关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

第一篇：关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结

ChIP实验原理

在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。

可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

ChIP实验步骤

第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。

（二）、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2h。13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液：a.low salt wash buffer----one wash b.high salt wash buffer-----one wash c.LiCl wash buffer------one wash d.TE buffer------two wash

15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。

第三天：

（一）、DNA样品的回收

17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度处理2h。

19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

ChIP技术总结

（一）、关于细胞

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！

抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！

这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作

希望尽可能的保持低温（4度）。

沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。

虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联

虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA片段的回收

需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

第二篇：染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结

染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结

ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。

一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。

在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。

第一天：

（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。

1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。

3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。

450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。

4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。

5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。

6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。

假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。

7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。

（二）、除杂及抗体哺育。

8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。

300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65度处理4h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。

9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。

11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。

（三）、检验超声破碎的效果。

取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理4h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。

第二天：

（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。

12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2h。13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。

14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。

洗涤溶液：a.low salt wash buffer—-one wash b.high salt wash buffer—–one wash c.LiCl wash buffer——one wash d.TE buffer——two wash

15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。

每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。

16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。第三天：

（一）、DNA样品的回收

17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。

18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度处理2h。

19、DNA-片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。

（二）、PCR分析

二、技术总结

（一）、关于细胞

细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。

一般细胞长到75％－80％比较好。

（二）、关于抗体！

抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。

单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。

一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。

（三）、关于交联与超声破碎！

这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。

交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。

一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。

一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。

（四）、关于操作

希望尽可能的保持低温（4度）。

沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。

虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。

（五）、关于解交联

虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。

（六）、关于DNA-片段的回收

需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。

小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。

染色质免疫沉淀（ChIP）实验中应注意的细节问题

本文来自互联网搜索，仅供参考使用，最好实验条件需要自己摸索：

1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。

2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。

3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。

4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。

5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。

6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。

7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）

8、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。

9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。

10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。

Upstate生物技术公司chip试剂盒英文Protocol ChIP assay: Chromatin immunoprecipitation assay was performed according to the protocol of ChIP assay kit(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).1, For cells cultured in 2D, about 1—2×107 S1 cells were growth in 100mm dish, and were cross-linked by adding formaldehyde to final concentration of 1% and incubated in room temperature for 10 minutes.For cells growth in 3D, cells were isolated from EHS using PBS/EDTA, and also cross-linked as cells growth in 2D.2, Wash cells twice using ice cold PBS containing protease inhibitors(1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A).Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use.PMSF has a half-life of approximately 30 minutes in aqueous solutions.3, Scrape cells into conical tube, Pellet cells for 4 minutes at 2000 rpm at 4℃.4, Cells were washed with PBS and resuspended in ChIP lysis buffer(1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH8.0)add protease inhibitors(inhibitors: 1mM PMSF, 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A)..After incubated 10 minutes on ice, cells were sonicated to shear DNA to lengths between 200 and 1000 basepairs being sure to keep samples ice cold.5, Centrifuge samples(part A, step 7)for 10 minutes at 13,000 rpm at 4℃, and detected the OD260 of the lysates.6, Sonicated lysates were then diluted to OD260 2 with ChIP dilution buffer().60 ul protein A-agarose beads(Upstate Catalog # 16-157)was added to sonicated lysates and rotated at 4 for one hour to reduce the non-specific dinding.7, Pellet agarose by brief centrifugation and collect the supernatant fraction, 20ul of lystates were taken out as input control.9, Add the immunoprecipitating antibody(the amount will vary per antibody)to the 2ml supernatant fraction and incubate 2h at 4℃ with rotation.For a negative control, perform a no-antibody immunoprecipitation by incubating the supernatant fraction with 60 microliters of Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose Slurry for one hour at 4℃ with rotation.10, Pellet agarose by gentle centrifugation(700 to 1000 rpm at 4℃, ~1min).Carefully remove the supernatant that contains unbound, non-specific DNA.Wash the protein A agarose/antibody/histone complex for 3-5 minutes on a rotating platform with 1ml of each of the buffers listed in the order as given below: Low salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl);High salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl);LiCl buffer(0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% SDC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH8.0);TE buffer(20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA pH8.0).11, Elute the histone complex from the antibody by adding 250 microliter elution buffer(1%SDS, 0.1M NaHCO3)to the pelleted protein A agarose/antibody/histone complex from step 10 above.Vortex briefly to mix and incubate at room temperature for 15 minutes with rotation.Spin down agarose, and carefully transfer the supernatant fraction(eluate)to another tube and repeat elution.Combine eluates(total volume=approximately 500 microliters.)12, Add 20 microliters 5M NaCl to the combined eluates(500 microliters)and reverse histone-DNA crosslinks by heating at 65℃ for 4 hours.Note: Include the input DNA from this step.13, Add 10 microliters of 0.5M EDTA, 20 microliters 1M Tris-HCl, pH 6.5 and 2 microliters of 10mg/ml Proteinase K to the combined eluates and incubate for one hour at 45℃.14, Recover DNA by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation.Addition of an inert carrier, such as 20 micrograms glycogen, helps visualize the DNA pellet.Wash pellets with 70% ethanol and air dry.15, Resuspend pellets in an appropriate buffer for PCR or slot-blot reactions.PCR or slot-blot conditions must be determined empirically.

第三篇：Millipore ChIP实验说明书

ChIP实验操作手册

阳性对照抗体是兔抗乙酰化组蛋白H3抗体（可检测人，鼠和四膜虫）。阴性对照是正常的兔IgG。对照引物mix是检测166 bp人体GAPDH启动子序列的（both end-point and real-time quantitative PCR）。用启动子特异性引物进行PCR时建议用来分析富集度较高的DNA片段。

需自己准备的材料：

 细胞， 自己要检测用的ChIP抗体， 37%的甲醛， Taq DNA聚合酶（PCR用）， dNTPs，2.5 mM each， SYBR-Green for qPCR， DNase and RNase-free sterile H2O。

引物设计：

 Primer Length：24 nt

 Optimum Tm：60°C Optimum GC：50% Amplicon size：100-700 bp Detailed Chromatin Immunoprecipitation Protocol

A.In vivo Crosslinking and Lysis

开始前准备：

 150 mm培养皿中装20 ml培养基，让细胞铺板率达到80~90%。

 HeLa细胞数大约有107个，可用来制备10次独立的免疫沉淀反应。

 细胞数量可以根据抗体的性能进行缩放。例如提供的对照抗体能够用105个细

胞来进行ChIP实验。为了确保抗体的性能，此protocol用了106个细胞来进行ChIP实验。

 将PBS和培养皿放在冰上（步骤3和6）。

 每块150 mm培养皿准备42 ml 1×PBS（4.2 ml 10×PBS加37.8 ml水）并放

在冰上。

 将Nuclear Lysis Buffer放在室温下使SDS充分溶解。

 取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温下解冻（步骤3和13使用）。该溶液

中含有DMSO在18.4℃以下就会冻结。

1、加550 μl 37%的甲醛（或1100 μl新鲜的18.5%甲醛）到20 ml细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。

 甲醛的终浓度为1%。尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录B）。

2、室温下孵育10 min，不要振荡细胞。

3、取出2 ml冰冷的PBS，每ml PBS中加5 μl Protease Inhibitor Cocktail II。

4、加2 ml 10×Glycine到培养皿中将未反应的甲醛消除。

5、晃动混匀并在室温下孵育5 min。

6、将培养皿放在冰上。

7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。

8、加20 ml冰冷的PBS来洗涤细胞。

9、除去PBS，再用PBS洗涤一次。

10、加2 ml含1×Protease Inhibitor Cocktail II的冷PBS到培养皿中。

11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。

12、4℃ 800 g（900~1000 rpm）离心5 min沉淀细胞。

13、准备好0.5 ml cell Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。

14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80℃中保存）。

15、用准备好的0.5 ml cell Lysis Buffer重悬细胞。

16、冰上孵育15 min，每5 min漩涡振荡一下细胞悬液。

 可选：孵育之后，用Dounce匀浆器将细胞悬液匀浆化10次以促进核释放。17、4℃ 800 g（900~1000 rpm）离心5 min。

18、准备0.5 ml Nuclear Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。

19、离心后除去上清，用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer重悬细胞。

 107个HeLa细胞建议加0.5 ml Nuclear Lysis Buffer。如果细胞浓度不同可以相

应的改变用量，因为裂解液和细胞的比例会影响细胞的裂解效果。

20、如果已经确定了最适的超声处理条件，继续B部分，否则，看附录A。

B、Sonication to Shear DNA

选择最佳的超声条件来打断交联的DNA，使其长度为200~1000 bp。

1、需要的话，从步骤A-17中取5 μl细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。

2、在冰上超声处理细胞裂解液。（条件摸索）

3、4℃ 10000~15000 g（~12000 rpm）离心10 min除去不溶解的沉淀。

4、有需要的话，可以取出5 μl打断的DNA电泳检测超声效果。

5、将上清液吸到一个新的离心管中，分为50 μl一份。

 每50 μl包含106个细胞的裂解产物，可以用来做一次免疫沉淀反应。 打断的交联染色质可以在-80℃中保存3个月。

C、Immunoprecipitation(IP)of Crosslinked Protein/DNA

开始该步骤之前：取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温融化（步骤3用）。

1、准备足够的稀释液（含蛋白酶抑制剂），放在冰上。

 每个IP实验需要450 μl Dilution Buffer和2.25 μl Protease Inhibitor Cocktail II。 测试样品包括：阳性对照Anti-Acetyl Histone H3，阴性对照Normal Rabbit IgG，和自己实验用的抗体。建议增加一个与自己所用抗体同源的阴性对照IgG。2、50 μl打断的交联好的染色质放在冰上。

 若用同一样品进行多个免疫沉淀反应，可将0.5 m样品放在一管中进行实验。

3、加450 μl稀释液（含Protease Inhibitor Cocktail II）到50 μl染色质样品中。

4、取出5 μl（1%）上清液作为“Input”并放在4℃直到步骤D-1。

5、加入免疫沉淀抗体和20 μl混匀的protein A magnetic beads。

 阳性对照anti-Acetyl Histone H3，5.0 μg抗体每管。

 阴性对照Normal Rabbit IgG，5.0 μg抗体每管。

 用户使用的抗体和对照，每管加1~10 μg抗体每管（根据抗体效价进行调整）。6、4℃旋转孵育1~ 4 h或过夜。

7、用magnetic separator将Protein A magnetic beads沉淀下来并除去上清。

8、用0.5 ml下列冷的缓冲液洗脱Protein A bead-antibody/chromatin complex，每次在旋转台上孵育3~5 min以清楚磁性，并小心的除去上清。

a、Low Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-154), one washb、High Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-155), one washc、LiCl Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-156), one wash

d、TE Buffer(Cat.# 20-157), one wash

D、洗脱Protein/DNA复合物和反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。

1、在室温下解冻Proteinase K和ChIP Elution Buffer(w/o Proteinase K)，确保SDS完全溶解了。为所有的IP管和Input管准备最终的的洗脱液。

 每管用的洗脱液：100 μl ChIP Elution Buffer(不含蛋白酶K)，1 μl Proteinase K。2、62℃振荡孵育2 h3、95℃孵育10 min。

4、将样品冷却至室温。

5、用磁铁分离beads并将上清液移到一个新的管子中。

E、DNA Purification Using Spin Columns1、取出Spin Filter到Collection Tube中。

2、加0.5 ml Bind Reagent “A”到每个100 μl的DNA样品管中并混匀。

 5倍体积的Bind Reagent “A”用于1倍体积的样品，可能有沉淀，但不影响。

3、将sample/Bind Reagent “A”混合液转移到Spin Filter中。

4、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

5、将Collection Tube中的离心液除去。

6、将Spin Filter放回Collection Tube。

7、加500 μl Wash Reagent “B”到Spin Filter中。

8、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

9、除去Collection Tube中的离心液。

10、把Spin Filter放回Collection Tube中。

11、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

12、除去Collection Tube中的液体。

13、将Spin Filter放到一个干净的Collection Tube中。

14、将50 μl Elution Buffer “C”加到Spin Filte的膜上。

15、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。

16、除去Spin Filte，洗脱液就是纯化的DNA，可以用于检测或存于-20℃。

第四篇：化工原理实验总结

化工原理实验总结

化工原理是环境工程专业必修的一门极为重要的专业基础课，化工原理实验是学习、掌握和运用这门课程的重要环节。比起我们之前做的普通实验，化工原理实验更具工程特点，要求我们对理论知识的掌握也更加严格。通过化工原理及做实验的整个过程，我不仅学到了专业知识，在理解和巩固了理论知识的同时也积累了许多生活经验，了解到生活中我们所接触的普通事物的基本原理。

每次实验之前，在我们预习了教材的有关理论，理解了实验目的、原理及要求，了解了实验流程及操作步骤基础上，会先做仿真实验具体了解实验主要操作及过程，真正做实验时老师会及其细致的再将实验原理及实验所涉及的知识讲解一遍，同时具体的介绍实验流程、装置及主要设备的结构、测控元件及仪器仪表的使用方法，介绍实验操作步骤、数据测量和整理方法，最后，辅助我们对实验数据进行正确处理。这一整套流程，保证我们实验能够顺利进行，并能够对实验中发生的现象加以分析，从而找出原因加以解决。这种手脑结合的方式，启发和诱导了我们的思维，充分调动我们的参与意识和学习积极性，同时培养我们的学习兴趣，锻炼和培养了独立思考、分析问题和解决问题的能力，达到了高效学习的效果。

无论是化工原理课程学习中还是做实验过程中，老师都强调了伯努力方程的重要性，老师在讲到流体流动一章中的伯努利方程时，引导我们思考“人往高处走，水往低处流”的科学道理的基础上，思考着“水能不能由低处流向高处？能不能由低压容器流向高压容器呢？”。我们思维会使我们直接回答不会，但仔细思考，在无外界作用下确实不会，但如果这时把问题引到能量守恒上来，对流体做功使得流体具有能量再将能量转换成势能是完全可以的，这时又会想到引出流体的输送设备即“泵与风机”。老师在讲解原理时，将实际生活中与之紧密联系的现象，诸如飞机起飞、乒乓球的弧线球的产生与喷雾器原理等加以解释，强化我们对伯努力原理的理解，这样就可以在实际生活及科研过程中灵活地运用伯努力原理。在老师引导下，我懂得了不仅要考虑设备费及节能降耗，还要考虑产品产量与操作稳定性等问题，从而提炼一些工程观点。我们通过这种独立思考的方式，对问题产生浓厚的兴趣，从而产生急于找出问题答案和解决问题的心理状态，很好地培养思维能力和想象力。

这学期我们做了三个化工原理实验，每一次实验都有不足之处，理论知识的不完善导致对整个实验操作过程理解不够透彻，最后在分析实验结果时不能够准确分析出实验中所出现的问题并总结出结论，但每一次实验都比前一次实验有经验，做之前也会更注重理论知识的理解与掌握。流体流动阻力的测定实验中，我们主要研究影响流体阻力的因素，测定了在镀锌钢管、不锈钢管及突然扩大管中流体流动情况，从而推算出直管阻力和局部阻力，得出λ与Re的关系。同时联系实际我们也就懂得了泳衣，船头，模仿鲔鱼体形的核潜艇，流线型汽车的工作原理。在离心泵的性能测定实验中，不仅对离心泵的原理有了深入了解，更对离心泵的内部结构，叶轮，平衡孔，轴封装置等有了初步认识，同时知道了确定泵的最佳工作范围的方法。而传热实验更与我们生活实际密切相关。

“化工原理”是一门与生产和生活实际紧密联系的课程，其基本理论在实际生产、科研和生活中应用非常广泛。工程理论的重要性就体现在它的实用性，应用工程理论处理实际问题时，一定要明确工程理论的应用条件。因此，在学习过程中不仅要充分利用书本知识，而且应注意联系实际生活，注意将各种工程问题进行分类，培养抓住问题的本质，从根本上找出解决问题的思路、方法和步骤的能力。简单来说，化工原理是用直观的实例，来唤起联想的灵感，发挥我们的创新思维，所以学好化工原理大有益处。

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第五篇：化工原理实验总结

化工原理实验论文

化工原理实验是化工原理课程中理论与实践相联系、相结合的重要教学环节之一。，其基本任务是巩固和加深对化工原理课程中基本理论知识的理解，通过实验操作和实验现象的观察，使学生掌握一定的基本实验技能。

本学期化工原理实验课堂上我们一共做了十个实验，分别为伯努利方程实验、流体流动形态的观察和测定、流体流动阻力的测定、离心泵特性曲线的测定、恒压过滤常数的测定、空气-蒸汽给热系数的测定、填料精馏塔实验、填料吸收塔的操作及吸收传质系数的测定、流化床干燥实验以及膜分离实验。

开始的时候，我并不是很明白许多实验仪器的使用方法以及如何通过实验验证理论知识，虽然每次实验前都会有预习，但是在没有真正接触到实验的时候还是会有一头雾水的感觉。课前老师的讲解对我来说十分重要，自己不明白的地方，在听老师讲解时有时便会豁然开朗。我知道如果不明白实验原理，不知道实验目的，我们是不会真正利用到实验的价值。

我认为做实验的过程是一个既快乐又充满理性知识的过程。就像书本上的知识跳跃了起来一样，不再那么枯燥无味，通过自己的亲手操作和认真计算将原理进行证明的过程我们仿佛能够体会以前科学家的智慧结晶，自己也可以身临其境的体会学习化工原理的快乐。

例如流体阻力的测定实验旨在让我们了解流体流动阻力的测定方法，确定摩擦系数与雷诺准数的关系以及局部阻力由于一开始对这个实验不是很了解，使得流体的流量过小达不到实验预期效果。

恒压过滤实验时，第一组实验因为没有正确装好板框导致实验重来，让我们从中吸取教训：实验一定要严格遵守实验步骤的每一个要求，否则可能前功尽弃。

还有吸收实验中，我们了解了填料塔吸收装置的基本结构及操作方法，这个实验中，我们组的进出口二氧化碳含量出现了问题。在实验的过程中，我们遇到过挫折，一开始心里还是很着急，有点不知所措，但后来我调整了心态，理性分析实验过程问题，才能使实验顺利完成。

化工原理实验最重要的就是将理论付诸实践，平时我们上化工原理课的时候，只能通过老师的讲解，自己的想象了解知识，许多时候我们甚至不能明白为什么就能有这样的结论。而化工原理实验就提供给我们一个平台，一个能更深入了解化工原理知识、更锻炼自己动手能力、在学习上更加丰富的平台。我们可以通过实验锻炼动手能力，团队合作能力，不再读死书，死读书。

化工原理实验从各个方面锻炼了我们的能力。

首先，预习是帮助理解实验原理，了解实验内容，操作步骤以及实验注意事项以利于完成实验达到较好的教学效果。在每次实验前，我们都会写预习报告，了解实验目的，清楚实验原理，实验仪器，这培养了我们自学的能力；

其次，正确进行实验操作，是成功作好实验的关键。在实验过程中，我们需要耐心，细心，认真的完成实验步骤，掌握实际操作和掌握化工实验的基本技能，培养观察实验现象，测定化工参数的能力，掌握用计算机读数和数据记录。

最后就是实验过后的数据处理和回答思考题，这也是完成一个实验的最后一个阶段，是整个实验最终能够出结果的重要阶段，通过数据处理我们可以跟所学知识进行比较，进而提高到能应用实验误差和误差理论分析、解决化工原理实际问题，得出较正确的结论。看是否能够验证试验原理，实验做得是否成功，而思考题更是将我们引入了一个深入思考实验的阶段，让我们对实验更加清楚。

学习化工原理实验课程，可以在学习化工原理课程的基础上，进一步理解一些比较典型的已被或将被广泛应用的化工过程与设备的原理和操作，巩固和深化化工原理的理论知识，将所学的化工原理等化学化工的理论知识去解决实验中遇到的各种实际问题，同时学习在化工领域内如何通过实验获得新的知识和信息，这学期的化工原理实验课我收获很多，了解了典型化工过程和化工设备结构的特点 也逐步对化工原理产生了更加浓厚的兴趣。