实验四 植物DNA的提取[定稿]

第一篇：实验四 植物DNA的提取[定稿]

实验四

植物DNA的提取

一、实验目的

掌握CTAB法从植物叶片提取DNA的原理和方法。采用CTAB法从植物叶片中提取基因组DNA，并进行纯度分析。

二、实验原理

1、核酸提取的基本原理

核酸是生物有机体中的重要成分，在生物体中核酸常与蛋白质结合在一起，以核蛋白的形式存在。核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)两大类，在真核细胞中，前者主要存在于细胞核中，后者主要存在于细胞质及核仁里。在制备核酸时，通过研磨破坏细胞壁和细胞膜，使核蛋白被释放出来。

在浓氯化钠溶液(1～2 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很大，RNA核蛋白的溶解度很小；而在稀氯化钠溶液(0.14 mol／L)中，DNA核蛋白的溶解度很小，RNA核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来。分离得到核蛋白后，需进一步将蛋白等杂质除去，常采用的去除蛋白的方法有3种：①用含异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液，使其乳化，然后离心除去变性蛋白质，此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间，而DNA溶于上层水相。用两倍体积的无水乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来。如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀，得到的是游离的DNA。②用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性，与核酸分离，从而从材料中直接提取出DNA。③用苯酚处理，然后离心分层，DNA溶于上层水相，蛋白变性后则停留在酚层内。吸出上面水层，加两倍体积的无水乙醇溶液，得到白色纤维状DNA沉淀。反复使用上述方法多次处理DNA核蛋白溶液，就能将蛋白等杂质较彻底地除去，得到较纯的DNA制品。为了彻底除去DNA制品中混杂的RNA，可用RNA酶处理。生物材料中含有的脂肪物质和大部分的多糖，在用盐溶液分离核蛋白和用乙醇或异丙醇分级沉淀时即被除去。

在DNA提取、制备的过程中，核酸极不稳定，许多因素可破坏其完整结构：①化学因素，核酸的结构在pH值4.0～11.0间较稳定，pH值在此范围外就会使核酸变性降解，故制备过程应避免过酸过碱。②物理因素，DNA分子链很长，是双螺旋结构，既有一定的柔性，又有一定的刚性，故强机械作用如剧烈搅拌会令DNA分子断裂，不利于收集，应加以避免。③酶的作用，细胞中普遍存在的核酸酶在细胞壁或膜遭到破坏时被释放出来，它会降解DNA分子。故须用酶的变性剂、抑制剂使之失活。操作过程最好在低温(0℃左右)下进行。常用的酶抑制剂有柠檬酸盐、氟化物、砷酸盐、乙二胺四乙酸盐、(ETDA-Na)等。SDS和苯酚作为蛋白变性剂，同时可使核酸酶被破坏而失活。

2、CTAB法和SDS法的提取原理

（1）CTAB法是一种快速简便的提取植物总DNA的方法.。CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种阳离子型去污剂，它不仅能使蛋白质变性，而且还能与核酸形成特异的核酸-CTAB复合物，这种复合物溶于高盐缓冲液（≥0.7M NaCl），降低盐浓度，通过超速离心能选择性地沉淀核酸，并与多糖等可溶性杂质分开，CTAB-核酸复合物再用70-75%乙醇浸泡可脱掉CTAB。提取时先将新鲜的叶片在液氮中研磨，破碎其细胞，然后加入CTAB分离缓冲液，将DNA溶解出来，再经氯仿－异戊醇抽提除去蛋白质，最后通过异丙醇沉淀或低盐离心得到DNA。

（2）SDS法也是提取植物DNA的常用方法。先将新鲜的叶片在液氮中研磨以机械力破本碎细胞壁，然后加入SDS使细胞膜破裂，并同时将蛋白质和多糖等杂质与核酸分开。加入KAc可使SDS—蛋白质复合物转变为溶解度更小的钾盐形式，使沉淀更加完全。

3、DNA的浓度测定和纯度分析

（1）定磷法：是对样品中核酸（DNA和RNA）含量的准确定量。将样品中的核酸用强酸（硫酸或高氯酸）消化成无机磷，然后用定磷试剂对生成的无机磷酸进行滴定。定磷试剂是酸性钼酸铵溶液，钼酸铵能与无机磷酸定量结合成磷钼酸络合物，该络合物能被抗坏血酸等还原剂还原成兰色的钼蓝，在660nm处有最大光吸收。

（2）紫外光吸收法：核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。1ug/mL的DNA溶液A260=0.020，1ug/mL的RNA溶液或单链DNA的A260=0.022~0.024。1个A260相当于50ug/mL的DNA、40ug/mL的RNA。蛋白质的最大吸收在280nm，多糖的最大吸收在230nm。纯的DNA的A260/A280在1.8左右，纯的RNA的A260/A280在2.0左右。

三、试剂和器材：

(1)1M Tris-cl（pH8.0）：Tris l21.1g溶于蒸馏水，用浓HCl调至pH8.0以蒸馏水定容至1000ml(2)CTAB分离缓冲液： 2g CTAB，8.18g NaCL，0.74g EDTA.Na2.2H2O，10mL 1mol/L的Tris-HCL(pH8.0)，0.2mL巯基乙醇，加水定容到100mL。

(3)洗涤缓冲液（70%乙醇，10mmol/L乙酸铵）：70mL无水乙醇，0.077g乙酸铵，加水到100mL。(4)TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCL（pH7.4），1mmol/L EDTA(5)氯仿:异戊醇=24:1(6)液氮

(7)研钵，恒温水浴（37～100℃），离心机，离心管。

四、操作方法：

(1)将10mlCTAB分离缓冲液加入50ml离心管中，置于65℃水浴中预热。(2)称取1.5g叶片，置于预冷的研钵中，倒入液氮，尽快将叶片研碎。(3)取1g粉末直接加入预热的CTAB分离缓冲液中，轻轻转动使之混匀。

(4)样品于65℃保温30分钟，每5～10分钟混匀一次。(5)加等体积（10ml）的氯仿－异戊醇，轻轻颠倒混匀。(6)室温下4000r/min离心10分钟。

(7)用胶头滴管将上层水相吸入另一干净的离心管中（注意不要吸动悬浮的细胞碎片和中间白色的蛋白质层），向离心管中加入2/3体积的异丙醇，轻轻混匀，使DNA析出。（有些情况下，这一步可以产生云雾状的DNA析出，如果看不到云雾状的DNA，样品则可以在冰浴中放置数小时甚至过夜）。(8)用下述方法收集DNA：

如果呈云雾状的DNA析出，则用玻璃棒在云雾状的DNA中轻轻转动，缠起DNA，然后将玻璃棒转移至20mL洗涤缓冲液中浸泡洗涤10分钟（不要将DNA沉淀从玻璃棒上弄掉）。

如果看不到云雾状的DNA，可将离心管在4000r/min离心5分钟，小心地倒掉上清液，在松散的沉淀上加20mL洗涤缓冲液，轻轻转动离心管，洗涤核酸沉淀10分钟，然后离心，小心地倒掉上清液，让DNA沉淀自然干燥20分钟。(9)用玻璃棒缠出DNA，在室温下使DNA自然干燥20分钟。(10)

将自然干燥的DNA溶于1mLTE缓冲液中，—20℃保存备用。

(11)

取100uL稀释20倍，测定A260，A280，A230，或作出吸收波谱200~400nm并计算浓度和得率。

(12)

取5~10uLDNA溶液做0.7%的琼脂糖电泳，检查DNA的大小和质量，以λ-DNA/HindⅢ做分子量标准，另取5uL做限制性酶切。

注意；所有操作均须温和，避免剧烈震荡。

五、思考题

1、CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用是什么？

2、吸取样品、抽提、及电泳时应注意什么？为什么？

第二篇：实验四动物血液中DNA的提取-教案

授课教师常祖明学生人数 55

课题血液基因组DNA的提取

授课类型新授课授课方法讲授、演示 教学用具多媒体、实验室设备

教学目的掌握鸡血DNA提取的原理及方法

教学重点理解实验过程中每一步操作的目的及原理 教学难点 教学过程

一、实验目的

1.掌握鸡血DNA提取的原理；

2.掌握鸡血DNA提取的方法及操作过程。

二、实验原理

哺乳动物的成熟红细胞已经高度分化，因而当中没有细胞核，无法提取DNA。禽类的血细胞则可以。禽类代谢旺盛，血液中红细胞更多，而且红细胞中有完整的细胞核、大量的染色体。且材料易得、经济。用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。

三、实验仪器 1.水浴锅：55℃

2.离心机：8000转、12000转 3.离心管：5ml（120个）

4.移液枪：10μl、680μl、700μl、800μl、900μl、1ml 5.容量瓶：100ml 6.取血针及管

四、实验材料及药品

实验材料：普通家鸡：需血液4.08ml（每管136(l）1.无水乙醇

作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。

商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。

理化性质：无色澄清液体。有灼烧味。易流动。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。2.柠檬酸

作用：ACD抗凝血剂成分之一。在抗凝剂中，中和柠檬酸钠的碱性。商品信息：分析纯AR，白色塑料瓶/500g，理化性质：无臭，有很强的酸味，白色粉末或颗粒，易溶于水和醇。在潮湿的空气中微有潮解性。

储存：在湿空气中有轻微潮解，需阴凉密封干燥保存。

危害：柠檬酸浓溶液对黏膜有刺激作用。柠檬酸可燃。粉体与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热或与氧化剂接触，有引起燃烧爆炸的危险。3.柠檬酸钠

作用：ACD抗凝血剂成分之一。能与血液中的钙离子结合成螯合物，而使钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固。

商品信息：柠檬酸三钠分析纯500克/瓶。

理化性质：有机化合物，外观为白色到无色晶体。无臭, 有清凉咸辣味。常温及空气中稳定, 在湿空气中微有溶解性, 在热空气中产生风化现象。加热至150℃失去结晶水。易溶于水、可溶于甘油、难溶于醇类及其他有机溶剂，过热分解，在潮湿的环境中微有潮解，在热空气中微有风化，其溶液 pH 值约为8。储存： 常温密闭保存 危害：无毒 4.尿素

作用：禽血裂解液成分之一。尿素能非常有效地使蛋白质变性，尤其能非常有效地破坏非共价键结合的蛋白质。

商品信息：化学试剂分析纯 500克/瓶（塑料瓶装）理化性质：无色柱状结晶或白色结晶性粉末，溶于水，乙醇和苯，难溶于乙醚，不溶于氯仿。储存：密封避光保存。

危害：避免与皮肤和眼睛接触。5.十二烷基硫酸钠(SDS)作用：禽血裂解液成分之一。裂解核酸-蛋白质复合体，用于从蛋白质中分离核酸。商品信息：500g/分析纯AR。

理化性质：白色或淡黄色粉末。溶解性：溶于水，呈透明溶液，溶液呈中性。易溶于热水，溶于水，溶于热乙醇，微溶于醇，不溶于氯仿、醚。储存：密封阴凉干燥保存 防止受潮受热 危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用，对眼和皮肤有刺激作用。可引起呼吸系统过敏性反应。该品可燃，具刺激性，具致敏性。遇明火、高热可燃。受高热分解放出有毒的气体。6.1M Tris-HCl(PH8.0)缓冲液

作用：禽血裂解液成分之一。提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏 商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液

理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。

储存：室温保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。7.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）

作用：配制0.5M EDTA（PH8.0）溶液。螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。商品信息：瓶/250g。理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。

储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。

危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。8.蛋白酶K（共需300μl，每管10μl）作用：消化组蛋白，释放出DNA；消化DNase，提高DNA产量 商品信息：（20mg/mL）1ml/支。

理化性质：一种枯草蛋白酶类的高活性蛋白酶，从林伯氏白色念球菌中纯化得到。储存：保存在－20℃冰箱里，避免反复冻融，有效保证12月。危害：使用时注意不要接触皮肤，以免损伤皮肤表面的蛋白质。9.Tris饱和酚（共需60ml，每管2ml）作用：强蛋白质变性剂。商品信息：瓶/250ml。理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。

储存：4℃避光保存。

危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。10.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的迹量酚。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色透明重质液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。储存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。11.异戊醇

作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。12.无水葡萄糖

作用：ACD抗凝血剂成分之一。商品信息：500g/瓶。

理化性质：无色结晶或白色结晶性粉末；无臭、味甜。水中易溶，在乙醇中微溶。储存：无水葡萄糖易吸水结块，因此应密封保存。危害：无。

五、实验试剂 1.75%的乙醇

{75ml + 25ml水} → 100ml75%的乙醇

2.ACD抗凝剂 100ml（共需48ml，每管0.8ml）

{柠檬酸0.48g + 柠檬酸钠1.32g + 葡萄糖1.47g} →加水至100ml，灭菌后备用。3.禽血裂解液 100ml（共需51ml，每管1.7ml）

{尿素12g + SDS 1g + 1M Tris-HCl(PH8.0)10ml + 0.5M EDTA(PH8.0)20ml} →加水定容至100ml，备用。

【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。4.氯仿-异戊醇（24:1）共需54ml，每管1.8ml {氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存

5.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）共需60ml，每管2ml {氯仿-异戊醇（24:1）40ml + Tris饱和酚40ml} = 80ml，4℃保存 6..TE缓冲液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → →定容到50ml →高压灭菌后冷却4℃保存 【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {水 80ml + EDTA-2Na 18.61g} →用NaOH（约2g）调至PH8.0 →定容至100ml →分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} →定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液

六、实验步骤

1.采用翅静脉采血，抽取血液5mL，溶于20mL 75%的乙醇中，振荡混匀，配成家鸡血样25ml（酒精：血＝4：1）目的：乙醇可以抑制DNA水解酶的活性，防治DNA降解，并且75%有防止血液凝固的作用。75%乙醇效果比无水乙醇效果好，血样不至于太干涩。酒精:血(4:1)混合的血样保存时间长，可达4个月。

2.取血样(酒精:血＝4:1)680(L至5mL离心管中，8000转离心1分钟，弃上清； 目的：去除血样中大部分的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。

3.加800(LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；再加800(LACD摇匀，8000转离心1分钟，弃上清；

目的：ACD抗凝剂可以螯合血液中的钙离子，防治血细胞凝集成团凝固，影响血细胞的破碎和对血细胞里DNA的提取。多次离心可以去除血样中的乙醇，保证后面蛋白酶K的活性。4.加1700(L裂解液，10(L蛋白酶K（100(g），摇匀，55℃水浴保温过夜； 目的：DNA裂解液的作用是破坏细胞膜、核膜,并使组织蛋白与DNA分离，抑制细胞中DNase的活性；而蛋白酶k的作用是将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来，蛋白酶k还可以消化DNAse，提高DNA产量。55℃水浴保温过夜可以让蛋白酶K充分发挥作用。

5.加2mL饱和酚，摇匀至无块状物，12000转离心10分钟；

目的：饱和酚是强蛋白质变性剂，可以将蛋白质及降解后的产物充分变性，变性后的蛋白质溶解度减低，易沉淀。

6.吸取上层透明的DNA溶液至另一5mL离心管中，注意不要搅拌下层的酚－蛋白层；

目的：加入饱和酚后溶液分层，上层是透明的DNA溶液，再往下是变性的蛋白质，饱和酚的比重最大在最下层。

7.加2mL酚-氯仿-异戊醇（25：24：1），摇匀至悬浮液，12000转离心10分钟； 目的：加入酚-氯仿-异戊醇进一步去除DNA溶液中的残留蛋白质。

8.吸取上层DNA液于另一5mL离心管中，加1.8mL氯仿-异戊醇溶液，摇匀，12000转离心10分钟； 目的：由于酚与水有部分混溶，DNA水溶液中会混有部分酚，由于氯仿和酚互溶而不溶于水，用氯仿-异戊醇在抽提一次可以把酚带走。

9.吸取上层DNA液900(L于另一5mL离心管中，加无水乙醇至满，颠倒混合，试管中出现白色团块，即是DNA；

目的：DNA水溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇与DNA不相溶但与水相溶，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合收集。用无水乙醇的目的是乙醇中如果含有水，DNA会部分溶于水中，降低DNA沉淀的产量。

10.吸出试管中的无水乙醇，加75%的乙醇，混合，吸出75%的乙醇，重复2次；

目的：像前面步骤中加入的抗凝血剂中的柠檬酸钠、葡萄糖，裂解液中的SDS、EDTA-2Na，在氯仿及醇中的溶解度低，经乙醇沉淀后的DNA中会有以上杂质存在。以上杂质有个共同的特征就是都易溶于水，故用75%的乙醇洗涤，可以利用其中的15%的水溶解这些杂质除去。11.将DNA自然晾干后溶入1000(L TE缓冲液，-20℃保存；

目的：乙醇已挥发除去，TE缓冲液一可以抑制Dnase活性，二维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。

七、实验注意事项

1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作； 2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；

3.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔； 4.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；

5.吸出试管中的无水乙醇时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。

八、思考题

1.本实验中几次用到的不同浓度乙醇的作用是什么？

九、实验安排

全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。每组作3个离心管，共用一个研钵。

每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。

第三篇：实验四 植物RNA的提取及其电泳鉴定2

实验四 植物RNA的提取及其电泳鉴定

一、原理植物细胞内含有细胞质RNA、细胞核RNA和细胞器RNA。细胞质RNA包括mRNA、rRNA、tRNA。细胞核RNA主要有细胞质RNA的前体及小分子细胞核RNA(snRNA)、染色质RNA(chRNA)等。细胞器RNA主要指线粒体RNA及叶绿体RNA。这些RNA统称细胞总RNA，其中大量的是rRNA，占80％左右。基因转录产物mRNA在总RNA中只占1％～5％。不同的mRNA在分子大小、核苷酸序列，以及在细胞内转录水平等方面各不相同，但真核细胞mRNA 3ˊ末端都具有20～200个不等的多聚腺苷酸的尾，称为poly(A)结构。利用poly(A)结构可以把mRNA从总RNA中分离出来。对于Northern杂交可以使用植物细胞总RNA，也可以使用由总RNA中分离出的mRNA。

植物细胞RNA提取中的主要问题是防止RNA酶的降解作用。RNA酶是一类水解核糖核酸的内切酶，它与一般作用于核酸的酶类有着显著的不同，不仅生物活性十分稳定，耐热、耐酸、耐碱，作用时不需要任何辅助因子，而且它的存在非常广泛，除细胞内含有丰富的RNA酶外，在实验环境中，如各种器皿、试剂、人的皮肤、汗液、甚至灰尘中都有RNA酶的存在。因而，生物体内源、外源RNA酶的降解作用是导致RNA提取失败的致命因素。

内源RNA酶来源于材料的组织细胞，提取自始至终都应对RNase活性进行有效抑制。RNA提取过程中将蛋白质变性剂与RNase抑制剂联合使用效果较理想。蛋白质变性剂包括酚、氯仿、SDS、Sarkosyl(十二烷酰肌氨酸钠)、DOC(脱氧胆酸钠)、盐酸胍、异硫氰酸胍、4—氨基水杨酸钠、三异丙基萘磺酸钠等；RNA酶抑制剂有RNasin(RNase阻抑蛋白)、氧钒核糖核苷复合物等。

外源RNA酶的抑制主要是使用DEPC(焦碳酸二乙酯C2Hs-O-CO-O-CO-O-CxH5)，它能与RNase分子中的必需基团组氨酸残基上的咪唑环结合而抑制酶活性，用于水、试剂及器皿的RNase灭活。DEPC与肝素合用效果增强，值得注意的是DEPC在Tris溶液中很不稳定，很快分解成CO2 及C2H5OH，因而不能用于Tirs溶液的RNase灭活。水及其它溶液的灭活一般使用0.05％～0.1％DEPC，37℃处理过夜，也有人采用磁搅0.5小时以上的做法。DEPC处理后的溶液还需高压灭菌，以去除残存的DEPC。若DEPC去除不净，会破坏mRNA活性。不能高压灭菌的试剂要使用经过DEPC处理的灭菌蒸馏水配制，然后用0.22μm 滤膜过滤。含有Tris的试剂用经DEPC处理过的水配制，再经高压消毒。玻璃器皿可以在180℃烘烤8小时以上，不能烘烤的器皿用0.1％的DEPC水处理过夜后再高压灭菌。

提取全过程必须在清洁无尘的环境中进行。操作人员要使用一次性的手套拿取物品，尽可能避免一切污染机会。提取时使用的器皿应经过硅烷化处理，以防止RNA被吸附在器皿壁上，造成损失。RNA电泳使用的电泳槽需用去污剂洗涤，水冲洗，乙醇干燥。再浸入3％ H202溶液中，室温下放置10分钟以上，再用DEPC溶液处理过的水冲洗干净。总之，实验中所用的试剂、器皿都要经过RNase灭活处理。尽管如此，有时还会出现在提取的后期RNA被降解的问题。这是因为RNase活性的抑制只是一个暂时的现象，一旦抑制剂浓度下降RNase就有可能恢复活性。对于RNA提取来说，这是一个潜伏的危险。在提取的前阶段，提取液中无疑是有足够的抑制剂，但到了提取后期，抑制成分逐渐减少，残存的RNase就会复活而引起RNA降解。另外，提取后期发生的RNase污染，那怕是极轻微的，也会使到手的产品降解，因而提取后期要更加小心。

影响植物RNA提取的另一个问题是水溶性的细胞代谢物如酚、多糖等易与RNA结合成胶冻状的不溶物或有色的复合物，它们能影响RNA的质量及产量。人们采用了多种处理方法来解决这个问题，如对组织提取液进行高速离心去除多糖；采用低pH值的提取缓冲液抑制酚的解离及氧化；或用β—巯基乙醇、PVP来抑制酚类的干扰等。

（一）总RNA的提取

用于研究基因表达的总RNA提取时首先要考虑的问题是材料的选取及预处理。由于基因表达与生理状态密切相关，因而取材时必须考虑材料的生理状态，必要时还要对材料进行预处理，即施加某种因素，诱导目的基因表达，如进行光照、暗处理、或加入诱导物等。

材料的破碎与植物细胞总DNA的提取相同，采用液氮冷冻及在液氮中研磨。预处理过的材料要尽早地投入到液氮中，投入前要尽可能保持材料完整及新鲜，不要让材料压碎及破损。因为植物材料在破损时会引起多酚类物质的积累及氧化，使组织变褐而影响RNA分离。细胞膜裂解也与DNA提取相同，主要使用SDS或Sakosyl、酚等。

由于细胞内RNA主要以核蛋白体形式存在，所以总RNA提取的路线是细胞破碎，使核蛋白体从细胞内释放；采用使蛋白质变性的做法，令核蛋白体解析，RNA迅速与蛋白质分离，大量地释放到溶液中；然后用酚、氯仿有机溶剂抽提，去除蛋白质杂质，使核酸进入水相；再选择性沉淀RNA，使之与DNA分离；所得RNA再进行必要的纯化，最后用乙醇或异丙醇沉淀RNA。

至于植物细胞总RNA的提取方法，同植物总DNA提取一样，没有一种固定的通用方法。文献中报导的植物细胞总RNA的提取方法很多，但综合起来看，分离的主要依据不外乎如下几点：① 用酚及去污剂SDS或Sakosyl破碎细胞膜并去除蛋白质；② 酚、氯仿反复抽提纯化核酸；③ LiCl选择性沉淀去除DNA及其它不纯物；④ 3mol／L乙酸钠(pH6)沉淀RNA，DNA在上清液中；⑤ CsCl密度梯度离心，去除多糖等杂质，纯化RNA。

目前用于Northern 杂交植物总RNA提取方法根据主要试剂可分为苯酚法、异硫氰酸胍（或CTAB）法及氯化锂沉淀法：

1、苯酚法：该法利用苯酚协助破碎细胞；酚／氯仿变性蛋白质并反复抽提核酸；3mol／L乙酸钠选择沉淀RNA；提取液中使用4—氨基水杨酸及三异丙基萘磺酸盐抑制RNase活性。该方法操作简单、经济，可用于从植物叶、茎、根及萌发幼苗中提取总RNA或核RNA。

2、异硫氰酸胍法：异硫氰酸根及胍离子都是很强的蛋白质变性剂。异硫氰酸胍与十二烷基肌氨酸钠合用可使核蛋白体迅速解体；与还原剂β—巯基乙醇合用能强烈抑制RNase 活力，因而是制备RNA的一种常用试剂。

传统的异硫氰酸胍法需利用CsCl离心分离RNA(沉到管底)。这种做法操作时间长、设备要求高。经改进，目前使用的方法使操作大大地简化，并可同时提取多个样品。做法是将异硫氰酸胍、β—巯基乙醇、十二烷基肌氨酸钠三者合用，强有力抑制了RNA降解，增加了核蛋白体的解离，将大量的RNA释放到溶液中，然后用酸性酚进行抽提，既可保证RNA稳定，又可抑制DNA解离，使DNA与蛋白质一起沉淀，RNA被抽提进入水相，用异丙醇沉淀RNA后，经酚／氯仿再次抽提进行纯化。该方法提取的RNA 用于Northern 杂交可以得到满意结果。

3、氯化锂沉淀法：该方法的主要原理是在一定的pH条件下，Li+使RNA发生特异性沉淀，通过多级沉淀可提高RNA的纯净度。利用氯化锂选择性沉淀时，因提取缓冲体系不同有多种不尽相同的氯化锂法，有的使用硼酸缓冲液，加入还原剂二硫苏糖醇抑制RNase活性，用SDS变性核蛋白；有的使用Tris—HCl缓冲体系，用苯酚及蛋白酶K处理蛋白；还有的使用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RNase。氯化锂沉淀法虽也有效，但沉淀过程较为繁琐，并存在着Li+的污染问题。

（二）mRNA的分离

从总RNA中分离mRNA主要是利用亲和层析的原理。植物mRNA的3ˊ—端具有poly(A)结构，可用oligo(dT)—纤维素(寡聚(dT)—纤维素)或Poly(U)—Sepharse(多聚(U)—琼脂糖)亲和层析技术来纯化mRNA。总RNA在流经寡聚(dT)—纤维素层析柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 3／—端多聚(A)残基与连接在纤维素柱上的寡聚(dT)残基间配对，形成氢键，使mRNA被吸附在柱上。不具poly(A)结构的RNA，不能发生特异性结合而从柱中流出。结合在柱上的mRNA可以用低盐缓冲液或蒸馏水洗脱。因为在高盐溶液中碱基间的氢键稳定，在低盐状态下易解离，水打破poly(A)与(dT)间的氢键，使mRNA洗脱。

层析中涉及到的缓冲液有两种，一是上样缓冲液，也有人称结合缓冲液。各文献报道的结合缓冲液都由Tris·C1、EDTA、氯化物盐类及去污剂组成。不同之处是有的使用0.5mol/L的NaCl、有的使用0.5mol／L的LiCl。不管使用哪种盐，都为高浓度，以促进poly(A)与寡聚(dT)结合。第二种是洗脱缓冲液，除Tris、去污剂的浓度减半外(也有Tris 量不减半的)，最大的变化是不含氯化物或含低浓度的LiCl。其作用是解除Poly(A)与寡聚(dT)的结合，使mRNA洗脱下来。

在没有特制的层析柱时，可以用无菌硅化的巴斯德吸管或lml的注射器做层析柱，出口端用无菌硅烷化过的玻璃纤维填充。寡聚(dT)纤维素用上样缓冲液悬浮后装柱。柱体积在0.25ml左右。装柱后用0.1mol/L 的NaOH 洗柱，上样缓冲液平衡。RNA的样品量一般在2~5mg，体积为lml左右。上样前样品要经过变性处理，置沸水浴中加热数分钟后立即置冰浴中。上样后就要立即收集流出液，这时流出液中可能含有一些未能与纤维素结合的mRNA。将流出液加热至65℃维持6~7分钟，然后快速冷却再重新上样，如此反复多次，以使mRNA充分被吸附在纤维素柱上，用5~10倍体积的结合缓冲液洗柱，这时rRNA、tRNA 等逐渐被冼脱，而mRNA挂在柱上。洗脱至流出液的OD260值几乎为零，换用低盐的洗脱缓冲液洗脱mRNA，部分收集器收集，测定每管中的mRNA浓度，合并含mRNA的洗脱液，用乙醇沉淀mRNA，于-70℃保存。

（三）RNA样品质量检测

用于Northern杂交的RNA样品应是纯净的，无明显的DNA、蛋白质污染，无小分子有机物复合，无提取试剂的污染。分子完整，无严重降解。同DNA样品质量检测相同，主要有紫外吸收法及琼脂糖凝胶电泳法两种。

1、紫外吸收法

① 纯度检测：在分光光度计上分别测定样品在230nm、260nm、280nm的吸收值，计算A260/A280及A260／A230的比值。纯净的RNA样品A260/A280的比值应在1.7~2.0之间，若小于1.7则表明样品中有蛋白质或酚试剂污染。此时，可用等体积的酚／氯仿重新抽提去除蛋白质；用氯仿、乙醚抽提去除残酚。在抽提过程中RNA损失较大(约60％)。A260/A230的比值应大于2.0，如小于2.0则表明RNA被异硫氰酸胍污染。这时可以通过乙醇或异丙醇重新沉淀(可反复几次)来去除。关于DNA杂质的存在与否紫外分光光度法不能予以明确说明。

② 浓度测定：纯净的RNA样品(无DNA及核苷酸杂质)260nm的光吸收值等于1.0时，RNA的含量为37 µg/m1。根据此吸收值与浓度的关系可求出任一RNA样品的浓度。

RNA含量(μg／m1)＝A × 稀释倍数× 37 μg／m1 当对含量要求不十分精确时，可近似认为A260=1.0 时的RNA浓度为40µg/m1。测定时如果按如下做法可使计算简化：取4µl RNA样品，加蒸馏水至lml，以蒸馏水或TE为空白测定A260值，该数值× 10 即为样品RNA浓度(µg/µl)。

2、琼脂糖凝胶电泳法

由于RNA分子结构与DNA不同，因而RNA电泳时有着与DNA电泳的不同之处。因RNA为单链分子，链内配对碱基很易通过氢键结合而形成二级以至三级结构。不同的RNA分子空间结构不同，因而RNA分子在未变性的条件下分子量与泳动率无严格的相关性。在变性条件下电泳，破坏RNA的空间结构，才能使RNA的泳动距离与其分子量对数值成正比。变性后的RNA泳动速度比天然RNA小1/2左右。在不需要测定RNA分子量时，使用浓度1.0％~1.4％的非变性琼脂糖凝胶也可将不同的RNA分子分离。当需要对所提取的RNA样品进行快速检测时可使用非变性胶。

总RNA样品中的主要成分是28S的rRNA、18S的rRNA及5SrRNA。电泳后在胶板上呈现三条明显的条带。在上样量小时，5SrRNA的条带有时显示不清。若在变性胶上，这三条带的迁移率分别与5.1kb、2.0kb 及0.12kb 的标准RNA的迁移率相近。从量上看，溴化乙锭染色后28SrRNA条带的亮度应为18SrRNA的两倍。如果28SrRNA的亮度不如18SrRNA条带，表明样品中RNA有降解。发生降解的原因主要是RNase灭活不好，或操作中温度过高。防止的方法是操作全过程在4℃低温条件下或冰上进行。操作中一次性手套要经常更换，尽量避免RNase污染。

二、植物总RNA的提取方法

（三）TRIZOL法小量提取RNA（Invitrogen Co.）

1、于1.5ml离心管中加入1ml TRIZOL提取液；

2、称取0.1g液氮研磨后的材料，转移到提取液中，漩涡振荡混匀，15-30℃静置5min； 3、4℃，12000g，离心10min；取上清；

4、加0.2ml氯仿，剧烈摇动15sec，15-30℃放置2-3min，4℃，12,000g，离心15 min；

5、取水相，加0.25ml异丙醇，0.25ml高盐溶液，颠倒混匀，15-30℃放置10min，4℃，12,000g离心10 min，去上清；

6、用1ml冰预冷的75％乙醇洗涤沉淀，漩涡振荡，4℃，7500g离心5min；

7、真空泵吸除乙醇，用DEPC-ddH2O溶解RNA，55-60℃溶解10min，迅速冰浴，稍离心

8、-20℃短时间保存，-80℃保存长期保存。

高盐溶液（100mL）：0.8M柠檬酸钠 23.528g；1.2M NaCl 7.013g

三、RNA电泳检测

在含有甲醛的凝胶上进行的RNA电泳应小心，甲醛蒸气有毒，含有甲醛的溶液应在化学通风橱内配制，含甲醛溶液的电泳槽应尽可能盖严。操作步骤如下：

1、配制5×甲醛凝胶电泳缓冲液：0.1M MOPS（pH7.0）；40mM 乙酸钠；5mM EDTA（pH8.0）

将20.6g 3-（N-玛琳代）丙磺酸（MOPS）溶于800ml经用DEPC处理的50mM乙酸钠溶液。用2M氢氧化钠将溶液的pH值调至7.0，加10ml经用DEPC处理的0.5M EDTA(pH8.0)，在加经用DEPC处理的水至溶液总体积为1L。上述溶液经用0.2µm微孔滤膜过滤除菌，避光保存于室温。光照或高压后溶液逐渐变黄，淡黄色的缓冲液可正常使用，而深黄色缓冲液则不然。

2.、制备凝胶

将适量琼脂糖溶于水（1%），冷却至60℃，加入5×甲醛凝胶电泳缓冲液和甲醛至终浓度分别为1×和2.2M（将12.3M甲醛贮存液、琼脂糖水溶液和5×甲醛凝胶电泳缓冲液按1:3.5:1.1比例混合即可）。再化学通风橱内灌制凝胶，于室温放置30分钟或更长时间，使凝胶凝固。

3、在一灭菌的1.5ml离心管内混合下列液体，以制备样品：RNA（30µg）

4.5μl；5×甲醛凝胶电泳缓冲液

2.0μl；甲醛

3.5μl；甲酰胺

10.0μl 于65℃温育15分钟，冷浴冷却，离心5秒钟使管内所有液体集中于管底。每一泳道至多可分析30µg RNA，通常用10-20μg细胞总RNA进行Northern杂交，可以检测高丰度mRNA（占mRNA总量的0.1%以上）。许多批号的试剂级甲醛溶液已足够纯，不需经过任何预处理即可直接使用。但如果甲醛溶液呈黄色，需在溶液中加入Dowex XG8混合床树脂置磁力搅拌器上搅拌1小时，再用Whatman1号滤纸过滤2次，进行去离子甲醛应分装成小份，充氮保存于-70℃。

4、加2μl灭菌的并经用DEPC处理的甲醛凝胶加样缓冲液。

甲醛凝胶加样缓冲液：50% 甘油；1mM EDTA（pH8.0）；0.25% 溴酚蓝；0.25% 二甲苯青FF；

5、加样前，将凝胶预电泳5分钟，电压降为5V/cm，随后将样品加至凝胶加样孔。可用已知大小的RNA作为分子量标准参照物，如用18S和28SrRNA或者9S兔β-珠蛋白mRNA，这些RNA的长度分别为6333、2366和710个核苷酸。也可以从BRL购置已知大小的RNA的混合物作为分子量标准参照物。通常分子量标准参照物的泳道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化乙锭染色，可能的话在分子量标准参照物以及欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留一个空白泳道。

6、将凝胶浸入1×甲醛凝胶加样缓冲液中，3-4V/cm电压降进行电泳。电泳缓冲液不需进行持续循环，电泳1-2小时后，收集并混合两个液槽的缓冲液，再加入电泳槽中，即可继续电泳。

7、电泳结束后（溴酚蓝迁移出约8cm），切下分子量标准参照物的凝胶，浸入溴化乙锭溶液（0.5μg/ml,用0.1M乙酸铵配制）中染色30-45分钟。在凝胶旁放置一透明尺，在紫外灯下照像。测量照片上每个RNA条带至加样孔的距离，以RNA片段大小的1g对数值对RNA条带的迁移距离作图，用所得曲线计算从凝胶转移到固相支持物后通过杂交所检出的RNA分子的大小。

小心：溴化乙锭是一种强烈的诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料的溶剂时应戴手套，用后应进行净化处理。紫外线照射有危害，对眼睛尤甚。为尽量避免受到照射② RNA沉淀未完全溶解

2、A260/A280<1.65。可能的原因是：

① 检测吸光度时，RNA样品没有溶于水，而溶于了TE中。低离子浓度和低pH值条件下A280值偏高② 样品匀浆时加的试剂量太少③ 匀浆样品时未在室温放置5分钟④ 吸取水相时混入了有机相⑤ RNA沉淀未完全溶解

3、RNA降解。可能的原因是：① 组织取出后没有马上处理或冷冻② 待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃③ 细胞在用胰酶处理时过度④ 溶液或离心管未经RNase去除处理⑤ 电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5

4、DNA污染。可能的原因是：① 样品匀浆时加的试剂量太少 ② 样品中含有有机溶剂（如乙醇，DMSO等），强缓冲液或碱性溶液

五、植物RNA提取过程中难点的相应对策

（一）酚类化合物的干扰及对策：

许多植物组织特别是植物的果实（如苹果、樱桃、李子、葡萄等）和树木类植物中富含酚类化合物。酚类物质的含量会随着植物的生长而增加。因而从幼嫩的植物材料中更容易提取RNA。此外，针叶类植物的针叶中多酚的含量比在落叶植物的叶子中要高得多。在植物材料匀浆时，酚类物质会释放出来，氧化后使匀浆液变为褐色，并随氧化程度的增加而加深，这一现象被称为褐化效应（browning effect）。被氧化的酚类化合物（如醌类）能与RNA稳定地结合，从而影响RNA的分离纯化。但Newbury等发现RNA提取的难易程度与材料中酚类物质的总量之间并无相关性，因此认为不是所有的酚类化合物都影响RNA的提取。但一般认为所谓的“缩合鞣质”即聚合多羟基黄酮醇类物质（如原花色素类物质）是影响RNA提取的一类化合物。目前去除酚类化合物的一般途径是在提取的初始阶段防止其被氧化，然后再将其与RNA分开。

1、防止酚类化合物被氧化的方法：

① 还原剂法：一般在提取缓冲液中加入(-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）或半胱氨酸来防止酚类物质被氧化，有时提取液中(-巯基乙醇的浓度可高达2％。(-巯基乙醇等还可以打断多酚氧化酶的二硫键而使之失活。Su等认为在过夜沉淀RNA时加入(-巯基乙醇（终浓度1％）可以防止在此过程中酚类化合物的氧化。硼氢化钠（NaBH4）是一种可还原醌的还原剂，用它处理后提取缓冲液的褐色可被消减，醌类化合物可被还原成多酚化合物。

② 螯合剂法：螯合剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和聚乙烯聚吡咯烷酮（PVPP）中的CO－N＝基有很强的结合多酚化合物的能力，其结合能力随着多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强。原花色素类物质中含有许多芳环上的羟基，因而可以与PVP或不溶性的PVPP形成稳定的复合物，使原花色素类物质不能成为多酚氧化酶的底物而被氧化，并可以在以后的抽提步骤中被除去。用PVP去除多酚时pH值是一个重要的影响因素，在pH8.0以上时PVP结合多酚的能力会迅速降低〔11〕。当原花色素类物质量较大时，单独使用PVPP无法去除所有的这类化合物，因而需要与其它方法结合使用。

③ Tris-硼酸法：如果提取缓冲液中含有Tris-硼酸（pH7.5），其中的硼酸可以与酚类化合物依*氢键形成复合物，从而抑制了酚类物质的氧化及其与RNA的结合。这一方法十分有效，所以Lбpez-Gбmez等在提取缓冲液中不再加入其它还原剂。但如果Tris-硼酸浓度过高（＞0.2M）则会影响RNA的回收率。

④ 牛血清白蛋白（BSA）法：原花色素类物质与BSA间可产生类似于抗原－抗体间的相互作用，形成可溶性的或不溶性的复合物，减小了原花色素类物质与RNA结合的机会，因此提高了RNA的产量。BSA与PVPP结合使用提取效果会更好。由于BSA中往往含有RNase，因而在使用时要加入肝素以抑制RNase的活性。

⑤ 丙酮法：Schneiderbauer等用-70℃的丙酮抽提冷冻研磨后的植物材料，可以有效地从云杉、松树、山毛榉等富含酚类化合物的植物材料中分离到高质量的RNA。

2、酚类化合物的去除：

通过Li+或Ca2+沉淀RNA的方法可以将未被氧化的酚类化合物去除。与PVP、不溶性PVPP或BSA结合的多酚，可以直接通过离心去除掉，或在苯酚、氯仿抽提时除去。Manning利用高浓度的2-丁氧乙醇（50％）来沉淀RNA，而多酚溶解于2-丁氧乙醇中而被除去。然后用含50％ 2-丁氧乙醇的缓冲液洗涤RNA沉淀以去除残留的多酚。他认为即使多酚被氧化，其氧化产物仍可以溶解在高浓度2-丁氧乙醇溶液中而被去除，无需再用NaBH4来处理。

（二）多糖的干扰及对策：

多糖的污染是提取植物RNA时常遇到的另一个棘手的问题。植物组织中往往富含多糖，而多糖的许多理化性质与RNA很相似，因此很难将它们分开。在去除多糖的同时RNA也被裹携走了，造成RNA产量的减少；而在沉淀RNA时，也产生多糖的凝胶状沉淀，这种含有多糖的RNA沉淀难溶于水，或溶解后产生粘稠状的溶液。由于多糖可以抑制许多酶的活性，因此污染了多糖的RNA样品无法用于进一步的分子生物学研究。在常规的方法中，通过SDS-盐酸胍处理可以部分去除一些多糖；在高浓度Na+或K+离子存在条件下，通过苯酚、氯仿抽提可以除去一些多糖；通过LiCl沉淀RNA也可以将部分多糖留在上清液中。但即使通过这些步骤仍会发现有相当多的多糖与RNA混杂在一起，所以还需要用更有效的方法来解决植物RNA分离纯化时多糖污染的问题。

用低浓度乙醇沉淀多糖是一个去除多糖效果较好的方法。在RNA提取液或溶液中缓慢加入无水乙醇至终浓度10％～30％，可以使多糖沉淀下来，而RNA仍保留于溶液中。一般都是在植物材料的匀浆液中加入乙醇，如Lewinsohn等在从裸子植物的木质茎中提取RNA时，在匀浆上清液中加入乙醇至终浓度10％以沉淀多糖。但Tesniere等在从葡萄浆果组织中提取RNA时，是在用CsCl超离心，乙醇沉淀之后的RNA溶液中加入终浓度30％乙醇来沉淀多糖的，进一步纯化了RNA样品。

另一个常用的方法是醋酸钾沉淀多糖法。Bahloul等在提取云杉组织的RNA时在匀浆上清液中加入1/3体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液以沉淀多糖；Ainsworth在提取酸模植物花组织的RNA时加入的是1/5体积的5M醋酸钾（pH4.8）溶液。Hughes等在提取棉花叶和花粉的RNA时是加1/3体积的8.5M醋酸钾（pH6.5）溶液到匀浆液中以除去多糖等杂质。在提取某些植物材料的RNA时，是将上述两种方法结合使用。如Lбpez-Gбmez等在提取芒果中果皮的RNA时，是在匀浆液中加入0.25体积的无水乙醇和0.11体积的5M醋酸钾溶液以去除多糖杂质。Su等在去除褐藻的多糖时，单独使用乙醇或醋酸钾都无效，只有两者结合使用效果最佳。Fang等认为缓冲液中含有高浓度的NaCl有助于去除多糖。Chang等在提取松树RNA时，缓冲液中NaCl的浓度为2.0M和1.0M，通过氯仿抽提和乙醇沉淀RNA将RNA与多糖分离。Manning是将胡萝卜种子等材料苯酚提取后的上清液稀释，调节Na+离子浓度至80mM，然后加入0.4体积的2-丁氧乙醇来沉淀去除多糖。

（三）蛋白杂质的影响及对策：

蛋白质是污染RNA样品的又一个重要因素。由于RNase和多酚氧化酶亦属于蛋白质，因而要获得完整的、高质量的RNA就必须有效地去除蛋白杂质。常规的方法是在冷冻的条件下研磨植物材料以抑制RNase等的活性；提取缓冲液中含有蛋白质变性剂，如苯酚、胍、SDS、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）等，这样在匀浆时可以使蛋白质变性，凝聚；有的方法是利用蛋白酶K来降解蛋白杂质。进一步可以用苯酚、氯仿抽提去除蛋白质。

Wilcockson利用蛋白质与RNA在高氯酸钠溶液中的溶解度不同将它们分离。在70％高氯酸钠溶液中，RNA的溶解度大于蛋白质的溶解度，因而将大部分蛋白质沉淀下来。接着在离心上清液中加入两倍体积的无水乙醇，这时RNA能沉淀下来而能溶于70％高氯酸钠溶液中的残留蛋白质仍然留在上清液中。这样可以除去绝大部分的蛋白质。

（四）次级代谢产物的影响及对策：

从植物组织中提取高质量RNA的另一个难点是许多高等植物组织尤其是成熟组织能产生某些水溶性的次级代谢产物，这些次级代谢产物很容易与RNA结合并与RNA共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的RNA的分离。因不能确定这些次级产物具体是什么物质，所以，目前还没有什么特殊的方法来解决这个问题。Baker等综合Hughes等的选择性沉淀法、Chirgwin的氯化铯梯度离心法和Iversen等的RNA回收方法纯化了松树种子、成熟松树针叶等植物组织的RNA。

由于植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织RNA的提取相对于其它生物材料来说要困难的多。实践中经常会发现，即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法会有很大的不同；含有某种干扰因素的不同植物材料，其适用的RNA提取方法可能不同；即使是同一种植物同一种组织材料，但来源于不同基因型植株，其RNA提取方法也可能不一样。所以，对于某一植物或其组织来说，其相应的RNA提取方法必需经过摸索和实践才能确立。

随着植物分子生物学研究领域的拓宽，可以肯定地说，在作为其研究基础的植物材料RNA提取过程中还会出现新的难点，但随着不断地探索和经验的积累，科学工作者们一定会迅速地解决这些难点，为植物分子生物学的发展铺平道路。

思考题

1、RNA纯化过程中如何避免RNA酶的污染？

2、如何检测已纯化RNA的质量？

第四篇：DNA提取问题集

DNA提取问题集

默认分类 2009-12-31 18:59:50 阅读155 评论0字号：大中小

提取植物DNA时遇到多糖成分的干扰，DNA质量一直不高，如何消除多糖的影响？ 参考见解：一般来说，SDS法提取的DNA会还有较多的多糖，使DNA成胶冻状。而CTAB法提取可基本上除去多糖。如果是植物材料本身含糖量比较高，可用以下方法试一试：

1、在 DNA 未溶出之前，先用一些缓冲液洗去多糖。如可用缓冲液：100 mmol/LTris-HCl(pH=8.0)、5 mmol/L EDTA和0.35 mol/L Sorbitol洗几次。

2、使 DNA 提取液中的多糖先沉淀。在提取液中加入 0.35 倍体积的无水乙醇，迅速混匀，多糖会先沉淀。

3、沉淀 DNA 时，使多糖保留在溶液中。如用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入 1/2 体积的 5 mol/L NaCl，或加 NH4Ac 使终浓度为 10 mmol/L。或 0.5 mL DNA 液中加 0.12 5 mL 4 mol/L NaCl 和 0.625 mL 13% PEG 8000（冰浴 1 h）。

4、多糖和 DNA 的共沉淀物进行再分离。如用 TE缓冲液反复清洗共沉淀 物，将清洗液合并再用醇沉淀 DNA，或将沉淀物溶解后，经琼脂糖电泳，切下 DNA 部分再将胶回收，或者用多糖水解酶将多糖降解。还 有在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用而去除多糖。

上述方法还可组合使用，以达到最佳效果。然而这些方法均会在一定程度上减低 DNA 的提取量；如果材料较少或要求较高，则可考虑用柱层析方法，使用对 DNA 具有 特异性吸附的树脂来纯化 DNA。曾有文献提到选用 Wizard Purification Kit，PRC-5 柱，Sephacryl S-1000 或 S-500，Qiagen Genomic tip 500/G，或者 CsCl 梯度离心纯化 DNA。血样4度保存了2月，现在按照酚常规提取方法不能提取出DNA，有什么解决办法？ 参考见解：按照常规的酚/氯仿法不可能提不出来，下面是参考方法：

1、首先洗出白细胞，最好有1毫升以上血液。

2、加入5ml DNA提取缓冲液，(10m mol/L Tris-cl, 0.1 mol/L EDTA, o.5% SDS),混匀。

3、加入25ul 蛋白酶K ,使终浓度达到100ug/ml, 混匀，50℃水浴过夜。

4、用等体积的（酚，氯仿，异戊醇，25：24：1）混合物抽提一次，5000r/min，10min离心收集水相。

5、取水层，加入3倍体积-20℃预冷无水乙醇5000r/min，10min，75%乙醇5000r/min洗DNA，充分干燥将DNA溶于适量水中。

CTAB法提取水稻基因组DNA，TE 溶解后琼脂糖胶电泳检测，点样孔附近有一条明显的主带。用MBI 公司产的限制性内切酶酶切过夜，鉴定时发现DNA已经被完全切烂，只在溴酚蓝前存在微弱smear状产物。换用NEB 公司产的酶，更换EP管，灭菌水之后重复几次，结果还是如此。拿其他人的DNA 做对照，酶切结果正常。用异丙醇将DNA 重新沉淀，换了TE溶解，检测主带仍旧清晰，可是用酶切之后DNA还是被切烂。为什么？

参考见解：

1、公司的酶不行。

2、如做酶切，DNA最好不用异丙醇（因其不易挥发）而用无水乙醇沉淀。

3、酶量大或作用时间太长了。

建议重提DNA，取少许用超纯水溶解（非TE），按照说明书进行酶切。要用新鲜样品或液氮冷冻-70度保存的样品。这样通过降低内切酶的活性减少DNA的降解；

要得到全血基因组DNA，可以先用分层液密度梯度离心将淋巴细胞分离吗？这样做，与沉淀全血细胞然后破坏红细胞得到的结果有何差异？ 参考见解：

1、觉得还是先分离细胞好，因为DNA和RNA大都是在细胞核内，有红细胞反而不太好。从血里面提RNA，用淋巴细胞分离液先分离有核细胞的，效果还是不错的。

2、现在提取全血的DNA,也就是提取淋巴细胞中的DNA，用密度梯度离心，只是富积淋巴细胞，能得到更多的DNA而已。一般如果DNA的量的要求不太多的话，没必要。

3、如果对基因组的要求不高，可以试试这个方法。取EDTA-Na2抗凝血100μl加至1.5ml Eppendorf管中，加无菌重蒸水500μl；10 000r/分钟离心3分钟，弃净上清；加20μl 5mol/L KI，旋涡振荡30秒;0.9%NaCl 100μl,150μl氯仿/异戊醇(24∶1)，振荡30秒；10 000r/分钟离心5分钟，吸上清100μl于另一Eppendorf管中，加异丙醇60μl，轻轻混匀，10 000r/分钟离心5分钟，弃上清；加冷无水乙醇1000μl，10 000r/分钟离心5分钟；弃去无水乙醇，37℃烤干；50μl无菌重蒸水或TE，混匀溶解备用。

从经福尔马林处理后的组织标本中提取DNA可以吗？

参考见解：可以的，国外有好多相关试剂盒，qiagen, roche等公司都有的。

100ml的大量提取，蛋白酶Ｋ是必需的吗？它的作用是什么？用溶菌酶代替可以吗？每次在用酚氯仿异戊醇抽提后，上层里面都是絮状的蛋白质，离心几次都沉淀不下来，请问是哪里出了问题？

参考见解：一般来说，蛋白酶的作用是将蛋白质消化成小的片段，促进核酸与蛋白质的分开，同时，也便于后面的纯化操作以及获得更纯的核酸。而溶菌酶的作用是破坏微生物细胞壁，二者作用各异，不可替代。对于实验中的蛋白问题，建议离心后先用竹签挑出蛋白，小心吸取上层清液，再重复抽提几次试试。

一般植物DNA提取的时候都不加蛋白酶K，这样提出来的DNA链上的组蛋白等未被蛋白酶消化，不是很难除去吗？那DNA是不是不纯？可以用来酶切吗？

参考见解：蛋白酶k的主要作用并不是消化组蛋白，而是消化细胞，在动物细胞DNA的提取也不加蛋白酶k也是可以的，植物细胞的较易破碎，不需要蛋白酶k的作用。protenase K作用：

1、消化组蛋白，释放出DNA。

2、消化DNAse，提高DNA分子量。

建议还是加蛋白酶k为好，这样提出来的 DNA分子量会高一点，且更纯。提白粉孢子的总DNA，白粉孢子比较小，直接在研磨中加液氮研磨可以吗？

参考见解：液氮研磨的方法应该可行的，做动物组织，植物组织多采用这种方法，植物纤维一样可以用液氮研磨，要有耐心，边加液氮边研磨，研磨好后再抽提，应该是可以的。在CTAB法提取DNA时，有一些品种没有DNA析出，是什么原因？ 参考见解：

1、用预冷的异丙醇来沉淀试试，同时研磨的时候要研的非常非常的细。

2、没有看到析出物并不代表没有沉淀，可以继续下一步试验，溶解的时候少加一点儿。

3、高离子强度下DNA与CTAB能形成共沉淀。可能DNA就这样留在沉淀里了。提取DNA配方

CTAB为十六烷基三甲基溴化铵，CTAB提取缓冲液的经典配方

Tris-HCl(pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性；

NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中；

Cβ-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除基因组DNA。

CTAB 4g

NaCl 16.364 g

1M Tris-HCl 20ml(PH8.0)

0.5M EDTA 8ml，先用70ml ddH2O溶解, 再定容至200ml灭菌

冷却后0.2-1% 2-巯基乙醇（400ul）氯仿-异戊醇（24：1）：先加96ml氯仿，再加4ml异戊醇，摇匀即可。

提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，怎样更好的抑制内源核酸酶的活性？ 参考见解：在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量,细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔。

用试剂盒对农田土壤的的微生物群落DNA进行提取，虽然总DNA提出来了，可是用细菌的通用引物进行PCR的时候却怎么也扩不出来，请有没有什么好的办法可以解决这个问题？

参考见解：环境特别是土壤的样品成分复杂，尤其是有腐殖酸具有和DNA类似的性质，因此用一般的国内试剂盒无法提纯。应当选用自制的提取方法，在裂解液中加入要加入PVP。洗涤后硅胶膜上仍有杂色残留？

参考见解：细胞裂解不充分，裂解液和样品要快速充分混匀。洗涤产物中DNA量很少或没有？ 参考见解：

1、样品中细胞或者病毒浓度低。

2、裂解液和样品混合不均匀造成细胞的裂解不充分。

3、蛋白酶K活性下降造成细胞裂解的不充分。

4、温浴时间不够造成的细胞裂解不充分或蛋白降解不完全，尽量把组织切成小块，延长温浴时间，使裂解物中没有颗粒状物残留。

5、在上柱前，裂解物中没有加乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇。

6、DNA没有有效洗脱，提高洗脱效率，可将离心柱在加入洗脱液后在室温静止至少1min，再离心。

7、洗脱液pH不合适，低pH值会减少DNA产率，确保洗脱液pH在7.0－8.5之间。8洗脱体积太大，超过200ul洗脱体积所得的DNA浓度会降低，但DNA总量不会减少。

第五篇：实验二 植物核酸的提取-教案

授课教师 学生人数 55 课 题 实验二 植物基因组DNA的提取 授课类型 新授课 授课方法 讲授、演示 教学目的 掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理与方法 教学重点 理解每一步实验操作的目的 教学难点 实验操作过程中的一些注意事项 教学过程

一、背景知识

1.DNA在细胞中存在的位臵？植物细胞DNA存在的位臵和动物细胞有何不同？（图）教学用具 多媒体

2.DNA的存在形式

双螺旋结构图

双螺旋结构组成

染色体是怎样形成的？

一级结构（核小体=双螺旋+组蛋白）-二级结构（螺线管）-三级结构（超螺线管）-四级结构（染色体）

真核生物基因组DNA是经过四级包装形成了染色体，先是DNA形成双螺旋结构，再与组蛋白形成核小体（一级结构），压缩7倍，再形成螺旋管（二级结构），压缩6倍，之后再形成超螺旋管（三级结构），压缩40倍，最后超螺旋管压缩形成染色体（四级结构），再压缩5倍，正常细胞中基因组DNA是以染色质（相当于一级结构）形式存在，在细胞分裂的中期以染色体形式存在，真核生物细胞质DNA主要是以裸露的环状DNA形式存在，没有核小体结构。

3.遗传物质核酸除了DNA外还有另外一种，即RNA，它与DNA在结构上的区别？（图）

RNA基本单位中间的五碳糖是核糖，含氮碱基尿嘧啶（U）替代 胸腺嘧啶（T）4.核酸的理化性质

（1）形状：DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。

（2）溶解性：一般都溶于水，不溶于乙醇、异丙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。（3）保存：在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。

二、实验目的

1.掌握CTAB法提取植物基因组DNA的原理 2.CTAB法提取植物基因组DNA的实验方法

三、实验原理

1.核酸在细胞中的存在方式，是以核酸-蛋白质复合物的形式存在，如一级结构核小体（图）：DNA螺旋+组蛋白

2.通过低温研钵破坏植物细胞壁

3.加入CTAB溶解细胞膜，CTAB与核酸形成核酸-CTAB复合物，使核酸与蛋白质分离。

4.加入高盐溶液溶解核酸-CTAB复合物，加入蛋白质变性剂使蛋白质变性沉淀出来，离心除去蛋白质。5.加入核酸沉淀剂，溶解CTAB，并使和核酸沉淀出来，离心得到核酸沉淀。

四、实验仪器 1.水浴锅

2.离心机（12管）：3台 3.研钵：10个

4.移液枪（包括枪头）：1ml、400ul

五、实验材料与药品

实验材料：新鲜菠菜叶片 1.十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）

作用：溶解细胞膜并与核酸结合，便于分离核酸。商品信息：瓶装/100g。

理化性质：白色或浅黄色结晶体至粉末状，有刺激气味，易溶于异丙醇，可溶于水,震荡时产生大量泡沫，化学稳定性好，耐热、耐光、耐压、耐强酸强碱。有吸湿性，在酸性溶液中稳定；溶于10份水，溶于热水、乙醇、三氯甲烷,易溶于异丙醇水溶液,微溶于丙酮,不溶于乙醚和苯。

储存：在阴凉，干燥，通风良好的地方，远离不相容的物质。危害：高毒，对皮肤及粘膜刺激性小，有轻微脱脂作用。2.1M Tris-HCl PH8.0缓冲液

作用：提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏 商品信息：瓶/100ml，无色、澄清溶液

理化性质：Tris中文品名为三羟甲基氨基甲烷，瓶/500g。是一种白色结晶或粉末。溶于乙醇和水，微溶于乙酸乙酯、苯，不溶于乙醚、四氯化碳，对铜、铝有腐蚀作用，有刺激性的化学物质。

储存：室温保存。

危害：毒性低，可致癌，不要直接接触皮肤。3.乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）

作用：螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。

商品信息：瓶/250g。

理化性质：无味无臭或微咸的白色或乳白色结晶或颗粒状粉末。溶于水，不溶于乙醇、乙醚，其水溶液pH值约为5.3。可由EDTA与氢氧化钠和碳酸钙作用制得。

储存：于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。配备相应品种和数量的消防器材。储区应备有合适的材料收容泄漏物。

危害：对粘膜和上呼吸道有刺激作用。对眼睛、皮肤有刺激作用。本品可燃，具刺激性。4.Tris饱和酚

作用：强蛋白质变性剂。商品信息：瓶/250ml。

理化性质：为浅黄色透明液体，上层为Tris-HCl溶液，加有抗氧化的0.25% 8-羟基喹啉和0.1%的β-巯基乙醇。

储存：4℃避光保存。

危害：Tris饱和酚有较强的腐蚀性，应尽量避免皮肤直接接触或吸入体内。如发现变为黄色或棕色，表明发生氧化，不能使用。5.β-巯基乙醇（2-巯基乙醇）

作用：提供一种还原剂，这样酚类物质（植物材料特别是老的材料中含有大量的酚类物质）就不能被氧化成醌（醌易与DNA发生共价结合，使DNA发生褐变，从而影响你提DNA的实验）。巯基乙醇兼有消除CTAB震荡时产生的泡沫的作用。

商品信息：瓶/100g。

理化性质：无色透明液体，具有少许硫醇气味。易溶于水，乙醇和乙醚等有机溶剂，与苯可以任意比例混溶。水中溶解度：1mg/mL。

储存：对空气敏感，易吸潮。使容器保持密闭，储存在阴凉、干燥通风处。打开了的容器必须仔细重新封口并保持竖放位臵以防止泄漏。建议贮存温度 2-8℃。

危害：高毒吸入、摄入或经皮肤吸收后会中毒。对环境有危害，对水体可造成污染。本品可燃。6.氯化钠（NaCl）

作用：CTAB-核酸复合物在高盐溶液中易溶。商品信息：瓶/500g，分析纯AR。

理化性质：白色晶体状。易溶于水、甘油，微溶于乙醇、液氨；不溶于浓盐酸。在空气中微有潮解性。稳定性比较好。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。应与氧化剂分开存放，切忌混储。危害： 7.无水乙醇

作用：DNA沉淀剂、洗涤剂。商品信息：瓶/500ml，分析纯AR。

理化性质：无色澄清液体。极易从空气中吸收水分，能与水和氯仿、乙醚等多种有机溶剂以任意比例互溶。储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、碱金属、胺类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。

危害：易燃，具刺激性。蒸气与空气能形成爆炸性混合物，爆炸极限3.5%～18.0%（体积）。8.氯仿（三氯甲烷）

作用：蛋白质变性剂，加速有机相与液相分层，去除核酸溶液中的少量酚（酚易溶于氯仿）。商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色透明液体，极易挥发，有特殊气味。不溶于水，溶于醇、醚、苯。储存：保存在密封的棕色瓶中。

危害：麻醉性。有致癌可能性。在光照下遇空气逐渐被氧化生成剧毒的光气。9.异戊醇

作用：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。

商品信息：瓶/500ml。

理化性质：无色液体，有不愉快的气味。微溶于水，可混溶于醇、醚等有机溶剂。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

危害：吸入、口服或经皮肤吸收有麻醉作用。其蒸气或雾对眼睛、皮肤、粘膜和呼吸道有刺激作用，可引起神经系统功能紊乱，长时间接触有麻醉作用。易燃，其蒸气与空气可形成爆炸性混合物，遇明火、高热能引起燃烧爆炸。10.异丙醇

作用：DNA沉淀剂，DNA在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全，而后由于异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇，乙醇挥发快。用-20度预冷异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好；异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当；但DNA微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分DNA溶解损失；所以多选用-20度预冷异丙醇。一般6500倍到8000倍重力10分钟就可以将异丙醇沉淀的核酸紧密的离到管底。

商品信息：棕色玻璃瓶/500ml。

理化性质：无色透明具有乙醇气味的可燃性液体。有似乙醇和丙酮混合物的气味，能与醇、醚、氯仿和水混溶，不溶于盐溶液。

储存：储存于阴凉、通风的库房。远离火种、热源。库温不宜超过30℃。保持容器密封。应与氧化剂、酸类、卤素等分开存放，切忌混储。采用防爆型照明、通风设施。禁止使用易产生火花的机械设备和工具。储区应备有泄漏应急处理设备和合适的收容材料。

危害：微毒类，高浓度蒸气具有明显麻醉作用，对眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能损伤视网膜及视神经。常温下可引火燃烧，其蒸汽与空气混合易形成爆炸混合物。11.PVP-40（聚乙烯吡咯烷酮）

作用：PVP是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖。

商品信息：白色塑料瓶/100g。

理化性质：白色或乳白色粉末或颗粒，有微臭。溶于水、碱、酸及极性有机溶剂。储存：室温干燥保存。危害： 12.液氮（LN2）

作用：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全；低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNAase的作用，保护DNA。商品信息：分析纯

理化性质：-196℃。液态的氮气。是惰性的，无色，无臭，无腐蚀性，不可燃，温度极低。储存：储存于阴凉、通风的库房。库温不宜超过30℃。危害：汽化时大量吸热接触造成冻伤。

六、实验试剂

1.氯仿-异戊醇（24:1）100ml-20ml=80ml {氯仿 96ml + 异戊醇 4ml} = 100ml，4℃保存 2.酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）40ml {氯仿-异戊醇（24:1）20ml + Tris饱和酚20ml} = 40ml，4℃保存 3.TE缓冲液 PH8.0 50ml {10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 0.5ml + 0.5M EDTA（PH8.0）0.1ml} → → 定容到50ml → 高压灭菌后冷却4℃保存  【0.5M EDTA（PH8.0）】的配制：100ml {蒸馏水 80ml + EDTA-2Na.2H2O 18.61g} → 用NaOH（约2g）调至PH8.0 → 定容至100ml → → 分装后高压灭菌备用。注：需加入NaOH调至PH8.0才能完全溶解。 【10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液】的配制：10ml {1M Tris-HCl PH8.0缓冲液100μl + 水9.9ml} → 定容至10ml → 10mM Tris-HCl（PH8.0）缓冲液 4.2%CTAB抽提液 250ml

{CTAB 4g + 无水乙醇 5ml + 水100ml} → 加入200ml烧杯中 → 加热溶解 → 再依次加入 → → {5M NaCl 56ml + 1M Tris-HCl（PH8.0）20ml + 0.5M EDTA 8ml} → 定容至250ml → 高压灭菌冷却后加入 → {1%β-巯基乙醇（400ul）2ml + PVP-40 5g} → 4℃保存   【5M NaCl溶液】配制：100ml {NaCl 29.22g + 水90ml} → 加热到80℃溶解冷却后 → 定容至100ml → 高压灭菌备用 【1%（v/v）β-巯基乙醇】配制：10ml {β-巯基乙醇 100μl +水9.9ml} → 1%β-巯基乙醇10ml 5.蒸馏水

所有药剂用水都要纯净水经高压灭菌冷却

七、实验步骤

（一）实验前准备

1.研钵、异丙醇-20℃预冷；【研钵10个、异丙醇75ml】

2.将2%CTAB抽提液从4℃冰箱内取出在65℃水浴预热；【CTAB抽提液30ml】 3.称取30份新鲜菠菜叶片，每份1g，称重时去叶脉；【菠菜叶片30g】 4.用蒸馏水冲洗叶片，滤纸吸干水分，将叶片用剪刀剪小。【洗瓶、滤纸、剪刀】

5.实验器材：冰箱、65℃水浴锅、液氮、10ml离心管90个、药匙、移液枪（1ml、100μl、400μl）、离心机（10000r/min）

6.实验药剂：酚-氯仿-异戊醇30ml（每管1ml）、氯仿-异戊醇60ml（每管2ml）、无水乙醇12ml（每管400 μl）、TE缓冲液3ml（每管100μl）

（二）破碎细胞，释放溶解核酸

1.将叶片臵于预冷的研钵（实验前-20℃预冷）中，倒入液氮，尽快研磨成粉末；

 目的：低温导致植物组织冻裂，方便研磨使细胞破碎，使DNA释放完全；低温情况下各酶处于低活性状态，有利于抑制DNase的作用，保护DNA。

2.将粉末加入10ml离心管中，加入 1ml预热的CTAB 抽提缓冲液，轻轻搅动摇匀；  目的：CTAB可以溶解细胞膜并与DNA结合，便于分离DNA。加入β-巯基乙醇和PVP-40的目的是减少植物中酚类物质的影响。EDTA的作用是螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制脱氧核糖核酸酶（DNase）活性，活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。Tris-HCl提供一个缓冲环境，防止DNA被破坏。高盐溶液可以更好的溶解核酸-CTAB复合物。

3.将离心管臵于 65℃的水浴中保温40分钟，期间每隔10分钟轻轻摇晃几次。 目的：水浴使CTAB抽提液和叶片充分反应。

（三）抽提去掉蛋白质

1.将水浴的离心管取出，冷却 2分钟后，加入1ml酚-氯仿-异戊醇，振荡 2分钟，使两者混合均匀，12000 r/min离心10分钟；  目的：第一次离心溶液分3层，上-中-下层：CTAB-核酸-变性蛋白-有机溶剂

2.取上清液（含CTAB-核酸）至新的10 ml离心管中，加入2ml氯仿-异戊醇，轻轻颠倒离心管，混匀，12 000r/min离心10分钟。 目的：第二次离心进一步去掉变性蛋白，去掉多余的酚

（四）沉淀核酸

1.小心取上清液（含CTAB-核酸）臵于一个新的10ml离心管中（尽量避免吸取中间层）,加入2.5ml的异丙醇（-20℃预冷），将离心管慢慢上下摇动30秒，使异丙醇与水层充分混合，室温放臵15分钟至能见到DNA絮状物；  目的：异丙醇为DNA沉淀剂，异丙醇与CTAB互溶，但不与核酸相溶。用-20℃预冷的异丙醇沉淀效果较等体积乙醇沉淀好，异丙醇约和2.5倍体积的乙醇效果相当，但核酸微溶于乙醇，使用乙醇沉淀会使部分核酸溶解损失；所以多选用-20度预冷异丙醇。核酸在异丙醇的溶解度更低，所以用异丙醇来沉淀更完全。异丙醇易溶于CTAB，但不与核酸相溶。2.10000r/min离心10分钟,小心倒去上清液。 目的：第三次离心使核酸沉淀到管底。

（五）核酸的洗涤

用400ul无水乙醇洗涤核酸沉淀直至无色，10000r/min离心10分钟，倾去上清液晾干。 目的：异丙醇不易挥发，所以用乙醇洗去异丙醇及多余的NaCl，乙醇挥发快。

（六）保存

向下层离心物中加入100μl TE缓冲液进行溶解，臵于-20℃冰箱保存，以便下次课用。 目的：一般长期保存DNA，贮存在TE缓冲液中比较好。TE为含EDTA的Tris-HCl(PH 8.0)缓冲液：其中比较关键的成分是EDTA，日常环境中不可避免的存在DNase，而DNase的活性依赖于钙离子，并能被镁离子或二价锰离子激活。镁离子存在条件下，DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点；二价锰离子存在条件下，DNase I可在同一位点剪切DNA双链，形成平末端，或1-2个核苷酸突出的粘末端。TE中含有的EDTA可以螯合金属离子，从而使DNase失活。而Tris-HCl的作用主要是维持一定碱性PH值，有助于DNA的溶解和稳定。不加EDTA也是可以的，而且EDTA会影响下游酶切，连接反应以及质粒转染进细胞的效率，如果接下来要做这些实验是应该避免使用含EDTA的缓冲液的。短期储存DNA也可以使用ddH2O，有助于DNA连接等效果。

八、实验注意事项

1.在整个实验过程中应严格执行无菌操作； 2.部分药品有毒，操作中应注意安全防护；

3.磨样时最好是加液氮，磨样速度要快，使材料处于低温状态； 4.刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔； 5.抽提时不要有太力振动，操作也要仔细，尽量避免DNA断裂；

6.将异丙醇吸出时用的枪头一定要剪过的，这点很重要，过尖的枪头会把DNA链弄断。

九、思考题

1.本实验中用到的各种试剂的作用是什么？ 2.本实验中进行了几次离心操作，每次的目的？

十、实验安排

全班55人，按照学号分组，每6人一组，共9组，最后一组7人。每组作3个离心管，共用一个研钵。

每3组（共18人9个离心管）共同进行离心操作。