第一篇：ChIP实验中的细节
1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。
2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。
3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。
4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。
5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。
6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。
7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）
8、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。
9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。
10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。
11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。
第二篇：Millipore ChIP实验说明书
ChIP实验操作手册
阳性对照抗体是兔抗乙酰化组蛋白H3抗体（可检测人，鼠和四膜虫）。阴性对照是正常的兔IgG。对照引物mix是检测166 bp人体GAPDH启动子序列的（both end-point and real-time quantitative PCR）。用启动子特异性引物进行PCR时建议用来分析富集度较高的DNA片段。
需自己准备的材料：
细胞， 自己要检测用的ChIP抗体， 37%的甲醛， Taq DNA聚合酶（PCR用）， dNTPs，2.5 mM each， SYBR-Green for qPCR， DNase and RNase-free sterile H2O。
引物设计：
Primer Length：24 nt
Optimum Tm：60°C Optimum GC：50% Amplicon size：100-700 bp Detailed Chromatin Immunoprecipitation Protocol
A.In vivo Crosslinking and Lysis
开始前准备：
150 mm培养皿中装20 ml培养基，让细胞铺板率达到80~90%。
HeLa细胞数大约有107个，可用来制备10次独立的免疫沉淀反应。
细胞数量可以根据抗体的性能进行缩放。例如提供的对照抗体能够用105个细
胞来进行ChIP实验。为了确保抗体的性能，此protocol用了106个细胞来进行ChIP实验。
将PBS和培养皿放在冰上（步骤3和6）。
每块150 mm培养皿准备42 ml 1×PBS（4.2 ml 10×PBS加37.8 ml水）并放
在冰上。
将Nuclear Lysis Buffer放在室温下使SDS充分溶解。
取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温下解冻（步骤3和13使用）。该溶液
中含有DMSO在18.4℃以下就会冻结。
1、加550 μl 37%的甲醛（或1100 μl新鲜的18.5%甲醛）到20 ml细胞培养基中进行交联反应，轻轻地晃动混匀。
甲醛的终浓度为1%。尽量使用新鲜的甲醛（配置方法见附录B）。
2、室温下孵育10 min，不要振荡细胞。
3、取出2 ml冰冷的PBS，每ml PBS中加5 μl Protease Inhibitor Cocktail II。
4、加2 ml 10×Glycine到培养皿中将未反应的甲醛消除。
5、晃动混匀并在室温下孵育5 min。
6、将培养皿放在冰上。
7、吸出培养基，尽可能的将培养基去除干净，小心不要扰乱细胞。
8、加20 ml冰冷的PBS来洗涤细胞。
9、除去PBS，再用PBS洗涤一次。
10、加2 ml含1×Protease Inhibitor Cocktail II的冷PBS到培养皿中。
11、将细胞从培养皿刮下来放到离心管中。
12、4℃ 800 g（900~1000 rpm）离心5 min沉淀细胞。
13、准备好0.5 ml cell Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。
14、除去上清液（此步中的细胞沉淀可以放在-80℃中保存）。
15、用准备好的0.5 ml cell Lysis Buffer重悬细胞。
16、冰上孵育15 min，每5 min漩涡振荡一下细胞悬液。
可选：孵育之后，用Dounce匀浆器将细胞悬液匀浆化10次以促进核释放。17、4℃ 800 g（900~1000 rpm）离心5 min。
18、准备0.5 ml Nuclear Lysis Buffer（含2.5 μl Protease Inhibitor Cocktail II）。
19、离心后除去上清，用0.5 ml Nuclear Lysis Buffer重悬细胞。
107个HeLa细胞建议加0.5 ml Nuclear Lysis Buffer。如果细胞浓度不同可以相
应的改变用量，因为裂解液和细胞的比例会影响细胞的裂解效果。
20、如果已经确定了最适的超声处理条件，继续B部分，否则，看附录A。
B、Sonication to Shear DNA
选择最佳的超声条件来打断交联的DNA，使其长度为200~1000 bp。
1、需要的话，从步骤A-17中取5 μl细胞裂解液进行电泳检测未打断的DNA。
2、在冰上超声处理细胞裂解液。（条件摸索）
3、4℃ 10000~15000 g（~12000 rpm）离心10 min除去不溶解的沉淀。
4、有需要的话，可以取出5 μl打断的DNA电泳检测超声效果。
5、将上清液吸到一个新的离心管中，分为50 μl一份。
每50 μl包含106个细胞的裂解产物，可以用来做一次免疫沉淀反应。 打断的交联染色质可以在-80℃中保存3个月。
C、Immunoprecipitation(IP)of Crosslinked Protein/DNA
开始该步骤之前：取出Protease Inhibitor Cocktail II在室温融化（步骤3用）。
1、准备足够的稀释液（含蛋白酶抑制剂），放在冰上。
每个IP实验需要450 μl Dilution Buffer和2.25 μl Protease Inhibitor Cocktail II。 测试样品包括：阳性对照Anti-Acetyl Histone H3，阴性对照Normal Rabbit IgG，和自己实验用的抗体。建议增加一个与自己所用抗体同源的阴性对照IgG。2、50 μl打断的交联好的染色质放在冰上。
若用同一样品进行多个免疫沉淀反应，可将0.5 m样品放在一管中进行实验。
3、加450 μl稀释液（含Protease Inhibitor Cocktail II）到50 μl染色质样品中。
4、取出5 μl（1%）上清液作为“Input”并放在4℃直到步骤D-1。
5、加入免疫沉淀抗体和20 μl混匀的protein A magnetic beads。
阳性对照anti-Acetyl Histone H3，5.0 μg抗体每管。
阴性对照Normal Rabbit IgG，5.0 μg抗体每管。
用户使用的抗体和对照，每管加1~10 μg抗体每管（根据抗体效价进行调整）。6、4℃旋转孵育1~ 4 h或过夜。
7、用magnetic separator将Protein A magnetic beads沉淀下来并除去上清。
8、用0.5 ml下列冷的缓冲液洗脱Protein A bead-antibody/chromatin complex，每次在旋转台上孵育3~5 min以清楚磁性，并小心的除去上清。
a、Low Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-154), one washb、High Salt Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-155), one washc、LiCl Immune Complex Wash Buffer(Cat.# 20-156), one wash
d、TE Buffer(Cat.# 20-157), one wash
D、洗脱Protein/DNA复合物和反交联Protein/DNA复合物为单独的DNA。
1、在室温下解冻Proteinase K和ChIP Elution Buffer(w/o Proteinase K)，确保SDS完全溶解了。为所有的IP管和Input管准备最终的的洗脱液。
每管用的洗脱液：100 μl ChIP Elution Buffer(不含蛋白酶K)，1 μl Proteinase K。2、62℃振荡孵育2 h3、95℃孵育10 min。
4、将样品冷却至室温。
5、用磁铁分离beads并将上清液移到一个新的管子中。
E、DNA Purification Using Spin Columns1、取出Spin Filter到Collection Tube中。
2、加0.5 ml Bind Reagent “A”到每个100 μl的DNA样品管中并混匀。
5倍体积的Bind Reagent “A”用于1倍体积的样品，可能有沉淀，但不影响。
3、将sample/Bind Reagent “A”混合液转移到Spin Filter中。
4、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
5、将Collection Tube中的离心液除去。
6、将Spin Filter放回Collection Tube。
7、加500 μl Wash Reagent “B”到Spin Filter中。
8、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
9、除去Collection Tube中的离心液。
10、把Spin Filter放回Collection Tube中。
11、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
12、除去Collection Tube中的液体。
13、将Spin Filter放到一个干净的Collection Tube中。
14、将50 μl Elution Buffer “C”加到Spin Filte的膜上。
15、10000~15000 g（~12000 rpm）离心30 s。
16、除去Spin Filte，洗脱液就是纯化的DNA，可以用于检测或存于-20℃。
第三篇：关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结
关于染色质免疫共沉淀ChIP实验原理及实验总结
ChIP实验原理
在活细胞状态下固定蛋白质－DNA复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。
可以利用ChIP研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）的关联性。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
ChIP实验步骤
第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。当然，如果实验室有Bioruptor这种神器的话那就轻松了。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65度处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。
（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2h。13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。洗涤溶液：a.low salt wash buffer----one wash b.high salt wash buffer-----one wash c.LiCl wash buffer------one wash d.TE buffer------two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。
第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度处理2h。
19、DNA片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
（二）、PCR分析
ChIP技术总结
（一）、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。一般细胞长到75％－80％比较好。
（二）、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。
（三）、关于交联与超声破碎！
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。
（四）、关于操作
希望尽可能的保持低温（4度）。
沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
（五）、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
（六）、关于DNA片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。
小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。
第四篇：染色质免疫沉淀(ChIP)实验指南及技术总结
染色质免疫沉淀（ChIP）实验指南及技术总结
ChIP是一项比较流行的研究转录因子（transcription factor, TF）与启动子（promoter）相互结合的实验技术。由于ChIP采用甲醛固定活细胞或者组织的方法，所以能比较真实的反映细胞内TF与Promoter的结合情况。这个优势是EMSA这个体外研究核酸与蛋白相互结合的实验方法所不能比拟的。当用甲醛处理时，相互靠近的蛋白与蛋白，蛋白与核酸（DNA或RNA）之间会产生共价键。细胞内，当TF与Promoter相互结合（生物意义上的结合）时，它们必然靠的比较近，或者契合在一起，这个时候用甲醛处理，能使它们之间产生共价键。
一般ChIP的流程是：甲醛处理细胞——收集细胞，超声破碎——加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合——加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀——对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合——洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物——解交联，纯化富集的DNA-片断——PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量－PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q－PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243ul 37％甲醛，使得甲醛的终浓度为1％。（培养基共有9ml）2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M。
450ul 2.5M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。
假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80％。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25％功率，4.5S冲击，9S间隙。共14次。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10，000g 4度离心10min。去除不溶物质。留取300ul做实验，其余保存于－80度。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M），65度处理4h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。再各加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转混匀1h。10、1h后，在4度静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul 抗体，另一管中则不加抗体。4度颠转过夜。
（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65度处理4h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul Protein A Agarose/Salmon Sperm DNA。4度颠转2h。13、4度静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4度颠转10min，4度静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：a.low salt wash buffer—-one wash b.high salt wash buffer—–one wash c.LiCl wash buffer——one wash d.TE buffer——two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul 10％SDS，100ul 1M NaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为0.2M）。混匀，65度解交联过夜。第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37度孵育1h。
18、每管加入10ul 0.5M EDTA，20ul 1M Tris.HCl（PH 6.5），2ul 10mg/ml 蛋白酶K。45度处理2h。
19、DNA-片段的回收―――omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
（二）、PCR分析
二、技术总结
（一）、关于细胞
细胞的生长状态要好。因为细胞的生长状态直接影响细胞内部的基因表达调控网络，也很有可能影响你所研究的TF与其靶Promoter的结合。
一般细胞长到75％－80％比较好。
（二）、关于抗体！
抗体是实验成败的致命因素之一！必须是IP级别的抗体，另外如果经济条件许可的话，尽量买大厂的抗体。不推荐国产抗体和santa cruz的抗体，即使是IP级别的。
单抗与多抗的选择也需要仔细考虑。两种抗体各有利弊。单抗特异性强，背景低。但是单抗有一个致命的弱点，就是识别位点单一，而在ChIP甲醛交联的过程中，很有可能该位点被其它蛋白或核酸结合而被封闭，导致单抗不能识别靶蛋白。多抗虽然没有这个问题，但是多抗特异性较差，背景可能会偏高。
一般而言，如果没有十足把握（单抗的识别位点远离靶蛋白与核酸结合的区域），选择多抗比较稳妥一些。
（三）、关于交联与超声破碎！
这一块的确是ChIP实验中比较难把握的部分。交联的程度会影响到超声破碎的效果，交联的程度越高，超声破碎就越不易把基因组打碎成小片段。
交联不充分，只有一部分靶蛋白与其Promoter相结合，富集得到的Promoter的量不高，实验假阴性。交联过充分，基因组上结合了太多的蛋白，对超声破碎造成障碍。另外也会增加背景。
一般来讲，按照我的经验，交联条件取决于细胞类型。不同的细胞系，交联的条件也不一样。例如：NIH－3T3的交联条件是室温（25摄氏度）下15min，1％的甲醛浓度，而别的细胞系则可能完全不一样。而超声破碎的条件，机器不一样，条件也不一样。当然如果你有bioruptor这样的神器，那么超声破碎对你而言就是小菜一碟了。
一般，理想的超声破碎得到的片段大小是200bp－1000bp。但是200bp－2000bp的范围也是可以接受的。
（四）、关于操作
希望尽可能的保持低温（4度）。
沉淀的时候可以先在4度放置一会，等它自然沉降一些，再超低转速（500rpm等）离心使其完全沉降。
虽然说明书上说ChIP实验的过程中有几个可以停顿的地方，我还是希望你能够连续把它做完，直到PCR结果出来为止。尽量避免实验中不可预知的影响因素。
（五）、关于解交联
虽然说明书上说4小时已经足够，但是我还是希望你可以解交联过夜。因为在那样的环境里，DNA不会降解，过夜解交联更充分些。只是不要忘记在EP管口封上封口膜。
（六）、关于DNA-片段的回收
需要注意的是：样品中SDS样品较高，普通的PCR产物回收试剂盒回收，很有可能会在最终的样品中混入SDS，影响PCR实验结果。
小Tip：过柱前，在样品中加入一定量的异丙醇，能有效的消除SDS沉淀。
染色质免疫沉淀（ChIP）实验中应注意的细节问题
本文来自互联网搜索，仅供参考使用，最好实验条件需要自己摸索：
1、cell counting：尽量做到准确，会影响input结果。
2、cross link：甲醛的终浓度是1%，这个基本所有的protocol上都会强调。
3、resuspend cells with SDS:一定要选用小的tip头，在液面下吹打，否则很容易产生气泡，后面的sonication就麻烦了。
4、sonication：ChIP中最重要的一部分，合适的条件要自己摸索，可以一次尝试不同次数的sonication，然后建议采用EZ-ChIP上推荐的方法看看sonication的效果如何。
5、加入salmon sperm DNA/Protein A or G之前要先混匀，因为salmon sperm DNA是很粘稠的物质，若不混匀，后面你会发现beads的量不一样，自然也会影响实验的结果。
6、wash 的时候前面几个步骤可以不用洗的太干净，但最后一个要尽量吸干净，必要时可用gel loading tips吸。
7、含beads的samples离心时，有的protocol上推荐是1000rpm，45秒，但可以根据情况调整，但要注意转速不能太快防止beads破碎。（当然如果采用的是magnetic的beads就不存在这个问题）
8、reverse crosslink可以是65°4个小时，也可以overnight。
9、reverse crosslink后的在进行下面步骤之前建议先离心，把蒸发到离心管盖子上的部分离下来。
10、每次行real time PCR之前都要把sample离心保证取样的准确。11、1~10ul的枪取3ul以上才比较准确，所以考虑好自己PCR反应体系的配置。
Upstate生物技术公司chip试剂盒英文Protocol ChIP assay: Chromatin immunoprecipitation assay was performed according to the protocol of ChIP assay kit(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY).1, For cells cultured in 2D, about 1—2×107 S1 cells were growth in 100mm dish, and were cross-linked by adding formaldehyde to final concentration of 1% and incubated in room temperature for 10 minutes.For cells growth in 3D, cells were isolated from EHS using PBS/EDTA, and also cross-linked as cells growth in 2D.2, Wash cells twice using ice cold PBS containing protease inhibitors(1mM phenylmethylsulfonyl fluoride(PMSF), 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A).Note: Add protease inhibitors to PBS just prior to use.PMSF has a half-life of approximately 30 minutes in aqueous solutions.3, Scrape cells into conical tube, Pellet cells for 4 minutes at 2000 rpm at 4℃.4, Cells were washed with PBS and resuspended in ChIP lysis buffer(1% SDS, 10mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH8.0)add protease inhibitors(inhibitors: 1mM PMSF, 1microgram/ml aprotinin and 1microgram/ml pepstatin A)..After incubated 10 minutes on ice, cells were sonicated to shear DNA to lengths between 200 and 1000 basepairs being sure to keep samples ice cold.5, Centrifuge samples(part A, step 7)for 10 minutes at 13,000 rpm at 4℃, and detected the OD260 of the lysates.6, Sonicated lysates were then diluted to OD260 2 with ChIP dilution buffer().60 ul protein A-agarose beads(Upstate Catalog # 16-157)was added to sonicated lysates and rotated at 4 for one hour to reduce the non-specific dinding.7, Pellet agarose by brief centrifugation and collect the supernatant fraction, 20ul of lystates were taken out as input control.9, Add the immunoprecipitating antibody(the amount will vary per antibody)to the 2ml supernatant fraction and incubate 2h at 4℃ with rotation.For a negative control, perform a no-antibody immunoprecipitation by incubating the supernatant fraction with 60 microliters of Salmon Sperm DNA/Protein A Agarose Slurry for one hour at 4℃ with rotation.10, Pellet agarose by gentle centrifugation(700 to 1000 rpm at 4℃, ~1min).Carefully remove the supernatant that contains unbound, non-specific DNA.Wash the protein A agarose/antibody/histone complex for 3-5 minutes on a rotating platform with 1ml of each of the buffers listed in the order as given below: Low salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 150 mM NaCl);High salt wash buffer(0.1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl pH8.0, 500 mM NaCl);LiCl buffer(0.25 M LiCl, 1% NP-40, 1% SDC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH8.0);TE buffer(20 mM Tris-HCl pH8.0, 1 mM EDTA pH8.0).11, Elute the histone complex from the antibody by adding 250 microliter elution buffer(1%SDS, 0.1M NaHCO3)to the pelleted protein A agarose/antibody/histone complex from step 10 above.Vortex briefly to mix and incubate at room temperature for 15 minutes with rotation.Spin down agarose, and carefully transfer the supernatant fraction(eluate)to another tube and repeat elution.Combine eluates(total volume=approximately 500 microliters.)12, Add 20 microliters 5M NaCl to the combined eluates(500 microliters)and reverse histone-DNA crosslinks by heating at 65℃ for 4 hours.Note: Include the input DNA from this step.13, Add 10 microliters of 0.5M EDTA, 20 microliters 1M Tris-HCl, pH 6.5 and 2 microliters of 10mg/ml Proteinase K to the combined eluates and incubate for one hour at 45℃.14, Recover DNA by phenol/chloroform extraction and ethanol precipitation.Addition of an inert carrier, such as 20 micrograms glycogen, helps visualize the DNA pellet.Wash pellets with 70% ethanol and air dry.15, Resuspend pellets in an appropriate buffer for PCR or slot-blot reactions.PCR or slot-blot conditions must be determined empirically.
第五篇：重视实验细节-实验论文-
重视实验细节成就课堂精彩
——科学实验教学细节例谈
摘要 :加强实验教学是培养学生探究能力的主要途径。但在实验教学探究活动的设计和实施中，我们往往会忽略一些重要的细节。本文着重从实验过程中、现象中、步骤中、冲突中等细节方面进行深层次的挖掘，引领学生自觉地获取知识和技能，训练科学的思维方法，体验探究的乐趣，同时促进教师自身的成长，演绎课堂的精彩。关键词 :实验教学细节学生能力
以实验为基础是初中科学的重要特征之一。物理和化学实验可以激发学生的学习兴趣，帮助学生理解科学知识，掌握实验技能，启迪学生的科学思维，训练学生的科学方法，培养学生的科学态度和价值观。物理和化学实验内容丰富多彩，其中一些易被忽视的细节，如稍纵即逝的现象、习以为常的操作、司空见惯的字眼，在不经意之间一闪而过。对此进行深层次的挖掘，不仅能很好地培养学生的思维能力，开发学生的潜能，还能给你许多意外的惊喜，成就课堂的精彩。下面以教学实际为例，作一浅谈。
一、关注实验过程中的细节，引导学生分析推理
设计新颖实验，关注过程中的细节，不仅能开发每个学生的思维成果──知识，更能培养和训练学生的思维过程，有利于学生最快、最准确地找到自己最需要的知识和信息，同时在分析、推理的过程中使之系统化，并引导学生学会对未来进行大胆预测、构想和创新。
如在学习燃烧的条件时,课本给出的是一个控制实验变量的对比探究性实验。开始时介绍实验方法，引导学生对铜片上的红磷和白磷进行对比；再对铜片上的白磷和水中的白磷进行对比。学生很容易观察到只有铜片上的白磷燃烧；水中的白磷和铜片上的红磷都没有燃烧。经过分析和讨论，学生很容易得出：水中的白磷没有燃烧是因为没有和空气接触；铜片上的红磷也没有燃烧是为什么？经过再次的分析和讨论，学生会发现，铜片上的红磷和白磷条件都一样而现象不一样，很可能是红磷和白磷本身的性质不一样。经过查阅资料马上发现是红磷和白磷的着火点不同，这样就可以得出燃烧的条件了。得出结论教学任务已经完成了，如果就此收尾，必将失去一次提高学生思维能力，培养学生兴趣的大好机会。教师可以从生活入手举出雅典奥运会开幕式上的“水下火五环”的事例，让学生讨论是如何实现的？最后通过实验，向热水中的白磷通氧气；用酒精灯给铜片上的红磷加热，进一步证实学生得出的结论是正确的。到此学生已经对可燃物的燃烧条件深刻理解了，否则学生就失去了一次开拓思维，树立主体意识的机会了。白磷 1
在水中燃烧的现象，平时是看不到的，这样通过实验、增加了学生主动学习的兴趣，又能引导学生从不同的方向思考问题，寻求众多的适当答案，发挥自己创见的问题，使学生们找出以前没想到也不敢想的各种奇妙的好方法。
二、分析实验现象中的细节，抓住事物的本质
在教师的演示实验中，要善于引导学生根据事物发展变化的具体情况，审时度势，随机应变，仔细分析实验现象中的细节，及时调整思路，找出符合实际的解决问题的最佳方案。例如在Na2O2与水的反应中，反应结束后，滴入酚酞试液，发现溶液变红，但
振荡后迅速消失。溶液变红，说明有NaOH生成，但使溶液退色的物质是什么呢？引导学生讨论，会有多种猜测。①Na2O2起漂白作用：在过量水存在的情况下，Na2O2已不存在；
②NaOH起漂白作用：用实验验证，往浓NaOH溶液中加入酚酞试液，确实能退色，但随着水的加入，红色又重新出现；③O2起漂白作用：把O2通到品红溶液中，品红溶液不退
色，说明氧气无漂白性；在学生思维处于“山重水复疑无路”时，教师做适当地点拨，可能的反应物、生成物都已经考虑并被一一否定之后，有没有可能是一种中间物质在起作用。④学生试验H2O2的漂白性：往双氧水中加品红溶液，结果退色。这样结论就出来
了：起漂白作用的是H2O2。那么H2O2是怎样产生的呢？结合现象及结论可马上写出化学
方程式：Na2O2 +2H2O = 2NaOH + H2O2, 2 H2O2 = 2H2O+O2↑。经过对现象的层层剖析深入
探索，结合灵活的思维，揭示了反应的实质，为后续的氧化剂、还原剂、电子转移情况等问题的解决打下了很好的基础。
综上所述，在发现问题后，学生分析问题、提出假设、实验验证、得出结论，在一种结论不正确之后，又提出新的假设，开始新的探索。在整个探索的过程中，学生始终积极的思考，既动手又动脑，从中也充分体会到了探究的乐趣，抓住了事物的本质，又掌握了解决问题的方法。
三、巧设实验步骤中的细节，激发学生探究欲望
当前中学科学实验教学中，以教师验证性实验居多。因而在演示实验前后以及过程中，制造矛盾，提出疑问，主动联想，是设计实验情境的一种好方法。当然，这些问题的设计，应该围绕实验主体教学的实质展开，即为什么要进行这种实验，进行这种实验所要达到的目的，借以激发学生思考，促使学生的思维从疑问开始，在联想和想象中活跃，在获得正确答案中发展，最后在具体实验验证过程中及结果中得到强化，从而完成一个层次的认识。
例如：“浮力”教学，来自生活中的经验往往成为学生思维的障碍，学生常误认为浮力跟物体的质量、密度有关，跟物体浸入液体中的深度有关，沉入水底的物体不受浮
力等。为了使学生建立正确的概念，实验教学的步骤可以这样具体设计：（1）用弹簧秤分别挂起同体积的铁块和铝块浸入水中，要求学生观察弹簧秤示数，并提问说明什么？在这里先设计简单的实验，激发学生探究的兴趣，为后面即将展开的实验笼罩上一层趣味的“灵光”。（2）用弹簧秤挂铁块徐徐浸入水中，让学生注意观察弹簧秤示数变化，待铁块全部浸入再置于不同深度，提问学生观察到什么？故意设置悬念，吊起学生的胃口，激起他们进一步探究的欲望。（3）换用煤油或酒精重做上面的实验，也可让学生上来进行演示，让学生观察并回答液体密度不同弹簧秤示数又有何不同？学生一个个瞪大眼睛，很多人跃跃欲试，此时课堂业已成为学生探究的舞台，成为学生自主质疑、合作交流的平台。通过一步步的实验过程加以验证，层层递进,慢慢切入试验的科学本质, 更透彻深入知识点。这样更符合学生认识事物的规律，有利于培养学生合乎逻辑地思考问题的能力。
四、贴近实验生活中的细节，实践成功的体验 生活是最好的老师，在生活情境中的实验教学，学生更容易提出问题，更愿意主动的寻找方法解决问题。而开展家庭实验是实践探究的重要组成部分，也是课堂教学的自然延伸，有利于培养学生实践能力和探索能力。
当药品和仪器缺少时会大胆地启用替代药品（甚至是废物利用）和替代仪器，有利于养成勤俭节约的习惯。开展家庭实验要考虑简便易做且安全。象“会游泳的鸡蛋”只需一只鸡蛋、玻璃杯用少量的食盐即可成功。针对“知了”的呼吸器官长在腹部，我指导学生开展了家庭对比实验：①将“知了”的头部按在水中，②将“知了”的腹部按在水中，③将整只“知了”按在水中，实验结果是将整只知了按在水中比其它情况的死亡要快得多，同学们进一步明确了身体各部分相互协调的重要性。大家积极开动脑筋，利用玻璃瓶、塑料瓶、一次性注射器等制作漏斗、烧杯、量筒、滴管、酒精灯等简单实用的实验仪器，用食醋、碘酒、面粉、乌贼骨、鸡蛋壳、蔬菜、西红柿等替代化学药品或实验材料，设计了许多有趣的实验，如“神笔”、“钮扣潜水员”等。通过动手实验，大家对科学研究的过程有了初步的了解，初步理解了科学家是如何做科学研究的。使课堂教育得到了延伸和拓展，促进了感性认识向理性认识的转变，挖掘了自己的潜力，动手动脑能力得到提高，探索能力和创新精神得到了培养，提高了自己的素养，体验到了成功的快乐。
五、预设实验冲突中的细节，揭示知识内在联系
科学实验在科学探究过程中起着发现新事实，提出新问题，获取事实、证据，验证
科学猜想等作用。在实验中预设情景冲突，能激发学生探究动机，真正发挥实验的最大功效。例如教学《液体的压强》时，在利用底部和侧壁扎有橡皮膜的玻璃管研究了液体对容器底部和侧壁有压强后，教学“液体内部压强”往往是按照课本先介绍液体压强计后用压强计去研究液体内部压强。这样教可以顺利完成教学任务，但容易给学生产生一个错觉，以为液体内部压强只能用液体压强计来测量，因此会束缚学生思维。其实上述教学会错失让学生进行探究的良好时机。若在研究这个问题时，教师有意识地预设如下冲突情景：“液体对容器底部和侧壁有压强，那么，液体内部是否也有压强呢？如果有，怎样来观察呢？”使学生容易想到“把底部扎有橡皮膜的玻璃管插入液体中去进行观察”。运用学生提出的方法去研究液体内部压强，结果发现橡皮膜有变化但不明显，此时教师可趁机激发学生思考，寻找更佳的器材。在学生百思不得其解时教师出示“液体压强计”必定能达到水到渠成之功。从“扎有橡皮膜的玻璃管”到“液体压强计”的设计是为了让学生经过矛盾冲突后获得自主发现，体验探究学习快乐，由此也揭示了液体压强与液体内部压强的联系。
对于实验教学中的冲突情景，教师课前精心预设是必不可少的。然而预设不等于封闭，现代课堂改革倡导以自主学习为基础，以合作学习为途径，以探究学习为目的的教学。学生带着自己的经验、知识、兴趣和灵感等参与实验课堂，使实验教学呈现出丰富性和多变性。因此教师对预设应想得细些，对可能出现问题估计得全面些，对各种资源的整合考虑得周全些，将使预设既具预测性，更具应变性。预设是为了更有效的生成，使生成更有把握。课前多一份精心预设，课中就可能多一份精彩的生成。
六、改进实验中不规范的细节，强化规范操作意识
实验操作必须符合一定的规范，对于不符合规范的细节，首先应有一种批判的意识。而学生在实验中暴露出的两种思想意识应引起教师的警惕。一是做实验比较放松而把做实验看做一种休闲活动；二是认为不规范操作照样能得到预期的现象，无所谓。学生在实验室无所顾忌地大声说话，站起坐下频繁；试剂用量“多多益善”致使反应液溢出试管；试剂用完不及时归位，瓶塞张冠李戴；铁夹口朝下致使试管跌落，铁夹太紧导致试管破裂等等。例如在氢氧化亚铁的制取实验中，滴管竟伸到液面以下。这严重违反了滴管的基本操作方法，滴管应该在试管口平面之上进行操作，不能伸进试管，不能碰到内壁。为什么要这样做呢?原来是为了避开空气中的氧气。能不能做到既符合规范，又解决氧气的问题呢？引导学生从多角度、综合性考虑问题。可以从试剂、操作、装置等方面来分析。通过认真地思考并经过实践的检验，得到多种方案：①直接将片状NaOH 放入FeSO4 溶液中，在NaOH 表面的现象很明显；②创造还原性的气氛，把CaCO3、Fe 屑
加到稀盐酸中，利用生成的CO2、H2 隔绝氧气，然后直接从上面加NaOH 溶液。实践证
明这堂课的规范教育是成功的，学生产生了规范操作的意识，对实验做到了独立思考，做出正确的判断。细节问题不容忽视，在认识处理问题的过程中，不能把视线只盯在一点、一线、一面上，也可以看作是扩展学生思维空间的契机。
总之，经过多年的实践探索，重视实验细节，能引领学生自觉地获取知识和技能，训练科学的思维方法，体验到探究的乐趣。当然从细节中寻找问题，对教师、学生提出了更高的要求：观察需要更加细致，阅读需要更加仔细，知识的储备需要更加丰富。教师是引路人，在启发学生发现问题、分析问题、解决问题的过程中，也极大地促进了自身的成长，演绎出课堂更多的精彩。
参考文献：1、2、3、4、5、钟启泉、袁运开《科学课程与教学论》浙江教育出版社2003版 杨美秀开展化学“研究性学习”的初步探索《化学教学》2002.2 孙国光《引导学生主动参与，提高课堂教学效果》中学物理2002.5 叶澜《重建课堂教学过程观》教育研究2002年第10期 陈厚德《有效教学》教育科学出版社2000年
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