实验四动物血液中DNA的提取-教案

第一篇：实验四动物血液中DNA的提取-教案

授课教师常祖明学生人数 55

课题血液基因组DNA的提取

授课类型新授课授课方法讲授、演示 教学用具多媒体、实验室设备

教学目的掌握鸡血DNA提取的原理及方法

教学重点理解实验过程中每一步操作的目的及原理 教学难点 教学过程

一、实验目的

1.掌握鸡血DNA提取的原理；

2.掌握鸡血DNA提取的方法及操作过程。

二、实验原理

哺乳动物的成熟红细胞已经高度分化，因而当中没有细胞核，无法提取DNA。禽类的血细胞则可以。禽类代谢旺盛，血液中红细胞更多，而且红细胞中有完整的细胞核、大量的染色体。且材料易得、经济。用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

三、实验仪器 1.水浴锅：55℃

2.离心机：8000转、12000转 3.离心管：5ml（120个）

4.移液枪：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml 5.容量瓶：100ml 6.取血针及管

四、实验材料及药品

实验材料：普通家鸡：需血液4.08ml（每管136(l）1.无水乙醇

作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。

商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。

理化性质：无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。2.柠檬酸

作用：ACD抗凝血剂成分之一。在抗凝剂中，中和柠檬酸钠的碱性。商品信息：分析纯AR，白色塑料瓶/500g，理化性质：无臭，有很强的酸味，白色粉末或颗粒，易溶于水和醇。在潮湿的空气中微有潮解性。

储存：在湿空气中有轻微潮解，需阴凉密封干燥保存。

危害：柠檬酸浓溶液对黏膜有刺激作用。柠檬酸可燃。粉体与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧爆炸的危险。3.柠檬酸钠

作用：ACD抗凝血剂成分之一。能与血液中的钙离子结合成螯合物，而使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固。

商品信息：柠檬酸三钠分析纯500克/瓶。

理化性质：有机化合物，外观为白色到无色晶体。无臭, 有清凉咸辣味。常温及空气中稳定, 在湿空气中微有溶解性, 在热空气中产生风化现象。加热至150℃失去结晶水。易溶于水、可溶于甘油、难溶于醇类及其他有机溶剂，过热分解，在潮湿的环境中微有潮解，在热空气中微有风化，其溶液 pH 值约为8。储存： 常温密闭保存 危害：无毒 4.尿素

作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白质变性，尤其能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质。

商品信息：化学试剂分析纯 500克/瓶（塑料瓶装）理化性质：无色柱状结晶或白色结晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，难溶于乙醚，不溶于氯仿。储存：密封避光保存。

危害：避免与皮肤和眼睛接触。5.十二烷基硫酸钠(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白质复合体，用于从蛋白质中分离核酸。商品信息：500g/分析纯AR。

理化性质：白色或淡黄色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于热水，溶于水，溶于热乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。储存：密封阴凉干燥保存 防止受潮受热 危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。该品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。6.1M Tris-HCl(PH8.0)缓冲液

作用：禽血裂解液成分之一。提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏 商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液

理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。

储存：室温保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。7.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）

作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。

储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。

危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化组蛋白，释放出DNA；消化DNase，提高DNA产量 商品信息：（20mg/mL）1ml/支。

理化性质：一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌中纯化得到。储存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。危害：使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质。9.Tris饱和酚（共需60ml，每管2ml）作用：强蛋白质变性剂。商品信息：瓶/250ml。理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。

储存：4℃避光保存。

危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。储存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。11.异戊醇

作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。12.无水葡萄糖

作用：ACD抗凝血剂成分之一。商品信息：500g/瓶。

理化性质：无色结晶或白色结晶性粉末；无臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。储存：无水葡萄糖易吸水结块，因此应密封保存。危害：无。

五、实验试剂 1.75%的乙醇

{75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇

2.ACD抗凝剂 100ml（共需48ml，每管0.8ml）

{柠檬酸0.48g + 柠檬酸钠1.32g + 葡萄糖1.47g} →加水至100ml，灭菌后备用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）

{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0)10ml + 0.5M EDTA(PH8.0)20ml} →加水定容至100ml，备用。

【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-异戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml {氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存

5.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml {氯仿-异戊醇（24:1）40ml + Tris饱和酚40ml} = 80ml，4℃保存 6..TE缓冲液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → →定容到50ml →高压灭菌后冷却4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} →定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液

六、实验步骤

1.采用翅静脉采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振荡混匀，配成家鸡血样25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比无水乙醇效果好，血样不至于太干涩。酒精:血(4:1)混合的血样保存时间长，可达4个月。

2.取血样(酒精:血＝4:1)680(L至5mL离心管中，8000转离心1分钟，弃上清； 目的：去除血样中大部分的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。

3.加800(LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；再加800(LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；

目的：ACD抗凝剂可以螯合血液中的钙离子，防治血细胞凝集成团凝固，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。多次离心可以去除血样中的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。4.加1700(L裂解液，10(L蛋白酶K（100(g），摇匀，55℃水浴保温过夜； 目的：DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来，蛋白酶k还可以消化DNAse，提高DNA产量。55℃水浴保温过夜可以让蛋白酶K充分发挥作用。

5.加2mL饱和酚，摇匀至无块状物，12000转离心10分钟；

目的：饱和酚是强蛋白质变性剂，可以将蛋白质及降解后的产物充分变性，变性后的蛋白质溶解度减低，易沉淀。

6.吸取上层透明的DNA溶液至另一5mL离心管中，注意不要搅拌下层的酚－蛋白层；

目的：加入饱和酚后溶液分层，上层是透明的DNA溶液，再往下是变性的蛋白质，饱和酚的比重最大在最下层。

7.加2mL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），摇匀至悬浮液，12000转离心10分钟； 目的：加入酚-氯仿-异戊醇进一步去除DNA溶液中的残留蛋白质。

8.吸取上层DNA液于另一5mL离心管中，加1.8mL氯仿-异戊醇溶液，摇匀，12000转离心10分钟； 目的：由于酚与水有部分混溶，DNA水溶液中会混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-异戊醇在抽提一次可以把酚带走。

9.吸取上层DNA液900(L于另一5mL离心管中，加无水乙醇至满，颠倒混合，试管中出现白色团块，即是DNA；

目的：DNA水溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇与DNA不相溶但与水相溶，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用无水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA会部分溶于水中，降低DNA沉淀的产量。

10.吸出试管中的无水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重复2次；

目的：像前面步骤中加入的抗凝血剂中的柠檬酸钠、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，经乙醇沉淀后的DNA中会有以上杂质存在。以上杂质有个共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗涤，可以利用其中的15%的水溶解这些杂质除去。11.将DNA自然晾干后溶入1000(L TE缓冲液，-20℃保存；

目的：乙醇已挥发除去，TE缓冲液一可以抑制Dnase活性，二维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。

七、实验注意事项

1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作； 2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；

3.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔； 4.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；

5.吸出试管中的无水乙醇时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。

八、思考题

1.本实验中几次用到的不同浓度乙醇的作用是什么？

九、实验安排

全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。每组作3个离心管，共用一个研钵。

每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。

第二篇：实验四 植物DNA的提取[定稿]

实验四

植物DNA的提取

一、实验目的

掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。

二、实验原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物，这种复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl），降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB-核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB。提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的浓度测定和纯度分析

（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、试剂和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml(2)CTAB分离缓冲液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL。(4)TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:异戊醇=24:1(6)液氮

(7)研钵，恒温水浴（37～100℃），离心机，离心管。

四、操作方法：

(1)将10mlCTAB分离缓冲液加入50ml离心管中，置于65℃水浴中预热。(2)称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

(4)样品于65℃保温30分钟，每5～10分钟混匀一次。(5)加等体积（10ml）的氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。(6)室温下4000r/min离心10分钟。

(7)用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中间白色的蛋白质层），向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA析出。（有些情况下，这一步可以产生云雾状的DNA析出，如果看不到云雾状的DNA，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云雾状的DNA析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA中轻轻转动，缠起DNA，然后将玻璃棒转移至20mL洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA沉淀从玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云雾状的DNA，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA沉淀自然干燥20分钟。(9)用玻璃棒缠出DNA，在室温下使DNA自然干燥20分钟。(10)

将自然干燥的DNA溶于1mLTE缓冲液中，—20℃保存备用。

(11)

取100uL稀释20倍，测定A260，A280，A230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

五、思考题

1、CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？

2、吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？

第三篇：DNA粗提取及鉴定教案

《DNA粗提取及鉴定》

一、学习目标：

学生通过对本节内容的探究学习：能

⑴了解DNA的物理化学性质。⑵理解DNA粗提取与鉴定的原理。⑶掌握DNA粗提取及鉴定方法，⑷利用DNA的性质进行实验分析和实验设计。

二、本节内容学习的重点：DNA的粗提取和鉴定原理、方法。

难点：DNA的粗提取和鉴定原理、方法。

三、自主探究

（一）（阅读教材、学案；探究下列问题）

1、提取生物大分子的基本思路？

2、提取DNA的基本思路？

3、用文字和坐标曲线描述DNA的溶解性；并思考该问题在DNA粗提取中将有何应用？

4、DNA在酒精溶液中的溶解性

5、DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性

6、如何来进行DNA鉴定

自主探究

（二）（阅读教材、学案；探究下列问题）

1、进行DNA粗提取应选择什么样的材料；你的选择的理由？

2、为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？

3、如何破碎植物细胞，并获取含DNA的滤液；请举例说明，并告诉自己应注意什么？

自主探究

（三）（阅读教材、学案；探究下列问题）

去除滤液中的杂质

1、此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？

2、方案一中为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？

3、方案二与方案三的原理有什么不同？

自主探究

（四）（阅读教材、学案；探究下列问题）

1、DNA析出的原理，DNA析出物是什么颜色？

2、DNA鉴定需要设置对照吗？要注意什么问题？ 四：

讨论

（一）你帮助、我改正；我质疑，共提升

小组内讨论自主探究内容并自行改正

讨论

（二）你我同思考，细总结，共同突破难点

小组内讨论：总结

1、本实验的实验原理

2、DNA粗提取与鉴定过程

3、此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤，几次析出？分别在哪一步？

五：

小组间质疑，完善 六：课堂小结

七：达标检测；当堂掌握 知识拓展：课下思考总结：

1、在我们的高中生物学习中有颜色反应的实验有那些？

2、DNA在不同浓度氯化钠溶液中溶解度的变化曲线还能表示那些量的关系？

3、还有那些实验中用到了酒精，他们的作用是？

第四篇：实验一大肠杆菌DNA的提取（写写帮推荐）

大肠杆菌总DNA的提取

实验原理：本实验利用溶菌酶和碱裂解液SDS使细胞壁破坏，利用氯仿抽提的方法去除蛋白质，得到的DNA溶液利用乙醇将DNA沉淀下来。

实验目的：1.掌握DNA提取的原理和方法；

2.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 实验材料：

1.实验菌株：大肠杆菌

2.试剂：TE溶液：Tris•HCl 10 mM，EDTA 1 mM，pH 8.0，20% SDS：

溶菌酶（50mg/ml）

5M NaCl

氯仿：异戊醇（24：1 v/v）

无水乙醇

0.8%琼脂糖

TAE电泳缓冲液 仪器：离心机，电泳仪 实验步骤：

1)取1.5ml培养好的大肠杆菌培养液与离心管中，7,000 rpm离心5 min，弃上清； 2)加入500ul TE溶液洗涤菌体7,000 rpm离心5 min，弃上清；

3)用360ul TE溶液悬浮菌体，加入20ul 溶菌酶（50mg/ml），37°C保温30min； 4)加入40ul 20 %SDS使其终浓度为2 %，60°C水浴30min。5)加入110ul 5 M 高氯酸钠 使其终浓度为1 M，充分混匀；

6)加入等体积氯仿：异戊醇（24：1 v/v），充分混匀，4°C 12,000 rpm 离心15min，吸取上清于一新离心管中；

7)加入2倍体积的无水乙醇，混匀后12000rpm 离心10min； 8)弃上清，离心管在空气中自然晾干； 9)加入30-40ul TE溶解DNA；

10)取3-5ul DNA溶液，琼脂糖电泳检测。

第五篇：高中生物必修二实验十一DNA的粗提取与鉴定

实验十一

DNA的粗提取与鉴定 教学目的

初步掌握DNA粗提取和鉴定的方法。观察提取出来的DNA物质。实验原理

DNA在NaCl溶液中的溶解度是随NaCl的浓度变化而改变的。DNA在0．14mol/L的NaCl溶液中的溶解度最低，据此可使溶解于NaCl溶液中的DNA析出。DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些物质可以溶于酒精溶液，据此可提取杂质较少的DNA。DNA＋二苯胺蓝色（用于DNA的鉴定）实验步骤 1．材料制备

0.1G/ml柠檬酸钠100ml

500ml烧杯→玻璃棒搅拌→1000r/min离心2min→吸去上清液→ 活鸡血180ml

即得鸡血细胞液（也可将上述烧杯置于冰箱中，静置一天使鸡血细胞自行沉淀）2．方法步骤

取血细胞液5-10ml＋20ml蒸馏水，玻璃棒沿一个方向快速搅拌

（1）提取血细胞核物质纱布过滤，滤液中含DNA和其他核物质，如蛋白质 原理：血细胞的细胞膜、核膜吸水胀破，玻璃棒快速搅拌机械加速血细胞破裂（2）溶解核内DNA：滤液＋2mol/LNaCl溶液40ml，玻璃棒沿一个方向搅拌

（3）析出含DNA的粘稠物：向上述溶液中缓缓加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向搅拌，出现丝状物，当丝状物不再增加时，停止加水（此时NaCl溶液相当于稀释到0．14mol/L）（4）滤取含DNA的粘稠物：用多层纱布过滤，含DNA的粘稠物留在纱布上（5）DNA粘稠物再溶解：

20ml2mol/LNaCl溶液

50ml烧杯，上述粘稠物缓慢搅拌3 min（6）过滤含DNA的2mol/LNaCl溶液：用2层纱布过滤，滤液中含DNA（7）提取含杂质较少的DNA：上述溶液＋95%酒精，缓慢搅拌，出现乳白色丝状物，用玻璃棒将丝装物卷起。（8）DNA鉴定：

实验关键：

本实验成功的关键是获取较纯净的DNA，因此应注意：

1．充分搅拌鸡血细胞液。DNA存在于鸡血细胞核中。将鸡血细胞与蒸馏水混合以后，应用 玻璃棒沿一个方向快速搅拌，使血细胞加速破裂，并释放出DNA 2．沉淀DNA必须用冷酒精。实验前必须准备好大量95%的酒精，并在冰箱中（5℃以下）至少存放24小时。

3．正确搅拌含有悬浮物的溶液。在第（3）、（5）步骤，玻璃棒不要直插烧杯底部，且搅拌要轻缓，以便获得较完整的DNA分子。在步骤（7），要将玻璃棒插入烧杯溶液中间，用手缓慢转动5-10min。【同类题库】

．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中分别使用2mol／L、0．14mol／L、2mol／L、0015mol／L的氯化钠溶液，其作用分别是（A）A．溶解、析出、溶解、溶解

C．溶解、溶解、析出、溶解 B．析出、溶解、析出、溶解

D．溶解、析出、溶解、析出 ．下列图示中能反映DNA溶解度与NaCI溶液浓度之间关系的是（C）

．DNA在下列哪种浓度的NaCl溶液中溶解度最低（B）

A．2．00mol/L

B．0．14 mol/L

C．0．015 mol/L

D．0．10 mol/L ．在DNA的粗提取过程中，初步析出DNA和提取较纯净的DNA所用的药品的浓度和名称分别是（B）

①0．1 g/ml的柠檬酸钠溶液②2．00mol/L的NaCl溶液③0．14 mol/L的NaCl溶液④体积分数为95%的酒精溶液⑤0．015 mol/L的NaCl溶液⑥0．04 mol/L的NaCl溶液 A．①③⑤

B．③④

C．②④

D．②③④ ．与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是（C）A．操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度

B．在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C．加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出 D．当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度约为0.14mol/L.．（多选）下列有关“DNA粗提取”的操作中，正确的是（ABCD）A．在鸡血细胞液中加入蒸馏水

B．在“析出DNA粘稠物”时，要缓缓加入蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多 C．在用酒精凝集DNA时，要使用冷酒精 D．用玻璃棒搅拌时要沿一个方向 ．“DNA的粗提取与鉴定实验”中有三次过滤：（1）过滤用蒸馏水稀释过的鸡血细胞液。（2）过滤含粘稠物的0.14mol/L NaCl.（3）过滤溶解有DNA的2mol/L NaCl.以上三次过滤分别为了获得（A）

A．含核物质的滤液、纱布上的粘稠物、含DNA的滤液 B．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、含DNA的滤液 C．含核物质的滤液、滤液中DNA粘稠物、纱布中DNA D．含较纯的DNA滤液、纱布上粘稠物、含DNA的滤液

．为获取较纯净的DNA，采集来的血样可用蛋白酶处理，然后用有机溶剂除去蛋白质。下列有关叙述，正确的是（D）

A．除去血浆中的蛋白质

B．除去染色体上的蛋白质

C．除去血细胞表面的蛋白质

D．除去血细胞中所有的蛋白质

．在“DNA的粗提取与鉴定实验”中，和“使用蛋白酶从染色体中提取DNA”中的蛋白酶具有相似作用的物质是（D）

A．NaCl溶液

B．蒸馏水

C．柠檬酸钠

D．冷却的酒精 ．DNA不溶于下列何种溶液（D）

A．NaCl溶液

B．KCl溶液

C．MgCl溶液

D．酒精溶液 ．下列不同浓度的NaCl溶液中，使DNA析出最彻底和溶解度最高的是（A）①0.14mol/L ②2mol/L ③0.25mol/L ④0.015 mol/L A．①和②

B．②和①

C．②和③

D．②和④ ．下列操作中，对DNA的提取量影响较小的是（B）

A．使鸡血细胞在蒸馏水中充分破裂，放出DNA等核物质 B．搅拌时，要用玻璃棒沿一个方向轻缓搅动

C．在析出DNA粘稠物时，要缓缓加入蒸馏水，直至溶液中粘稠物不再增多 D．在用酒精沉淀DNA时，要使用冷酒精，甚至再将混合液放入冰箱中冷却 E．在DNA的溶解和再溶解时，要充分搅拌 ．在“DNA的粗提取与鉴定实验”中：

（1）实验中两次使用蒸馏水，第一次目的是，第二次目的是。

（2）说明不同浓度的NaCl溶液的作用： 2mol/L NaCl的作用； 0.14mol/L NaCl的作用； 0.015 mol/L NaCl的作用；

（3）提纯DNA的原理是，所用试剂为。搅拌要，目的。

（4）能否用哺乳动物血液代替？简述理由。

[（1）使血细胞吸水破裂，溶解细胞核内的DNA；降低NaCl溶液的浓度，降低DNA分子在NaCl溶液中的溶解度析出DNA分子（2）溶解含DNA的核物质；使含DNA的丝状粘稠物析出DNA分子；进行DNA鉴定（3）DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些盐类蛋白质可溶于酒精溶液；95%的冷却酒精；轻缓、同方向；保持DNA分子的完整性（4）不能，成熟的哺乳动物红细胞没有细胞核] ．此实验中有几次用玻璃棒搅拌，每次搅拌的方向是一致的；但每次搅拌的强度不同，请就此予以说明。

（1）提取鸡血细胞核内物质时，应搅拌，目的是。

（2）向含核物质的2mol/L NaCl 溶液滴加蒸馏水析出DNA粘稠物时，应搅拌，目的是。（3）DNA粘稠物再溶解于2mol/L NaCl 溶液时，应搅拌，目的是。（4）用95%的冷却酒精提取含杂质较少的DNA时，应搅拌，目的是。

[（1）快速；加速血细胞破裂（2）轻缓；尽量保持DNA分子的完整性（3）轻缓；尽量保持DNA分子的完整性（4）轻缓；保持DNA分子的完整性] ．以下是有关DNA的粗提取实验的阅读材料：

a．核酸极不稳定，在较为剧烈的化学、物理因素和酶的作用下很容易降解。在制备DNA时要加入DNA酶（水解DNA的酶）的抑制剂柠檬酸钠，以除去Mg，防止DNA酶的激活。b．核酸中的DNA和RNA在生物体内均以核蛋白（由核酸和蛋白质组成）的形式存在，DNA核蛋白在1 mol/L NaCl 溶液中溶解度很大，但在0.14mol/L NaCl 溶液中溶解度很低；而RNA核蛋白溶于0.14mol/L NaCl 溶液。

c．用苯酚处理，可使蛋白质变性，且留在苯酚层内；在DNA溶液中加入2．5倍体积，浓度为95%的酒精，可将DNA分离出来。此时DNA十分粘稠，可用玻璃棒搅成团取出。d．DNA在强酸性环境下，水解产生脱氧核糖等小分子物质，它与二苯胺酸性溶液反应，能生成蓝色化合物。

e．实验材料与器械：柠檬酸钠溶液、石英砂、0.14mol/L NaCl 溶液、1 mol/L NaCl 溶液、苯酚、95%的酒精、二苯胺试剂、浓硫酸、花椰菜、研钵、烧杯、漏斗、玻璃棒、量筒、石棉网、酒精灯、吸管、试管等。

以下是DNA粗提取实验的步骤，请根据以上阅读材料回答有关问题：（1）研磨：取10克花椰菜加适量的、和石英砂，研磨成匀浆。（2）过滤。（3）将滤液稀释6倍，其目的是：。（4）离心处理，产生沉淀。

（5）取沉淀物，置于2毫升1 mol/L NaCl 溶液中，使DNA核蛋白再次溶解，再加2毫升苯酚充分震荡后静止，待其分层后弃其上层苯酚。这一步的目的是除去。（6）如何将剩余溶液中的DNA提取出来？。（7）如何证明提取物质确实是DNA分子？。

其实验过程的要点是向放有DNA的试管中加入适量该试剂，混合均匀后，将试管置于中5min，待试管后，观察试管中的颜色变化。这个实验也说明DNA耐温，前次温度有利于，后次温度则有利于DNA。

[（1）柠檬酸钠溶液、1 mol/L NaCl 溶液（3）使DNA核蛋白溶解度降低而析出（5）（DNA核蛋白中的）蛋白质（6）向下层溶液中加2．5倍体积，浓度为95%的酒精，此时用玻璃棒搅动，玻璃棒上成团的物质即是DNA（7）用适量浓硫酸处理提取物，再滴加二苯胺酸性溶液数滴，如有蓝色物质出现即可证明提取物为DNA。沸水浴；冷却；高；加快染色反应的速度；析出。] ．“DNA的粗提取与鉴定”实验中，A、B、C、D、E五个小组除下表中所列处理方法不同外，其他操作步骤均相同，而且正确，但实验结果却不同。组别

实验材料

提取核物质时 加入的溶液

去除杂质时 加入的溶液

DNA鉴定时 加入的试剂

A

鸡血

蒸馏水

95％的酒精(25C)

二苯胺

B 菜花

蒸馏水

95％的酒精(冷却)双缩脲，C 人血浆

蒸馏水

95％的酒精(冷却)

二苯胺

D

人血细胞

2mol／L的氯化钠

0．14mol／L的氯化钠

双缩脲

E

鸡血

蒸馏水

95％的酒精(冷却)

二苯胺

(1)实验材料选择错误的组别是。其原因是。

(2)实验步骤(不包括实验材料)均正确，但得不到DNA的组别是。

(3)沸水浴中试管颜色变蓝的组别是；蓝色较淡的是，其原因是。(4)B组实验不成功的最主要原因是。[(1)C、D 人的血浆中没有细胞结构，成熟的红细胞中没有细胞核，选用这些材料得不到DNA或得到的DNA很少

(2)C(3)A、E A 冷却的酒精对DNA的凝集效果较佳，该组使用的是25℃的酒精

(4)菜花细胞在蒸馏水中不能被破坏，得不到DNA(应采用研磨的方法)] ．在“DNA的粗提取与鉴定”的实验中，有同学按书本知识和自己的思路，试做了如下实验，请你判断实验结果。

(1)他把与柠檬酸钠混合的新鲜血液放在几层纱布上过滤，纱布上最主要的结构是。

(2)他在含有DNA、RNA及蛋白质等的混合物中加入大量的物质的量浓度为2．0mol/L的氯化钠溶液后，通过搅拌后，放在几层纱布上过滤，他得到的滤液中一定含有实验目的中需要提取的成分是。

(3)他在上述滤液中加入冷酒精(体积分数为95％)，并用玻璃棒向—个方向搅拌，溶液中的丝状物的主要成分是。

(4)他把含有DNA、RNA、蛋白质与氯化钠的混合溶液稀释成物质的量浓度为0．14mol/L的氯化钠溶液后，放在几层纱布上过滤，他得到的滤液中含量最多的成分是。[血细胞

DNA DNA 水] ．请利用如下实验材料做相关实验，再选择其中的一种实验材料，设计一个实验，以展示你的科学素养和创新才能。

(1)如用上述材料做观察植物细胞的有丝分裂、叶绿体中色素的提取和分离、观察植物的向性运动等实验。你选择的最佳材料依次是(填图中序号即可)。

(2)如用紫色洋葱表皮做完细胞的质壁分离及复原实验后，又用此装片观察细胞分裂，结果未观察到处于分裂期的细胞。请解释原因。(3)创新实验设计方案

实验课题：探究镍为植物生活所必需的矿质元素

材料用具：完全营养液甲、缺镍的完全营养液乙、适当的容器和固定材料、长势相似的玉米幼苗，含镍的无机盐。方法步骤： ①； ②； ②。

实验预期：。

为进一步验证镍元素一定是必需元素．还应增加的实验步骤及结果是：。

[（1）①⑤③（2）高度分化的细胞一般不能继续分裂（3）①取长势相似的等量玉米幼苗，编为甲、乙两组；②甲组用营养液甲培养，乙组用营养液乙培养，其余条件均相同且适宜；③定期观察并记录两组幼苗的生长情况。实验预期：①若两组长势相似，则镍不是玉米生活所必需的营养元素；②若甲组生长正常，乙组生长不良，则镍是玉米生活所必需的营养元素。在乙组缺镍的培养液中加入适量含镍的无机盐，若症状在不久后消失，则镍一定是玉米生活所必需的营养元素。]