菠菜叶片 1.十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）

作用：溶解细胞膜并与核酸结合，便于分离核酸。商品信息：瓶装/100g。

理化性质：白色或浅黄色结晶体至粉末状，有刺激气味，易溶于异丙醇，可溶于水,震荡时产生大量泡沫，化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。有吸湿性，在酸性溶液中稳定；溶于10份水，溶于热水、乙醇、三氯甲烷,易溶于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。

储存：在阴凉，干燥，通风良好的地方，远离不相容的物质。危害：高毒，对皮肤及粘膜刺激性小，有轻微脱脂作用。2.1M Tris-HCl PH8.0缓冲液

作用：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液

理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。

储存：室温保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。3.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）

作用：螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。

商品信息：瓶/250g。

理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。

储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。

危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。4.Tris饱和酚

作用：强蛋白质变性剂。商品信息：瓶/250ml。

理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。

储存：4℃避光保存。

危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。5.β-巯基乙醇（2-巯基乙醇）

作用：提供一种还原剂，这样酚类物质（植物材料特别是老的材料中含有大量的酚类物质）就不能被氧化成醌（醌易与DNA发生共价结合，使DNA发生褐变，从而影响你提DNA的实验）。巯基乙醇兼有消除CTAB震荡时产生的泡沫的作用。

商品信息：瓶/100g。

理化性质：无色透明液体，具有少许硫醇气味。易溶于水，乙醇和乙醚等有机溶剂，与苯可以任意比例混溶。水中溶解度：1mg/mL。

储存：对空气敏感，易吸潮。使容器保持密闭，储存在阴凉、干燥通风处。打开了的容器必须仔细重新封口并保持竖放位臵以防止泄漏。建议贮存温度 2-8℃。

危害：高毒吸入、摄入或经皮肤吸收后会中毒。对环境有危害，对水体可造成污染。本品可燃。6.氯化钠（NaCl）

作用：CTAB-核酸复合物在高盐溶液中易溶。商品信息：瓶/500g，分析纯AR。

理化性质：白色晶体状。易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨；不溶于浓盐酸。在空气中微有潮解性。稳定性比较好。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。危害： 7.无水乙醇

作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。

理化性质：无色澄清液体。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。8.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的少量酚（酚易溶于氯仿）。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色透明液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。储存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。9.异戊醇

作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。10.异丙醇

作用：DNA沉淀剂，DNA在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全，而后由于异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇，乙醇挥发快。用-20度预冷异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好；异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失；所以多选用-20度预冷异丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分钟就可以将异丙醇沉淀的核酸紧密的离到管底。

商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。

理化性质：无色透明具有乙醇气味的可燃性液体。有似乙醇和丙酮混合物的气味，能与醇、醚、氯仿和水混溶，不溶于盐溶液。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、卤素等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

危害：微毒类，高浓度蒸气具有明显麻醉作用，对眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能损伤视网膜及视神经。常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气混合易形成爆炸混合物。11.PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）

作用：PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

商品信息：白色塑料瓶/100g。

理化性质：白色或乳白色粉末或颗粒，有微臭。溶于水、碱、酸及极性有机溶剂。储存：室温干燥保存。危害： 12.液氮（LN2）

作用：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全；低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNAase的作用，保护DNA。商品信息：分析纯

理化性质：-196℃。液态的氮气。是惰性的，无色，无臭，无腐蚀性，不可燃，温度极低。储存：储存于阴凉、通风的库房。库温不宜超过30℃。危害：汽化时大量吸热接触造成冻伤。

六、实验试剂

1.氯仿-异戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml {氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存 2.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）40ml {氯仿-异戊醇（24:1）20ml + Tris饱和酚20ml} = 40ml，4℃保存 3.TE缓冲液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → → 定容到50ml → 高压灭菌后冷却4℃保存  【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {蒸馏水 80ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g} → 用NaOH（约2g）调至PH8.0 → 定容至100ml → → 分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。 【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 4.2%CTAB抽提液 250ml

{CTAB 4g + 无水乙醇 5ml + 水100ml} → 加入200ml烧杯中 → 加热溶解 → 再依次加入 → → {5M NaCl 56ml + 1M Tris-HCl（PH8.0）20ml + 0.5M EDTA 8ml} → 定容至250ml → 高压灭菌冷却后加入 → {1%β-巯基乙醇（400ul）2ml + PVP-40 5g} → 4℃保存   【5M NaCl溶液】配制：100ml {NaCl 29.22g + 水90ml} → 加热到80℃溶解冷却后 → 定容至100ml → 高压灭菌备用 【1%（v/v）β-巯基乙醇】配制：10ml {β-巯基乙醇 100μl +水9.9ml} → 1%β-巯基乙醇10ml 5.蒸馏水

所有药剂用水都要纯净水经高压灭菌冷却

七、实验步骤

（一）实验前准备

1.研钵、异丙醇-20℃预冷；【研钵10个、异丙醇75ml】

2.将2%CTAB抽提液从4℃冰箱内取出在65℃水浴预热；【CTAB抽提液30ml】 3.称取30份新鲜菠菜叶片，每份1g，称重时去叶脉；【菠菜叶片30g】 4.用蒸馏水冲洗叶片，滤纸吸干水分，将叶片用剪刀剪小。【洗瓶、滤纸、剪刀】

5.实验器材：冰箱、65℃水浴锅、液氮、10ml离心管90个、药匙、移液枪（1ml、100μl、400μl）、离心机（10000r/min）

6.实验药剂：酚-氯仿-异戊醇30ml（每管1ml）、氯仿-异戊醇60ml（每管2ml）、无水乙醇12ml（每管400 μl）、TE缓冲液3ml（每管100μl）

（二）破碎细胞，释放溶解核酸

1.将叶片臵于预冷的研钵（实验前-20℃预冷）中，倒入液氮，尽快研磨成粉末；

 目的：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全；低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNase的作用，保护DNA。

2.将粉末加入10ml离心管中，加入 1ml预热的CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；  目的：CTAB可以溶解细胞膜并与DNA结合，便于分离DNA。加入β-巯基乙醇和PVP-40的目的是减少植物中酚类物质的影响。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。Tris-HCl提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。高盐溶液可以更好的溶解核酸-CTAB复合物。

3.将离心管臵于 65℃的水浴中保温40分钟，期间每隔10分钟轻轻摇晃几次。 目的：水浴使CTAB抽提液和叶片充分反应。

（三）抽提去掉蛋白质

1.将水浴的离心管取出，冷却 2分钟后，加入1ml酚-氯仿-异戊醇，振荡 2分钟，使两者混合均匀，12000 r/min离心10分钟；  目的：第一次离心溶液分3层，上-中-下层：CTAB-核酸-变性蛋白-有机溶剂

2.取上清液（含CTAB-核酸）至新的10 ml离心管中，加入2ml氯仿-异戊醇，轻轻颠倒离心管，混匀，12 000r/min离心10分钟。 目的：第二次离心进一步去掉变性蛋白，去掉多余的酚

（四）沉淀核酸

1.小心取上清液（含CTAB-核酸）臵于一个新的10ml离心管中（尽量避免吸取中间层）,加入2.5ml的异丙醇（-20℃预冷），将离心管慢慢上下摇动30秒，使异丙醇与水层充分混合，室温放臵15分钟至能见到DNA絮状物；  目的：异丙醇为DNA沉淀剂，异丙醇与CTAB互溶，但不与核酸相溶。用-20℃预冷的异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好，异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分核酸溶解损失；所以多选用-20度预冷异丙醇。核酸在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全。异丙醇易溶于CTAB，但不与核酸相溶。2.10000r/min离心10分钟,小心倒去上清液。 目的：第三次离心使核酸沉淀到管底。

（五）核酸的洗涤

用400ul无水乙醇洗涤核酸沉淀直至无色，10000r/min离心10分钟，倾去上清液晾干。 目的：异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇及多余的NaCl，乙醇挥发快。

（六）保存

向下层离心物中加入100μl TE缓冲液进行溶解，臵于-20℃冰箱保存，以便下次课用。 目的：一般长期保存DNA，贮存在TE缓冲液中比较好。TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液：其中比较关键的成分是EDTA，日常环境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金属离子，从而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA会影响下游酶切，连接反应以及质粒转染进细胞的效率，如果接下来要做这些实验是应该避免使用含EDTA的缓冲液的。短期储存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA连接等效果。

八、实验注意事项

1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作； 2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；

3.磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低温状态； 4.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔； 5.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；

6.将异丙醇吸出时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。

九、思考题

1.本实验中用到的各种试剂的作用是什么？ 2.本实验中进行了几次离心操作，每次的目的？

十、实验安排

全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。每组作3个离心管，共用一个研钵。

每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。

第二篇：实验四 植物DNA的提取[定稿]

实验四

植物DNA的提取

一、实验目的

掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。

二、实验原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物，这种复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl），降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB-核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB。提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的浓度测定和纯度分析

（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、试剂和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml(2)CTAB分离缓冲液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL。(4)TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:异戊醇=24:1(6)液氮

(7)研钵，恒温水浴（37～100℃），离心机，离心管。

四、操作方法：

(1)将10mlCTAB分离缓冲液加入50ml离心管中，置于65℃水浴中预热。(2)称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

(4)样品于65℃保温30分钟，每5～10分钟混匀一次。(5)加等体积（10ml）的氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。(6)室温下4000r/min离心10分钟。

(7)用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中间白色的蛋白质层），向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA析出。（有些情况下，这一步可以产生云雾状的DNA析出，如果看不到云雾状的DNA，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云雾状的DNA析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA中轻轻转动，缠起DNA，然后将玻璃棒转移至20mL洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA沉淀从玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云雾状的DNA，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA沉淀自然干燥20分钟。(9)用玻璃棒缠出DNA，在室温下使DNA自然干燥20分钟。(10)

将自然干燥的DNA溶于1mLTE缓冲液中，—20℃保存备用。

(11)

取100uL稀释20倍，测定A260，A280，A230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

五、思考题

1、CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？

2、吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？

第三篇：几种核酸提取方法概述

几种核酸提取方法概述

(1).浓盐法

利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常用的方法是用1M 氯 纳提取化钠抽提,得到的DNP粘液与含有少量辛醇的 氯仿一起摇荡,使乳化,再离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中,用2倍体积95％乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.也可用0.15 MNaCL液反复洗涤细胞破碎液除去RNP,再以1MNaCL提取脱氧核糖蛋白,再按氯仿---异醇法除去蛋白.两种方法比较,后种方法使核酸降解可能少一些.以稀盐酸溶液提取DNA 时,加入适量去污剂,如SDS可有助于蛋白质与DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的DNase对DNA 的降解作用,在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子的烙合剂.通常用.15MNaCL,0.015M柠檬钠,并称SSC溶液,提取DNA.（2）.阴离子去污剂法:

用SDS或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性,可以直接从生物材料中提取DNA.由于细胞中DNA与蛋白质之间常借静电引力或配位键结合,因为阴离子去污剂能够破坏这种价键,所以常用阴离子去污剂提取DNA.（3）.苯酚抽提法:

苯酚作为蛋白变性剂,同时抑制了DNase的降解作用.用苯酚处理匀浆液时,由于蛋白与DNA 联结键已断,蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。离心分层后取出水层，多次重复操作，再合并含DNA 的水相，利用核酸不溶于醇的性质，用乙醇沉淀DNA。此时DNA是十分粘稠的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是使提取的DNA保持天然状态.

第四篇：植物芳香油的提取教案

植物芳香油的提取

教材内容解读

要点1 植物芳香油的来源

（1）植物芳香油的来源

天然香料的主要来源是动物和植物。动物香料主要来源于麝、灵猫、海狸和抹香鲸等。植物香料的来源更为广泛，植物芳香油可以从大约50多个科的植物中提取。例如，玫瑰花用于提取玫瑰油，樟树树干用于提取樟油。

（2）植物芳香油的主要化学成分

提取出的植物芳香油的组成主要包括萜类化合物及其衍生物，具有很强的挥发性。要点2 植物芳香油的提取方法

提取植物芳香油的三种基本方法：蒸馏、压榨和萃取。（1）蒸馏法

①水蒸气蒸馏法的原理

利用水蒸气将挥发性较强的植物芳香油携带出来，形成油水混合物，冷却后，混合物又会重新分出油层和水层。是植物芳香提取的常用方法。

②水蒸气蒸馏法的类型

根据蒸馏过程中原料放置的位置，可以将水蒸气蒸馏法划分为水中蒸馏、水上蒸馏和水气蒸馏。

③水中蒸馏的方法对于有些原料不适用的原因 如柑橘和柠檬不适用水中蒸馏的方法，这是因为水中蒸馏会导致原料焦糊和有效成分水解等问题。因此，柑橘、柠檬芳香油的制备通常使用压榨法。

（2）萃取法

①萃取法是将粉碎、干燥的植物原料用有机溶剂浸泡，使芳香油溶解在有机溶剂中的方法。

②原理

植物芳香油易溶于有机溶剂，如石油醚、乙醚和戊烷等。芳香油溶解于有机溶剂后，只需蒸发出有机溶剂，就可以获得纯净的植物芳香油。

③不适于用水蒸气蒸馏的原料，可以考虑使用萃取法。要点3 实验设计

（1）提取玫瑰精油的实验流程

（2）提取橘皮精油的实验流程

石灰水浸泡→漂洗→压榨→过滤→静置→再次过滤→橘皮油 要点4 实验案例

案例一 玫瑰精油的提取

5月上、中旬是玫瑰的盛开期，最好是选用当天采摘的鲜玫瑰花。将花瓣用清水冲洗，去掉上面的灰尘等杂质，沥干水分。由于玫瑰精油化学性质稳定，从玫瑰花中提取玫瑰精油可采取水中蒸馏法。本实验的具体操作步骤如下。1.称取50 g玫瑰花瓣，放入500 mL的圆底烧瓶中，加入200 mL蒸馏水。按教科书图6-2所示安装蒸馏装置。蒸馏装置包括：铁架台两个、酒精灯、石棉网、蒸馏瓶、橡胶塞、蒸馏头、温度计、直型冷凝管、接液管、锥形瓶，以及连接进水口和出水口的橡皮管。所有仪器必须事先干燥，保证无水。整套蒸馏装置可分为左、中、右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接收。安装仪器一般都按照自下而上、从左到右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安装顺序和方法如下。

（1）固定热源──酒精灯。

（2）固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如教科书中图6-2所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。

（3）安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。

（4）连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。

（5）连接接液管（或称尾接管）。

（6）将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接受器，接收瓶应在实验前称重，并做好记录。

（7）将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。

2.蒸馏装置安装完毕后，可以在蒸馏瓶中加几粒沸石，防止液体过度沸腾。打开水龙头，缓缓通入冷水，然后开始加热。加热时可以观察到，蒸馏瓶中的液体逐渐沸腾，蒸气逐渐上升，温度计读数也略有上升。当蒸气的顶端达到温度计水银球部位时，温度计读数急剧上升。在整个蒸馏过程中，应保证温度计的水银球上常有因冷凝作用而形成的液滴。控制蒸馏的时间和速度，通常以每秒1～2滴为宜。蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。

3.收集锥形瓶中的乳白色的乳浊液，向锥形瓶中加入质量浓度为0.1 g/mL的氯化钠溶液，使乳化液分层。然后将其倒入分液漏斗中，用分液漏斗将油层和水层完全分开。打开顶塞，再将活塞缓缓旋开，放出下层的玫瑰精油，用接收瓶收集。向接收瓶中加入无水硫酸钠，吸去油层中含有的水分，放置过夜。

为了更好地将油、水两层液体分离，操作时应注意正确使用分液漏斗。分液漏斗的使用方法如下。

（1）首先把活塞擦干，为活塞均匀涂上一层润滑脂，注意切勿将润滑脂涂得太厚或使润滑脂进入活塞孔中，以免污染萃取液。

（2）塞好活塞后，把活塞旋转几圈，使润滑脂分布均匀。并用水检查分液漏斗的顶塞与活塞处是否渗漏，确认不漏水后再使用。

（3）将分液漏斗放置在大小合适的、并已固定在铁架台上的铁圈中，关好活塞。将待分离的液体从上部开口处倒入漏斗中，塞紧顶塞，注意顶塞不能涂润滑脂。

（4）取下分液漏斗，用右手手掌顶住漏斗顶塞并握住漏斗颈，左手握住漏斗活塞处，大拇指压紧活塞，将分液漏斗略倾斜，前后振荡（开始振荡时要慢）。

（5）振荡后，使漏斗口仍保持原倾斜状态，左手仍握在漏斗活塞处，下部管口指向无人处，用拇指和食指旋开活塞，使其释放出漏斗内的蒸气或产生的气体，以使内外压力平衡，这一步操作也称做“放气”。

（6）重复上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的气体时为止。再将分液漏斗剧烈振荡2～3 min，然后将漏斗放回铁圈中，待液体静置分层。

案例二 橘皮精油的提取 课前准备 在实验前一天，教师需要准备新鲜的、没有霉烂的橘皮，用量可根据实验人数来决定。用清水冲洗橘皮，去掉灰尘等杂质，沥干水分后，将橘皮摊放在干燥通风处。将晾干的橘皮浸泡在pH大于

12、质量分数为7%～8%的石灰水中，时间为16～24 h，中间翻动2～3次。浸泡好的橘皮呈黄色、无白芯、稍硬、脆而不断、具有弹性。这样的橘皮在压榨时不易打滑，橘油的喷射力强；压榨后的残渣呈颗粒状，残渣中的含水量低，黏稠度不太高，过滤时比较顺利，不易堵塞筛孔。

提取橘皮精油的具体步骤如下。

1.将浸泡后的橘皮，用流动的水漂洗，洗净后捞起、沥干。切记一定要将橘皮彻底冲洗干净。然后将橘皮粉碎至3 mm大小，放入家用榨汁机或手动压榨机中粉碎。粉碎时加入与橘皮同质量的质量分数为0.25%的小苏打和质量分数为5%的硫酸钠溶液，并调节pH为7～8。

2.在榨出的油水混合液中加入明矾，使之沉淀并变澄清，然后用布袋过滤，除去糊状残渣。再将得到的混合物，用6 000 r/min～8 000 r/min的转速进行高速离心。在正常情况下，离心后获得的香精油将是澄清透明的。

3.分离出的香精油往往带有少量水分和蜡质等杂质，为了进一步除去杂质，可以将分离的产品放在5 ℃～10 ℃的冰箱中，静置5～7 d，让杂质与水下沉。然后用吸管吸出上层澄清的油层，再通过垫有滤纸或石棉纸的漏斗进行减压抽滤，得到黄色油状的橘皮精油。

第五篇：优质课教案---植物芳香油的提取教案

2010年河南省高中生物优质课

植物芳香油的提取

姓 名： 李 宴 会 单 位： 上 蔡 一 高 日 期： 2010 年 8月

专题6 植物有效成分的提取 课题1 植物芳香油的提取

一、课题目标

本课题通过设计简易的实验装置来提取植物芳香油，使学生了解提取植物芳香油的基本原理，研究从生物材料中提取特定成分的方法，初步学会某些植物芳香油的提取技术。

二、课题重点与难点

课题重点：植物芳香油的提取技术；针对原料的不同特点，采用适宜的提取方法。课题难点：植物芳香油的提取技术；针对原料的不同特点，采用适宜的提取方法。

三、课题背景分析

课题背景从古代人类将芳香植物或花卉制成干品，当作药物和香料使用谈起，引入到欧洲中世纪香料贸易的发展，促成了植物芳香油提取技术的诞生，反映了社会生活的需要对科学技术的推动。随着有机化学的发展，人造香料日益普及，但人们对天然植物芳香油仍情有独钟，它一方面说明了科学技术的发展赋予了人类更多的自由，同时也反映了人造物依旧很难取代自然产物的事实。在充分体现了植物芳香油与人类社会生产生活的紧密联系后，教材说明了本课题的目标：了解提取植物芳香油的原理，设计简单的实验装置，从橘皮或玫瑰花中提取芳香油。在教学中可充分利用上述素材，对学生进行生动的科学、技术、社会的教育，并激发学生动手实践的兴趣。

四、基础知识分析与教学

（一）植物芳香油的来源

知识要点：1.植物芳香油的来源和发展历史；2.植物芳香油的主要化学成分。教学：在介绍植物芳香油的来源时，宜结合教材提供的旁栏资料进行讲解，让学生对植物芳香油的广泛来源有一个初步的了解。还可以采取学生查阅资料和介绍相关的小故事等方式，使学生大致了解植物芳香油的发展历史。

（二）植物芳香油的提取方法

知识要点：提取植物芳香油的三种基本方法：蒸馏、压榨和萃取。

教学：可以通过列举日常生活中的一些具体事例，帮助学生熟悉提取植物芳香油的三种基本方法，并理解其原理。例如，实验室制备蒸馏水就用到了蒸馏的方法；超市出售的手动榨汁器，其原理与教材介绍的压榨法是类似的；等等。此外，还应引导学生分析这三种方法 的优点与不足，让学生尝试根据不同的原料，选用适宜的提取方法。

五、实验案例 玫瑰精油的提取

5月上、中旬是玫瑰的盛开期，最好是选用当天采摘的鲜玫瑰花。将花瓣用清水冲洗，去掉上面的灰尘等杂质，沥干水分。由于玫瑰精油化学性质稳定，从玫瑰花中提取玫瑰精油可采取水中蒸馏法。本实验的具体操作步骤如下。

1.称取50 g玫瑰花瓣，放入500 mL的圆底烧瓶中，加入200 mL蒸馏水。按教科书图6-2所示安装蒸馏装置。蒸馏装置包括：铁架台两个、酒精灯、石棉网、蒸馏瓶、橡胶塞、蒸馏头、温度计、直型冷凝管、接液管、锥形瓶，以及连接进水口和出水口的橡皮管。所有仪器必须事先干燥，保证无水。整套蒸馏装置可分为左、中、右三部分，其中左边的部分通过加热进行蒸馏，中部将蒸馏物冷凝，右边的部分用来接收。安装仪器一般都按照自下而上、从左到右的顺序。拆卸仪器的顺序与安装时相反。具体安装顺序和方法如下。

（1）固定热源──酒精灯。

（2）固定蒸馏瓶，使其离热源的距离如教科书中图6-2所示，并且保持蒸馏瓶轴心与铁架台的水平面垂直。

（3）安装蒸馏头，使蒸馏头的横截面与铁架台平行。

（4）连接冷凝管。保证上端出水口向上，通过橡皮管与水池相连；下端进水口向下，通过橡皮管与水龙头相连。

（5）连接接液管（或称尾接管）。

（6）将接收瓶瓶口对准尾接管的出口。常压蒸馏一般用锥形瓶而不用烧杯作接受器，接收瓶应在实验前称重，并做好记录。

（7）将温度计固定在蒸馏头上，使温度计水银球的上限与蒸馏头侧管的下限处在同一水平线上。

2.蒸馏装置安装完毕后，可以在蒸馏瓶中加几粒沸石，防止液体过度沸腾。打开水龙头，缓缓通入冷水，然后开始加热。加热时可以观察到，蒸馏瓶中的液体逐渐沸腾，蒸气逐渐上升，温度计读数也略有上升。当蒸气的顶端达到温度计水银球部位时，温度计读数急剧上升。在整个蒸馏过程中，应保证温度计的水银球上常有因冷凝作用而形成的液滴。控制蒸馏的时间和速度，通常以每秒1～2滴为宜。蒸馏完毕，应先撤出热源，然后停止通水，最后拆卸蒸馏装置，拆卸的顺序与安装时相反。

3.收集锥形瓶中的乳白色的乳浊液，向锥形瓶中加入质量浓度为0.1 g/mL的氯化钠溶

液，使乳化液分层。然后将其倒入分液漏斗中，用分液漏斗将油层和水层完全分开。打开顶塞，再将活塞缓缓旋开，放出下层的玫瑰精油，用接收瓶收集。向接收瓶中加入无水硫酸钠，吸去油层中含有的水分，放置过夜。

为了更好地将油、水两层液体分离，操作时应注意正确使用分液漏斗。分液漏斗的使用方法如下。

（1）首先把活塞擦干，为活塞均匀涂上一层润滑脂，注意切勿将润滑脂涂得太厚或使润滑脂进入活塞孔中，以免污染萃取液。

（2）塞好活塞后，把活塞旋转几圈，使润滑脂分布均匀。并用水检查分液漏斗的顶塞与活塞处是否渗漏，确认不漏水后再使用。

（3）将分液漏斗放置在大小合适的、并已固定在铁架台上的铁圈中，关好活塞。将待分离的液体从上部开口处倒入漏斗中，塞紧顶塞，注意顶塞不能涂润滑脂。

（4）取下分液漏斗，用右手手掌顶住漏斗顶塞并握住漏斗颈，左手握住漏斗活塞处，大拇指压紧活塞，将分液漏斗略倾斜，前后振荡（开始振荡时要慢）。

（5）振荡后，使漏斗口仍保持原倾斜状态，左手仍握在漏斗活塞处，下部管口指向无人处，用拇指和食指旋开活塞，使其释放出漏斗内的蒸气或产生的气体，以使内外压力平衡，这一步操作也称做“放气”。

（6）重复上述操作，直至分液漏斗中只放出很少的气体时为止。再将分液漏斗剧烈振荡2～3 min，然后将漏斗放回铁圈中，待液体静置分层。橘皮精油的提取

课前准备

在实验前一天，需要准备新鲜的、没有霉烂的橘皮，用量可根据实验人数来决定。用清水冲洗橘皮，去掉灰尘等杂质，沥干水分后，将橘皮摊放在干燥通风处。将晾干的橘皮浸泡在pH大于

12、质量分数为7%～8%的石灰水中，时间为16～24 h，中间翻动2～3次。浸泡好的橘皮呈黄色、无白芯、稍硬、脆而不断、具有弹性。这样的橘皮在压榨时不易打滑，橘油的喷射力强；压榨后的残渣呈颗粒状，残渣中的含水量低，黏稠度不太高，过滤时比较顺利，不易堵塞筛孔。

提取橘皮精油的具体步骤如下。

1.将浸泡后的橘皮，用流动的水漂洗，洗净后捞起、沥干。一定要将橘皮彻底冲洗干净。然后将橘皮粉碎至3 mm大小，放入家用榨汁机或手动压榨机中粉碎。粉碎时加入与橘皮同质量的质量分数为0.25%的小苏打和质量分数为5%的硫酸钠溶液，并调节pH为7～8。

2.在榨出的油水混合液中加入明矾，使之沉淀并变澄清，然后用布袋过滤，除去糊状残渣。再将得到的混合物，用6 000 r/min～8 000 r/min的转速进行高速离心。在正常情况下，离心后获得的香精油将是澄清透明的。

3.分离出的香精油往往带有少量水分和蜡质等杂质，为了进一步除去杂质，可以将分离的产品放在5 ℃～10 ℃的冰箱中，静置5～7 d，让杂质与水下沉。然后用吸管吸出上层澄清的油层，再通过垫有滤纸或石棉纸的漏斗进行减压抽滤，得到黄色油状的橘皮精油。

六、课题成果评价

（一）是否提取出了植物精油

观察学生提取出的玫瑰精油或橘皮精油，从颜色、气味等方面来评价所提取的精油的纯度和质量。从玫瑰花提取的芳香油是浅黄色至黄色的液体，并带有甜韵的玫瑰香；从橘皮提取的橘皮精油无色透明，具有诱人的橘香味。本课题只是对两种精油进行了初步的提取，其中仍然含有大量的杂质。

（二）出油率的计算

根据教科书提供的公式计算出油率。如果出油率高，说明实验方案设计合理；如果出油率低，可以帮助学生从实验方法的选择、实验过程的操作等各方面分析原因，改进后再作尝试。