实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

第一篇：实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

电转法

设计方案一：

感受态制备：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管； 4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml 10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；

5.再加入0.4ml 1 mol/L DTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min； 6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；

7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）； 8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。电转化：

1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10 ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；

2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；

3．立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h； 4．离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h； 5．离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。

设计方案二：

感受态制备：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜； 2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；

3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100 mM LiAc，10 mM DTT，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5），室温静置30min；

4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL 1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；

5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80 ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。电转化：

1.向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；

2.擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；

3.立即加入1ml 预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；

4.离心，弃上清，加入1mL YEPD后，于30℃、200rpm培养2h； 5.离心得菌体后，吸除550 ul上清液，然后按150 ul/板进行涂板。

说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。

设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞 具体如下：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中或转接于50mL YEPD中，在30℃、250-300rpm 条件下培养至OD=6-10（为防止菌体老化，可将50mL培养体系提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到预定的OD:6-10）；

2.取1mL菌液分装于EP管中，于4℃，12000rpm离心30s，弃上清； 3.收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；

4.所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；

5.离心，弃上清，加入1ml 1M 预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次； 6.最终用1M 预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80 ul，于-70℃冰箱保存； 7.电转方法同上。

8.每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。

备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4℃条件下。

醋酸锂转化法

方案一：

1.挑一环酵母菌接种于5mL YEPD培养基中，30℃、200rpm培养过夜；

2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；

3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体； 4.25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样； 5.用1mL 0.1M LiAc悬浮，离心收集菌体；

6.再用0.5mL 0.1M LiAc悬浮，以50 ul/管分装于EP管中，置于冰上备用； 7.依次向上述50 ul感受态细胞中加入50% PEG3350 ：240ul、1M LiCl：36ul、2mg/ml 单链DNA：50ul、转化DNA（5-10ug）：50ul； 8.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）； 9.30℃水浴孵育30min；

10.42℃水浴热休克20～25min；

11.13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1ml YEPD培养基，30℃摇床

孵育4h；

12.离心收集沉淀菌体，取除约800 ul上清液，然后按每100 ul/板进行涨涂板。

方案二：

1、接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2×107cells/ml；

2、取1mL一级种子分别接种于两瓶50mL YEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；

3、收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到1.5ml离心管； 4、1ml TE/LiAC（10×TE[0.1 M Tris-HCI,0.01 M EDTA,pH 7.5]；lO×LiAc[1 M LiAc pH 7.5）清洗细胞，然后用1×TE/LiAC重悬至2×109 cells/ml； 5、1.5ml离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA混合；

6、加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀； 7、30度振荡培养30min； 8、42度水浴热击15min；

9、离心5s，用1ml 1×TE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基。

附：

电转法方案二中的处量液配制方法：

1.A液成份：100 mM LiAc，0.6 M山梨醇，10 mM Tris-HCl，pH 7.5；配制量：500mL。

1.1 称取54.654g山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500 mL容量瓶中； 1.2 事先配制1 M LiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中； 1.3 事先配好1M Tris-HCl（pH 7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中； 1.4 用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4℃保存。2.B液成份（母液）：1 M DTT

配制量：20mL。2.1 称取3.09g DTT，加入到50mL小烧杯内； 2.2 加入20 mL的0.01M NaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um滤器过滤除菌； 2.3 适量分成小份后，-20℃保存。

3.在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液（A+B）。以50mL菌体为例：取A 液8mL，再取80ul 1 M DTT 于小三角瓶中混匀，备用。

第二篇：酵母转化问题参考

Ways to Destroy Your Yeast Transformation

by Emily Crow on 27th of July, 2011 in Cell / Tissue Culture

Transforming yeast with DNA is a very similar process to transforming E.coli, but with just enough differences to trip you up if you let your attention slip.Whether you’re doing a yeast two-hybrid screen, or using yeast as a model system, here are a some mistakes to to avoid…

1.Forgetting to add single stranded DNA

While E.coli readily takes up double-stranded DNA, yeast requires the addition of single-stranded “carrier DNA” to enhance uptake of your plasmid or fragment.If you only add your plasmid to the transformation mix, chances are you’ll be confronted with a pristinely sterile plate after three days of incubation.2.Using old PEG

PEG(polyethylene glycol)is a crucial ingredient in the yeast transformation buffer.Unfortunately, it’s annoying to make and goes bad quickly.The percentage of PEG will make or break the success of your transformation;an old PEG solution has had a chance to evaporate, so that the water to PEG ratio is off.If you can stand it, make new PEG for every transformation.Otherwise, make it in small batches, and seal tightly with parafilm between uses to minimize evaporation.3.Using cells in stationary phase

Cells in log phase, or exponential growth, take up DNA with much better efficiency.This is not to say that cells from a stationary culture can’t be transformed – only that your successful transformation rate will be much lower.Your best bet is to use cells that are growing rapidly at the time of transformation.4.Using the wrong selective marker

A stupid mistake, but one that I’ve made more times than I’d like to admit.Double check to save yourself some tears!

5.Cutting corners when heat-shocking

This is a major difference between E.coliand yeast transformations: while E.coli is relatively delicate, and requires a heat-shock of less than a minute to take up DNA, the cell wall makes yeast more hardy and resistant to shock.Thus, for efficient transformation, yeast are generally heat-shocked for up to 45 minutes.I’ve gotten away with as little as 15 minutes, but any shorter and the transformation efficiency is drastically reduced.If you’re not in a hurry, let it go the whole 45 minutes, or you’ll get to experience the joy of doing it all over again.

第三篇：转化方法和酵母质粒抽提

酵母转化（快速）

侯昕

1、挑单菌落于3ml 2XYPAD培养基中，30°C 200rpm培养至菌浓度为2X108 cell/ml。（约18h）。

2、用1.5ml离心管收集菌液两次，每次1ml，13500rpm，常温离心30秒。3、4、2mg/ml carrier DNA变性，100°C 5分钟，置冰上备用。在菌中依次加入

50％PEG3350

240ul

1M LiAc

34ul 2mg/ml S.S.carrier DNA

50ul plasmid DNA(各1ug)

36ul 每加入一种后，要吸打混匀。5、6、42°C水浴1－3小时。

13500rpm离心1分钟，吸弃上清。沉淀中加500ul水，吸打均匀，100ul涂皿。

7、30°C培养两天

此方法可用于已知蛋白互做检测，将两个质粒共转化。

2×YPAD：Yeast Extract

16g

2mg/ml carrier DNA：

Peptone

32g

鲑鱼精DNA（Sima D1626）

Glucose

32g

溶于水，低温放置过夜，灭

Adenine hemisulfate

80mg

菌后－20°C保存。

d2 H2O

800ml 酵母转化（高效）

侯昕

1、挑酵母单菌落于100ml SC液体培养基中，30°C，200rpm摇至菌浓度为2X107 cell/ml（稀释20倍，OD545或OD600为0.1）。※或挑酵母单菌落于50ml 2XYPAD液体培养基中，30°C，200rpm摇至菌浓度为2X108cell/ml（稀释200倍，OD545或OD600为0.1）。

2、用两个50ml离心管分别收集40ml菌液，3000g，常温离心5分钟。

3、将菌分别转入两瓶150ml 2XYPAD培养基中，扩大培养至菌浓度为2X107cell/ml。

4、用500ml离心管收集300ml菌液，3000g，5分钟。用 200mlddH2O洗两次，将菌转入一个50ml离心管。

5、2mg/ml carrier DNA变性，100°C 5分钟，置冰上备用。

6、配Mixture：

50％PEG3350

14.4Mml

1M LiAc

2.16ml 2mg/ml S.S.carrier DNA

3ml plasmid DNA＋ddH2O

2.04ml

7、把Mixture加入菌沉淀中，吸打均匀。

8、42°C水域热激45分钟；每5分钟摇一下，使其受热均匀。

9、3000g，离心5分钟，弃上清，菌沉淀中加40ml水，吸打均匀，涂皿，100－200u/皿。

此方法可用于酵母双杂交文库筛选，建议分步转化。

酵母质粒抽提

侯昕

1、收集菌液，10000g，离心10秒。

2、菌沉淀中加200ul YLS，牙签打散。

3、加200ul 苯酚氯仿异戊醇（25：24：1），摇5分钟，13000rpm，离心5分钟。

4、将上层转入一新离心管中，重复3。

5、将上层转入一新离心管中，加20ul 3M NaOAc（pH5.2）、500ul乙醇，摇匀，10000g，4°C离心10－30分钟。

6、750ul 75％乙醇洗，10000g，离心5－10分钟。

7、重复6。

8、吹干，加10－20ul 水或TE。

此方法得到的质粒可用于电转大肠杆菌

Yeast lysis solution（YLS）：

2％（v/v）

Triton X－100

1％（w/v）

SDS 100mM

NaCl 1mM

EDTA

第四篇：消化实验方法总结

《豆粕粉碎粒度与蛋白质体外消化率的关系研究》

采用胃蛋白酶-胰酶两步法，通过体外模拟鸡体消化道内环境来比较不同粉碎力度豆粕的蛋白消化率，从而确定适合肉仔鸡生长的较适宜豆粕粉碎力度。

平均粒径采用GB 6971-86 方法，体外试验采用Boisen和Fernandez等体外模拟消化方法。胃蛋白酶最适浓度的选择

1g豆皮→100ml三角瓶+25ml磷酸缓冲液（pH=6.0 0.01M）+10ml盐酸（0.2M）→温和搅拌+1ml(15mg/ml,30mg/ml,45mg/ml,60mg/ml,75mg/ml,90mg/ml)的新鲜胃蛋白酶溶液（由0.01M HCl 配制），pH=2.0 +0.5ml抑菌剂（青霉素+链霉素）→39℃恒温水浴中震荡6h,消化后+20%黄基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤→干燥后残渣凯式定氮法测蛋白质含量→计算蛋白质和干物质消化率。确定最适胃蛋白酶浓度为75mg/ml.胰酶最适浓度选择

在最适（75mg/m）胃蛋白酶液消化后的产物中加入10ml磷酸缓冲液（0.2M pH=6.8）+5mlNaoH(0.6M)+1ml(70mg/ml,90mg/ml,110mg/ml,130mg/ml,150mg/ml)的胰酶溶液（由磷酸二氢钾缓冲液配制）pH=6.8→39℃恒温水浴中震荡18h→消化后+20%磺基水杨酸5ml→室温静置30min→抽滤，干燥后残渣按照凯式定氮法测其蛋白质含量，计算粗蛋白和干物质消化率，确定最适胰酶浓度为110mg/ml。胃蛋白酶一胰酶两步法测定过程[1]

分别称取原样和过筛豆粕于三角瓶中，4个重复，使用最适浓度测定不同粒度豆粕蛋白和干物质含量，并通过氨基酸自动分析仪测其氨基酸含量，计算粗蛋白、干物质和氨基酸消化率。《燕麦粉添加量对面包营养组分含量和淀粉体外消化性的影响》 淀粉体外水解动力学测定

1g样品+50ml磷酸缓冲液（pH=6.9）→37℃水浴消化5min→取0.2ml消化上清液→1min后加入1mlα-淀粉酶溶液（40mg/ml 用DNS溶液配制）→37℃水浴继续消化→每隔15min分别取消化液0.2ml于25ml试管中+0.8ml蒸馏水+1mlDNS→沸水浴中煮沸10min→取出后+15ml蒸馏水，摇匀→空白管调零，采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的含量。采用0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00、2.50 mg/m L的葡萄糖溶液绘制标准曲表2，根据还原糖释放量的变化比较淀粉的体外消化性。《苦荞芽粉馒头品质及体外模拟消化研究》 甲醇提取液的制备

参照Bojana(2011)提取样品的方法并稍作修改。准确称取5g待提取的苦荞馒头样品浸没于50ml甲醇/水（80/20，v/v）溶液中，用均质机搅拌使样品破碎均质。样品液超声波提取15min，将悬浮液转移至离心管中。原样品再加入50ml甲醇/水（80/20，v/v），重复一次，合并提取液。2500r/min离心，取上清液于45℃水浴下蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到100ml，备用。酚含量测定

采用Folin–Ciocalteu法（FILIPCEV 2011）测定试样的总酚含量，并稍作修改。取500μL蒸馏水，加入125μL的标准溶液或提取液后，再加入125Μl Folin–Ciocalteu试剂，充分混匀后加入1.25ml 7%碳酸钠溶液，漩涡混匀后避光放置90min后于760nm处测定混合液的吸光值。以没食子含量为纵坐标（μg/ml），吸光度为横坐标，得回归方程为y=0.014X+0.041（R2=0.995）。按照测定没食子酸标准液吸光度的步骤测定待测液吸光度。黄酮含量测定

采用NaNo2-Al(NO)3方法测定。取一定浓度的样品水溶液0.1ml与0.2ml 5%NaNO2溶液，漩涡混匀后室温下放置6min，加入0.2ml 10%的ALCL3，振荡后静止6min，然后加入2ml 1M NaOH溶液，最后加水定容至5ml，放置15min后于波长510nm处测定混合液吸光值。以芦丁含量为纵坐标（μg/ml），吸光度为横坐标得回归方程为y=0.007x+0.030（R2=0.991）。按照测定芦丁标准液吸光度的步骤测定待测液吸光度。体外模拟消化过程

体外模拟消化过程参考Gawlik等人的方法，略作修改。

模拟唾液：2.38gNa2HPO4，0.19gKH2PO4，8gNacl和0.91gα-淀粉酶（220U/ml）溶于1升水中形成模拟唾液，用磷酸盐缓冲液调节溶液为pH=6.75。

模拟胃液：0.32%胃蛋白酶溶于0.3mol/L的Nacl，用HCL调节溶液pH=1.2。模拟肠液：0.05g胰蛋白酶和0.3g胆汁溶于35ml的NaHCO3（0.1mol/l）。

体外提取过程（S0）：准确称取6.0g荞麦馒头样品浸没于100ml甲醇水（80/20，v/v）溶液中，静置6h，悬浮液转移至离心管中，2500r/min离心10min，取上清液于45℃水浴下旋转蒸发至干，用甲醇重新溶解并定容到10ml，-20℃保存，备用。

口腔消化过程（S1）：准确称取6g样品置于100ml的烧杯中并加入30ml模拟唾液，用均质机搅拌使样品充分破碎均质后放入水浴摇床中，37℃振荡10min。

胃肠消化过程（S2）：取出水浴摇床中的样品，用3mol/l的盐酸调节溶液体系至pH=1.5后加入30ml模拟胃液，置于40℃水浴摇床中振摇60min。反应结束后取5ml的样液，于70℃的水浴锅中加热灭酶，经过模拟胃部消化的消化液用0.1mol/l的NaHCO3调节使溶液体系的pH=6，加入30ml胆汁胰酶的复合液，再分别加入5ml 1mol/l的Nacl和1mol/l KCl，置于37℃水浴震荡120min模拟肠道消化，于70℃的水浴锅中加热灭酶，-20℃保存备用。每个样品重复三次。

肠道吸收过程（S3）：将20ml剩余消化液转移到透析袋中，并将透析袋置于装有50ml PBS缓冲液的烧杯中，37℃水浴震荡4h。将PBS缓冲液转移到离心管中，-20℃保存备用，每个样品重复三次。

《羊奶婴儿配方奶粉中蛋白质体外模拟消化研究》 外模拟胃消化

体外模拟胃消化参照Johns[8]的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37℃水浴中预热10min，用1mol/L的HCl调乳液p H3。在每100m L乳样中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为3×106U)，于

37℃恒温摇床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH调节乳液p H值至7灭酶，测定其中蛋白质的胃消化率。体外模拟肠消化

体外模拟肠消化参照Johns[8]的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37℃水浴中预热10min，用1mol/L的Na OH调乳液p H7。在每100m L乳样中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为1.25×105U)，于37℃恒温摇床上消化水解2h，然后沸水浴5min灭活，测定其中蛋白质的肠消化率。体外模拟总消化

体外模拟总消化参照Johns[8]的方法并对其加以改进。将奶粉样品用蒸馏水配制成蛋白质质量分数为1%的乳液，于37℃水浴中预热10min，用1mol/L的HCl调乳液p H3。在每100m L乳样中添加3×106U胃蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为3×106U)，于37℃恒温摇床上消化水解1.5h，然后用lmol/L的Na OH调节乳液p H值至7。再向每100m L乳样中添加1.25×105U胰蛋白酶(即每克蛋白质对应的酶用量为1.25×105U)，于37℃恒温摇床上消化水解2h，然后沸水浴5min灭活，测定其中蛋白质的总消化率。燕麦全粉中蛋白质体外消化的测定

燕麦蛋白质的体外消化实验采用Wang[15]报道的体外消化模型进行,略有改动。具体操作如下:准确称取一定质量的样品分散于0.1 mol/L HCl中形成50 g/L的溶液,置于37℃水浴中预热5 min,以酶∶底物为1∶ 100加入胃蛋白酶,在37℃恒温振荡器上反应,分别在不同的消化时间(0、10、30、60、120 min)取样,用1 mol/L的NaOH调节pH7.0终止消化反应,120min所得的消化液调节pH7.0后,以酶∶底物为1∶ 100加入胰蛋白酶,在消化10、30、60、90、120min之后取样分析。

第五篇：实验总结-细胞培养方法

一、培养细胞常用配置

培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置：10 % DMSO + 90%胎牛血清 依次比例酌量配置。超净工作台常规配置

移液器1套（2.5μl、20μl、200μl、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50㎝2），定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200μl、10μl），培养皿，6/24/48/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管 所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMSO，胰酶，75%酒精……

实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶喷洒实验台面，并关闭工作台打开紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及胰酶恢复常温后使用，可37℃水浴5-10min

二、细胞复苏 步骤：

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。超净台内准备一支15ml离心管备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴中，快速摇晃，直至冻存液融化至黄豆粒大小后迅速取出。

5.将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加入4ml培养液，离心（1000r/min，5min）。6.取出2个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入5-10ml培养液；离心结束后用1ml培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。

7.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8.将培养瓶放入培养箱内培养

注意事项：

1.取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2.冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作用较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3.离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4.离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。

5.冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液

6.复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7.加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于0.5%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是 10％DMSO的话那么加10ml以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度

8.原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。

三、培养液的更换

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液（DMEM），恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸 5．拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基瓶内吸取5-10ml培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次后盖上。6.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7.将培养瓶放入培养箱内培养

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代。

四、细胞传代

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。

5.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。8.拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上，再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3次，悬空进入培养基皿内吸取5-10ml培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒2-3次盖上，在皿盖上做好实验标记。

9.将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

10.将培养瓶放入培养箱内培养。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水，且定期更换确保无菌。

每天定时观察细胞生长情况，一般72-96h后，细胞生长密度大于90%，即可进行细胞的传代或保株。

五、细胞株的保存

原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体肿胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。

实验步骤：

选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心(1000r/min，10分钟)。加入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80℃冰箱中。

1.紫外消毒30min后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作者的双手。

2.培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温，恒温水浴箱37℃预热20min，备用。

3.将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯，再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分别放于酒精灯的两侧。

4.将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次，盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1.5ml胰酶液，悬空移入培养瓶内。

5.将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬空沿皿壁加入培养皿内。6.将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min（消化时间根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。

6.吸取1ml培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可能处于单个悬浮状态。

7.将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min 8.预先配制冻存液：10 % DMSO + 90%胎牛血清。按需要配置一定数量备用 9.弃去培养基，用冻存液进行重悬混匀后，将1ml含有细胞的冻存液移入冻存管内，拧紧瓶盖，做好实验标记。

10.将培养基，胰酶瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。

8.将冻存管先放于4℃冰箱 30min后拿出放置-20℃冰箱过夜，次日再放于-80℃的冰箱内3-4天，最后存放于-196℃的液氮灌内长期保存。或直接放入梯度降温盒内，放入-80℃冰箱内过夜后最后存放于液氮罐内。（梯度降温盒内为甲醇，使用5次需要更换，每次使用需做好标记，使用前需恢复常温）

六、细胞转染

RNA干扰（RNA interference, RNAi）:  是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类:TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常录;

 PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

 由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，（长度超过三十的dsRNA会引起干扰素毒性）所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的治疗领域。

 病毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应。

作用机制

1)其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约21～23 bp），即siRNA。

2)siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。

3)RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。

4)siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。

5)RNAi发生于除原核生物以外的所有真核生物细胞内。需要说明的是，由于dsRNA抑制基因表达具有潜在高效性，任何导致正常机体dsRNA形成的情况都会引起不需要的相应基因沉寂。所以正常机体内各种基因有效表达有一套严密防止dsRNA形成的机制。

脂质体转染原理：

1.脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因而可用作外源物质进入细胞的载体 2.阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹人内，形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞，形成包涵体或进入溶酶体其中一小部分DNA能从包涵体内释放，并进入细胞质中，再进一步进入核内转录、表达

DNA转染步骤

1.转染前一天接种细胞于6孔板，0.5-2×105每孔，2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到90-95%每孔。

2.转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3.A液：DNA 5ug 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。

4.B液：脂质体使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5.B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6.将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7.孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8.第二天看细胞状态来决定是否换液。9.同时设立细胞对照组，空白转染组。

siRNA转染步骤

1)转染前一天接种细胞于6孔板（40x104），2ml无抗生素培养基每孔，第二天转染时细胞达到50-60%每孔。

2)转染前半小时换Opti-MEM无血清培养基1.5ml。

3)A液：siRNA 5ul（共100pmol）加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀。（siRNA按照说明书稀释）4)B液：脂质体（RNAimax）使用前轻轻混匀，脂质体10ul 加入245ul Opti-MEM无血清培养基，轻轻混匀，室温静止5min。

5)B液加入A液，用枪轻轻混匀，室温静止20min。

6)将混合液均匀分散慢慢滴加到6孔板细胞中，边滴加变前后左右十字交叉摇晃。

7)孵箱37℃培养48h（转染时间待定）。8)第二天看细胞状态来决定是否换液。9)同时设立细胞对照组，空白转染组。

使用RNAiMAX和AGS cell用于siRNA在6孔板上进行转染实验

1)提前配制GAPDH，NC，NV-FAM及各片段siRNA的20uM的稀释液，取附赠的DEPC水至管内，打开离心管前先离心，将附在管壁上的冻干粉离心下来 2)溶解时滴加适量的DEPC水后盖上管盖，震荡溶解：NC，NC-FAM溶解加入62.5ulDEPC水，其他siRNA片段加入125ul DEPC水

3)取6只EP管，分别标记GAPDH，NC，NV-FAM，三个片段名称，从管内吸取20ul的稀释液分装后

4)将稀释液至于-80度冰箱保存。

 转染前一天，在6孔板上接种40x104AGS cell，再取一个35mm培养皿接种40x104AGS cell，每孔放2ml不含抗生素的生长培养基。使细胞在转染的时候有50-60%的融合率

 从细胞中除去生长培养基

 每个孔中加入1.5ml新鲜不含血清的培养基，并准备如下混合物 1)A液：(取7个EP管，分别标记空白，GAPDH，NC,NC-FAM,三个片段)。在250ul的opti-mem终加入100pmol siRNA（稀释好的siRNA浓度为20uM，100pmol的siRNA需要取5ul），混合均匀

2)B液：（取一个EP管标记RNAiMAX），RNAiMAX 使用前摇匀，在250ul X7.2=1800ul的opti-mem加入6ul X7.2=43.2ul的RNAiMAX，稀释RNAiMAX混匀后并在室温下温育5min 3)混合A液和B液，混匀B液后吸取256ul至A液中室温下温育20min  将混合物混匀后加入到含AGS的6孔板与35mm培养皿中，每孔终体积为2ml，则加入混合液500ul，并轻摇混匀  在37℃的二氧化碳培养箱中培养5-6小时  更换含血清的培养基并培养细胞24-48小时 24-48小时后收细胞跑WB，看沉默效果