基因工程 简答题总结

第一篇：基因工程 简答题总结

基因工程原理复习题思考题

5、简单叙述同尾酶和同裂酶的差别。

同尾酶：来源不同，识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端，连接后不能被相关的酶同时切割。

同裂酶：识别序列相同，切割位点有些相同，有些不同。分完全同裂酶和不完全同裂酶（PS：完全同裂酶：识别位点和切点完全相同。不完全同裂酶：识别位点相同，但切点不同。）

6、连接酶主要有哪些类型？有何异同点？影响连接酶连接效果的因素主要有哪些？ 类型：DNA连接酶和RNA连接酶 异同点：

相同点：都能以DNA为模板，从5'向3'进行核苷酸或脱氧核苷酸的聚合反应。

不同点：DNA聚合酶识别脱氧核糖核苷酸，在DNA复制中起作用；而RNA聚合酶聚合的是核糖核苷酸，在转录中起作用。

7、试分析提高平端DNA连接效率的可能方法。（传说中的网上答案）

1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。

2、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。

3、足够多的载体和插入片段是最重要的。

4、平端的连接对于离子浓度很敏感

5、尽可能缩小连接反应的体积

6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好

8、基因工程中常用的DNA聚合酶主要有哪些？ 1）大肠杆菌DNA聚合酶 2）Klenow fragment 3）T7 DNA聚合酶 4）T4 DNA聚合酶

5）修饰过的T7 DNA聚合酶 6）逆转录酶

7）Taq DNA聚合酶

第四章 基因克隆的载体系统

1、作为基因工程载体，其应具备哪些条件？

具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；

具有合适的筛选标记；

具有较高的外源DNA的载装能力；

具有多克隆位点（MCS）；

具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。

3、载体的类型主要有哪些？在基因工程操作中如何选择载体？

基因工程中常用的载体(vector)主要包括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和病毒(virus)三大类。这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。

4、质粒转化原理，影响转化率的因素有哪些？ A、化学法（CaCl2法)转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。

B、电穿孔转化转化原理：将待转化的质粒或DNA重组连接液加在电穿孔转化仪的样品池中，两极施加高压电场，在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。影响转化率的主要影响因素: 1）载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高； 2）插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低； 3）受体细胞的类型及预处理； 4）转化方法：电击法高于化学法。

5、重组体分子的选择方法主要有哪些？并简单阐述其原理。

从总体上看，重组体分子的选择与鉴定方法基本上可以分为如下几个类型：（1）基于载体遗传标记检测法

在构建基因工程载体系统时，载体DNA分子上通常携带了一定的选择性遗传标记基因，转化或转染宿主细胞后可以使后者呈现出特殊的表型或遗传学特性，据此可进行转化子或重组子的初步筛选。

（2）基于克隆DNA序列检测法

Southern印迹杂交：根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过与已标记的单链DNA探针的杂交作用以检测这些被转移的DNA片段。

（3）基于外源基因产物检测法

如果目的基因产物能降解某些药物使菌株呈现出抗性标记，或者基因产物与某些药物作用是显颜色反应，则可根据抗性或颜色直接筛选含目的基因的克隆子。

第五章基因的克隆一般方法

1、基因的克隆方法主要有哪些？并阐述其克隆原理（至少3种，都是书上找的，自选哈，建议必选DD RT-PCR和SSH，原因请看下题）？ 1）差减杂交（SH）

通过DNA复性动力学原理富集目的基因序列，并以此构建减数文库的方式来进行目的基因分离克隆的。

2）抑制性差减杂交（SSH）

SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。3）差异显示PCR（DD RT-PCR）

利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。4）DNA代表性差异分析（DNA RDA）

代表性差别分析是通过突变型（驱赶DNA，driver DNA）与野生型（检测DNA，tester DNA）基因组之间的差异来分离和鉴定突变基因的方法。5）扩增限制性片段长度多样性（AFLP）

基因组DNA经过限制性内切酶消化后，产生粘性末端。使用人工合成的短的双链接头，该接头一端具有同样的内切酶识别粘性末端，互补连接后成为DNA模板。接头和与接头相邻的酶切片断的几个碱基序列作为引物的结合位点。[

2、简单阐述差异显示PCR克隆基因的原理及其优缺点，有何应用？

主要原理：利用真核生物mRNA结尾处有POLY（A）结构，在其3`端设计象5`-T11GA样引物，该引物可与mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合5`端的随机引物（20条10-mer），可以使不同长度的基因得到扩增。优点：

 简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。 所需的mRNA量少。

 各样本mRNA的差异可同时进行比较。

 扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛选等。缺点：

 假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。 工作量大。 无法定量研究。

 扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列，提供的信息较少。利用该技术，目前已有越来越多的差别表达基因得以分离和鉴定，在分子生物学和基因工程研究领域发挥了极大的作用。（P221）

3、抑制性差减杂交的原理与应用。

原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤结合为一体的技术。其中标准化步骤均等了检测子中的cDNA单链丰度，而消减杂交步骤去除了检测子和驱赶子之间的共同序列，使检测子和驱赶子之间不同的序列得到扩增。应用：  基因突变体的研究：如基因的表达与不表达；  基因时空表达的研究：如根、茎、叶；  不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。

4、酵母双杂交技术、噬菌体表面展示技术的原理。

A．酵母双杂交技术原理：大部分真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分隔开的结构域，一个是DNA特异结合域（DNA-binging domain,BD），一个是转录激活域(transcriptional activation domain,AD)。这两个结构域各具功能，互不影响，但一个完整的、具有激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域，否则无法完成其激活功能。不同来源的激活因子的BD区与AD区结合后则能特异地激活BD结合基因的表达。

B．噬菌体表面展示技术原理：当外源DNA片段插入丝状噬菌体基因组的一个外被蛋白基因中时，如果两者读码框结构保持一致，这个外源DNA片段所编码的产物可与此外被蛋白一起以融合蛋白的形式表达，并显示在噬菌体的表面。利用抗此外源基因编码产物（多肽或蛋白）的抗体，通过亲和纯化，就能从大量的噬菌体中富集、分离出含有所要的基因的融合噬菌体。然后，通过基因扩增，得到大量所要的目的基因。

5、T-DNA标签法克隆基因的一般技术路线。

 农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。 建立突变体基因组文库及野生型基因组文库. 用T-DNA片段做probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。

 用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。 把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。

第七章克隆基因的表达

1、通过比较，分析大肠杆菌表达系统和酵母表达系统各有何优缺点。大肠杆菌表达外源基因的优势：

全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架； 基因克隆表达系统成熟、完善；

繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定； 被FDA批准为安全的基因工程受体生物。大肠杆菌表达外源基因的劣势：

缺乏对真核生物蛋白质的复性功能； 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统；

内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白； 周质内含有种类繁多的内毒素。甲醇酵母表达系统的优点：

 具有强的受严格调控的AOX1启动子  表达蛋白的翻译后的加工和修饰  营养要求低，工业化生产成本低  可高密度发酵

 表达蛋白可存在于胞内和胞外

酵母表达系统的缺点：酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题（这个找不到，百度的）

2、如何提高克隆基因的表达水平？ 1）、表达载体的优化设计； 2）、提高目标基因mRNA和目标基因产物的稳定性； 3）、密码子偏爱性； 4）、表达环境条件的优化。

3、克隆基因目的蛋白的表达的形式主要有哪些类型？ 表达蛋白按溶解特性通常包括：不溶性蛋白和可溶性蛋白两类，具体包括如下几种结构形态：包涵体型蛋白、融合型蛋白、分泌型蛋白

5、表达载体和基因工程一般克隆载体在元件构成上有何差别？ 表达载体：启动子；终止子；核糖体结合位点（SD序列）；筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点

克隆载体：筛选标记；复制子（质粒拷贝数）；多克隆位点

第八章植物基因工程

2、外源基因导入植物的方法主要有哪些？  物理方法：电击法、基因枪法(biolistic)、显微注射法、微激光束法  化学方法：PEG介导法、脂质体介导法  生物学方法：农杆菌介导法、花粉管通道法 四．问答题

（一）简答 4．某学生在用EcoR I 切割外源DNA 片段时，出现了星号活性，请分析可能的原因。答：盐离子浓度不对，温度不对，甘油浓度过高。

5．在序列5'-CGAACATATGGAGT-3'中含有一个6bp 的II 类限制性内切核酸酶的识别序列，该位点的序列可能是什么？

答：回文序列是5’-CATATG-3’。

6．下面几种序列中你认为哪一个（哪些）最有可能是II 类酶的识别序列：GAATCG、AAATTT、GATATC、ACGGCA？为什么？

答：GATATC 和AAATTT，因为它们是回文序列。

7．用Klenow酶填补的办法可使5' 黏性末端转变成平末端。这种方法常使DNA 上的某些限制酶的识别位点消失。请问，对于下列限制酶，用这种方法处理会不会使它们的识别序列都消失？BamH I(G↓GATCC)、Taq I(T↓CGA)、BssH II(G↓CGCGC)。答：BssH II 不会。

四、问答题

2．DNA 连接酶的作用特点有哪些？ ①连接反应需要在一条DNA 链的3’末端具有一个游离的-OH, 而另一条DNA 链的5’末端具有一个磷酸基团(-P)的情况下，才能发挥其连接DNA 分子的功能作用，而在末端带有5’-羟基和3’-羟基；5’-磷酸和3’-二脱氧核苷基团的两个DNA 片段之间不起连接作用。②连接反应中需要 ATP 或NAD+ 和Mg2+ 为辅助因子和激活因子； ③ DNA 连接酶不能够连接两条单链的DNA 分子，被连接的DNA 链必须是双螺旋的一部分。④ DNA 连接酶只封闭双螺旋DNA 骨架上的缺口(Nick)，即在双链DNA 的某一条链上两个相邻核苷酸之间失去一个磷酸二酯键所出现的单链断裂，而不能封闭双链DNA 的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的裂口（Gap）。

3．影响DNA 连接酶连接反应的因素主要有哪些？

答：1)反应温度：最佳反应温度37℃，但黏性末端之间退火形成的氢键结合不稳定，连接黏性末

端的最佳温度，一般认为4～20℃比较合适。2)DNA 片段末端：不仅要考虑反应体系中DNA 末端的总浓度，还要考虑载体与插入片段的末端浓度的比例。原则上应保证一个DNA 分子的末端有较高的几率与另一 DNA 分子连接，减少同一个分子两个末端之间的自身连接。载体与插入片段 3：1 ~ 1：3。

3)连接酶浓度：平末端DNA 分子的连接反应，最适酶量大约是1～2 单位；而黏末端DNA 片段间的连接，在同样的条件下，仅为 0.1 单位时，便能得到最佳连接效率。

四、问答题

1．YAC 载体具有什么样的？为什么在克隆大片段时，YAC 具有优越性？ 答：（1）功能性DNA 序列: ①来自于酵母的125bp DNA 片段的着丝点序列(CEN4)。

②来自酵母的自主复制序列(ARS1)，起始在酵母中的DNA 复制。

③来自酵母的端粒序列，它是(5-TGTGGGTGTGGTG-3)的多拷贝重复，它对染色体的复制和维持是必需的。

④在酵母中进行选择的标记基因，URA3（尿嘧啶生物合成基因）和TRP1（色氨酸合成基因）。寄主是这些基因的营养缺陷性，只有带有这些基因的转化体才能在选择培养基上生活

⑤具有细菌的复制起始点和选择标记基因。YAC 载体通常含有ColE1 的ori和氨苄青霉素抗性标记基因，可以在大肠杆菌中复制和繁殖，所以它也是一种穿梭载体。

（2）优越性：YAC 能够容纳长达上千kb 的外源DNA，这是质粒和黏粒办不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色体步移中每次允许更大的步移距离，同时能够减少完整基因组文库所需的克隆数目。

3．举例说明什么是穿梭载体？

答：穿梭载体是含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA 片段的杂种质粒，有两个复制起点和能在两种不同细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主(来回穿梭)。

5.什么是YAC？YAC 克隆载体常出现哪些问题？

答：YAC 即酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosome）的缩写，是人工构建的染色体样大容量克隆载体，基本组成有着丝点、能在细菌和酵母中进行复制的复制起始点和选择标记及端粒。最大DNA 克隆片段可达到2000kb。

问题有：(1)YAC 有嵌合现象，一个YAC 中克隆的DNA 片段可能来自两个或多个不同的染色体。在基因组文库中，嵌合体占克隆总数的10％～60％。

(2)YAC 内部有重组现象，插入的DNA 较大，序列发生重排，导致和原来染色体的序列不一致，重组很难检出。

(3)YAC 还有缺失现象，影响YAC 文库的代表性。(4)YAC 结构和酵母天然染色体结构相似，使用常规方法不易将YAC 和酵母天然染色体分开。(5)构建好的YAC 转化原生质化的酵母菌，转化效率低。(6)建好库后保存方便，但要筛选某个基因时工作量大

6．什么是 BAC？BAC 载体的组成与优缺点有哪些？

①细菌人工染色体（BAC）是从大肠杆菌F 因子改造构建而来的，能够携带大约300kb 的DNA 插入片段。

②载体具有 F 因子的复制起始点（oriS），可使载体维持每个细胞一个拷贝的水平。③载体包括有 4 个维持DNA 复制和拷贝数目的基因，repE, parA, parB and parC。

④具有一个抗生素选择标记基因，和lacZ’基因。在lacZ’基因中组装有一多克隆位点，便于外源片段的插入和蓝白反应筛选克隆子。

⑤插入的 DNA 片段非常稳定，可以在大肠杆菌细胞中维持数百代，而且不易发生重组和从寄主细胞中丢失。

⑥主要缺点是每个细胞中的拷贝数少（1~2 个），使得分离和筛选较为困难。

7．利用pBR322 质粒插入失活分离带有外源DNA 片段的重组克隆的原理是什么？

①外源 DNA 片段插入在pBR322 质粒tetr基因的编码序列内（BamHI）位点，使该基因失活；

②体外重组反应混合物转化大肠杆菌ampstets菌株，并涂布在amp 琼脂平板上，凡获得了pBR322质粒和重组质粒(AmprTets)的寄主细胞都可长成菌落； ③将 amp 琼脂上的菌落原位影印在tet琼脂平板上生长，对比这两个平板的菌落生长情况，凡在amp平板上能够生长而在tet平板上不能生长的菌落，便是属于带有重组体质粒的转化子克隆；挑出这样的阳性克隆，扩增分离带有外源DNA 插入片段的重组体质粒。

8.pUC质粒利用α-互补作用筛选重组子原理是什么？ 答：pUC系列质粒载体是在pBR322 质粒载体基础上改造来的，它用lacZ’基因取代了pBR322质粒载体上的tetr基因。lacZ’基因编码β-半乳糖苷酶的N 末端1-63 个氨基酸(α-肽链)的DNA 片段, 在lacZ’基因内组入了一个多克隆位点（MCS），但不影响lacZ’基因的功能。pUC载体的宿主（E.coli）携带一个编码β-半乳糖苷酶C 端序列的基因片段, 它们本身用这个基因片段产生的β-半乳糖苷酶片段是无活性的, 但它们可以通过α-互补作用在体内相互弥补, 即两部分产物可以结合形成有活性的β-半乳糖苷酶。当pUC质粒引入大肠杆菌中，在含有指示剂X-gal 和 IPTG 的诱导培养基上培养时，菌落成蓝色。如果在MCS 插入外源DNA 片段（基因），破坏了lacZ’基因的功能（插入失活），不再产生α-肽链，不能和宿主细胞产生的多肽片段形成有活性的β-半乳糖苷酶，形成的菌落是无(白)色的。因此，根据这种β-半乳糖苷酶的显色反应，便可以检测出含有外源DNA 插入序列的重组体克隆。

9．自然界中具备理想条件的质粒载体为数不多，即使是ColE1 和pSCl01 这两个自然质粒也不尽如人意，通常需要进行改造。请问质粒改造包括哪些基本内容? 答：

基本内容包括：

(1)删除一些非必要的区段及对宿主有不良影响的区段；削减载体的分子质量，使载体具有更大的容纳外源片段的能力。(2)加上易于选择或检测的标记。

(3)限制性内切核酸酶的酶切位点的改造，便于外源基因插入到载体中的特定位置。(4)加上一些调控元件，有利于克隆基因的表达。(5)安全性改造，限定载体的宿主范围。

10．质粒制备的基本原理？

答：带有质粒的细菌细胞在SDS 作用下裂解，并在碱性条件下使DNA 变性。调节pH 值至中性时质粒DNA 首先复性，而细菌基因组DNA 不能复性而与SDS-蛋白质形成复合体，可以被离心沉淀除去。上清液中的质粒DNA 分子可被酒精沉淀或其他方法沉淀纯化出来。

四、问答题

1．λ噬菌体DNA 被包装到噬菌体的头部需要哪些基本条件？为什么？

答：①两个cos位点；②线性DNA；③分子大小在λ噬菌体基因组的75%～105%。2．为什么野生型的λ噬菌体DNA 不宜作为基因工程载体? 答：(1)噬菌体DNA 没有容载能力，因为噬菌体的头部对DNA 包装的量是有限制的，不能大于基因组的105％，所以要将λ噬菌体改造成载体，必须削减本身的分子大小；(2)野生型的λDNA 对于一些常用的酶都有多个识别和切割位点，不便于克隆；(3)没有可供选择的标记；

(4)野生型的λ噬菌体具有感染性，因此不够安全。4．λ噬菌体载体具有哪些优点与不足? 答：优点：(1)λ基因组中有1／3 的非必需区可以被置换。改造成载体后，克隆的片段较大(可达20kb)，而质粒载体的克隆片段只有几个kb；

(2)用噬菌体λDNA 作为载体，即使不进行体外包装，转染的频率也比质粒转化的效率高，包装后的效率就更高了；

(3)λ可通过溶原化反应整合到寄主染色体上，当不需要外源基因大量表达时，可让它以溶原性存在，若要表达，可通过诱导即可进入裂解途径，释放出大量的噬菌体，得到的重组DNA 的拷贝数就会很多。

缺点：(1)包装比较麻烦，包装率不稳定，购买包装蛋白的费用高；(2)没有质粒的用途广泛。

5．以置换型λ噬菌体作为载体进行克隆时，为什么说能够形成噬菌斑的就一定是重组体? 答：改造的置换型噬菌体载体，重组入外源片段之后，总体积不能超过入基因组的105％，不能小于又基因组的75％。以置换型λ噬菌体DNA 作为载体，首先要分离左、右两臂同外源DNA 重组。如果没有外源片段，仅是两臂连接，长度短于久基因组的75％，不能被包λ噬菌体颗粒，就不能感染寄主，也就不能形成噬菌斑。如果插入了外源片段后，总长度超过λ基因组105％后，也不能包入噬菌体颗粒，自然也不能形成噬菌斑。6．M13 系列载体具有哪些优缺点? 答：M13 克隆系统具有很多优点：

(1)克隆的片段大：M13 噬菌体的DNA 在包装时不受体积的限制，所以容载能力大。有报道，有些噬菌体颗粒可以包装比野生型丝状噬菌体DNA 长6～7 倍的 DNA(插入片段可达40kb)。

(2)可直接产生单链DNA，这对于DNA 测序、DNA 诱变、制备特异的单链DNA 探针都是十分有用的。

(3)单链DNA 和双链DNA 都可以转染宿主，并可根据人工加上的选择标记进行筛选。M13 克隆系列的不足：

(1)较大的外源片段插入后，在扩增过程中往往不够稳定。一般说，克隆的片段越大，发生丢失的概率越大。

(2)单链载体分子感染的细胞中，往往是单链和双链混杂，分离双链比较麻烦。

7．黏粒载体具有哪些特点与不足? 答：主要特点有：

①柯斯质粒是含有λ噬菌体 COS 位点的质粒载体。柯斯质粒具有质粒的复制子，进入寄主细胞后能够像质粒一样进行复制，并且能够被氯霉素扩增。②具有质粒载体的抗生素抗性基因的选择标记和克隆位点。

③插入片段的消化、连接及后来重组克隆的纯化与质粒载体相同。

④具有λ噬菌体的包装和转导特性。与质粒载体转化细菌细胞不同，重组体像λ载体一样，需体外包装后转染细菌。

⑤包装后形成的λ颗粒用来感染大肠杆菌，重组DNA 像λ DNA 一样注入细菌细胞，并以COS位点环化。由于缺乏λ的其他DNA 序列，环化DNA 在细菌体内以质粒一样维持。⑥简化了筛选。载体体积小，承载外源 DNA 片段大。如果载体的分子质量在5kb 的话，得到的转导子几乎排除由载体自连的可能性，因为要被成功包装，至少要7 个分子的载体自连。尽管如此，也是不能被包装的，因为COS 位点太多了。重组体只有达到32-45kb 才能有效包装体外包装，这就提供了对重组体的正向选择。⑦对转化体的选择是基于载体上的抗生素标记。⑧感染后形成菌落，而不是噬菌斑。黏粒载体也有如下不足：

①如果两个黏粒之间有同源序列，可能会发生重组，结果会使被克隆的片段重排或丢失。②含不同重组 DNA 片段的菌落生长速度不同，会造成同一个平板上菌落大小不一。另外由于不同大小的插入片段对宿主细胞的作用不同，会造成文库扩增量的比例失调。③包装过程复杂，包装效率不稳定，代价高。

四、问答题

1．怎样将一个平末端的DNA 片段插入到EcoR I 的限制位点中去？ 答：可以化学合成一个连接子（linker），即一段长为lObp含有EcoR I 识别位点的短的DNA 片段，然后与待克隆片段两端连接起来，如果用EcoR I 切割这种连接片段，就会产生EcoR I 的单链末端。这种片段就可以插入到任何EcoR I 的限制性核酸内切酶位点中。

2．构建基因组文库时为什么要对基因组DNA 进行部分酶切？（列举至少两条理由）答：①部分酶切可获得长度适宜的片段（如获得中等长度的酶切片段）；②部分酶切可保证切出的DNA 片段内部依然保留了部分限制酶位点，便于后续的克隆分析。3．什么是基因组文库(genomic library)？它同遗传学上的基因库有什么不同? 答：基因组文库是用基因工程的方法，人工构建的含有某一生物基因组DNA 的各种片段的克隆群。

包括下列过程：高分子质量染色体DNA 的制备；体外重组连接；将重组DNA 导入寄主细胞并扩增；筛选。

基因组文库同遗传学上所讲的基因库是完全不同的概念。基因库(gene poo1)是指在进行有性生殖的某一群体中，能进行生殖的个体所含总的遗传信息。在基因组文库的构建中，由于使用的载体不同，分为噬菌体载体和黏粒载体构建的基因组文库、YAC 文库、BAC 文库等。

4．什么是cDNA文库？同基因组文库有何差别? 答：同mRNA 互补的DNA 称为cDNA。cDNA文库是以某一生物的总mRNA 为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成一互补的DNA，即第一链，破坏RNA 模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到的双链DNA 称为cDNA。选用适合的载体，将合成的cDNA重组导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库是不可能构建得十分完全的，也就是说，任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物的全部编码基因。cDNA文库与基因组文库的主要差别是：

(1)基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA 序列；cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。

(2)基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响；cDNA文库克隆的是不完全的编码 DNA 序列，因它受发育和调控因子的影响。

(3)基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子；而cDNA克隆的是不含内含子的基因。

6．如何使用甲基化酶对克隆DNA 进行保护？有什么意义？

答：在构建基因文库时，可用与接头中限制性内切核酸酶相应的甲基化酶对克隆DNA 先进行甲基化修饰，将插入片段上该酶可能的识别序列先行保护起来。

意义：用这种方法，不仅保护了插入片段的大小不会改变，又有利于插入片段的回收，因为插入片段中特定限制性内切核酸酶的识别位点被保护起来，重组后可以用特定的限制性内切核酸酶将插入片段回收。

8．某一质粒载体具有Tetr和Kanr的表型，在Kan抗性基因内有一Bgl I 的酶切位点。现用Bgl I 切割该载体进行基因克隆，问：①转化后涂皿时应加什么样的抗生素? ②培养后长出的菌落具有什么样的抗性基因型? ③如何利用抗性变化筛选到含有插入片段的重组体? 提示：①加四环素； ②TetrKans和TetrKanr；

③重新点种在含Tet、Kan和只加Tet的平板上，选择只在Tet平板上生长的菌落，即为所 需的重组体。

9．限制性内切核酸酶BamH I 和Pst I 切割某一DNA 序列，结果如下所示。5’------G↓GATCC-------3’BamH I------G GATCC------3’------CCTAG↑G------5’------CCTAG G------5’------CTGCA↓G------3’Pst I------CTGCA G------3’------G↑ACGTC------5’------G ACGTC------(1)指出被切割DNA 分子的5’端和3’端；

(2)如果你将切割后的DNA 同DNA 聚合酶、4 种dNTP在一起温育，这些DNA 末端会有什么样的变化?(3)经过(2)中的反应后，你还能够用T4 DNA 连接酶将BamH I 末端连接起来吗？Pst I 末端呢？(T4 DNA 连接酶能够连接平末端和黏性末端。)(4)在(3)中的连接后，能够重新形成BamH I 位点吗？Pst I 位点呢？为什么？ 答：(1)切割后分子的5’和3’端(如图示)：

(2)如图所示，BamH I 的末端能够被DNA 聚合酶填补，而Pst I 的末端却不能。这种差异是由DNA聚合酶的作用条件所决定的：dNTP只加到具有3'-OH 的引物上，并且要有一条保证正确添加的模板链。BamH I 的末端可以满足这些条件，但Pst I 的末端却不能，因其具有隐蔽的5’端，这种末端是不能作为引物的，故不能被填补。

(3)如图所示，平末端化的BamH I 末端和未被修饰的Pst I 末端二者都能被T4 DNA 连接酶连接。

(4)连接处理过的末端可以再产生Pst I 的位点，但不会产生BamH I 的位点（画图说明）。切割、填补末端并重新连接，常会产生新的限制酶酶切位点，这些位点对于进一步的操作有时是有用的。

10．从基因组DNA 文库中分离的一段DNA（如下图所示），其中有一编码基因（黑框），图中给出了几种限制性内切核酸酶的作用位点。该图同时给出了用作表达该基因的表达载体，弯曲箭头是启动子的转录方向，并给出了几种酶的作用部位。请根据此图，回答下列问题：

(1)给出限制性内切核酸酶Pst I、BamH I、EcoR I、HindH I 和Cla I 所在部位的遗传学名称。(2)如果你打算用该表达载体表达DNA 片段中的基因，该片段应如何插入表达载体？(3)如果只想表达该基因的一部分，以获得部分表达的蛋白质用于制备抗体，应如何操作?(4)如果你需要将整个基因在表达载体中表达，应如何操作？是用单酶切还是双酶切？ 答：(1)多接头区域（MCS）,也叫多克隆位点。(2)主要是插入的方向问题。因为启动子的转录方向必须与基因的方向一致，所以该DNA 必须倒转180°插入，即5’端必须紧挨启动子。

(3)用EcoR I 切割载体和基因组DNA，用连接酶重组后筛选重组体，通过测序确定正确方向的重组体进行蛋白质表达。

(4)可用Pst I 和Hind III 双酶切割基因组DNA 和表达载体DNA，这种切割可将基因组DNA 片段定向克隆入表达载体。’

四、问答题

1．构建表达载体应注意些什么？

答：(1)构建表达载体的关键是用于表达克隆序列的启动子类型，如果目的是基因的高效表达，就要选用强的启动子；如果表达产物对寄主细胞有毒性，可选择弱的启动子，最好使用可诱导型启动子，使在一定的条件下表达。(2)表达载体还应具有以下组成元件：

①携带能在寄主细胞中维持的复制的起始点。②具有抗生素选择标记或其他选择机制。

③在紧接启动子的下游安排限制性位点，用于插入需表达的基因。

④具有单一的酶切位点来克隆基因，克隆位点应位于准确的位置，以使克隆基因有效表达。

3．插入失活法和插入表达法筛选重组体的主要差别是什么？ 答：主要差别是：

(1)插入失活法是直接根据失活基因的表型变化来筛选重组体。

(2)插入表达法是根据一个基因的失活引起另一个基因的表达表型来选择。

4．一个携带有氨苄和卡那霉素抗性基因的质粒被仅在卡那霉素基因中有识别位点的EcoR I 消化。消化物与酵母DNA 连接后转化对两种抗生素都敏感的E.coli 菌株。(1)利用哪一种抗生素抗性选择接受了质粒的细胞？(2)怎样区分接受了插入酵母DNA 的质粒的克隆？ 提示：(1)选择Ampr的转化子；

(2)所需的克隆是Ampr和Kans。任何能够抗这两种药物的克隆都是自连的非重组质粒。

5．用EcoR I 和Hind III 分别切割同一来源的染色体DNA，并进行克隆。在前者的克隆中筛选到A 基因，但在后者的克隆中未筛选到A 基因，请说明原因。提示：因为HindH I 的切点位于A 基因内。

7．用一限制性内切核酸酶切割Lac+ Tetr的质粒载体，已知该酶识别的是4 个碱基序列，并产生有两个碱基突出的单链末端，该酶在lac 基因内有切割位点，并在第二个氨基酸密码子内，该位点可以被任何氨基酸所取代而不影响酶活性。用该酶切割后，用DNA 聚合酶将单链末端补齐为双链的平末端，然后重新连接成环，转化Lac-Tet-受体菌，筛选Tetr转化子，问：Lac 的基因型是什么？并说明原因。提示：基因型是lac—，原因是在该密码子中插入了两个碱基，造成了移码突变，所以Lac 的基因是缺陷的。

10．在基因工程中，为了在细菌细胞中表达真核生物的基因产物，为什么通常要用cDNA而不用基因组DNA? 为什么要在cDNA前加上细菌的启动子？

答：这是因为细菌没有内含子剪接系统，并且不能识别真核生物的启动子的原因。

11．如何根据下面的应用设计探针？

(1)假定你分离纯化了一未知功能的蛋白质，需要确定是何种组织和细胞表达这种蛋白质。(2)假定你获得了绵羊的胰岛素mRNA，如何进一步从人的cDNA文库中获得含人胰岛素的克隆并使之在E.coli 中表达? 提示：(1)首先对该蛋白质进行部分测序，然后根据测得的氨基酸序列设计简并引物。(2)以该mRNA 为模板反转录，得到cDNA，即可进行标记用作探针。

13．单链RNA 作为探针，具有哪些单链DNA 探针所没有的优点？ 答：单链RNA 探针的下列优点是单链DNA 探针所没有的：

(1)RNA／RNA 和RNA／DNA 比DNA／DNA 杂交体具有更高的稳定性。因此，杂交可以在更严格的各件下讲行．杂交后的信号也比较强。

(2)单链RNA 由于不存在互补双链的竞争性结合，所以杂交效率比较高。(3)RNA 中不存在重复序列，所以特异性比较高。

(4)杂交后可用RNase消化掉未杂交的RNA，因此降低了本底。

四、简答题（每题 6 分,共 24 分）

1.酵母作为真核基因的高效表达系统有什么优缺点？克服大肠杆菌表达系统的不足，能繁殖快，高密度发酵，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等例如甲醇酵母系统，利用甲醇作为唯一碳源。乙醇氧化酶将甲醇氧化为甲醛，乙醇氧化酶的启动子是强启动子，编码乙醇氧化酶的基因是 AOX1 合 AOX2.AOX1 基因的表达受甲醇严格调控，诱导表达水平可达 30％以上。

五、问答题（每题 8 分，共 16 分）。

2.基因组文库构建的基本步骤是什么？构建基因组文库需要用到哪些载体？ 步骤①载体的制备；

②高纯度大分子量基因组 DNA（High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取；③ HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）；

④载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；⑤重组克隆的挑取和保存。载体的选择：λ噬菌体，YAC,BAC,粘粒等。

基因文库构建的一般步骤：（1）染色体DNA大片段的制备 ①酶切法 ②物理切割法

（2）载体与基因组DNA大片段的连接 ①粘性末端直接连接 ②人工接头法（3）转导受体（4）筛选重组子

cDNA：以mRNA为模板合成的互补脱氧核糖核苷酸序列。

cDNA文库：某种生物基因组转录的的全部mRNA经反转录产生的各种cDNA分别与克隆载体重组，贮存在一个受体菌的群体中，这个群体就称为cDNA文库。cDNA文库与基因组文库的区别在于cDNA文库是有时效性的。cDNA文库的特点

优点：分离的目的基因可直接用于表达；比DNA文库小的多，容易构建

缺点：只与编码序列有关；不能反映内含子；不能反映启动子、终止子以及与核糖体识别的序列

构建cDNA文库的一般步骤：（1）总RNA（total RNA）提取（2）mRNA的分离纯化

①原理：利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA（rRNA、tRNA等）中分离纯化。

② mRNA的分离纯化 Column（柱）（3）cDNA的合成 ①cDNA第一链合成 ②降解mRNA模板

③cDNA第二链合成（cDNA第二链合成的方法有四种，自身引导合成法，置换合成法，引导合成法和引物－衔接头合成法。）（4）cDNA与载体连接：

（5）噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化（导入宿主中繁殖）

基因的化学合成：寡核苷酸单链的化学合成；探针的化学合成；连接子和接头的合成；基因的半合成；全长基因化学合成 目的基因的分离：

目的序列已知：一般采用PCR技术或分子杂交技术分离克隆目的基因

目的序列未知：差异表达序列；无差异表达的目的序列，可采用文库筛选法、功能蛋白分离法、序列克隆法

第七章高等动物基因工程

1、基因导入细胞内的方法

物理方法：裸DNA直接注射、电穿孔、显微注射

化学方法：磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法、阳离子-质粒复合物法

生物学方法——动物病毒载体：腺病毒、SV40、腺相关病毒、反转录病毒、人牛痘病毒、疱疹病毒等。

反转录病毒（单链RNA病毒）优点：

A、宿主范围广（几乎所有类型哺乳动物细胞）

B、效率高，可以感染大量的细胞，通常一次可以感染106～107细胞

C、外源DNA在整合时不发生重排，单位点、低拷贝整合（一般不超过5个）缺点：

A、只感染分裂细胞

B、携带外源基因的长度有限(8kb)C、载体病毒基因有潜在的致病性，如存在载体与人内源性逆转录病毒（HERV）序列间发生 D、重组而产生有感染能力的人逆转录病毒的潜在危险

第二篇：基因工程

宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

基因工程

摘要：基因工程是20世纪70年代在分子遗传学、细胞生物学基础上发展起来的，是一种可以按照人们的意愿设计、改造和组建生物品种的新技术。包括它通过基因操作，将目的基因活DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状。

关键词：生物技术；基因工程

一、基因工程的诞生：

从20世纪40年代开始，受分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学取得巨大进步，为基因工程的诞生奠定了基础。现在人们公认的诞生日期是1973年，其中现代分子生物学领域上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性作用。

理论上的三大发现包括：第一，20世纪40年代，Avery 在美国的一次学术会上报道了肺炎球菌的转化，证明了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的双螺旋结构以及半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题；第三，20世纪50年代末的“中心法则”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操纵分子学说，并成功的由一批科学家破译了遗传密码从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

以上问题的解决使得人们自主改造生物遗传性状从理论上成为现实。

技术上的三大发明：第一，1967年发现的DNA连接酶，以及1979年发现的具有更高活性的T4 DNA连接酶。在1970年Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化的限制性核酸内切酶HindⅡ和1972年发现的EcoRⅠ核酸内切酶。后来发现的大量的限制性核酸内切酶。第二，一些病毒、质粒和噬菌体等载体技术的发现使把目的基因的导入更加容易。第三，DNA分子序列分析及琼脂糖凝胶电泳、Southern杂交技术的发展使得基因工程的诞生越来越近。1973年，斯坦福大学将抗四环素质粒和抗新霉素的质粒用限制性内切酶切割并连接成重组质粒导入到大肠杆菌中是基因工程诞生的标志。

二、基因工程有几个重要特征：（1）、打破了物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）、通过已知功能基因的遗传转化，进行物种的定向改良；（3）、创造出自然界中本来不存在的物种。

三、基因工程技术流程包括：（1）、目的基因克隆，即从特定生物基因组和cDNA中分离提纯和扩大繁殖目的基因；（2）、选择合适的载体，并对载体DNA进行克隆；（3）、将目的基因与载体宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

连接；（4）、将重组DNA导入到大肠杆菌或酵母菌体内培养；（5）、利用载体上的标记基因进行筛选，获得转目的基因的细胞或植株。

四、基因工程的应用：

（1）基因工程应用于农业生产方面：农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。

（2）基因工程应用于医药方面：目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和核苷酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。

（3）基因工程应用于环保方面：基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性问题：

自基因工程诞生以来，基因工程的安全性问题就受到人们极大的关注，关于重组DNA潜在的危险性问题的争论，在基因工程还处于酝酿阶段的时候就已经开始。争论的焦点是担心基因工程宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：的杂种生物会从实验室溢出，在自然界造成难以抑制的灾难，有害的杂种菌或病毒与化学物质不同，它们会在自然界不断繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美国国立卫生研究院（NIH）在加利福尼亚州的Asilomar 会议中心内，160名来自美国和16个国家的专家学者对重组DNA的危害辩论，虽然与会代表分歧挺大，但最后也达成了一些重要的共识，在1976年6月23日美国NIH制定并公布了《重组DNA研究准则》。为了避免可能造成的危害，除了规定禁止若干类型的重组DNA实验外，还制定了许多具体的规定条文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技术是继工业革命、信息革命之后 对人类社会产生深远影响的一场革命。它在基因制药、基因诊断、基因治疗、基因芯片和基因克隆等技术方面取得的革命性成果，将极大地改变人类生命和生活面貌。

参考文献：

1、基因工程/楼士林，杨盛昌，龙敏南等主编.—北京：科学出版社，2002

2、基因工程技术/钟卫鸿主编.—北京：化学工业出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主编.—北京：科学出版社，2008

4、基因工程原理与技术/刘志国主编.—2版.—北京：化学工业出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法与应用/徐煜泉等编著.—北京：北京大学出版社，2008.12

第三篇：基因工程

《基因工程论文》

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

学

院：生命科学学院 班

级：生物技术12-2 学

号：7011208209 姓

名：陈 昆 任课教师：张锐

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

摘要﹕从以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长的解烃菌———地芽孢杆菌MD-2细胞中获得了1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA。将基因sladA克隆到质粒pSTE33上,构建了重组质粒pSTalk。通过电转化将pSTalk转化入嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3内,构建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜热和解烃的功能,在70℃条件下,14d后对原油的降解率达75.08%。研究结果表明,可以通过体外重组的方式向嗜热菌中引入烃降解基因,从而构建嗜热解烃基因工程菌。关键词:微生物采油;烃类降解菌;嗜热解烃基因;质粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要机理之一。研究结果表明,在解烃菌作用下原油的族组分发生变化,轻质组分增加,粘度下降,改善了原油的流动性;同时,解烃菌还可以将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质。迄今为止,从自然界筛选的高效解烃菌绝大多数为嗜温微生物,最适合生长温度一般为20-45℃,很难适应油藏的高温环境。笔者从1株解烃菌细胞中分离出1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段将此基因转化到另外1株最适合生长温度为70℃的嗜热菌体内,构建了嗜热解烃基因工程菌SL-21。该基因工程菌既具有高效的解烃功能,又能适应油藏高温环境,在微生物采油中具有良好的应用前景。1.1 实验材料

实验材料包括限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR片断回收试剂盒;大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α;pGEM-T easy载体;质粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培养基按文献配制。无机盐培养基组成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸馏水100mL;pH值为7.2。嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3,分离自胜利油区孤岛油田中一区馆3区块采出液,最适合生长温度为70℃;地芽孢杆菌MD-2,以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长,分离自胜利油区原油污染土壤。1.2 实验方法

DNA的操作 基因组DNA小量提取,利用聚合酶链式反应(PCR)对DNA扩增、PCR产物的回收、酶切与连接,质粒DNA提取和基因序列测定等均按文献[13-14]方法进行。菌株培养 所涉及到的菌株培养均在温度为70℃,转速为180r/min的条件下进行振荡培养。基因工程菌的构建和筛选方法 ZJ-3感受态细胞的制备按文献[13-14]方法进行。用构建的重组质粒pSTalk在最佳条件下电转化ZJ-3感受态细 胞构建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB琼脂平板上挑选10个阳性克隆接种到5mL LB培养基中,培养过夜,获得种子液。将该种子液接种到200mL以液蜡为惟一碳源的无机盐培养基中,培养5d后用CCl4抽提剩余的液蜡,用红外测油仪测定烃的剩余量,根据菌株降解液蜡的速率筛选出目的基因工程菌。基因工程菌的诱导表达及SDS-PAGE检测挑取阳性克隆接种于含100μg/mL Amp的10mL的LB液体培养基中,180r/min下振荡培养至光密度值达到0.6(检测光波波长为600nm),加诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,振荡培养8h,收集表达菌体,加SDS上样缓冲液,于100℃水浴10min后上样,用12%的SDS-PAGE电泳检测。基因工程菌降油能力测试 将基因工程菌接入20mL LB培养基中,培养12h,以5 000r/min的速度离心5min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体1次,加20mL无菌生理盐水悬浮,作为菌株利用烷

烃生长的种子液。取菌悬液按1%接种量接入200mL无机盐培养基中,加入2%孤岛油田中一区馆3区块原油或2%的液体石蜡作为惟一碳源培养,取样稀释涂布计数。原油降解实验 在无机盐培养基中添加2%的原油,按1%接种量接入基因工程菌,培养14d。用正己烷萃取降解后的原油,用气相色谱仪测定原油饱和烃组分的降解情况。原油降解率为菌株降解前、后原油量的差值与菌株降解前原油量的比值。2 实验结果与分析

2.1 MD-2基因组DNA的检测

对MD-2基因组进行提取和纯化。提取后的染色体DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,相对分子质量不小于23kb,说明提取的DNA完好。在检测光波波长为260280nm条件下分别测出DNA的光密度,其比值为1.95,换算出DNA的质量浓度为1 400g/mL,表明DNA纯度较好,无蛋白、RNA、酚和多糖物质的干扰。2.2 烷烃单加氧酶基因的克隆与序列分析依据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)中的烷烃单加氧酶基因开放阅读框两端保守序列,设计了一对兼并引物以MD-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,将约1.3kb的PCR产物回收后连接到pGEM-T easy载体上,转入E.coliDH5α,挑取阳性克隆质粒进行测序。测序结果经Genbank检索,表明该DNA序列是个新的烷烃单加氧酶基因,命名为sladA。2.3 基因工程菌的构建及筛选

通过PCR扩增sladA后,将PCR产物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分离纯化出1 329bp的片断,与经EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33质粒连接,构建成含sladA的重组质pSTalk。经电泳鉴定表明(图1),重组质粒构建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的诱导表达

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE图谱可见(图2),在烷烃单加氧酶基因sladA对应蛋白大小的地方扫描到高信号强度,表明sladA基因在SL-21中得以表达。2.5 基因工程菌SL-21碳源生长

基因工程菌SL-21在以原油和液体石蜡为惟一碳源的无机盐培养基中培养,在70℃和180r/min条件下,经过3d的延滞期后进入对数期,菌体数增加。17d后,菌体数为接菌初期的5倍,表明SL-21能够利用原油或液体石蜡作为惟一碳源生长。2.6 对原油的降解作用

由原油饱和烃组分的降解情况可看出(图3),基因工程菌对原油有很明显的降解效果,几乎将饱和烃降解完全。经对气相色谱各峰面积对比,计算出各峰面积的含

量和饱和烃组分降解率(表2)。基因工程菌SL-21对原油的降解率为75.08%。

实验结果表明,烃类降解菌地芽孢杆菌MD-2细胞提取的烷烃单加氧酶基因sladA可以在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中表达。但不同的基因工程菌株中烷烃单加氧酶基因sladA表达的效率不同,需要通过菌株对原油的降解评价进一步筛选。获得的对原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高温条件下生长,并且对原油降解效果明显。因此以体外重组方式向嗜热菌中引入烃类降解基因构建嗜热解烃基因工程菌在技术上是可行的。3 结论

以地芽孢杆菌MD-2为目标菌株,克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因sladA,并在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中正确表达了基因sladA,构建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃条件下,能以原油或液体石蜡为惟一碳源生长。14d对原油的降解率为75.08%,对原油饱和烃组分均有明显的降解效果。该基因工程菌既可以用于微生物驱油技术,又可以用于高温油田污水的生物处理。利用基因工程的方法可以获得既能耐受极端环境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌种选育的重要方向。参考文献: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烃降解菌的筛选及性能研究[J].大庆石油地质与开发,2007,26(6):119-123.[2] 汪卫东,汪竹,耿雪丽,等.美国微生物采油技术现场应用效果分析[J].油气地质与采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁长忠,宋永亭,段传慧.微生物采油用营养物质在石英砂上的静态和动态吸附规律[J].油气地质与采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龙,董汉平,俞理,等.微生物提高采收率数值模拟研究现状[J].油气地质与采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花丽.本源微生物降解原油的饱和烃色谱分析[J].油气地

质与采收率,2008,15(1):77-79.[6] 宋智勇,张君,马继业,等.微生物菌液的界面特性[J].油气地质与采收率,2008,15(3):73-75.[7] 蒋焱,曹功泽,赵凤敏,等.聚合物驱后微生物提高采收率的可行性分析[J].油气地质与采收率,2008,15(5):63-65,68.[8] 陈爱华,方新湘,吕秀荣,等.克拉玛依油田内源微生物驱油机理探索[J].油气地质与采收率,2008,15(5):75-77.[9] 宋绍富,刘菊荣,张忠智.微生物采油替代营养源的研究[J].油气地质与采收率,2007,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驱替盲端类剩余油的微观实验[J].油气地质与采收率,2008,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2000:143.[12]唐赟,冯露,刘沐之,等.嗜热解烃菌NG80-2的鉴定及其特[J].南开大学学报,2006,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,译.北京:科学出版社,1992.[14]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4

第四篇：基因工程

基因工程技术的程序与应用

【摘要】基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，它将给人类社会带来一场深刻的变革，我们有必要了解基因工程的概念、原理、技术程序，以及基因工程在农业、工业、医药等方面的应用和进展情况。

【关键词】基因工程技术程序应用进展

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，在分子水平上对基因进行复杂的操作，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技术程序

基因工程的基本原理是在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成镶嵌DNA分子，然后将之导入宿主细胞，使其扩增表达，从而使宿主细胞获得新的遗传特性，形成新的基因产物。它有3个基本的步骤：①从合适材料分离或制备目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段与载体连接作成重组DNA分子。③重组DNA分子引入宿主细胞，在其中扩增和表达。不同种类生物的生物学特性不同，其基因工程在操作上和具体技术上必然有所差异，但技术核心都是DNA的重组，即利用一系列的DNA限制性内切酶、连接酶等分子手术工具，在某种生物DNA链上切下某个目标基因或特殊的DNA片段，然后根据设计要求，将其接合到受体生物DNA链上。

一个完整的用于生产生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：①外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。②适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。③外源基因的导入。④外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。⑤外源基因表达产物的生理功能的检定。⑥转基因新品系的选育和建立以及转基因新品系的效益分析。⑦生态与进化安全保障机制的建立。⑧消费安全评价。

（一）外源目标基因的分离、克隆及功能结构分析

获合乎人类某种需要的取目的基因是实施基因工程的第一步，也是开展一项基因工程的前提和全部工作的核心。目前人们已经能够通过多种途径和方法来获取目标基因，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），1

从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。

（二）构建能在受体生物细胞中表达的重组目标基因

要使一个外源目标基因能整合到受体细胞的基因组中并能在整合后在受体基因组的调控下有效地转录和翻译，就必须事先对目标基因的功能结构用DNA重组技术进行适当的修饰，也就是将目标基因与一种特别的DNA分子重组，这种特别的DNA分子称为基因载体，目前所用的载体主要有以下几类：质粒、λ噬菌体、柯斯质粒、病毒载体、YAC载体等，各类载体具有独特的生物学特性，可用于不同的目标基因。

（三）外源重组目标基因的导入

将重组的外源目标基因转入到宿主细胞中的过程称为基因导入或基因转移。接受外源基因的细胞称为受体细胞。由于受体生物学特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因导入的方法也不同，有的是用载体导入，有的是直接用物理的方法导入。目前使用的有转化、转染、电穿孔导入法、基因枪射入法、显微注射法、脂质体介导法等，向细菌等微生物中导入外源目标基因常用质粒转化和噬菌体转染方法；向植物细胞中导入外源基因常用基因枪注入法和Ti质粒导入法；能由原生质体再生出植株的植物细胞还可以用电穿孔导入法及脂质体融合法；动物的受精卵一般通过人工显微镜注射法导入外源基因；动物的体细胞可用电穿孔法和病毒转染法导入外源基因，但对用于生产目的的基因工程常常避免用病毒转染法。

（四）转基因细胞或个体的鉴别和筛选

在对宿主的细胞进行了外源目标基因导入处理以后，有些细胞可能并没有外源基因的进入，另有一些细胞可能在外源基因进入后因各种原因而不能使外源基因表达，因此必须对被进行了基因转移处理的细胞或个体进行鉴别，以筛选出导入外源目标基因的转基因细胞或个体。鉴别和筛选转基因生物一般在两个层面上进行：一是检测目标基因是否表达，二是检测目标基因是否整合到了宿主的染色体上和能否稳定传代。表达检测的方法主要有转录产物的印迹杂交法、免疫印迹检测法、免疫组织化学检测法等。整合检测可通过DNA分子杂交来确定。

（五）转基因品系的效益分析。

一个生产性能优越的转基因品系，首要的条件是目标基因的表达产物必须有正常的生理功能，另一个必要标志是其目标基因必须有适度的高效表达特性和可持续生产能力。

（六）生态与进化安全保障

由于转基因生物与其他生物一样具有可遗传、易扩散及自主的特性，而且人类对生命、生态系统、生物的演化实际上还知之甚少，对不同物种间基因的人工组合，外源基因对受体生物进化的可能影响，转基因生物对生态系统的长期影响

等都无法进行评估，因此如果人们不事先采取控制措施，转基因生物一旦进入到自然环境中就可能打破生态平衡，破坏生态环境和自然种质资源。对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去；生物的方法一般就是造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离，如利用三倍体不育的特性将用于生产的转基因动物或植物变成三倍体等。

（七）消费安全评价

消费安全评价一般要考虑以下一些主要的方面：①导入外源目标基因本身编码的产物是否安全。②外源目标基因是否稳定。③使用的载体是否安全。④使用的报道基因（就是能产生很容易观察的性状的基因）是否会产生有害物质。⑤外源基因导入后是否会诱导受体生物产生新的有害遗传性状或不利于健康的成分。为了保护人类的健康，许多国家都已通过立法或其他形式对转基因产品进行消费安全评价和严格的管理，对进口转基因食品严格限制。

二 基因工程的应用

基因工程在医药业中的应用。许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。如基因工程胰岛素、干扰素、人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。

基因诊断与基因治疗。遗传病是长期困扰人类的一类不治之症，迄今已发现的有3000多种。其根源于遗传基因存在缺陷，主要特征是可随生育而传代。基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。基本方法是：基因置换、基因修复、基因增补和基因失活等。如运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。

基因工程在农牧业、食品工业上的应用。运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。如转基因鱼（生长快、耐不良环境、肉质好），转基因牛（乳汁中含有人生长激素），转黄瓜抗青枯病基因的甜椒，转鱼抗寒基因的番茄，转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯，不会引起过敏的转基因大豆，抗虫棉等。

基因工程在环境保护工业方面的应用。基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。如有一种超级细菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。这种超级菌是美国科学家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一个菌株内而产生的。

总之，基因工程的发展将会给人类社会带来巨大的变化。

三 基因工程的进展状况

基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，而且也已经取得了许多重要的应用成果，但我们也应该看到，基因工程技术不是一项已经成熟的技术，仍然还很粗糙和原始，在许多方面尚需完善和改进。

1．基因工程在技术上存在一定的不确定性和盲目性。目前的基因工程在技术上有很多的不确定性。这种不确定性表现在两个方面，一是技术方面的不稳定性，二是由于对不同生物的生理特性的了解不很深入，如我们将鱼类抗冻蛋白基因转移到不抗寒的罗非鱼等热带鱼中，虽然抗冻蛋白基因得到表达，但并没有使受体鱼产生预期的抗寒效果。目前我们所进行的基因工程基本上只能对简单的、单基因控制的性状进行设计和改造，操作对象只限于一些比较简单的单因子基因。但生物绝大部分的重要性状是由多个基因共同控制的，对这些多基因控制的性状，现有的基因工程技术几乎仍然是束手无策。我们对活的生物体中基因表达调控的机制知之甚少，有关的知识仅限于对启动子和增强子有所了解，对生物体整体的调节复杂性的认识还刚刚开始。

2．在安全性方面存在着不确定性。对社会大众来说，最主要和最关心的是基因工程的安全性问题，基因工程的安全性问题包括两个方面：一是基因工程产品的消费安全问题，二是转基因生物的生态安全问题。目前用转基因技术生产出来的食品因其成分的某些改变是否会对人类的健康产生不良的影响，这需要实验和时间来验证。有着某种生存优势的转基因生物如果进入到自然生态系统，就有可能排挤自然种群，降低生态系统里物种的多样性，打破生态平衡。

所以我们在大力发展转基因技术的同时，必须高度重视对转基因动物、植物及微生物品种的生物控制和控制技术的研究。在转基因品种的安全性没有进行全面的评估和没有可靠的生物控制措施之前，应严格禁止其进行生产和进入开放的自然生态系统，只有其生态安全性达到了传统育种方法培育的新品种时，或无生殖能力的转基因动物和植物才能允许进入自然界进行生产，也只有这样才是有益于人类和社会进步的。

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第五篇：材料基因工程

材料基因工程

——为什么是一项“颠覆性前沿技术”

1.前言

材料基因组技术是近几年兴起来的材料研究新理念和新方法，是当今世界材料科学与工程领域的最前沿。材料基因工程借鉴人类基因组计划，探究材料结构与材料性质变化的关系。并通过调整材料的原子或配方、改变材料的堆积方式或搭配，结合不同的工艺制备，得到具有特定性能的新材料。但是材料基因组与人类基因组的又有很大的区别，材料的微观结构多样化，不但成分组成可以不同，微观形貌等结构也可能千差万别，其组成-结构-性能之间的关系更加复杂。

2.材料基因组技术

2.1材料基因组技术

材料基因组计划是通过“多学科融合”实现“高通量材料设计与试验”；其核心目标在于通过“高通量计算、实验和大数据分析”技术加速材料“发现-研发-生产-应用”全过程，缩短材料研发周期，降低材料研发成本，引发新材料领域的科技创新和商业模式变革。

材料基因组技术包括高通量材料计算方法、高通量材料实验方法和材料数据库三大组成要素。

2.1.1高通量材料计算方法

高通量计算是指利用超级计算平台与多尺度集成化、高通量并发式材料计算方法和软件结合，实现大体系材料模拟、快速计算、材料性质的精确预测和新材料的设计，提高新材料筛选效率和设计水平，为新材料的研发提供理论依据。其中并发式材料计算方法包括第一原理计算方法、计算热力学方法、动力学过程算法等，跨越原子模型、简约模型和工程模型等多个层次，并整合了从原子尺度至宏观尺度等多尺度的关联算法。

高通量材料集成计算技术利用第一性原理、分子动力学与位错动力学、合金相图计算、相场计算等方法，快速并行模拟实验室中成分与性能优化的传统试错式材料研发过程，并基于材料科学知识，迅速挑选有利于目标性能的合金成分与微观结构特征，从而加速新材料的研发进程并显著降低材料研发成本。

2.1.2高通量材料实验方法

传统材料研发模式依赖于成分与工艺的不断“试错”实验优化，结合对结构-性能关系的不断理解以获得满足性能指标的材料。但是，新型关键材料具有成分多元化、复杂化、微结构多级化等特点，传统的“试错”模式在实际材料开发中不仅耗费巨大，而且几乎难以取得成功。

高通量实验平台是发展材料基因组技术具备的条件之一。高通量实验平台可以为据库提供数据支撑；而就高通量集成计算而言，高通量实验技术为各种计算模拟工作提供计算目标。材料基因组概念中的高通量实验技术具有快速制备快速表征各类金属与非金属样品的能力，典型的高通量实验方法有扩散多元结与材料基因芯片

2.1.3材料数据库

数据可以看作是感兴趣参量的具体数值，这些参量在空间与时间上的一系列数值就构成数据集，不同的数据集结合到一起并按照一定的协议实现相互调用，体量巨大、结构性的数据集就构成大数据。利用物理层面的分布式服务器对随时间不断膨胀的数据集进行存放，利用通讯协议实现服务器中数据集的远程调用与管理，利用专门的算法对不同数据集自身和数据集之间进行分析并提取有价值的信息，并用专门的软件实现数据分析的可视化，就构成了基于大数据方法的材料数据库技术。

材料信息学通过数据管理、数据分析与数据协作，实现从已有数据中提取高价值信息和知识的目的。由于计算材料数据库是综合物理，化学及生物的交叉学科的数据库。因此，材料数据库的建立，有利于减少材料的重复实验和测试，对缩短新材料的研发周期，节约新材料的研发成本具有非常积极的作用

2.2结论

材料计算模拟是实现“材料按需设计”的基础，可以帮助缩小高通量材料实验范围，提供实验理论依据；高通量材料实验起着承上启下的角色，既可以为材料模拟计算提供海量的基础数据和实验验证，也可以充实材料数据库，并为材料信息学提供分析素材，同时还可以针对具体应用需求，直接快速筛选目标材料；材料数据库可以为材料计算模拟提供计算基础数据，为高通量材料实验提供实验设计的依据，同时计算和实验所得的材料数据亦可以丰富材料数据库的建设。

3．结论

材料基因组技术融合了材料科学、固体力学、信息科学、软件工程、先进实验方法等学科，采用数值模拟、数据库及数据挖掘、人工智能等技术研究材料的工艺过程、微/细观结构、性能和服役行为等，阐明成分、微结构和工艺对性能的控制机制，引导并支撑实体材料的研发和应用。

在材料基因工程提出之前，新材料从研发到市场应用实践跨度非常大，某种材料从最初的研究开发，经过性能优化、系统设计与集成、验证、制造再到投入市场通常需要10-20年时间。部分原因是一直以来过度依赖对材料研发的科学自觉与实验判断，目前大部分材料的设计与测试时通过耗时的重复实验完成的、而实际上，有些实验通过理论计算工具就能完成模拟。材料基因工程采用强大的计算分析和理论模拟工具，减少新材料研发和生产过程中对物理实验的依赖。改进的数据共享系统和一体化的工程团队将允许设计、系统工程与生产活动的重叠与互动。这种新的综合设计将结合更多的计算与信息技术，加上实验与表征方面的进步，将显著加快材料投入市场的种类及速度，材料的开发周期可从目前的 10~20 年缩短为 5~10 年。因此说材料基因组技术是一项“颠覆性前沿技术”

参考文献

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