质粒提取常见问题解析

第一篇：质粒提取常见问题解析

质粒提取常见问题解析

涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？

参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。

原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：

1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。

3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！

【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：

1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。

2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】

未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解：

1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。

细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？ 参考见解：

1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。

2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。

3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。

4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。

为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：

1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。

2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下．

3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的ＲＮＡ酶。

4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。

5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。

加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？ 裂解不完全,参考见解：

1、问题可能是发生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？

2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。

3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？ 参考见解：酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？

参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？

参考见解：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？

乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。参考见解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在8.0左右？有时由于溶液III配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开? 参考见解：

1、确认酶的有效性。

2、平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。

3、是否不小心吸入了痕量的酚。

4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。

5、乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。

碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？ 参考见解：碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。提取质粒中RNA没有去除？ 可能是RNase失效或效率不高。参考见解：

1、更换RNase A，并保证其储存条件是正确的

2、手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min（需要保证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（如50℃）会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。

提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？ 参考见解：

1、质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。

2、当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。

3、可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切。

4、NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。

用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒DNA15min。双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？ 参考见解：

1、溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室RNase不同，这个条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。

2、确认一下酶切过程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切体系的Buffer或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物用70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。

3、也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。

4、没有用RNase消化，不要用放久的 RNase否则会有DNA酶的污染；

5、在没有进行酶切时,把所提的质粒跑一下核酸电泳看看,如果是提核酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的条带,这样可以先排除核酸提取的问题.若是没有酶切时间过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的问题，建议将超纯水换成TE。

用碱裂解法提取的质粒,取3ul转化感受态大肠杆菌涂amp抗性平板，却出现阳性克隆较少（含绿色荧光蛋白，阳性克隆应该显绿色，在紫外灯下非常明显，就几十个菌落）大部分菌落不发绿，这些菌落比发绿的菌落小一些的现象，为什么？ 参考见解：

1、做一次阴性对照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生长,说明amp过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的amp不容易失效,如果amp有效的话,可以配制远高于标准的浓度,如果细菌耐药的话,也能生长良好,如不耐药,则放置数天仍不见细菌生长。

2、拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的amp液体培养基中,如能生长,说明空白菌中带有耐药菌,建议换菌.3、提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。

培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？

参考见解：如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。|||谢谢楼主,还有什么专题也要贴出来啊!|||谢谢分享

到一个小tips。转帖过来和菜鸟分享。大虾凭手感就可以了,我们还是要学学的,受益匪浅

1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。

2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-„R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？

加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

8．如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最终PEG浓度为12％。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。

9．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

10．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

11．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？

因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

第二篇：质粒提取有关问题及注意点

质粒提取常见问题解析

涂布棒在酒精蘸一下，然后烧一下，能不能保证把所用的菌烧死？

参考见解：涂布棒可以在酒精中保藏，但是酒精不能即时杀菌。蘸了酒精后再烧一小会，烧的是酒精而不是涂布棒。建议涂布棒还是干烧较长时间后，冷却了再涂。同时作多个转化时，应用几个涂布棒免得交叉污染。

原先测序鉴定没有问题的细菌，37℃摇菌后发现质粒大小或序列出现异常? 参考见解：这种情况出现的几率较小，常出现在较大质粒或比较特殊的序列中。解决办法：

1、降低培养温度，在20～25℃下培养，或室温培养可明显减少发生概率。

2、使用一些特殊菌株，如Sure菌株，它缺失了一些重组酶，如rec类等，使得质粒复制更加稳定。

3、质粒抽提有一个酶切不完全的原因就是溶液Ⅱ中的NaOH浓度过高造成的，请大家注意一下！

【有两种方法可以在提质粒前判断菌生长是否正常：

1、利用你的嗅觉。只要平时做实验仔细点就能闻出大肠杆菌的气味，新鲜的大肠杆菌是略带一点刺鼻的气味，但不至于反感。而在泥水状的菌液中你只要一凑过去就感觉到其臭无比或者没有气味，可以和正常菌液对照。

2、肉眼观察活化菌株。对于生长不正常的菌液进行划板验证或者稀释到浓度足够低涂板，第二天观察单克隆生长情况，LB平板生长的DH5A正常形态在37℃16h后直径在1mm左右，颜色偏白，半透明状，湿润的圆形菌斑，如果观察到生长过快，颜色又是泛黄的话基本上不正常了。】

未提出质粒或质粒得率较低，如何解决？ 参考见解：

1、大肠杆菌老化：涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

2、质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

3、菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如，柯斯质粒在大肠杆菌中长期保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

4、碱裂解不充分：使用过多菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液的用量。对低拷贝数质粒，提取时可加大菌体用量并加倍使用溶液，可以有助于增加质粒提取量和提高质粒质量。

5、溶液使用不当：溶液2和3在温度较低时可能出现浑浊，应置于37℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

6、吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或2×YT，菌液体积必须减少；若质粒是非常高的拷贝数或宿主菌具有很高的生长率，则需减少LB培养液体积。

7、质粒未全部溶解(尤其质粒较大时)：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

8、乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，再加入洗脱缓冲液。

9、洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位以确保洗脱液会完全覆盖硅胶膜的表面达到最大洗脱效率。

10、洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，如洗脱缓冲液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脱效率还取决于pH值，最大洗脱效率在pH7.0-8.5间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱时将灭菌蒸馏水或洗脱缓冲液加热至60℃后使用，有利于提高洗脱效率。

11、洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

12、洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定影响。洗脱时放置1min可达到较好的效果。

细菌离心加入溶液I蜗旋振荡后，发现菌体呈絮状不均匀或呈细砂状？ 参考见解：

1、很可能是细菌发生溶菌，可减少培养时间或者试试平板培养，质粒提取前用PBS将菌落洗下，相较来说固体培养基上细菌生长的要好一些。

2、质粒抽提过程很大程度上是受细菌生长情况决定的，刚活化的菌比负80℃保存菌种所培养出来的菌液状态好，保存久的菌株可能会造成质粒浓度低，质粒丢失等不明原因。

3、判断生长的菌液是否正常，可以用肉眼观察，在光线明亮处摇荡新鲜培养液，如果发现菌液呈漂絮状，情况很好。如果发现呈泥水状，即看不到絮状，只是感觉很浑浊，则可能提不出好的质粒，或者没有质粒。

4、菌液不宜生长太浓，摇床速度不宜过高。达到OD600 1.5就可以了，（尤其是对于试剂盒提取要注意）另外如果只是简单的酶切验证根本无需酚氯仿抽提（安全考虑，慎重），只要溶液I/ II /III比例恰当，转管过程仔细吸取不会有太多杂志。

为什么加了溶液Ⅱ后，菌体没有逐渐由混浊变澄清？提出来的条带几乎没有，但是RNA很亮（没加RNA酶）？

溶液Ⅱ主要就是NaOH，如果菌液没有由混浊变澄清，参考见解：

1、可能是因为溶液储存不当，或屡次操作没有及时盖好溶液瓶盖，导致其吸收空气中的CO2失效。RNA在菌体中量较多，相对少量的菌体裂解，可有较DNA明显的条带。

2、可能是菌量大，加溶液Ⅱ后，菌体并不能完全裂解，所以没有变清，这也会导致质粒产率低下．

3、可能是质粒的拷贝数不高，质粒产率不高．如果是使用自己配的试剂，建议做中提或大提；或者买试剂盒提．用自己配的试剂，不加RNA酶，最后RNA是很亮的，要去除干净就要用比较好的ＲＮＡ酶。

4、如果不是试剂的原因，可能是质粒表达的过程中使膜蛋白变化（数量变多），很难使用碱裂解法，可以尝试用其他比较剧烈的方法(比如高温或者低温研磨等),然后使用一般的发放。

5、可能质粒随乙醇一起倒掉了。

加入溶液II后，菌液仍然呈浑浊状态，或者混浊度没有明显的改变？ 裂解不完全,参考见解：

1、问题可能是发生在溶液II上。首先看看10％SDS是否是澄清的？NaOH是否是有效的？如果使用的是试剂盒，也要首先确认溶液II是否澄清没有沉淀？

2、可能是细菌浓度很高，适当调整增加溶液I/II/III的体积。

3、可能是“杂菌”污染，如果菌液生长异常快，就有可能被杂菌污染。这种情况一般表现为和目的菌有相同的抗性，生长速度异常，能够提出质粒，跑胶的条带也异常的亮，但产物不是自己想要的质粒，要特别注意一下。抽提DNA去除蛋白质时，为什么要是酚/氯仿混合使用？怎样使用酚与氯仿较好？

参考见解：酚与氯仿都是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？

参考见解：保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以使用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊醇？

参考见解：在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，可以降低抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。加入酚/仿抽提，离心后在水相和有机相间没有出现变性蛋白相层，在随后的乙醇沉淀步骤中却出现大量的半透明沉淀，溶解后发现蛋白浓度很高？

乙醇沉淀时，较纯的质粒沉淀是白色的（PEG纯化的沉淀是透明的肉眼不易发现），如沉淀是半透明的凝胶状，则应是蛋白含量高。参考见解：首先看看平衡酚是否已被氧化？pH是否是8.0？其次检测溶液III反应完成后的离心上清pH是否在8.0左右？有时由于溶液III配置的问题，会出现溶液III反应后离心的上清pH与8.0偏差较大的现象，这会降低平衡酚抽提蛋白抽的有效性，pH偏差过大也会导致水相和平衡酚互溶。使用酚仿抽提方法，质粒的纯度很好，但酶切不能完全切开? 参考见解：

1、确认酶的有效性。

2、平衡酚是否被氧化（正常是黄色，而氧化后是棕色的）。

3、是否不小心吸入了痕量的酚。

4、乙醇沉淀后，70%乙醇漂洗的是否充分（残留的盐类会影响酶切）。

5、乙醇漂洗后是否完全干燥（残留的乙醇会影响酶切）。

碱裂解法提取的质粒DNA进行琼脂糖电泳进行鉴定时，看到的三条带分别是什么？

参考见解：碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，得到的三条带是以电泳速度的快慢排序的，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。提取质粒中RNA没有去除？

可能是RNase失效或效率不高。参考见解：

1、更换RNase A，并保证其储存条件是正确的

2、手工提取质粒的，可单独增加一步去除RNA的步骤，溶液III反应后，在离心的上清中加RNase，室温下去除RNA 10min～30min（需要保证RNase A是经过失活DNase的），同时较高温度（如50℃）会更加快速完全的去除RNA，经验所得经过高温处理的质粒质量不是很高。提取的质粒电泳后，为连续的一片火箭状？ 参考见解：

1、质粒如果盐离子多，会有走胶变形的现象，如果提到的质粒不够纯，会有电泳条带不平齐的现象。

2、当电压太大时，容易出现火箭状，而降解应该是弥散状。

3、可能是宿主菌影响的，质粒抽提好后，用酚-氯仿处理一下再酶切，若有改善，则为宿主菌影响。转化到其它宿主菌再切。

4、NaOH的浓度过高，会出现火箭状的结果。

用碱裂解法提取质粒，裂解5分钟，没有用酚 / 氯仿抽提，最后用灭菌水溶解质粒DNA15min。双酶切后跑胶一条带都没有，原因是什么？ 参考见解：

1、溶解时间稍微短了点，但是根据各个实验室RNase不同，这个条件是不同的。在溶解的过程要涡旋处理促进溶解。

2、确认一下酶切过程中是不是有DNA酶的污染，比如酶切体系的Buffer或者是水，特别是水中；其次是酶切体系的问题；建议再把提取的产物用70%酒精重新洗涤一遍，也可以用酚 / 氯仿重新抽提一下。

3、也可能在用乙醇洗时把质粒倒掉了。

4、没有用RNase消化，不要用放久的 RNase否则会有DNA酶的污染；

5、在没有进行酶切时,把所提的质粒跑一下核酸电泳看看,如果是提核酸的问题那这一步电泳结果应该没有大于三千的条带,这样可以先排除核酸提取的问题.若是没有酶切时间过长等其他问题的话可以那可以检查一下所用的溶解DNA的溶液是否有DNAse污染的问题，建议将超纯水换成TE。

用碱裂解法提取的质粒,取3ul转化感受态大肠杆菌涂amp抗性平板，却出现阳性克隆较少（含绿色荧光蛋白，阳性克隆应该显绿色，在紫外灯下非常明显，就几十个菌落）大部分菌落不发绿，这些菌落比发绿的菌落小一些的现象，为什么？ 参考见解：

1、做一次阴性对照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生长,说明amp过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的amp不容易失效,如果amp有效的话,可以配制远高于标准的浓度,如果细菌耐药的话,也能生长良好,如不耐药,则放置数天仍不见细菌生长。

2、拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的amp液体培养基中,如能生长,说明空白菌中带有耐药菌,建议换菌.3、提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。

培养基、抗生素、质粒提取都没有问题，而细菌菌液提取不到质粒？

参考见解：如果是氨苄抗性的，有可能是质粒丢失造成的。主要是培养时间较长，导致培养基中的beta-内酰胺酶过多，作用时间过长，同时培养基pH值降低，氨苄青霉素失活，从而使无质粒的菌株大量增殖。解决的办法：可以添加葡萄糖，缩短培养时间，改用羧苄青霉素。|||谢谢楼主,还有什么专题也要贴出来啊!|||谢谢分享

到一个小tips。转帖过来和菜鸟分享。大虾凭手感就可以了,我们还是要学学的,受益匪浅 1．溶液I—溶菌液：

溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。

葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。EDTA：（1）螯合Mg2＋、Ca2＋等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。2．溶液II－NaOH－SDS液：

NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当pH＞12或pH＜3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1／L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-„R＋-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。

3.溶液III--3mol／L NaAc（pH4.8）溶液：

NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol／L NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS－蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。

4．为什么用无水乙醇沉淀DNA？

用无水乙醇沉淀DNA，这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95％乙醇昂贵）。但是加95％的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用95％乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0.6倍体积的异丙醇选择性沉淀DNA。一般在室温下放置15－30分钟即可。

5．在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1～0.25mol/L？ 在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。6．加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？

加进去的RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA，又必须去除之，加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到较好效果。

7．为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？

在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统（pKa＝7.2）和硼酸系统（pKa=9.24）等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根离子的种类及数量将与Ca2＋产生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris-HCl（pKa=8.0）的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCl系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。8．如何选择聚乙二醇（6000）的浓度来沉淀DNA？

采用PEG（6000）沉淀DNA，大小不同的DNA分子所用的PEG的浓度也不同，PEG的浓度低，选择性沉淀DNA分子量大，大分子所需PEG的浓度只需1％左右，小分子所需PEG浓度高达20％。本实验选择性沉淀4.3kb的pBR322质粒DNA，每毫升加入0.4毫升的30％ PEG，其最终PEG浓度为12％。PEG选择性沉淀DNA的分辨率大约100bp。9．抽提DNA去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较好？

酞与氯仿是非极性分子，水是极性分子，当蛋白水溶液与酚或氯仿混合时，蛋白质分子之间的水分子就被酚或氯仿挤去，使蛋白失去水合状态而变性。经过离心，变性蛋白质的密度比水的密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而与溶解在水相中的DNA分开。而酚与氯仿有机溶剂比重更大，保留在最下层。

作为表面变性的酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊，酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互溶，大约10％～15％的水溶解在酚相中，因而损失了这部分水相中的DNA，而氯仿的变性作用不如酚效果好，但氯仿与水不相混溶，不会带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性蛋白质，此时一起将酚带走。也可以在第二次抽提时，将酚与氯仿混合（1:1）使用。

10．为什么用酚与氯仿抽提DNA时，还要加少量的异戊酵？

在抽提DNA时，为了混合均匀，必须剧烈振荡容器数次，这时在混合液内易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用。加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。一般采用氯仿与异戊酵为24：1之比。也可采用酚、氯仿与异戊醇之比为25：24:1（不必先配制，可在临用前把一份酚加一份24：1的氯仿与异戊醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。

11．为什么要用pH8的Tris水溶液饱和酚？呈粉红色的酚可否使用？如何保存酚不被空气氧化？

因为酚与水有一定的互溶，苯酚用水饱和的目的是使其抽提DNA过程中，不致吸收样品中含有DNA的水分，减少DNA的损失。用Tris调节至pH为8是因为DNA在此条件下比较稳定。在中性或碱性条件下（pH5～7），RNA比DNA更容易游离到水相，所以可获得RNA含量较少的DNA样品。

保存在冰箱中的酚，容易被空气氧化而变成粉红色的，这样的酚容易降解DNA，一般不可以便用。为了防止酚的氧化，可加入疏基乙醇和8-羟基喹琳至终浓度为0.1％。8-羟基喹琳是带有淡黄色的固体粉末，不仅能抗氧化，并在一定程度上能抑制DNase的活性，它是金属离子的弱螯合剂。用Tris pH8.0水溶液饱和后的酚，最好分装在棕色小试剂瓶里，上面盖一层Tris水溶液或TE缓冲液，隔绝空气，以装满盖紧盖子为宜，如有可能，可充氮气，防止与空气接触而被氧化。平时保存在4℃或－20℃冰箱中，使用时，打开盖子吸取后迅速加盖，这样可使酚不变质，可用数月。

去年做了半年载体构建，连接无疑是其中重要的一关，根据自己的实验心得和已有资料做个总结，希望对大家有用，同时希望战友们批评指正！互相进步！首先说说2片段连接

通常是指目的片断和载体片断的连接，包括①小片段（目的片断小于载体片断的大小）和载体片段的连接，这种情况多些，也比较容易连接，按照说明书要求的比例进行即可，比如TAKARA的pMD19-T Simple Vector连接时Vector DNA和Insert DNA的摩尔比一般为1 ：2～10即可，如果效果不佳，检测一下感受态细胞，如果片断过小比如几十bp，连接时要加大小片段的摩尔数，多连几管，挑选白斑，以上是指双酶切后的连接，即载体和目的片断俩端的酶切位点相同；②大片段（目的片断与载体片断的大小差不多甚至大于载体的大小）和载体片段的连接，目的片断与载体片断的大小差不多的情况应尽量避免，因为这会给目的片断胶回收带来麻烦，我就遇到过这种情况，胶回收时很是费尽，最后勉强分开，当然换个载体也许就解决问题了。我做过3000多bp和pMD19-T Simple Vector的连接，开始不行，后来成功了，连接率不高，我的经验是如果感受态细胞没问题，那就反复试目的片断和载体片断的连接比例，可以超出此范围1 ：2～10一试。再说说多片断的连接

做多个片断的连接，首先强调一个问题，那就是大家一定要注意所有片断俩端的酶，把他们的特征要弄得清清楚楚，是否存在同尾酶和同裂酶，多片段同时连接时这个问题就太重要了；多片段连接要总体先规划好了，再开始入手设计引物，否则考虑不周后患无穷啊,呵呵！①多片断的连接最经常的做法是顺次俩俩连接（目的片断和载体片断的连接），就采用载体上的多克隆位点，注意顺序！如果所选载体多克隆位点上的俩个酶切位点比较近，甚至相邻，最好分步酶切载体，比双酶切效果好的多，经验！接下来的方法和前面的差不多，就是麻烦些

②多片断的同时连接，我最多做过四个片断的同时的连接，当然，其中包括载体片断。做多个片断的同时连接，不得不把我走过的弯路告诉大家！那就是同尾酶的问题，我也是在合成引物后发现的这个问题，我的其中一个片断俩端分别是XhoI和SalI，结果问题来了，酶切后连接时有可能正连也可能反向连接，如果连正了还好，反了就比较郁闷了，根据当时的实验设计，如果想改就得改所有其他片段的引物，硬着头皮来吧！筛吧！一个原则，小片段要量大，多设计几种比例，连吧，挑选白斑，做菌落PCR检测连接情况，想想觉得痛苦，每个板挑几十个白斑做鉴定，大部分假阳性，不过最后还是找到了正确连接的克隆，可是浪费了很多时间和金钱，惨痛的教训！感觉多片断的连接，关键还是片断之间的摩尔比，大胆尝试吧！

需要说明的一点，以上主要是针对粘性末端的连接，关于平端连接，我做的比较少，欢迎其他同学总结！

分子克隆实验专题--

（五）感受态细胞的选择与使用 分子克隆实验专题--

（五）感受态细胞的选择与使用 常用感受态细胞的特性：

TOP10，DH5α：蓝白斑筛选，高效克隆，质粒抽提 JM110：甲基化酶缺陷型

SURE：克隆不稳定插入片段，降低同源重组 DH10B：文库构建，长片段质粒的克隆（150kp

质粒转化）

Stbl2：克隆不稳定插入片段，正向重复，逆转录病毒序列，克隆甲基化基因组序列。

Stbl3：克隆慢病毒表达载体中的正向重复序列，降低逆转录病毒载体中长末端重复序列的非目标同源重组。

选择适宜的感受态细胞

序列的结构，长度，载体种类以及特殊要求等。

选择适宜的转化方式

热激转化：常规克隆，片段较短（<10kb)

电转化: 建库，基因敲除，长片段（>10kb)感受态细胞使用的注意事项

连接产物或质粒的量

效价：1μg标准质粒转化感受态细胞产生的单克隆的数目，单位为cfu。

化学感受态细胞：106，107，108，109cfu

电转感受态细胞：108，109，1010cfu

常规的克隆根据连接产物和质粒的量选择适当效价的感受态细胞，特殊转化（如建库）则选择最高效价的感受态细胞，一般选用电转。

感受态细胞效价测定

标准质粒：pUC18, pUC19,pBR322

超螺旋，超纯

质粒使用量：<5μl, <1ng

设立阴性对照，多涂几板(3块以上）取平均值。

化学感受态细胞的使用

质粒PCR扩环的产物以及进行体内重组的线性片段不宜选用DH5α高效感受态细胞进行转化。

可能原因： DH5α本身不适合这种操作；高效感受态制备的试剂对于这种转化有抑制作用。

可选用TOP10感受态细胞。

电转感受态细胞的使用

尽量降低转化产物的离子浓度，防止细胞被击穿。

大量的连接产物提纯后进行转化，或者进行透析后再转化，有些进行体内重组的酶切产物进行提纯后进行转化。

氨苄平板的卫星菌落

氨苄平板涂板后如果时间太长，就会产生卫星菌落，在单克隆周围生成小的克隆。

氨苄抗生素只能抑制菌落生长，而不能杀死，当抗生素降解失效后，被抑制的菌体重新形成菌斑。

解决方法：使用新鲜配置的氨苄培养基平板，提高氨苄的使用量，选用高质量的氨苄抗生素。

感受态细胞的取用

特殊制备的感受态细胞在超低温条件下可以维持效价半年以上，在制成之后要立即放入超低温冰箱。

感受态细胞对温度的变化非常敏感，取用时要快取快放，不能将整包的细胞放在外面然后取用。

看清标记，防止拿错。分子克隆实验专题-

（二）酶切连接要点探讨 分子克隆实验专题-

（二）酶切连接要点探讨

声明：关于酶切连接的实验做法我在之前的帖子里已经非常详细的介绍了，原帖链接：http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=2311683 我们在这里对相关问题进行探讨 1.酶切

（1）

PCR产物的酶切

①酶切位点两端要有适当的保护碱基。一般在设计引物的时候会在新添加的酶切位点前加4-5个碱基当做保护碱基，这种保护碱基的序列没有特殊的要求，不要添加完后使你的引物不能用就行了（好引物应该具备的条件大家应该都知道吧）

–

NEB http:// •

分步酶切顺序的选择：选择适当的酶切顺序(低盐-----高盐）甲基化位点的影响

设计方案时尽量避免使用 •

JM110

PCR 扩增后再切 质粒DNA的质量与定量

质量：抽提过程中杂质的残留

定量：分步酶切时,酶切足够的DNA,保证第二步回收到浓度较高的载体或片段 酶切不完全

公用buffer选择不当 •

质粒DNA量过多 •

酶的活性不高 酶切出的小片段回收效率低 •

PCR扩增后再酶切

回收上柱时加终浓度为20%的异丙醇 •

Glass beads

(> 40 bp)3.影响连接的因素

（1）

片段的质量

片段回收时紫外线照射对克隆效率的影响

（2）摩尔比

In general, maximum cloning efficiency is achieved when using a 2:1 molar ratio of insert: vector.分子克隆实验专题-

（一）质粒提取 分子克隆实验专题-

（一）质粒提取 知识储备：

质粒(Plasmid)是一种宿主染色体外的稳定遗传因子,大小从1-200kb不等,为双链、闭环的DNA分子,并以超螺旋状态存在于宿主的细胞质中。

质粒的存在使宿主具有一些额外的特性,如对抗生素的抗性等。常见的天然质粒有F质粒(又称F因子或性质粒)、R质粒和Col质粒。

质粒在细胞内的复制一般有两种类型: 紧密控制型(Stringent control)-低拷贝和松驰控制型(Relaxed control)-高拷贝。

前者只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 BAC。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 pUC57,~200 copies。质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。

碱裂解法提取质粒DNA原理：

根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然H键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。试剂成分：

Buffer S1(pH 8.0)

+RNase

50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)

10mmol/L EDTA(pH 8.0)Buffer S2(pH12-12.5)

0.2mol/L NaOH

1%SDS Buffer S3(pH4.8)

3mol/L 乙酸钾

冰醋酸(HAC,乙酸）

异硫氰酸胍或盐酸胍 质粒检测：

电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。

吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。Buffer S1的作用：

任何生物化学反应，首先要控制好溶液的p H，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。

那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？说起来不可思议，加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，几乎没有任何影响。所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。

那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA.如果哪天你手上正好缺了Buffer S1，可不可以抽提质粒呢？实话告诉你，只要用等体积的水来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

Buffer S2的作用

用完后一定要把盖子拧紧，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。

很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为 SDS也是碱性的，只是弱了点而已。

很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合（象对待女孩子一样），不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。Buffer S3的作用

每个人都知道，Buffer S3加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白这沉淀的本质。

最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果你这样怀疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现，显然与SDS的加入有关系。如果在Buffer S2中不加SDS会怎样呢，也会有少量的沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然 SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate，PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，Buffer S3加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA 自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

那么2 M的醋酸又是为什么而加的呢？是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和之。基因组DNA一旦发生断裂，只要是50-100 kb大小的片断，就没有办法再被PDS共沉淀了。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入，琼脂糖电泳可以观察到一条浓浓的总DNA条带。很多人误认为是Buffer S3加入后基因组DNA无法快速复性就被沉淀了，这是天大的误会，因为变性的也好复性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本来是为了溶解细胞而用的，DNA分子的变性其实是个副产物，与它是不是沉淀下来其实没有关系。Buffer S3加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了PDS沉淀更充分一点。

第三篇：质粒提取简介及问题分析

质粒提取简介及问题分析

一、导论

(一)质粒提取的原理：

为了方便理解，这里罗列一下碱法质粒抽提用到三种溶液：

溶液I，50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，pH 8.0；

溶液II，0.2 N NaOH，1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾，2 M 醋酸。

让我们先来看看溶液I的作用。任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-HCl溶液，是再自然不过的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？加了葡萄糖后最大的好处只是悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言几乎没有任何影响，所以说溶液I中葡萄糖是可缺的。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA，就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。如果不加EDTA，其实也没什么大不了的，只要是在不太长的时间里完成质粒抽提，就不用怕DNA会迅速被降解，因为最终溶解质粒的TE缓冲液中有EDTA。如果手上正好缺了溶液I，可不可以抽质粒呢？只要用等体积的水或LB培养基来悬浮菌体就可以了。有一点不能忘的是，菌体一定要悬浮均匀，不能有结块。

轮到溶液II了。这是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。很多人不知道其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。用了不新鲜的0.4 N NaOH，即便是有SDS也无法有效溶解大肠杆菌(不妨可以自己试一下)，自然就难高效率抽提得到质粒。如果只用SDS当然也能抽提得到少量质粒，因为SDS也是碱性的，只是弱了点而已。很多人对NaOH的作用误以为是为了让基因组DNA变性，以便沉淀，这是由于没有正确理解一些书上的有关DNA变性复性的描述所导致。有人不禁要问，既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢?那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦。

溶液III加入后就会有大量的沉淀，但大部分人却不明白沉淀的本质。最容易产生的误解是，当SDS碰到酸性后发生的沉淀。如果这样怀疑，往1%的SDS溶液中加2M醋酸溶液看看就知道不是这么回事了。大量沉淀的出现显然与SDS的加入有关系。如果在溶液II中不加SDS，也会有少量沉淀，但量上要少得多，显然是盐析和酸变性沉淀出来的蛋白质。既然SDS不是遇酸发生的沉淀，那会不会是遇盐发生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，会发现SDS在高盐浓度下是会产生沉淀的。因此高浓度的盐导致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你会发现沉淀的量要多的多。这其实是十二烷基硫酸钠(SDS)遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(PDS)，而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。(二)细菌的收获和裂解。

细菌的收获可通过离心来进行，而细菌的裂解则可以采用多种方法中的任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等。选择哪一种方法取决于3个因素：质粒的大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA的技术。尽管针对质粒和宿主的每一种组合分别提出精确的裂解条件不切实际，但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意的结果。

1、大质粒(大于15kb)容易受损，故应采用漫和裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶和EDTA进生处理，破坏细胞壁和细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压的细菌内部把质粒释放出来所需要的作用力。

2、可用更剧烈的方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然的超螺旋分子。

3、一些大肠杆菌菌株(如HB101的一些变种衍生株)用去污剂或加热裂解时可释放相对大量的糖类，当随后用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类，而糖类可抑制多种限制酶的活性。故从诸 如HB101和TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时，不宜使用煮沸法。

4、当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌菌株(endA 株，如HB101)中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A，以后在温育(如用限制酶消化)时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤(用酚：氯仿进行抽提)可以避免此问题。

5、目前这一代质粒的拷贝数都非常高，以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加质粒DNA的产量，而是要降低细菌细胞在用于大量制备的溶液中所占体积。大量高度粘稠的浓缩细菌裂解物，处理起来煞为费事，而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得的质粒DNA的量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到的质粒DNA的量大致相等。(三)质粒DNA的纯化。

常用的纯化方法都利用了质粒DNA 相对较小及共价闭合环状这样两个性质。如，用氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒和染色体DNA 就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子的结合量有所不同。溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA的长度有所增加，作为补偿，将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加，从而阻止了溴化乙锭分了的继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多的染料，直至达到饱和(每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子)。由于染料的结合量有所差别，线状和闭环DNA分了在含有饱和量溴化乙锭的氯化铯度中的浮力密度也有所不同。多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA和宿主DNA的方法。

二、质粒DNA的小量制备(一)细菌的收获和裂解。

1、收获。

1)将2ml含相应抗生素的LB加入到容量为15ml 并通气良好(不盖紧)的试管中，然后接入一单菌落，于30℃剧烈振摇下培养过夜。

2)将1.5ml培养物倒入离心管中，4℃、12000g离心30秒，将剩余的培养物贮存于4℃。3)吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。

2、碱法裂解。

1)将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。溶液I可成批配制，高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4℃。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散。

2)加200μl新配制的溶液Ⅱ。盖紧管口，快速颠倒离心管5次，以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。不要振荡，将离心管放置于冰上。

3)加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口，将管倒置后温和地振荡10秒钟溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。

4)用离心机于4℃、12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。

5)可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4 ℃以12000g离心 2分钟，将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知的原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应的DNA。6)用2倍体积的乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分钟。

8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。9)用1ml70%乙醇于4℃洗涤双链DNA沉淀，去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。i.此法制备的高拷贝数质粒(如Xf3或pUC)，其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3-5μg。

ii.如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1μl DNA溶液加到另一含8μl水的微量离心管内，加1μl 10×限制酶缓冲液和1单位所需限制酶，在适宜温育1-2小时。将剩余的DNA贮存于-20℃。iii.此方法按适当比例放大可适用于100ml细菌培养物：。

3、煮沸裂解。

1)将细菌沉淀，所得重悬于350μlSTET中。STET：0.1mol/L NaCL，10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)，5% Triton X-100。

2)加25μl新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，用10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)配制]，振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8.0，溶菌酶就不能有效发挥作用。3)将离心管放入煮沸的水浴中，时间恰为40秒。4)用微量离心机于室温以12000g离心10分种。5)用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片。

6)在上清中加入40μl 5mol/L乙酸钠(pH5.2)和420μl异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。7)用微量离心机于4℃以12 000g离心5分种，回收核酸沉淀。

8)小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁的液滴除尽。除去上清的简便方法是用一次性使用的吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面。当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管的液滴。9)加1ml 70%乙醇，于4℃以12 000g离心2分钟。

10)按步骤8)所述再次轻轻地吸去上清，这一步操作要格外小心，因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成的所有乙醇液滴，打开管口，放于室温直至乙醇挥发殆尽，管内无可见的液体(2-5)分钟。11)用50μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解核酸稍加振荡，贮存于-20℃。注：当从表达内切核酸酶A的大肠杆菌株(endA 株，如HB101)中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A，以后在Mg 2 存在下温育(V中用限制酶时)质粒DNA可被降解。在上述方案的步骤9)之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提，可以避免这一问题。(二)质粒DNA小量制备的问题与对策。

碱裂解和煮沸都极其可靠，重复性也很好，而且一般没有什么麻烦。多年来，在我们实验室中日常使用这两种方法的过程中，只碰到过两个问题：

1、有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中的杂质。如果总是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。

2、在十分偶然的情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。

三、质粒DNA的大量制备(一)在丰富培养基中扩增质粒

许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上的细菌有效，然而在带有pMBl或ColEl复制子的高拷贝数质粒的大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500ml培养物2-5mg质粒DNA，而且重复性也很好。

1)将30ml含有目的质粒的细菌培养物培养到对数晚期(DNA 600约0.6)。培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来的小量液体闭关物进行接种。

2)将含相应抗生素的500ml LB或Terrific肉汤培养基(预加温至37℃)施放入25ml对数晚期的培养物，于37℃剧烈振摇培养25小时(摇床转速300转/分)，所得培养物的OD 600值约为0.4。3)可做可不做：加2.5ml氯霉素溶液(34mg/ml溶于乙醇)，使终浓度为170μg/ml。像pBR322一类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复的质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代的质粒(如pUC质粒)可复制达到很高的拷贝数，因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱和的细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理，具有抑制细菌复制的优点，可减少细菌裂解物的体积和粘稠度，极大地简化质粒纯化的过程。所以一般说来，尽管要在生长中的细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还是利大于弊。

4)于37℃剧烈振摇(300转/分)，继续培养12-16小时。(二)细菌的收获和裂解。

1、收获。

1)4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。2)将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH8.0)。

3)按步骤1)所述方法离心，以收集细菌细胞。

2、碱裂解法。

1)将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤3] 重悬于10ml(18ml)溶液I中。2)加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml，溶于10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。

3)加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。

4)加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾-SDS-蛋白质-膜复合物。

5)用合适转头于4℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤4)]。6)上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。7)用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4℃离心，盐也会了生沉淀。

8)小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。

9)用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。

四、质粒DNA的纯化

(一)聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA。

1、将核酸溶液所得]转入15mlCorex 管中，再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4℃下以10000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。

2、将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头(或与其相当的转尖)于室温以10 000转/分离心10分钏，回收沉淀的核酸。

3、小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。

4、用500μl含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/ml)的TE(pH8.0)溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。

5、加500μl含13%(w/v)聚乙二醇(PEG 8000)的1.6mol/L NaCl，充分混合，用微量离心机于4℃以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。

6、吸出上清，用400μl TE(pH8.0)溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次。

7、将水相转到另一微量离心管中，加100μl 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加2倍体积(约1ml)乙醇，于室温放置10分钟，于4℃以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒DNA。

8、吸去上清，加200μl处于4℃以12 000g离心2分钟。

9、吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10)用500μl TE(pH8.0)溶解沉淀1：100稀释[用TE(pH8.0)] 后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度(1OD260=50μg质粒DNA/ml)，然后将DNA贮于-20℃。

10、纯化。

一些试剂的生化作用原理

1、溶液Ⅰ

溶霉菌：水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的β-1,4糖苷键，因而具有溶菌作用。葡萄糖：增加溶液的粘度，防止DNA受机械剪切力作用而降解。

EDTA：金属离子螯合剂，螯合Mg2+，Ca2+等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶(DNase)对DNA的降解作用(DNase 作用时需要一定的金属离子强度作辅基)，同时EDTA的存在，有利于溶霉菌的作用。因为溶霉菌的反应要求有较低的离子强度环境。

2、溶液Ⅱ-NaOH-SDS液

NaOH：核酸在pH值为5~9的溶液中是最稳定的，但pH大于12或小于3时，就会引起双键之间氢键的解离而变性。在溶液Ⅱ中的NaOH浓度为0.2N，加入提取液时，该系统的pH就会高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。

SDS：为阴离子表面活性剂，主要功能有：溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，从而破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白SDS蛋白质结合为复合物，使蛋白变性沉淀下来，但SDS能抑制核糖核酸没的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，以防用RNase去除RNA时受到干扰。

3、溶液Ⅲ-3M KAc(pH4.8)溶液：

KAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸，所以该溶液实际上是KAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的KAc溶液是为了把pH 12.6的抽取液pH调回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3mol∕L KAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白质复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷。减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS-蛋白质复合物作用后，能形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀完全。

4、为什么用无水乙醇沉淀DNA: 此为实验中最常用的沉淀方法。乙醇的优点是低度极性，可以以任意比例和水相混容，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液时以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。其乙醇的最终含量占67%左右。因而也可改用95%乙醇来代替无水乙醇(因无水乙醇价格更贵)，但加95%乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中总有一定程度的溶解，因而DNA损失也增大，尤其用多次乙醇沉淀时，会影响收得率。折衷的做法是初次沉淀DNA是可用95%乙醇代替无水乙醇，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用异丙醇选择性沉淀DNA，一般在室温下放置15~30min即可。

使用乙醇在低温条件下沉淀DNA，分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀，且温度越低，DNA沉淀得越快。

5、RNase处理核糖核酸后，再次沉淀DNA时为什么一定要加NaAc至最浓度达0.1~0.25M。

在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的NaAc，使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA纳盐沉淀。当加入大量盐溶液浓度太低时，只有部分DNA形成DNA钠盐聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不太好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须要进行洗涤或重沉淀。

6、为什么将DNA保存于TE缓冲液中？ 在基因操作实验中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa2=7.2)、硼酸系统(pKal=9.24)等虽然也都符合细胞内环境的生理范围(pH)，可以作为DNA的保存液，但在转化实验时，磷酸根将与Ca2+产生沉淀；在DNA酶反应时，不同的煤对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有哦则要求低盐离子浓度，采用Tris-HCL(pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲对时Tris+/Tris，不存在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都采用Tris-HCL系统，而TE缓冲液中的EDTA更能稳定DNA的活性。

操作要领：

1、该实验成功的标志是把染色体DNA，蛋白质与RNA去除干净。获得一定收得率的质粒DNA。去掉染色体DNA最为重要，也较困难。因为在全部提取过程中，只有一次机会去除染色体DNA，其关键步骤是加入溶液Ⅱ与溶液Ⅲ时，控制变性与复性操作时机，既要使试剂与染色体DNA充分作用使之变性；又要使染色体DNA不断裂成小片段而能与质粒DNA相分离。这就要求试剂与溶菌液充分摇匀。摇动时用力适当。一般加入SDS后要注意不能过分用力振荡，但又必须让它反应充分。

2、当加入溶液Ⅱ5min后，若没有看到溶液变稠时，实验不能再继续做下去了。

3、配置试剂时，要用重蒸水配置外，其器皿必须严格清洗，最后要用重蒸水冲洗三次，凡可以进行灭菌的试剂与用具都要经过高压蒸汽灭菌，防止其他杂质或酶对DNA的降解，对Ep管、Tip头与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50℃温箱中烘干使用。

4、用乙醇沉淀DNA时，要观察水相与乙醇之间没有分层现象之后，才可放在冰箱中去沉淀DNA。

第四篇：质粒抽提常见问题与解答

1.没有提出质粒或者质粒收获量很低

A菌种老化

建议：对于甘油保存的菌种，需要先进行活化，涂布或者划线菌种，重新挑选单菌落进行液体培养，并对菌种进行初摇活化，按照1:500的比例进行菌种培养。二次培养时间最好不要超出16小时(或者OD600不超过3.0)。

B低拷贝质粒

建议：如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低，可以采用两倍的菌体量，并相应增加各种Buffer的用量。

C质粒丢失

建议：某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象，另外检查筛选抗生素的浓度是否正确。

D裂解不充分

建议：如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备，会导致菌体裂解不充分。可适当减少菌体的用量或者相应增大各种Buffer的用量。并确保细菌混悬均匀。

EBuffer中有沉淀未溶解

建议：BufferB1和BufferN1，BufferC1在温度较低时会出现沉淀，使用前请检查是否有沉淀生成，如果有沉淀生成，请置于37℃温育片刻，待溶液澄清后使用。

FDNAWashBuffer中未加入要求量的乙醇

建议：按照说明书要求加入要求量的无水乙醇，使用后旋紧瓶盖，防止乙醇挥发。另外对于质粒中提，大提等，要求用70%乙醇洗涤，请确保乙醇的体积不小于70%。

G离心柱中乙醇残留

建议：漂洗后，可适当延长离心时间，尽量去除残留的乙醇。另外对于质粒中提，大提和朝大量提取，建议离心后，将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻(或置于65℃烘箱)，以彻底去除残留的乙醇，便于洗脱和后续实验操作。

H洗脱液加入位置不正确

建议：洗脱液应加在膜中央，已取得最好的洗脱效果。

I洗脱液pH值不正确

建议：将DNA从柱子上洗脱下来的最适pH值在7.0-8.5之间，如果洗脱液的pH超出此范围将会显著影响洗脱效果，请使用试剂盒配套的ElutionBuffer(pH8.5，10mMTris-HCl)进行洗脱，如果用ddH2O进行洗脱，请确保pH在7.0-8.5之间。

J洗脱体积的选择

建议：洗脱体积将会影响最终的收获量，洗脱体积越大，收获量越高，但是浓度将会降低。请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱，以保证最好的收获量和浓度。如果需要高浓度的质粒，请减少洗脱体积。另外，如果想收获高浓度高收获量的质粒，请根据试剂盒要求进行二次洗脱，再用推荐的方法进行沉淀，浓缩质粒。

K洗脱时间的选择

建议：加入洗脱Buffer后，室温放置2-5分钟，将有利于洗脱。

2.质粒纯度不高

A蛋白质污染

建议：选择推荐量的菌体，离心后小心吸取上清，如果上清液中混有悬浮物，可再次离心，以彻底去除蛋白。另外如果用ddH2O作为稀释溶液,测定OD比值，比值可能较低，造成蛋白污染的假象，可用pH8.0的TEBuffer来稀释。

BRNA污染

建议：检查配送的RNaseA是否完全加入到BufferA1中，加入RNaseA后，BufferA1/RNaseA应该存放在4℃，如果存放时间过长，或者没有正确存放，RNaseA活力下降，请重新加入RNaseA。

C基因组DNA污染

建议：加入BufferB1后，轻轻颠倒混匀，避免剧烈震荡涡旋，加入BufferB1的处理时间最好不要超过5分钟。

D菌株为含内源核酸酶的宿主菌株

建议：请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒DNA提取试剂盒，或者转化质粒到不含内源核酸酶宿主菌株中。

3.加样时DNA飘出加样孔外

原因：柱中残留乙醇未除干净。

建议：洗脱质粒DNA前确保无乙醇残留在柱子上。可再离心或者抽真空。

第五篇：销售常见问题解析

1、网上了解价格

这类客户通常会连续转过几家店后才会决定是否购买，例如：在网上了解的是N518 来店后直接会问N518多少钱，销售员在这时千万不要直接报价，因为我们在价格方面没有优势，当客户问这个问题的时候是一个非常好的转型的一个机会，通常我会说您好，电纸书N518系列有三款型号，不知道您说的是哪款，此时要看是什么样的客户，如果是那种比较强势的就不要吞吞吐吐的，要自信一些很有底气的报价：N518我们全国的统一价格是XXXX当客户转身要走时一定不要放弃，紧跟一句您就看中518了吗？我们最新的产品您了解一下吧，我给您介绍一下好吗？通常客户都会停下脚步 等待你介绍，这时的机会很大，接下来你可以问客户问题，先要了解客户对产品到底了解多少，根据他所了解的一些产品相关的东西你在给出相应的问题和解决方案，切忌：想尽一切办法给客户惊喜，最后让他觉得你给介绍的产品才是他最需要的2、长期关注价格 经常在卖场里询价

这类客户通常会给销售员一个假象，路过我们店面的时候会顺嘴问一句你家XX电纸书多少钱，你说什么都不理你就让你报下价格，然后转身就走。

如果遇到类似这样的客户大家不要慌，越是这样的客户说明他越是谨慎，越是谨慎就越经不住我们吓，这时最好的武器就是我们的形象，案例：我遇到过这样的一个客户，产品是N518我报的价格是2980 当时他就很生气说了一句你们怎么这么贵，当时我就觉得有希望，我说不是我们价格贵，是全国都是这个价格 我又问他您问到多少钱啊 他很不情愿的告诉我2600 我就笑了一下您被骗了 应该是2300当我说完这句话的时候客户就是满脸的疑问紧接着我就很热情的把请进店里 跟他说产品售后，给他赠值服务，跟他讲为什么价格乱为什么什么价格都有在问他相关的需求为他提出其他的方案，有的时候即使你知道客户就是要高端你也要适当的推下低端很真诚的和他说：其实您用510就可以了完全不用那么高端的，让客户觉得你是在为他着想，是客户更加信任你 最后价格绝对不是问题。

备注（请专卖店的销售人员利用好自己的形象，我们的专业术语，一定把讲客户和谈客户区分开，朋友式的聊天和买卖式的交易谈话给人的感觉是完全不一样的，一切为客户着想 最后肯定是谈客户，而不是讲客户）

3.预算有限

我比较喜欢转型，我相信每个人都有自己的销售方法 我最喜欢的还是转型，因为在转型的过程当中你又机会和客户走的更近，让客户更加信任你，主要表现就是你在不停的为他解决问题，最后你选出的产品肯定是可以满足他需求的产品。转型的前提 对产品要非常了解，任意拿出几款产品都要说出各自的优势 无论高端低端都有个自得特点 用心就能想的出来 简单列举几个低端比高端价格除外。1 N510D20510待机时间超长 一定比d20长 稳定性好体积小 比D20更方便携带n517n518单手持的时候517明显比518要舒服，518指示灯亮影响看书，体积比517重，笔没有517的舒服

3d21f21我想每个人对这两款产品都很尴尬 有 D21的时候针对个人用户F21就不知道该怎么推了 不过个人发

现F21翻页速度要比D21快很多

请大家根据个人需求去推相应的产品，不要一味的推高端，一切为客户着想才是一个成功的销售员该做的。

产品技巧的演示

位置: 这里的位置是指你和客户所站的位置，1、你要站在一个不容易让客户很轻松就出店的位置可以理解为客户前面让他不容易摆脱你

2、尽量的和客户站的近一些 特别是中老年人 因为卖场一般都比较杂乱 有的时候你在介绍产品的时候容易听不清对你销售产品有影响

3、尽量让客户正面对着一个死角这样的话在你给他演示的过程中避免它看见代理商的店 让他的注意力集中在你的店里防止出去询价

演示内容:产品演示前尽量装一些市面上比较畅销的书籍，或比较不错的有声读物，来吸引客户，初步让客户产生兴趣，尽量找一些比较不错的PDF文件或者反复试验不出问题的 WORD文档，在演示带手写的电子书的时候一定要让客户体会到汉王手写识别的功能，在演示OCR软件的时候尽量用公司提供的演示样张。根据需求演示功能 给自己留有余地：销售过程中要问清客户需求了解需求后在演示相应的功能，在没有确定成交的情况和已经满足客户的初步需求的时候 剩下的产品特点先不要说，因为这一点可能成为我们和客户谈判最后的底牌，同时也是为转型做铺垫

销售过程中要问的问题

其实在销售过程中有很多问题，并不是固定的 我总结的这点也只不过是平时比较常问的，主要的目的还是要引导客户，帮助客户发现自己需求，但在问问题之前请销售员一定不要刻意的去问，是在两个人聊天聊的挺投机的时候去问，比如第一句就在客户进店点名电子书的时候去问，主要起两个作用 1、看客户是否对我们的产品有所了解，如果说听说过 或者直接说了解过那这个人很可能就知道产品的价格在报价的时候就要多加注意

2、如果说没了解过 那我们就可以热情主动的和客户说那您坐 我给您详细介绍下，紧接着拿出演示机给客户讲解。第二问题就是要近一步的锁定客户的目标。看客户到底需求什么样的产品，第三个问题主要还是在同客户沟通的时候去提出来这个问题的目的是吧客户引开，当客户说出喜欢看什么书时可以把我们准备好的资源给客户看，近一步交流 了解客户。当客户自己不知道该选择什么，或者你和客户已经谈的很好的并且很信任你你可以这样去发问 您觉得这款怎么样？ 可能客户已经有理想的选择 可你提出这个问题可能会给他一个新的惊喜。第五个问题当客户被你说东心了在犹豫的时候千万不要和停下来。这个时候问这句话是最合适的 因为如果你帮他解决完他担心的问题他基本没有退路了当你给客户介绍完产品，并且很全面客户仍以言不发 起身要走 这时一定要上前问一句，肯定是你之前某个细节出了问题不要放弃近一步了解。在销售过程中没有固定话术，大家记住一点引导客户 不停的抛出问题和难题，然后在不停的解决你所给客户抛出去的难题。@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@2

首先，卖产品就是在卖自己，顾客之所以会选择购买你的产品就是因为相信你，相信从你口中介绍出来的产品，你在推销你的产品的同时也是在推销你自己，所以想做好销售就要先学会做人。

销售是一门学问，不是简单的介绍产品，报个价，这样的事情任何人都能做得来，就像“轻松销售法”里面所说的以明确、清楚、只锁定一个目标为一个方向。每一句就是要达到一个目的为一个单位。比如如果顾客正在询问产品可以这样主动反问顾客问题：“先生/小姐，请问您是个人用还是单位用”这样问的目的是要了解顾客是个人用户还是单位采购。

做销售最重要的一点就是要“强势”，在有些人看来强势是厉害一点，态度

蛮横一点，其实不然。强势是让你在跟顾客交流时能占有主动权，主动去引导顾客，使顾客跟着你的思路走下去，不要出现顾客带着你走的局面，这样销售产品会显的比较被动，换句话说顾客会欺负你，比如讨价还价，索要赠品等。如果你不能满足他的要求他就会拿不买来要挟你。

总的来说今天再看轻松销售法要比第一次看理解的更透彻一点，因为这毕竟是自己做零售的这一年来亲身经历的事情，想说的还有很多现在就分享到这里。@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@@2222

将客户依照其个性分解为17种类型，根据这些客户类型的谈话特点，我们相应采取一些沟通谈话的对策

1、健谈型

 客户可能只顾自己的感受畅谈，不要让夸夸其谈的顾客将你引入和销售会谈毫不相关的其他话题中，要抓住一切机会礼貌地将谈话引入正题。(经常会有被说晕的感觉,听对方滔滔不决的讲他们公司和公司的产品)

2、少言寡语型

这种客户说得太少，甚至你问一句他就答一个字，不然就是用“哼”、“啊”作答。然而，你不要失去耐心，尽量不要用封闭式的提问，提出一些不能仅仅用“是”或“否”回答的问题，选择开放式的提问打开他的话匣子。话语要显示出你获得信息的热情，来调动客户的积极性。要比平日更具耐性，直至客户开尊口，并示意客户说下去。（说了半天对方没音，还要来一个喂？一定不要出现这个景象,一定要多问客户）关键字“什么”、“哪里”、“告诉”、“怎样”、“为什么”、“谈谈”、“如何”

3、因循守旧型

 这种客户会聆听，但会在购买决策上磨蹭，如果不及时采取促成交易的行动或条件，时间消耗下去也将会失掉这单生意。要向客户指出信息带来的帮助，如果有非常合适的项目也可以提供给他，或提出来更好的方案。如果这次你的提案和以往有些不同也可以强调新方案的优势，说明与以往的不可比性。

4、反对型

 往往客户上来先表示反对，来挫你的锐气。事实上是要争取谈判的主动地位。有可能反对是无理的，但你尽量不要与其争论和回击、保持冷静，听他把话说完，同时面带微笑表示谈判还可以进行下去。一方面你抓住客户提出的需要（主要是执行效果的）表示可以调整方案

如果你能够现场就把方案调整过来了，马上再来询问“如果这样如此--------可不可以？”；另一方面把客户的意见加到方案中，来确认“您看是不是这样？”。＊若客户再反对，你可能要重新思考方案的价值了，＊给自己留后路先撤回来＊，请客户再给机会进行下一个方案＊。

5、胆怯型

这类客户往往是没有经验或没有决策权，不愿意负责。如果是他没有经验，要提供引导、保证和支持，帮助客户克服成交的担心心理，鼓励客户，证明他决策的正确，使其放松压力，表示你可以成为他信任的朋友。若是他没有决策权，一方面可以陈述方案的要点与效果的描述令他确信这是个好生意；再有就是请他引见

能够决策的人物出场。

6、自我为中心型

 这种客户具有优越感、愿意用以上对下的口吻讲话。保持上下的距离会令他有良好的感觉。仔细地聆听并且恭维他，在合适的时候，向他征询意见，把他的主意变成你的生意。（如果您的业务可以辅射到河北，天津就建议您用个北方区更划算，您看呢？）

7、果断型

 这类客户很自信，知道将要得到什么。如果方案得到认同不要给客户过多的销售解释，尽快将注意力提到合同要求上。对客户关心的内容只给必要的细节，要严格忠于事实，因为他可能是通过细节来验证他的判断。

8、精明型

 这类客户善于搬出不同方案进行比较，或用一方的信息销售人员的方案对付另一方信息销售人员，要应用巧妙的恭维来表达对他的判为讨价能力的赞赏，同时表示在象他这样如此精明的客户面前，你就遇到了识货的人/懂行的人/专家。这类客户是砍价的专家，甚至胡砍一通，你就更要采用“示弱”的姿态，点明对方的精明已经使你无利可图，要对方手下留情。（您可真是高手，我们从来没有过您这么多的增值服务，希望您今年用的好，能与您长期合作我非常荣幸）

9、质疑型

 这类客户会找到方案中的问题点提出怀疑，不要躲避问题，对他的反对做出反应，但不要和他争论，确实是你的问题就坦然承认，也别做过多解释，否则你越描越黑，给他感觉问题越来越大。若不是你的问题，只是对方虚张声势或小题大做，要敢于说话，应用逻辑和已证明的事实，有可靠的数据支持最好。

10、牢骚型

 这是个事事不顺心的客户，牢骚是他发泄和减压的方式。你要特别快乐，不要被他的心情所影响，力图找到困扰他的麻烦是什么，搞清是与你方案有关的原因还是除此之外的原因。是与你有关的原因，要听清楚，表示同情和关切。是你能解决的不妨表示可以帮忙试试，千万别都揽下来！有些你做不到。若不是你的原因，客户他发完了牢骚可能就好了。别让客户陷在牢骚里，乐观开导，转移话题，为了继续谈你的事。(立邦)

11、条理型

 这类客户做事缓慢，似乎对你提出的每句话都在权衡，你急他不急。你表示很急切，可能他会采取更保守的态度，或用你急切的心态压制你。调整你的步伐，和他保持一致，放慢速度，你可能还可以获取对方更多的需求信息，在给对方的方案还可以尽量向细节上扩展，使他有充分的时间接受如做些宣传方面的信息。最好在见面前就给他方案，留时间让他消化，但也要注意方案的周全性。

12、依赖型

 这类客户在做决定时需要有人帮助、参谋，来证明他决定的正确。你最好把参谋的角色担当起来。为了解客户的需要，在你可以在首次接触时就问他一些问题，然后在后面跟进时说明你的产品方案就是为他量身订做的，能最好地满足他的需要。在谈话时将上一次的结果作为这次的开始，“您上次要我做一个有关某某的计划，我给您做好了”“我把和您沟通的内容

做了一个方案,我给您发过去您看一下?”。在细节的处理上，可以解释为就是围绕客户的要求制定的13、挑剔型

 这类客户看好信息可能也不会说OK，因为至少他要与你讨价还价，还会提出一些不满意，实际上，他需要你的东西才会花精力与你谈判，你必须强调信息的好处,后期的增值服务,证明我们的信息值这个价钱，而且不要把你能守住的底价过早地报出来，留有还价的余地。再有，做让步的时候要让对方感到，你的每次让步都是不容易的。而且可以让对方付出一些代价，例如你答应客户提出的优惠的价格，但要让对方介绍几个客户等。

14、冲动型

这类客户很容易下结论，谈判的节奏也比较快。见面要直接步入正题，不要绕圈子，可以提出建议，通过这个建议客户就能直接提出结果。就是说结论要从客户的嘴里说出来。你要注意的是把合同带上，能签就签，不往后拖。

15、分析型

 这类客户喜欢数据、事实和详尽的解说，这种客户富有条理，如果对客户提案需要做些数据支持的准备，在提案过程中注意你的条理性，给客户的信息越多越好。结论最好是清楚的，不要模棱两可。(一般在和市场部策划部负责人谈判时会遇到这样的问题,特别是一些大企业)

16、感情型

 这类客户对个人感情看得极重，你应该和这类客户逐渐熟识，每次通话都带给他一个好消息或提到一个好消息，让他能高兴起来。全身心地投入谈话并且保持你对他的专注。和他建立日常联系，建立私人友谊对工作深有益处。

17、固执型

这类客户总是装出很重要的样子，摆老大的派头。他如果对方案明显地表示出错误和不专业也不要指出来，向客户表明你是极尊重他的，抬高客户，同时也抬高你自己，有可能的话向他致以真挚的夸奖。注意他流露出来的意向，抓住他的意思，把你的主意变成是他的主意通过的可能性就会大大提高。

 一流的公司卖标准

 二流的公司卖品牌

 三流的公司卖服务

 四流的公司卖产品差导化

 五流的公司在同质化的产品下打价格战

只要用心,一切皆有可能

销售是一份灵活的工作,只要用心去分析和维护每一位新老客户,那么一定可以做出卓越的成绩