实验四 植物RNA的提取及其电泳鉴定2

第一篇：实验四 植物RNA的提取及其电泳鉴定2

实验四 植物RNA的提取及其电泳鉴定

一、原理植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA及叶绿体RNA。这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80％左右。基因转录产物mRNA在总RNA中只占1％～5％。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在细胞内转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA 3ˊ末端都具有20～200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly(A)结构。利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。

植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一类水解核糖核酸的内切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞内含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。因而，生物体内源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。

内源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4—氨基水杨酸钠、三异丙基萘磺酸钠等；RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。

外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2Hs-O-CO-O-CO-O-CxH5)，它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的RNase灭活。DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。水及其它溶液的灭活一般使用0.05％～0.1％DEPC，37℃处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22μm 滤膜过滤。含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在180℃烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1％的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。

提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。再浸入3％ H202溶液中，室温下放置10分钟以上，再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。总之，实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。尽管如此，有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。这是因为RNase活性的抑制只是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。对于RNA提取来说，这是一个潜伏的危险。在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成分逐渐减少，残存的RNase就会复活而引起RNA降解。另外，提取后期发生的RNase污染，那怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。

影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物，它们能影响RNA的质量及产量。人们采用了多种处理方法来解决这个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖；采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解离及氧化；或用β—巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。

（一）总RNA的提取

用于研究基因表达的总RNA提取时首先要考虑的问题是材料的选取及预处理。由于基因表达与生理状态密切相关，因而取材时必须考虑材料的生理状态，必要时还要对材料进行预处理，即施加某种因素，诱导目的基因表达，如进行光照、暗处理、或加入诱导物等。

材料的破碎与植物细胞总DNA的提取相同，采用液氮冷冻及在液氮中研磨。预处理过的材料要尽早地投入到液氮中，投入前要尽可能保持材料完整及新鲜，不要让材料压碎及破损。因为植物材料在破损时会引起多酚类物质的积累及氧化，使组织变褐而影响RNA分离。细胞膜裂解也与DNA提取相同，主要使用SDS或Sakosyl、酚等。

由于细胞内RNA主要以核蛋白体形式存在，所以总RNA提取的路线是细胞破碎，使核蛋白体从细胞内释放；采用使蛋白质变性的做法，令核蛋白体解析，RNA迅速与蛋白质分离，大量地释放到溶液中；然后用酚、氯仿有机溶剂抽提，去除蛋白质杂质，使核酸进入水相；再选择性沉淀RNA，使之与DNA分离；所得RNA再进行必要的纯化，最后用乙醇或异丙醇沉淀RNA。

至于植物细胞总RNA的提取方法，同植物总DNA提取一样，没有一种固定的通用方法。文献中报导的植物细胞总RNA的提取方法很多，但综合起来看，分离的主要依据不外乎如下几点：① 用酚及去污剂SDS或Sakosyl破碎细胞膜并去除蛋白质；② 酚、氯仿反复抽提纯化核酸；③ LiCl选择性沉淀去除DNA及其它不纯物；④ 3mol／L乙酸钠(pH6)沉淀RNA，DNA在上清液中；⑤ CsCl密度梯度离心，去除多糖等杂质，纯化RNA。

目前用于Northern 杂交植物总RNA提取方法根据主要试剂可分为苯酚法、异硫氰酸胍（或CTAB）法及氯化锂沉淀法：

1、苯酚法：该法利用苯酚协助破碎细胞；酚／氯仿变性蛋白质并反复抽提核酸；3mol／L乙酸钠选择沉淀RNA；提取液中使用4—氨基水杨酸及三异丙基萘磺酸盐抑制RNase活性。该方法操作简单、经济，可用于从植物叶、茎、根及萌发幼苗中提取总RNA或核RNA。

2、异硫氰酸胍法：异硫氰酸根及胍离子都是很强的蛋白质变性剂。异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠合用可使核蛋白体迅速解体；与还原剂β—巯基乙醇合用能强烈抑制RNase 活力，因而是制备RNA的一种常用试剂。

传统的异硫氰酸胍法需利用CsCl离心分离RNA(沉到管底)。这种做法操作时间长、设备要求高。经改进，目前使用的方法使操作大大地简化，并可同时提取多个样品。做法是将异硫氰酸胍、β—巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠三者合用，强有力抑制了RNA降解，增加了核蛋白体的解离，将大量的RNA释放到溶液中，然后用酸性酚进行抽提，既可保证RNA稳定，又可抑制DNA解离，使DNA与蛋白质一起沉淀，RNA被抽提进入水相，用异丙醇沉淀RNA后，经酚／氯仿再次抽提进行纯化。该方法提取的RNA 用于Northern 杂交可以得到满意结果。

3、氯化锂沉淀法：该方法的主要原理是在一定的pH条件下，Li+使RNA发生特异性沉淀，通过多级沉淀可提高RNA的纯净度。利用氯化锂选择性沉淀时，因提取缓冲体系不同有多种不尽相同的氯化锂法，有的使用硼酸缓冲液，加入还原剂二硫苏糖醇抑制RNase活性，用SDS变性核蛋白；有的使用Tris—HCl缓冲体系，用苯酚及蛋白酶K处理蛋白；还有的使用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNase。氯化锂沉淀法虽也有效，但沉淀过程较为繁琐，并存在着Li+的污染问题。

（二）mRNA的分离

从总RNA中分离mRNA主要是利用亲和层析的原理。植物mRNA的3ˊ—端具有poly(A)结构，可用oligo(dT)—纤维素(寡聚(dT)—纤维素)或Poly(U)—Sepharse(多聚(U)—琼脂糖)亲和层析技术来纯化mRNA。总RNA在流经寡聚(dT)—纤维素层析柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 3／—端多聚(A)残基与连接在纤维素柱上的寡聚(dT)残基间配对，形成氢键，使mRNA被吸附在柱上。不具poly(A)结构的RNA，不能发生特异性结合而从柱中流出。结合在柱上的mRNA可以用低盐缓冲液或蒸馏水洗脱。因为在高盐溶液中碱基间的氢键稳定，在低盐状态下易解离，水打破poly(A)与(dT)间的氢键，使mRNA洗脱。

层析中涉及到的缓冲液有两种，一是上样缓冲液，也有人称结合缓冲液。各文献报道的结合缓冲液都由Tris·C1、EDTA、氯化物盐类及去污剂组成。不同之处是有的使用0.5mol/L的NaCl、有的使用0.5mol／L的LiCl。不管使用哪种盐，都为高浓度，以促进poly(A)与寡聚(dT)结合。第二种是洗脱缓冲液，除Tris、去污剂的浓度减半外(也有Tris 量不减半的)，最大的变化是不含氯化物或含低浓度的LiCl。其作用是解除Poly(A)与寡聚(dT)的结合，使mRNA洗脱下来。

在没有特制的层析柱时，可以用无菌硅化的巴斯德吸管或lml的注射器做层析柱，出口端用无菌硅烷化过的玻璃纤维填充。寡聚(dT)纤维素用上样缓冲液悬浮后装柱。柱体积在0.25ml左右。装柱后用0.1mol/L 的NaOH 洗柱，上样缓冲液平衡。RNA的样品量一般在2~5mg，体积为lml左右。上样前样品要经过变性处理，置沸水浴中加热数分钟后立即置冰浴中。上样后就要立即收集流出液，这时流出液中可能含有一些未能与纤维素结合的mRNA。将流出液加热至65℃维持6~7分钟，然后快速冷却再重新上样，如此反复多次，以使mRNA充分被吸附在纤维素柱上，用5~10倍体积的结合缓冲液洗柱，这时rRNA、tRNA 等逐渐被冼脱，而mRNA挂在柱上。洗脱至流出液的OD260值几乎为零，换用低盐的洗脱缓冲液洗脱mRNA，部分收集器收集，测定每管中的mRNA浓度，合并含mRNA的洗脱液，用乙醇沉淀mRNA，于-70℃保存。

（三）RNA样品质量检测

用于Northern杂交的RNA样品应是纯净的，无明显的DNA、蛋白质污染，无小分子有机物复合，无提取试剂的污染。分子完整，无严重降解。同DNA样品质量检测相同，主要有紫外吸收法及琼脂糖凝胶电泳法两种。

1、紫外吸收法

① 纯度检测：在分光光度计上分别测定样品在230nm、260nm、280nm的吸收值，计算A260/A280及A260／A230的比值。纯净的RNA样品A260/A280的比值应在1.7~2.0之间，若小于1.7则表明样品中有蛋白质或酚试剂污染。此时，可用等体积的酚／氯仿重新抽提去除蛋白质；用氯仿、乙醚抽提去除残酚。在抽提过程中RNA损失较大(约60％)。A260/A230的比值应大于2.0，如小于2.0则表明RNA被异硫氰酸胍污染。这时可以通过乙醇或异丙醇重新沉淀(可反复几次)来去除。关于DNA杂质的存在与否紫外分光光度法不能予以明确说明。

② 浓度测定：纯净的RNA样品(无DNA及核苷酸杂质)260nm的光吸收值等于1.0时，RNA的含量为37 µg/m1。根据此吸收值与浓度的关系可求出任一RNA样品的浓度。

RNA含量(μg／m1)＝A × 稀释倍数× 37 μg／m1 当对含量要求不十分精确时，可近似认为A260=1.0 时的RNA浓度为40µg/m1。测定时如果按如下做法可使计算简化：取4µl RNA样品，加蒸馏水至lml，以蒸馏水或TE为空白测定A260值，该数值× 10 即为样品RNA浓度(µg/µl)。

2、琼脂糖凝胶电泳法

由于RNA分子结构与DNA不同，因而RNA电泳时有着与DNA电泳的不同之处。因RNA为单链分子，链内配对碱基很易通过氢键结合而形成二级以至三级结构。不同的RNA分子空间结构不同，因而RNA分子在未变性的条件下分子量与泳动率无严格的相关性。在变性条件下电泳，破坏RNA的空间结构，才能使RNA的泳动距离与其分子量对数值成正比。变性后的RNA泳动速度比天然RNA小1/2左右。在不需要测定RNA分子量时，使用浓度1.0％~1.4％的非变性琼脂糖凝胶也可将不同的RNA分子分离。当需要对所提取的RNA样品进行快速检测时可使用非变性胶。

总RNA样品中的主要成分是28S的rRNA、18S的rRNA及5SrRNA。电泳后在胶板上呈现三条明显的条带。在上样量小时，5SrRNA的条带有时显示不清。若在变性胶上，这三条带的迁移率分别与5.1kb、2.0kb 及0.12kb 的标准RNA的迁移率相近。从量上看，溴化乙锭染色后28SrRNA条带的亮度应为18SrRNA的两倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA条带，表明样品中RNA有降解。发生降解的原因主要是RNase灭活不好，或操作中温度过高。防止的方法是操作全过程在4℃低温条件下或冰上进行。操作中一次性手套要经常更换，尽量避免RNase污染。

二、植物总RNA的提取方法

（三）TRIZOL法小量提取RNA（Invitrogen Co.）

1、于1.5ml离心管中加入1ml TRIZOL提取液；

2、称取0.1g液氮研磨后的材料，转移到提取液中，漩涡振荡混匀，15-30℃静置5min； 3、4℃，12000g，离心10min；取上清；

4、加0.2ml氯仿，剧烈摇动15sec，15-30℃放置2-3min，4℃，12,000g，离心15 min；

5、取水相，加0.25ml异丙醇，0.25ml高盐溶液，颠倒混匀，15-30℃放置10min，4℃，12,000g离心10 min，去上清；

6、用1ml冰预冷的75％乙醇洗涤沉淀，漩涡振荡，4℃，7500g离心5min；

7、真空泵吸除乙醇，用DEPC-ddH2O溶解RNA，55-60℃溶解10min，迅速冰浴，稍离心

8、-20℃短时间保存，-80℃保存长期保存。

高盐溶液（100mL）：0.8M柠檬酸钠 23.528g；1.2M NaCl 7.013g

三、RNA电泳检测

在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳应小心，甲醛蒸气有毒，含有甲醛的溶液应在化学通风橱内配制，含甲醛溶液的电泳槽应尽可能盖严。操作步骤如下：

1、配制5×甲醛凝胶电泳缓冲液：0.1M MOPS（pH7.0）；40mM 乙酸钠；5mM EDTA（pH8.0）

将20.6g 3-（N-玛琳代）丙磺酸（MOPS）溶于800ml经用DEPC处理的50mM乙酸钠溶液。用2M氢氧化钠将溶液的pH值调至7.0，加10ml经用DEPC处理的0.5M EDTA(pH8.0)，在加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。上述溶液经用0.2µm微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用，而深黄色缓冲液则不然。

2.、制备凝胶

将适量琼脂糖溶于水（1%），冷却至60℃，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终浓度分别为1×和2.2M（将12.3M甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和5×甲醛凝胶电泳缓冲液按1:3.5:1.1比例混合即可）。再化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置30分钟或更长时间，使凝胶凝固。

3、在一灭菌的1.5ml离心管内混合下列液体，以制备样品：RNA（30µg）

4.5μl；5×甲醛凝胶电泳缓冲液

2.0μl；甲醛

3.5μl；甲酰胺

10.0μl 于65℃温育15分钟，冷浴冷却，离心5秒钟使管内所有液体集中于管底。每一泳道至多可分析30µg RNA，通常用10-20μg细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）。许多批号的试剂级甲醛溶液已足够纯，不需经过任何预处理即可直接使用。但如果甲醛溶液呈黄色，需在溶液中加入Dowex XG8混合床树脂置磁力搅拌器上搅拌1小时，再用Whatman1号滤纸过滤2次，进行去离子甲醛应分装成小份，充氮保存于-70℃。

4、加2μl灭菌的并经用DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液。

甲醛凝胶加样缓冲液：50% 甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25% 溴酚蓝；0.25% 二甲苯青FF；

5、加样前，将凝胶预电泳5分钟，电压降为5V/cm，随后将样品加至凝胶加样孔。可用已知大小的RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28SrRNA或者9S兔β-珠蛋白mRNA，这些RNA的长度分别为6333、2366和710个核苷酸。也可以从BRL购置已知大小的RNA的混合物作为分子量标准参照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留一个空白泳道。

6、将凝胶浸入1×甲醛凝胶加样缓冲液中，3-4V/cm电压降进行电泳。电泳缓冲液不需进行持续循环，电泳1-2小时后，收集并混合两个液槽的缓冲液，再加入电泳槽中，即可继续电泳。

7、电泳结束后（溴酚蓝迁移出约8cm），切下分子量标准参照物的凝胶，浸入溴化乙锭溶液（0.5μg/ml,用0.1M乙酸铵配制）中染色30-45分钟。在凝胶旁放置一透明尺，在紫外灯下照像。测量照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RNA片段大小的1g对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶转移到固相支持物后通过杂交所检出的RNA分子的大小。

小心：溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶剂时应戴手套，用后应进行净化处理。紫外线照射有危害，对眼睛尤甚。为尽量避免受到照射② RNA沉淀未完全溶解

2、A260/A280<1.65。可能的原因是：

① 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高② 样品匀浆时加的试剂量太少③ 匀浆样品时未在室温放置5分钟④ 吸取水相时混入了有机相⑤ RNA沉淀未完全溶解

3、RNA降解。可能的原因是：① 组织取出后没有马上处理或冷冻② 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃③ 细胞在用胰酶处理时过度④ 溶液或离心管未经RNase去除处理⑤ 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

4、DNA污染。可能的原因是：① 样品匀浆时加的试剂量太少 ② 样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液

五、植物RNA提取过程中难点的相应对策

（一）酚类化合物的干扰及对策：

许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。

1、防止酚类化合物被氧化的方法：

① 还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。

② 螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。

③ Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。

④ 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。

⑤ 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。

2、酚类化合物的去除：

通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。

（二）多糖的干扰及对策：

多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。

用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。

另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。

（三）蛋白杂质的影响及对策：

蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。

Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。

（四）次级代谢产物的影响及对策：

从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。

由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。

随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。

思考题

1、RNA纯化过程中如何避免RNA酶的污染？

2、如何检测已纯化RNA的质量？

第二篇：实验四 植物DNA的提取[定稿]

实验四

植物DNA的提取

一、实验目的

掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。

二、实验原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物，这种复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl），降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB-核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB。提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的浓度测定和纯度分析

（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、试剂和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml(2)CTAB分离缓冲液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL。(4)TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:异戊醇=24:1(6)液氮

(7)研钵，恒温水浴（37～100℃），离心机，离心管。

四、操作方法：

(1)将10mlCTAB分离缓冲液加入50ml离心管中，置于65℃水浴中预热。(2)称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

(4)样品于65℃保温30分钟，每5～10分钟混匀一次。(5)加等体积（10ml）的氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。(6)室温下4000r/min离心10分钟。

(7)用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中间白色的蛋白质层），向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA析出。（有些情况下，这一步可以产生云雾状的DNA析出，如果看不到云雾状的DNA，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云雾状的DNA析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA中轻轻转动，缠起DNA，然后将玻璃棒转移至20mL洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA沉淀从玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云雾状的DNA，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA沉淀自然干燥20分钟。(9)用玻璃棒缠出DNA，在室温下使DNA自然干燥20分钟。(10)

将自然干燥的DNA溶于1mLTE缓冲液中，—20℃保存备用。

(11)

取100uL稀释20倍，测定A260，A280，A230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

五、思考题

1、CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？

2、吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？

第三篇：提取RNA注意事项

RNA提取的细节

转载请注明来自丁香园

发布日期：2009-05-26 03:06 文章来源：丁香园

分享到： 收藏夹 新浪微博 腾讯微博 开心网 豆瓣社区 人人网 关键词： RNA 提取 细节 点击次数：41785 RNA 真不好提取，这是我在网上看到的，和大家共享！

对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？ 组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质 – 用嘴碾磨，肠胃抽提。

究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。实验前方法/试剂的选择 0：抽提 RNA 的目的

RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财。1：样品的收集/保存 – 影响降解的因素

样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。

2：样品的破碎及匀浆 – 影响降解和得率的因素

样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。

3：裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素

常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。

4：纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留，抽提速度的因素

对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。

第四篇：RNA提取注意事项

RNA提取心得/经验/体会/纪律（RNA提取注意事项）！

纪律一：杜绝外源酶的污染。

注意一：操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩，手套。

注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。

注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。纪律二：阻止内源酶的活性

注意四：选择合适的匀浆方法。

注意五：选择合适的裂解液。

注意六：控制好样品的起始量。纪律三：明确自己的抽提目的

注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。

注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。Rnase 污染的10大来源

1：手指头 – 手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。

2：枪头，离心管，移液器 – 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。3：水/缓冲液 – 一定要确保无 Rnase 污染。

4：实验台面 – 最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。

5：内源 Rnase – 所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。

6：RNA 样品 – RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。

7：质粒抽提 – 质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。

8：RNA 保存 – 即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。9：阳离子(Ca, Mg)– 在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂(1mM Sodium Citrate, pH 6.4)。10：后续实验所用的酶 – 酶均有可能被 Rnase 污染。RNase 和 DEPC 处理

1：高压灭菌是可以灭活部分 Rnase A 的。实验证明：37 C 与 RNA 反应，没有灭菌的 PBS，活性点为 100 pg/ml；灭菌后，活性点为 100 ng/ml。当然，灭菌后 Rnase 仍然不能认为没有残留。

2：DEPC 在水中半衰期为 30 分钟。0.1% 的 DEPC 灭菌 15 分钟可以认为彻底 破坏了 DEPC。破坏后可以闻到一点气味。

3：在1M Tris, 1M HEPES, 1M MOPS 中分别加入 1ug/ml Rnase A 和 0.1% 及 1% DEPC 实验。结果提示，0.1% DEPC 只对 MOPS 有效，而 1% DEPC 对三种试剂都有效。

4：0.01% DEPC，0.1% DEPC，1% DEPC 有效去除 Rnase A 的浓度分别为：100 ng/ml，500ng/ml，1 ug/ml。但要注意，DEPC 灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。我也来谈谈RNA的提取，我觉得14楼说的方法很严格，但是有时候我们其实不必在过多的细节上太紧张。而在有些步骤一定要小心了。以下的内容，是讲给那些既想偷懒，有希望实验结果有保证的人听的，如果你是习惯于每一步都很严格的人的话，建议还是按照14楼的方法做，因为那样才是正途啊。

好了，下面是给想偷懒，但又不想搞砸实验的战友看的。用最少的时间，Money，力气，来做出最好的结果，是我们的终极目标（PS：我相信一句话，懒人推动科技进步！个人愚见，大家不要拍我啊）。我是做植物的，所以以植物RNA提取为例子：

一、关于器皿的处理：

枪头ep管最好是用DEPC处理一下，当然如果老板钱多的话，尽管用进口的RNase-Free的吧。这里，如果你想要偷点懒，也是有办法的，就是少处理一些ep管，因为后面我们会讲到，不是所有的ep管都一定要处理的。

研钵，这个东西按要求是要高温干燥处理的，但是在实际实验中，如果你不处理的话，也不会有太大的影响。因为在一般我们要处理的材料上都会带有很多的RNA酶，设想一下，一个研磨碎了的细胞会释放多少RNA酶出来。所以，在研钵上残留的那些RNase，不是导致你RAN降解的原因。我的做法是，洗干净的研钵，和枪头等一起湿热灭菌即可。如果你真的很急的话，连湿热灭菌也免了。

关于手套、口罩和实验台。手套是一个很重要的东西，这个千万不能省，而且实验过程当中要勤换手套。因为，一般我们在做实验是时候，还要取用很多其他试剂、仪器。所以手套往往是最有可能污染你样品的东西。所以千万记得要换得勤快点。还有，顺便说一下，最好是戴两层PE手套，因为实验过程中，往往手上会出汗，戴一层手套的话，往往脱下来，就很难戴上去了。戴上两层，外层的手套可以方便更换，免得戴不上，还把PE手套夹到ep管里面，这样可是很危险的！至于口罩，我认为，不戴也没关系，但不戴口罩的话，建议你少说些话了，尤其是不要对这样品。讲话是时候，带出去的口水，足够降解你的样品了。工作台的话，我想，能在一个超净台上是最好，普通的bench也可以，但是要保证周围没人干扰，否则，有人冲你打个招呼，那喷过来的口水就够让你的RNA嗝屁了（像口水兵？）。

二、关于实验过程和试剂

通常，提取植物RNA的方法如下

试剂：Trizol，氯仿，75％乙醇，异丙醇，DEPC水；

操作：

1）、每100mg组织加1ml TRIZOL试剂，用液氮匀浆后，室温放置到变成液态；

2）、将液体吸到1.5 ml EP管中（可以用没有经DEPC处理的ep管），加新开的氯仿0.2ml，振荡15秒。

3）、室温静置2-3分钟后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。

4）、取0.5ml上清到ep管（DEPC处理）加等体积的氯仿重新抽提；4℃，12000g，15min；

5）、取上清无色水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10分钟；

6）、12000 rpm，15分钟，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清（小心别倒了沉淀），75%乙醇1.0 ml洗涤（用DEPC水新配制）后，7500 rpm，5 min，4℃离心。

7）、重复洗涤（可选）；

8）、去上清，用10 ul Tip吸干液体。气干沉淀5-10分钟； 9）、加DEPC水20-30 ul，枪打匀，溶解总RNA，测OD值。10）、电泳，检测RNA质量。

讲一下注意事项和可以偷懒的地方。Trizol现在我发现好多实验室都是自己做的，所以也不要吝啬，多加一点吧，这个东西可以有效的抑制RNase的活力，情愿偏多，不要偏少。

第1）步，在磨样的时候，注意，千万要保持低温，尤其是开始还没加Trizol的时候，千万不要让样品的温度升高了，否则就可以和你的RNA说拜拜了。在加了Trizol后，情况会好些，如果研磨充分，那就暂时安全了。

第2）步的时候，这里直接加了氯仿，不少protocol上都还要多一步，先离心去渣，取上清后再加氯仿，这两步完全可以合并，而且感觉合并的话，似乎RNA得率还高些！而且省下一批ep管，还省下一步的时间。

3）、4）和5）就按照protocol做，可以放松点，注意用处理过的ep管就好了，一般不会有降解的危险。

第6）和7）两步的洗涤会明显的减少RNA的盐含量，对提高RNA质量有很大的帮助，当然也会同时损失掉一部分的RNA，所以洗几次，就看你的要求了。

后面几步，大家就要小心了，现在剩下的可都是精贵的RNA了，做了几个小时，可别前功尽弃啊。最后一步，推荐使用进口ep管，进口管不容易把液体挂在管壁上，这样，将来取用的时候，损失会小不少。

三、其他

在批量提取的时候，建议用个大点的ep管架子，否则ep管挤在一起，手戴着手套，一不小心，就容易打翻样品（哭吧，如果就一份样）！

枪头的话都是高温成型的，如果你使用是枪头是没开封过的，一般不用DEPC处理也没问题。主要是怕二次污染，有些工厂是用人工包装了，不是机器打包的，那建议处理一下。

友情提示，DEPC是疑似致癌物质，使用是时候千万小心！我始终认为，安全是第一位的，如果条件允许的话，尽量使用进口ep管和枪头，这样就不用接触DEPC了。

(TRIZOL提取注意事项

TRIZOL试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水 3 样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

论是人、动物、植物还是细菌组织，该方法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×106)以及大量的组织(≥1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。TRIZOL试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。TRIZOL抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A)+ 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。如果是用于PCR，当两条引物位于单一外显子内时，建议用级联扩大的DNase I(Cat.No.18068)来处理抽提的总RNA。

RIZOL试剂能促进不同种属不同分子量大小的多种RNA的析出。例如，从大鼠肝脏抽提的RNA琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙啶染色，可见许多介于7 kb和15 kb之间不连续的高分子量条带，（mRNA和hnRNA成分）两条优势核糖体RNA条带位于~5 kb(28S)和~2 kb(18S)，低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之间(tRNA, 5S)。当抽提的RNA用TE稀释时其A260/A280比值≥1.8 预防RNA酶污染: 提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。由于RNA酶的活性很难完全抑制，预防其污染是十分必要的。在实际的操作中应遵循以下指南：

* 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。

* 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A 或 T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可能富含RNA酶。* 在TRIZOL中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。其他注意事项

* 当TRIZOL用量少于2-ml时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。

* 当TRIZOL用量较大时，可以使用玻璃试管(Corex)或聚丙材质试管，事先检验以确保该试管可以耐受加入TRIZOL和氯仿后12,000×g的离心力。不可使用有裂缝或者破损的试管。* 离心前小心平衡试管。

* 离心前玻璃管口必须盖上铝箔并用石蜡膜封口，聚丙烯管必须盖紧。RNA抽提指南

注意：用TRIZOL抽提RNA时要戴手套和护眼罩。避免接触皮肤和衣服。在化学通风橱完成操作。避免呼吸道吸入。

如无例外，所有的操作应该在15-25°C的条件下完成，试剂亦在15-25°C的条件下。

RNA提取注意事项

一些RNA提取方法，在进行具体实验时，应根据研究对象的性质，提取核酸的用途而对上述方法在操作步骤和试剂使用量上作一定的修改。

1、在核酸提取时，为了增加细胞的裂解度，增加核蛋白复合体破碎度，以释放更多的游离核酸，在操作中常要用到溶菌酶和蛋白酶K，在确保没有核酸水解酶存在的前提下，酶反应时间越长越好。

2、有时在使用蛋白酶时，为了抑制核酸水解酶的降解作用，可在蛋白酶缓冲液中用终浓度5mM的EDTA代替NaCL，并且可将反应温度提高到50－60℃，并将反应时间缩短到15－25min，但酶用量必须提高10－20倍。溶菌酶使用时缓冲液中需加EDTA，因游离金属离子对酶有抑制。

3、许多植物材料中富含酚，在细胞破碎时，在多酚氧化酶作用下，被氧化成有色的锟类物资，影响核酸的提取及降低提取质量，在提取液中加入PVP和巯基乙醇对降低酚类的干挠可能有所帮助。PVP将与酚形成复杂的聚合体，在提取时将酚从核酸成分中游离。且PVP与巯基乙醇作为强还原剂可防止多酚的褐变。另外作为还原剂的这些成分在一定程度上可抑制核酸水解酶的作用。

4、许多生物材料在提取核酸时，都会遇到多糖的污染问题，具体表现为有机溶剂沉淀时，沉淀很多，但复溶时，大量沉淀不溶，电泳观察时核酸含量很低。

克服多糖污染可采用以下一些办法 1)CTAB多次抽提。

2)在有机溶剂沉淀时先稀释样品浓度（可到10倍左右），对低浓度样品再进行沉淀。

3)在有机溶剂沉淀时选用异丙醇和5MNaCL作为沉淀溶剂，此时氯化钠的用量可用到1/5-1/2的体积，异丙醇可用到0.6-1的体积。异丙醇沉淀核酸时，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，从而可达到去多糖的作用。但高浓度的盐存 在会影响核酸的进一步操作，因此必须用乙醇多次洗涤脱盐。

5、在核酸提取时，酚与氯仿均起到变性的作用。酚的变性能力强于氯仿，但酚与水有一定的互溶，因此酚抽后，除可能损失部分核酸外，水相中还会残留酚，而酚的存在将对核酸的酶反应产生强的抑制，因此在操作中可单用氯仿作变性剂、也可用酚/氯仿混合变性，也可用单一酚作变性己，但用单一酚后在有机溶剂沉淀时一定要用氯仿从抽提。

6、在操作中当加入变性剂氯仿后，为了保证核酸样品的完整性，操作要轻，尤其在提DNA时，更要避免剧烈操作。

7、在沉淀核酸时可用乙醇与异丙醇，乙醇的极性要强于异丙醇，所以一般用2V乙醇沉淀，但在多糖、蛋白含量高时，用异丙醇沉淀可部分克服这种污染，尤其用异丙醇在室温下沉淀对摆脱多糖、杂蛋白污染更为有效。

8、在提取核酸时，如样品浓度低，则应增加有机溶剂沉淀时间，－70℃下>30min;－20℃过夜将有助于增加核酸的沉淀量。

9、在核酸提取过程中有机溶剂沉淀后复溶时可加水因此时离子浓度可能较高，而到高度纯化后低温保存时最好复溶于TE缓冲液中，因溶于TE的核酸储藏稳定性要高于水溶液中的核酸。另外核酸样品保存时要求以高浓度保存，低浓度的核酸样品要比高浓度的更易降解。

10、核酸提取后可通过PCR、RT－PCR直接扩增出目的基因片断，也可首先构建文库、然后由RACE、dd-PCR等差异显示技术、AFLP等标记技术、差异杂交或文库扣除技术等方法筛选出特异探针，再用此探针从文库中筛选出完整基因。

11、在抽提过程中，若蛋白质含量或其它的杂质还较多，可以增加抽提次数.提取RNA请尽量在低温下操作，如果条件不容许，在室温下操作的时间要尽可能的短。

第五篇：组织RNA提取

哺乳动物组织样品RNA的抽提

哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

关键词：抽提 样品 哺乳动物组织 样品RNA 哺乳动物组织样品RNA的抽提最基本的要素是防止RNA在抽提过程中降解，以及尽可能得到最高的RNA抽提效率。以下介绍我们实验室认为最符合以上两个要素的抽提方法。

一、实验材料：

Trizol试剂（Invitrogen公司）

研钵，匀浆器，镊子，铝箔都高温灭菌即可；

二、具体过程：

1、样品在离体后应迅速冷冻在液氮中，若是比较大块的组织，要尽量把组织剪切成黄豆大小的块，使液氮迅速渗透到组织内部而防止组织内部的RNA降解。组织用铝箔包好或放入冻存管中，并做好记号，注意不要把记号写在纸上，以防纸被组织的血水渗透而导致记号模糊。可以把铝箔放入纱布袋并储存在液氮中。

2、在抽提RNA前，先把研钵预冷，往研钵内反复加入液氮，至少4-5次，使研钵充分预冷。从液氮罐中取出样本后，把组织块放入已预冷的研钵中进行研磨，边研磨边加液氮，整个过程都不要使液氮挥干。一次研磨的组织块重量不要超过300mg。

3、研磨到组织样品成粉末状后（一般需要8-10min的研磨过程），在液氮基本挥发完时，在每个研钵中加2-3ml Trizol试剂。由于此时研钵很冷，Trizol加入后会冻结成固体状。可以继续研磨此固体成粉末，随着研钵温度回升到室温，固体状的 Trizol逐步回复到液体状态，此时，若发现液体很粘，研杵能牵起丝状物，说明Trizol的量太少，需在此步继续补加Trizol。若 Trizol的量过少，会导致抽提的RNA中有较多的基因组DNA污染。由于Trizol试剂中含有强烈的RNA酶抑制剂，因此组织样品和Trizol充分研磨混匀后就不用担心RNA的降解了。

4、把此Trizol试剂转移到玻璃匀浆器中，再进一步匀浆3-5min。

5、再把Trizol试剂转移到1.5ml离心管中，后续可以按照Trizol试剂的标准操作抽提总RNA。也可以把此Trizol试剂保存在生物冰（低于15℃即可）邮寄给我们，由我们来完成后续的抽提过程。说明：

1、研磨，匀浆过程中使用过的器具放入八四消毒液中浸泡消毒一天后，再用洗涤灵洗刷干净晾干后泡酸过夜，洗刷晾干后包上铝箔高压灭菌后，180℃烘烤4小时以备下次使用。

2、此方法看上去过程虽然比较繁琐，但得到的RNA质量好，抽提的RNA量比其他方法要高，比如米粒大的胃镜标本平均能提出约10 g总RNA，足够做一张人22K全基因组芯片了。得到的RNA的电泳检测图片如图7。

3、另外在我们的工作中，接触到一些用户在取了组织后，马上冻到-70℃冰箱来保存，然后提取RNA做反转录，这样的样品中RNA往往有较大的降解，用来 做一些基因的RT-PCR还可以，但若做芯片工作就不行了。要尽量先液氮速冻。