微生物发酵制药-总体工艺过程流程（定稿）

第一篇：微生物发酵制药-总体工艺过程流程（定稿）

微生物发酵制药-----总体工艺过程流程

工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。

微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。

微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容：

第一方面 菌种的获得

根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

1.分离思路：新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。2.定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。3.采样：有针对性地采集样品。

4.增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。5.分离：利用分离技术得到纯种。

6.发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

第二方面 高产菌株的选育

工业上生产用菌株都是经过选育过的。工业菌种的育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。

工业菌种育种的方法：诱变、基因转移、基因重组。

育种过程包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。

选择育种方法时需综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(例如分批或者连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术；如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。

工业菌种具体改良思路：(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤（通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。）(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。

第三部分 菌种保藏技术 转接培养或斜面传代保藏； 超低温或在液氮中冷冻保藏；

土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。第四部分 发酵工艺条件的确定 微生物的营养来源

能源，自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚铁盐。异养菌：碳水化合物等有机物，石油天然气和石油化工产品，如醋酸。

碳源，碳酸气；淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等，石油、正构石蜡，天然气，醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品

氮源，豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，酒糟水等有机氮，尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐等无机氮，气态氮

无机盐，磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等其他矿盐，铁、锰、钴等微量元素等 特殊生长因子，硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等

培养基的确定

（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提取方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶实验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。注意培养过程中的pH变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH，不断调整配比来适应上述各种情况。

（4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内pH可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。

（5）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。

(6)根据经济效益选择培并基原料 考虑经济节约，尽量少用或不用主粮，努力节约用粮，或以其他原料代粮。糖类是主要的碳源。碳源的代用品主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖；石油作为碳源的微生物发酵也可以生产以粮食为碳源的发酵产品。有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料为目标，代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉、黄浆水或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、菌体、酒糟，以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富，价格低廉，便于就地取材，方便运输。

培养工艺的确定：

培养条件：温度、pH值、氧、种龄、接种量、温度

工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。

静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为厌氧性发酵。通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。

在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。

关于液体深层培养：

用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。

深层培养基本操作的3个控制点

①灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。②温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。③通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱均匀分散等。

第五部分 发酵产物的分离提取 提取方法： 过滤 离心与沉降 细胞破碎 萃取

吸附与离子交换 色谱分离

沉析（盐析、有机溶剂沉析、等电点等）膜分离 结晶 干燥

分离提取过程的几个注意的问题： 水质

热源去除（石棉板吸滤、活性碳吸附、过离子交换柱）溶剂回收 废物处理 生物安全性

第二篇：微生物论文微生物制药

微生物制药

【摘要】微生物制药利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化技术进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。【关键词】微生物制药抗生素甾体激素酶及酶抑制剂

半个世纪以来微生物转化在药物研制中一系列突破性的应用给医药工业创造了巨大的医疗价值和经济效益。微生物制药工业生产的特点是利用某种微生物以“纯种状态”，也就是不仅“种子”要优而且只能是一种，如其它菌种进来即为杂菌。微生物在其生命活动过程中产生的，能以极低浓度抑制或影响其他生物机能的低分子量代谢物。微生物制药利用微生物技术，通过高度工程化的新型综合技术，以利用微生物反应过程为基础，依赖于微生物机体在反应器内的生长繁殖及代谢过程来合成一定产物，通过分离纯化技术进行提取精制，并最终制剂成型来实现药物产品的生产。微生物制药的生物来源是青霉素，放线菌；作用对象是抗菌药，抗肿瘤药，抗病毒药，除草剂，酶抑制剂，免疫调节剂；作用机制是抑制细胞壁合成药，影响细胞膜功能药，干扰蛋白质合成药；化学结构是抗生素，维生素，氨基酸，甾体激素，酶及酶抑制剂。

一、代表人物及主要成果

Louis Pasteur(1822～1895)法国微生物学家，化学家。对狂犬病的研究是他科学生涯中最后、也是最重要的一项工作。将狂犬患者的唾液注射到兔子体中，使兔感染狂犬病后，再将兔的脑和脊髓，制成可供免疫用的弱化疫苗，1885年在一个 9岁的被患狂犬病的狼咬伤的孩子身上试用，获得成功。这一研究成果当时被誉为“科学纪录中最杰出的一项”。巴斯德研究所就在那时筹款建立。开创了药物微生物技术的新时代。

Alexander Fleming英国细菌学家。他首先发现青霉素。后英国病理学家弗劳雷、德国生物化学家钱恩进一步研究改进，并成功的用于医治人的疾病，三人共获诺贝尔生理或医学奖。青霉素的发现，是人类找到了一种具有强大杀菌作用的药物，结束了传染病几乎无法治疗的时代；从此出现了寻找抗菌素新药的高潮，人类进入了合成新药的新时代。

Selman Abraham waksman抗生素之父瓦克斯曼，美国人。对土壤微生物产生抗生素物质进行了系统和开创性工作，发现了链霉素是结核杆菌的克星。

二、抗生素

细菌对抗生素的抗性有内在抗性(intrinsic resistance)和获得性抗性(acquired re2sistance)。内在抗性是指细菌天然对某些抗生素不敏感。获得性抗性涉及细菌遗传背景的改变。细菌可通过随机突变, 或表达潜在抗性基因获得抗性;也可通过抗性基因水平转移获得抗性。细菌可移动遗传元件(mobile genetic elements, MGE)可以在同种甚至不同种菌株间水平转移, 加速了临床上耐药及多重耐药菌株产生。【1】 链霉素（streptomycin）是一种氨基葡萄糖型抗生素，分子式C21H39N7O12。1943年美国 S.A.瓦克斯曼从链霉菌中析离得到，是继青霉素后第二个生产并用于临床的抗生素。它的抗结核杆菌的特效作用，开创了结核病治疗的新纪元。链霉素属于不含伯胺基的氨基糖苷类抗生素，可采用两种方法制备免疫原。一是利用醛基可以采用O-(羧甲基)羟基胺法，将其生成含有带羧基的半抗原衍生物，然后采用碳化二亚胺法，将带有羧基的半抗原与载体蛋白的胺基或者羧基结合。二是利用链霉素其醛基直接与载体蛋白的胺基缩和。【2】目前已发现的天然抗生素约2/ 3 来源于链霉菌。利用链霉菌产抗生素能力与链霉素抗性基因之间的对应关系定向筛选正向突变株,是目前农用抗生素科研领域的研究热点，紫外诱变是菌种选育过程中最常用的诱变方法之一,但该法导致的菌种突变是随机的,正突变株的出现频率很低,需要进行大量的筛选工作。通过将链霉素抗性筛选法与传统紫外诱变法结合,可快速、有效的获得理想的抗生素高产突变株。

三、甾体激素

甾体激素药物是仅次于抗生素的第二类药物, 由于其结构极其复杂, 目前利用全合成的方法比较困难, 通常以具有甾体母核结构的天然产物为原料采用半合成的方法改造后制得。以前生产甾体激素类药物以薯蓣皂素为起始原料, 但自20世纪70年代以来, 薯蓣资源日渐枯竭, 皂素价格不断上涨, 促使国内外一些公司寻找和开发新的甾体激素药物的原料。植物甾醇的结构特点决定了它可以作为甾体激素药物半合成的原料。微生物选择性降解甾体侧链技术的发展使这些廉价易得的甾醇充分利用成为可能。（1）植物甾醇的微生物转化

诺卡氏菌、分枝杆菌、节杆菌和假单胞杆菌等微生物都能将甾醇类化合物作为碳源利用, 而使甾醇降解。甾体微生物转化是利用微生物的酶对甾体底物的某一部位进行特定的化学反应来获得一定的产物。

（2）微生物选择性降解甾醇侧链

微生物对甾醇作用产生42AD和ADD主要包括侧链的降解, C23位羟基氧化成酮基以及C25, 6位双键的氢化。其中, 起决定作用的是侧链的降解。甾醇侧链的降解开始于C227位的羟化, 然后经过氧化, 最终截断于C217位。选择性控制微生物降解侧链的途径主要有以下两种: 加入酶抑制剂以及利用诱变技术。

（3）影响植物甾醇侧链降解收率的因素

一是发酵液中植物甾醇的溶解度，甾醇是脂溶性化合物, 在水中的溶解度很低, 因此反应中甾醇的有效浓度相当低, 这就导致反应速度和转化率偏低。因此, 应采取措施提高甾醇底物的溶解度, 使甾醇与微生物细胞有良好的接触从而提高产物收率；二是微生物细胞膜的通透性，甾体微生物降解缓慢的原因不仅在于发酵液中底物和产物溶解度低, 也在于它们进出微生物细胞的速度也很低。因此改变微生物细胞膜的通透性使甾醇底物及其转化产物能自由地出入细胞, 也是促进侧链降解的有效方法。【3】

四、微生物发酵制药

微生物有着非常强大的分解转化物质的能力,并能产生丰富的次生代谢产物,通过微生物的生长代谢和生命活动来炮制中药,可以比一般的物理或化学的炮制手段更大幅度地改变药性,提高疗效,降低毒副作用,扩大适应症。中药发酵制药技术是在继承中药炮制学发酵法的基础上,吸取了微生态学研究成果,结合现代生物工程的发酵技术而形成的高科技中药制药新技术,是从中药(天然药物)制药方面寻找药物的新疗效。（1）微生物对中药发酵的作用

微生物在生长过程中会产生各种各样的生物活性物质,并易于组织工业化生产。现代工业中许多生物产品都是通过微生物发酵生产的,如各式各样的酶、抗生素。有些微生物在生长过程中可以分泌几十种胞外酶到培养基中去,微生物进行生命活动所产生的胞内酶更是有成百上千,这些丰富而强大的酶系是中药发生化学反应的物质基础,可以将药物的成分分解转化形成新的成分,这些新成分就是新的活性药物筛选的物质基础。这就是微生物可以用来发酵炮制中药的理论根据如酶法已成为中药炮制的一种方法。（2）由于微生物也会形成丰富多样的次生代谢产物,它们有些本身就是功效良好的药物;或以中药中的有效成分为前体,经微生物的代谢可以形成新的化合物或微生物的次生代谢产物和中药中的成分发生反应形成新的化合物。微生物的分解作用有可能将中药中的有毒物质进行分解,从而降低药物的毒副作用。微生物容易诱变,可以根据需要,运用现代生物技术对微生物进行改造,使之更适合中药发酵的需要。现代生物技术首先在微生物体中得到运用,也是基因工程等技术最成熟的领域。【4】

五、酶抑制剂

酪氨酸酶广泛存在于自然界中，其化学本质是含铜蛋白，是黑色素生物合成的关键酶和限速酶。酪氨酸酶的活性与色素沉着性疾病、食品褐变等均有密切关系。抑制酪氨酸酶活性对人类皮肤色素疾病的治疗、食品保鲜及农业抗虫领域具有重要意义。（1）微生物来源

从海洋红藻表面分离得到核盘霉菌中的葡萄孢菌，利用酪氨酸酶抑制活性追踪法对其代谢产物进行研究，分离得到3个含α-吡喃酮结构的化合物均对酪氨酸酶有抑制性，同时初步确定α-吡喃酮联接戊烷基时显示最强的酪氨酸酶活性抑制力。从4000余个微生物代谢产物中找到一株活性化合物产生菌，经鉴定为链霉菌，以酪氨酸酶为底物，发现链霉菌代谢产物H7264A和H7263B 均具有酪氨酸酶抑制活性。（2）酪氨酸酶抑制剂的作用机理

国内外对酪氨酸酶抑制剂的抑制机理普遍认为包括：清除氧自由基，终止自由基链的引发，削弱酪氨酸酶的供氧作用，削弱酪氨酸酶作用。酪氨酸酶抑制剂结构与底物相似，作为酪氨酸酶的竞争性底物，从而削弱酪氨酸酶对酪氨酸及其系列氧化产物的催化氧化作用。根据抑制剂与酶作用后是否引起酶永久性失活，可将酶抑制剂分为不可逆抑制与可逆抑制。【5】 【参考文献】

【1】蒋培余，细菌遗传元件水平转移与抗生素抗性研究进展[J]，微生物学通报，2006年第4期

【2】张桂贤，链霉素人工抗原的合成及其多克隆抗体的制备[J]，山东畜牧兽医，2010 年第3 期 【3】张裕卿，植物甾醇微生物转化制备甾体药物中间体的研究进展[J]，微生物学通报，2006年第2期

【4】王玉阁，微生物发酵制药的研究[ J ]，齐齐哈尔医学院学报2006 年第27 卷第2 期 【5】李娜，鲁晓翔，酪氨酸酶抑制剂的研究进展[ J ]，食品工业科学，2010年第7期 生物与环境工程学院 周素花

第三篇：制药工艺论文

溶菌酶结晶的制备及活力测定研究 制药工程2011级制药11班 ×××

指导老师 ××

摘要

目的：探讨溶菌酶结晶的制备及活力测定的方法。方法：以蛋清为原料制备溶菌酶结晶，首先将鸡蛋中的蛋清与蛋黄分离，取蛋清，然后用处理好的“724”树脂吸附，接着用蒸馏水洗涤，再经树脂洗脱，将所需物质与鸡蛋清中的其他蛋白质分离，然后再经盐析、纯化处理所得到的溶菌酶即可得结晶。将所得酶和底物分别放入25 OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，共计下四个读数。结果：无结晶生成。结论：溶菌酶结晶的制备及活力测定研究实验以失败告终。关键词：溶菌酶 结晶 活力测定

The Preparation Of Lysozyme Crystallization And Activity Assay

Pharmaceutical Engineering2011 ZhenlinWei

Supervisor Weimin

Abstract Gold: to study the lysozyme crystallization method of preparation and activity assay.Methods: with egg white lysozyme crystallization as raw material preparation, first of all, separate the eggs in the egg white and yolk, egg white, a “724” and then use processing resin adsorption, then washing with distilled water, then through resin elution, the required material and other protein separation of egg qing dynasty, and then received by salting out, purification processing of lysozyme crystallization.Put the enzyme and substrate respectively in 25 OC preheat constant temperature water bath for 10 minutes, drain the substrate suspension 4 ml into colorimetric cup, read the absorbance at 450 nm wavelength, this is zero readings.Then absorbs the liquid sample 0.2 mL(equivalent to 10(including g enzyme), every 30 s read 1 absorbance, a total of four readings.Results: no crystallization generated.Conclusion: the preparation of lysozyme crystallization and dynamic measurement experiment ended in failure.Keywords: lysozyme crystallization activity assay

前 言

溶菌酶(Lysozyme, EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶 ,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在 192年在人的眼泪、唾液中发现的[1]。溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶[2]。其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的 3 倍。但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为 0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的[3]。李鹤等在食品研究与开发中提到了溶菌酶已确定的三种作用：1)将溶菌酶固定化在食品包装材料上, 生产出有抗菌功效的食品包装材料, 以达到抗菌保鲜功能。2)将溶菌酶固定化在 HEPA(空气过滤器)上, 作为空调的空气净化系统, 使其具有高效除尘和杀菌两大功能。当空气通过滤网时, 先滤集捕捉尘粒和细菌,然后将捕捉到的细菌杀灭[4]。3)用溶菌酶非专一性地降解海洋生物高分子壳聚糖, 使其成为能被人体吸收的低分子量具有独特生理活性和功能性质的低聚壳聚糖[5]。近几年,溶菌酶被广泛运用于医药、食品行业。溶菌酶作为一种天然蛋白质, 能在胃肠内作用于营养物质被消化和吸收, 对人体无毒性, 也不会在体内残留, 是一种安全性很高的食品保鲜剂、营养保健品和药品[8]。溶菌酶可用于各种加工食品或饮料制作中, 集药理、保健和防腐三种功能于一体[10]。因此, 在倡导绿色食品的今天, 溶菌酶的应用前景是相当广阔的应用前景[6]。

1、材料与方法

1．1实验试剂

鸡蛋清，10%硫酸铵，固体硫酸铵，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠，十二水磷酸二氢钠，十二水磷酸氢二钠，EDTA，底物干菌粉，“724”树脂，丙酮。1．2仪器

721型分光光度计，抽滤瓶及布氏漏斗，研钵，恒温水浴，离心机，透析袋，1cm x 35cm层析柱，吸量管：0.1ml、0.2ml、1ml、5ml，真空干燥器。

1．3实验方法及步骤 蛋清的制备

将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约80~100ml，计量体积，用冰块预冷至0摄氏度备用[7]。树脂吸附 将处理好的“724”树脂用布氏漏斗抽干，取湿树脂20g（约为蛋清量的1/5~1/4），在不断搅拌下加入预冷的蛋清中，再继续搅拌3h使充分吸附，静置过夜（0~5摄氏度）[9]。洗涤

将树脂移入烧杯，取10%硫酸铵溶液30~40ml（树脂量2倍，不可多用！）分3次加入搅拌（15min）洗脱，抽干树脂，合并洗脱液（滤液），树脂保存供再生。

脱盐 沉淀用1ml蒸馏水溶解后转入透析袋，用蒸馏水透析24h（0~5摄氏度冰箱），中途换水3~5次，或流水（搅拌）透析24h。去除碱性杂蛋白

将上述透析液用1mol/LNaOH（最后用0.1mol/LNaOH）溶液调至pH8.0~8.5。如有沉淀，离心除去[14]。结晶

用药勺在搅拌下慢慢向酶液中加入5%（W/V）研细的固体NaCl，注意防止局部过浓。加完后用NaOH溶液慢慢调至pH9.5~10.0，室温下静置48h。结晶观察与收取

肉眼观察有结晶形成后，用滴管吸取结晶液1滴置于载玻片上，在低倍显微镜下观察并画出结晶图形。离心或过滤收集酶晶体，用少量丙酮洗涤晶体2次，以五氧化二磷真空干燥后称重。

酶活力的测定

底物的制备

将微球菌接种于液体培养基扩大培养(28℃,24h),再接种于固体培养基培养(28℃,48h),用无菌水将菌体洗涤, 4000rpm 离心10min, 弃上清,再洗菌体数次, 最后用少量无菌水制成悬液, 冷冻干燥即得干菌粉[11]。取干菌粉5g,加入少量0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液置于匀浆器或研钵中研磨2min, 倾出并稀释至20～25mL,悬液的光密度OD450在0.5～0.7范围为宜。

酶液的制备

准确称取干溶菌酶粉5mg,用0.1mol/L的pH6.2磷酸缓冲液溶解成0.05mol/L酶液。

酶活力测定

将酶液与底物悬液分别置于25℃水浴中保温10～15min, 测底物悬液的OD450 值,作为对照。然后加入酶液0.2mL(约10μg酶蛋白)迅速摇匀。从加酶时开始记时, 每30s测1次OD450值,共测3次[17]。

酶活力的计算

以每毫克溶菌酶每分钟使吸光度降低0.001个单位为1个酶活力单位。溶菌酶活力=ΔOD450/(0.001×W)(U/mg)式中, ΔOD450 为450nm 处每分钟吸光度的变化；W为加入的酶量(mg)。1．4数据处理

（1）计算：活力单位定义是：在25摄氏度，pH6.2，波长为450nm时，每分钟引起吸光度下降0.001为一个活力单位。

每1mg酶活力单位数=吸光度×1000/样品（ug）

（2）计算溶菌酶的收率并由其效价计算总活力回收率。收率=干燥的酶重量/蛋清总重量×100% 总活力回收率=（酶重量×效价）/蛋清总重量

2、结果

在溶菌酶结晶制备时无结晶形成，无法进行酶活力测定实验。

3、结论及分析

3.1 可能与实验过程中溶液的pH值有关，酶活性在pH6.0~6.5最强,且在pH5~7范围内较稳定[15]。实验结果无结晶生成，其原因可能是在实验过程中溶液的pH过酸或过碱，导致酶失活了，故无结晶生成。

3.2 可能与实验过程中溶液的温度有关，酶活性在25~65摄氏度范围内随着作用温度的升高酶的活性增强,但温度太高则变性失活[16]。实验结果无结晶生成，其原因可能是在实验过程的溶液的温度过高，导致酶失活，故无结晶生成。

3.3 可能与实验所用的蛋清的量有关，因为是小实验，所以实验所用蛋清的量约80~100ml，本来蛋清中就含有多种蛋白质，溶菌酶的含量也不高，并且在实验的过程中还会造成一定程度的损失，导致达不到结晶时对溶菌酶的浓度要求，故无结晶生成。

参考文献

[1] 宗柱，楚慧民，溶菌酶的应用前景和提取工艺，[J]，农牧产品开发，1996，(4)，30-31.[2] 楼善贤，溶菌酶的研究进展，[J]，浙江肿瘤通讯，1991，（4），48-52.[3] 刘文会，从鸡蛋清中提取溶菌酶的研究，[N]，北京化工大学硕士研究生学位论文，2003，（4），1-60.[4] 刘贤明, 马云骏.含溶菌酶的 HEPA 与双重杀菌过滤技术[J].节能 环保,2001(2): 20-21.[5] 周桂, 黄在银, 谭学才, 等.溶菌酶对海洋生物高分子壳聚糖的降 解研究[J].海洋科学, 2002(3): 53-56.[6] 李鹤, 马力 *, 王维香溶菌酶的研究现状[J]食品研究与开发，2008,29（1）：182-185.[7] 赵龙飞,徐亚军.鸡蛋清中溶菌酶的应用性研究[J].食品工业,2006,(3):19-20.[8] 李敏.溶菌酶及其应用[M].生物学教学,2006,31(4):2-3.[9] 荣晓花,凌沛学.溶菌酶的研究进展[J].中国生化药物杂志,1999,20(6):319-320.[10]宗柱，楚慧民，溶菌酶的应用前景和提取工艺，[J].农牧产品开发，1996，(4)，30-31 [11]楼善贤，溶菌酶的研究进展，[J].浙江肿瘤通讯，1991，（4），48-52 [12] 韩学仁，韩治才，[J].禽产品加工，北京，轻工业出版社，1989，24 [13] 孙占田.蛋清中的溶菌酶，[J].国外畜牧科技.1999,26(6):47.[14] 林亲录,马美湖.鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯化[J].食品科学.2002,23(2):43-46.[15] 贾向志,李元,马文煜，[J].生物技术通讯,2002,9:374.[16] 中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国卫生部药品标准,生化药品,第一册,北京:北京科学出版社,1989:103.[17] 马绪荣,苏德模主编.药品微生物学检验手册.北京:北京科学出版社,2000:68.

第四篇：发酵工程论文发酵过程论文

发酵工程论文发酵过程论文

生物工程技术下的发酵床养猪法

摘要: 在我国,工业式养猪的缺点逐渐显露,而“发酵床养猪法”的提出在解决养猪业环境污染、养殖效益、质量安全方面都表现出了明显的优势,受到养猪者的欢迎和行业部门的重视。因此,具有巨大的推广价值。但在应用这一技术时,也存在一些问题,影响、制约“发酵床养猪法”的应用发展,我们应该对其有一个客观的认识。

关键词: 发酵床养猪;优势;问题;制约;客观

近年来,养猪业面对的挑战日渐增多,除了猪病与市场风险外,排污与环保的压力可能是最令养猪人头痛的难题。在环保声浪日渐高涨的背景下,以厚垫料为主要特征、以“零排放”为主要卖点的“发酵床”养猪法,在强大的商业宣传攻势及各级政府部门的推动下,大有星火燎原之势。我认为,一项饲养工艺的重大变革不但需要严谨的科学论证,更需要对实际效果进行实事求是的经得起时空考验的客观评估。

发酵床技术的概括

1.1 发酵床养猪技术的原理

发酵床养猪的原理是在养猪圈舍内利用一些高效有益微生物与垫料建造发酵床,猪将排泄物直接排在发酵床上,利用生猪的拱掘习性,加上人工辅助翻耙,使猪粪、尿和垫料充分混合,通过有益发酵微生物菌落的分解发酵,使猪粪、尿有机物质得到充分的分解和转化。发酵床养猪的技术原理与农田有机肥被分解的原理基本一致,关键是垫料碳氮比与发酵微生物的选择。其技术核心在于“发,可以说,“发酵床”效率的高低决定了该养猪法经济效益的高低。

1.2 发酵床中的有益微生物

发酵床中所使用的高效有益微生物主要有芽孢杆菌属、乳酸杆菌属(厌氧型)、放线菌群(好气型)和酵母菌群(好氧型)。

1.3 发酵床养猪的注意事项

1.3.1 猪舍:一般要求猪舍呈东西走向,座北朝南,这样的圈舍采光好,利于发酵;而且南北可以敞开,适合通风良好,不臭也没蚊蝇。

1.3.2 阳光:屋顶需要设置透明亮瓦,要让阳光照进来,这个对圈底微生物发酵床菌种营养搭档伴侣和粪便秸秆发酵剂的发酵非常重要,亮瓦的多少以阳光自东向西移动时可照到猪圈全部为最佳,尽量做到阳光普照。

1.3.3 养猪密度:根据猪的大小来分,考虑猪的数目,每个猪大概1平方米左右,如果养的密度太小,微生物营养不够,发酵不好,就失去效果了,但是可以补充。密度过大绝对不行,对圈地造成很大的影响,猪的活动空间也不够,微生物吸收不了这么多猪粪,导致圈底潮湿。

1.3.4 垫料:垫料一般选择:秸秆、树叶杂草、稻谷壳粉、锯末屑、粪便,发酵床菌种之一粪便秸秆发酵剂等,有条件加入少量的米糠、酒糟等糟渣饲料发酵效果更好。其厚度一般在80cm左右,以确保发酵床有较高的温度。

1.3.5 垫料管理:正常运行的垫料,其中心部无臭味,湿度45%～50%,温度45℃左右,PH值7～8。为了保证垫料的正常发酵,应每周翻动2～3次,翻动深度30厘米以上。打散结块垫料保证通透性。每批猪出栏后将垫料彻底翻一遍。

对发酵床的客观看待

2.1 发酵床养猪技术的优点

2.1.1 减轻对环境的污染:猪粪尿可长期留存猪舍内,不向外排放,不向周围流淌,利用垫料里含有的相当活性的土壤微生生物的发酵原理,能够迅速有效的降解、消化猪的排泄物,不需要再对猪粪尿采用清扫排放,也不会形成大量的冲圈污水,从而变成没有任何废弃物排放的养猪场,真正达到养猪零排放的目的。

2.1.2 节约能源:猪粪尿与锯末垫料的混合物在微生物的作用下迅速发酵分解,产生热量,中心温度可达40～50℃或更高,表层温度长期维持在25～30℃。在零度以下的冬天,不管南方北方(北方更有优势),这个升温的优点是很具经济价值的,省了电、煤等取暖费。尤其是改善了猪的腹感温度,降低了猪舍温度变化幅度,相比其他取暖方式,更具优势。同样,在夏季,由于几乎全敞开窗户,形成了扫地风、穿堂风等类似凉亭子的效果,结合垫料管理,猪只感觉非常凉爽。

2.1.3 增加安全性:利用有益菌占位原理,增强猪只抗病力,提高了饲养效率和猪肉品质病原菌致病的基础是病原菌达到一定的浓度,由于发酵微生物等有益菌的大量繁殖,在垫床上、空气中甚至猪舍的各个角落都弥漫着有益菌,使有益菌成为优势菌群,形成阻挡病原菌的天然屏障。即使有极少量病原菌的刺激,也只能使猪只产生特异性免疫反应,从而使猪只形成坚强的保护力。

2.1.4 提高猪肉品质:猪饲养在垫料上,显得十分舒适,猪活动量较大。猪生长发育健康,几乎没有猪病发生,几乎不用抗生药物,提高了猪肉品质,生产出真正意义上的有机猪肉。

2.2 发酵床养猪技术的缺点

2.2.1 发酵床造价比较高:不适合小型用户,适合规模养殖场。

2.2.2 饲养密度与排泄物承载能力:由于猪群的排泄物全部汇集在“发酵床”上,有效单位面积的饲养密度与排泄物的承载能力呈正相关,发酵床面积太小导致功能微生物因面积不够而超负荷工作,导致发酵床降解粪便、除臭、促生长的作用就不明显或基本丧失殆尽。

2.2.3 疫病的控制问题:虽然危害养猪业的主要细菌、病毒无法在50℃的环境下长期存活,但不能带猪消毒始终是这一养猪法的缺陷,发酵床养的猪也会得病,发酵的益生菌也不可能完全抑制病毒,同时发酵床是靠木屑、米糠等粉状物吸收猪的排泄物,而猪有拱食的习惯,木屑、米糠等粉状物会因为猪拱食进入呼吸道,有造成呼吸道疾病的潜在威胁,湿度过高时会使寄生虫病危害严重。

总结

总之,任何一种技术都会存在优缺点,也有一定的应用条件,发酵床养猪技术也不例外,因此发酵床的功能作用不是万能的,办法是否总会比问题多,也不一定,关键需要从各个方面综合考虑。在推广过程中,我们根据其他怕什么不怕什么,对一些技术进行了完善改良并积极做好维护和管理工作使发酵床长期正常运转。

参考文献:

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第五篇：微生物制药的一般工艺流程

微生物制药的一般工艺流程

微生物制药技术

工业微生物技术是可持续发展的一个重要支撑，是解决资源危机、生态环境危机和改造传统产业的根本技术依托。工业微生物的发展使现代生物技术渗透到包括医药、农业、能源、化工、环保等几乎所有的工业领域，并扮演着重要角色。欧美日等国已不同程度地制定了今后几十年内用生物过程取代化学过程的战略计划，可以看出工业微生物技术在未来社会发展过程中重要地位。

微生物制药技术是工业微生物技术的最主要组成部分。微生物药物的利用是从人们熟知的抗生素开始的，抗生素一般定义为：是一种在低浓度下有选择地抑制或影响其他生物机能的微生物产物及其衍生物。(有人曾建议将动植物来源的具有同样生理活性的这类物质如鱼素、蒜素、黄连素等也归于抗生素的范畴，但多数学者认为传统概念的抗生素仍应只限于微生物的次级代谢产物。)近年来，由于基础生命科学的发展和各种新的生物技术的应用，报道的微生物产生的除了抗感染、抗肿瘤以外的其他生物活性物质日益增多，如特异性的酶抑制剂、免疫调节剂、受体拮抗剂和抗氧化剂等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活动的范围。但这些物质均为微生物次级代谢产物，其在生物合成机制、筛选研究程序及生产工艺等方面和抗生素都有共同的特点，但把它们通称为抗生素显然是不恰当的，于是不少学者就把微生物产生的这些具有生理活性（或称药理活性）的次级代谢产物统称为微生物药物。微生物药物的生产技术就是微生物制药技术。可以认为包括五个方面的内容：

第一方面 菌种的获得

根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。

分离思路 新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。具体分离操作从以下几个方面展开。

定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。

采样：有针对性地采集样品。

增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。

分离：利用分离技术得到纯种。

发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。

第二方面 高产菌株的选育

工业上生产用菌株都是经过选育过的。工业菌种的育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。通过改造，可使现存的优良性状强化，或去除不良性质或增加新的性状。

工业菌种育种的方法：诱变、基因转移、基因重组。

育种过程包括下列3个步骤：(1)在不影响菌种活力的前提下，有益基因型的引入。(2)希望基因型的选出。(3)改良菌种的评价(包括实验规模和工业生产规模)。

选择育种方法时需综合考虑的因素(1)待改良性状的本质及与发酵工艺的关系(例如分批或者连续发酵试验)；(2)对这一特定菌种的遗传和生物化学方面认识的明了程度；(3)经济费用。如果对特定菌种的基本性状及其工艺知晓甚少，则多半采用随机诱变、筛选及选育等技术；如果对其遗传及生物化学方面的性状已有较深的认识，则可选择基因重组等手段进行定向育种。

工业菌种具体改良思路：(1)解除或绕过代谢途径中的限速步骤（通过增加特定基因的拷贝数或增加相应基因的表达能力来提高限速酶的含量；在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径。）(2)增加前体物的浓度。(3)改变代谢途径，减少无用副产品的生成以及提高菌种对高浓度的有潜在毒性的底物、前体或产品的耐受力。(4)抑制或消除产品分解酶。(5)改进菌种外泌产品的能力。(6)消除代谢产品的反馈抑制。如诱导代谢产品的结构类似物抗性。

第三部分 菌种保藏技术

转接培养或斜面传代保藏；

超低温或在液氮中冷冻保藏；

土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。

第四部分 发酵工艺条件的确定

微生物的营养来源

能源，自养菌：光；氢，硫胺；亚硝酸盐，亚铁盐。异养菌：碳水化合物等有机物，石油天然气和石油化工产品，如醋酸。

碳源，碳酸气；淀粉水解糖，糖蜜、亚硫酸盐纸浆废液等，石油、正构石蜡，天然气，醋酸、甲醇、乙醇等石油化工产品 氮源，豆饼或蚕蛹水解液，味精废液，玉米浆，酒糟水等有机氮，尿素，硫酸铵，氨水，硝酸盐等无机氮，气态氮

无机盐，磷酸盐，钾盐，镁盐，钙盐等其他矿盐，铁、锰、钴等微量元素等

特殊生长因子，硫胺素、生物素、对氨基苯甲酸、肌醇等

培养基的确定

（1）首先必须做好调查研究工作，了解菌种的来源、生活习惯、生理生化特性和一般的营养要求。工业生产主要应用细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物。它们对营养的要求既有共性，也有各自的特性，应根据不同类型微生物的生理特性考虑培养基的组成。

（2）其次，对生产菌种的培养条件，生物合成的代谢途径，代谢产物的化学性质、分子结构、一般提取方法和产品质量要求等也需要有所了解，以便在选择培养基时做到心中有数。

（3）最好先选择一种较好的化学合成培养基做基础，开始时先做一些摇瓶实验;然后进一步做小型发酵罐培养，摸索菌种对各种主要碳源和氮源的利用情况和产生代谢产物的能力。注意培养过程中的pH变化，观察适合于菌种生长繁殖和适合于代谢产物形成的两种不同pH，不断调整配比来适应上述各种情况。

（4）注意每次只限一个变动条件。有了初步结果以后，先确定一个培养基配比。

其次再确定各种重要的金属和非金属离子对发酵的影响，即对各种无机元素的营养要求，试验其最高、最低和最适用量。在合成培养基上得出一定结果后，再做复合培养基试验。最后试验各种发酵条件和培养基的关系。培养基内pH可由添加碳酸钙来调节，其他如硝酸钠、硫酸铵也可用来调节。

（5）有些发酵产物，如抗生素等，除了配制培养基以外，还要通过中间补料法，一面对碳及氮的代谢予以适当的控制，一面间歇添加各种养料和前体类物质，引导发酵走向合成产物的途径。

(6)根据经济效益选择培并基原料

考虑经济节约，尽量少用或不用主粮，努力节约用粮，或以其他原料代粮。糖类是主要的碳源。碳源的代用品主要是寻找植物淀粉、纤维水解物，以废糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工业葡萄糖代替食用葡萄糖；石油作为碳源的微生物发酵也可以生产以粮食为碳源的发酵产品。有机氮源的节约和代替主要为减少或代替黄豆饼粉、花生饼粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有丰富蛋白质的原料为目标，代用的原料可以是棉籽饼粉、玉米浆、蚕蛹粉、杂鱼粉、黄浆水或麸汁、饲料酵母、石油酵母、骨胶、菌体、酒糟，以及各种食品工业下脚料等。这些代用品大多蛋白质含量丰富，价格低廉，便于就地取材，方便运输。

培养工艺的确定：

培养条件：温度、pH值、氧、种龄、接种量、温度

工业微生物的培养法分为静置培养和通气培养两大类型。

静置培养法即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行发酵，又称为厌氧性发酵。通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。

在静置和通气培养两类方法中又可分为液体培养和固体培养两大类型，其中每一类型又有表面培养与深层培养之分。

关于液体深层培养：

用液体深层发酵罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方法，相对于由气液界面靠自然扩散使氧溶解的表面培养法来讲，称为深层培养法。特点是容易按照生产菌种对于代谢的营养要求以及不同生理时期的通气、搅拌、温度、与培养基中氢离子浓度等条件，选择最佳培养条件。

深层培养基本操作的3个控制点

①灭菌：发酵工业要求纯培养，因此在发酵开始前必须对培养基进行加热灭菌。所以发酵罐具有蒸汽夹套，以便将培养基和发酵罐进行加热灭菌，或者将培养基由连续加热灭菌器灭菌，并连续地输送于发酵罐内。②温度控制：培养基灭菌后，冷却至培养温度进行发酵，由于随着微生物的增殖和发酵会发热、搅拌产热等，所以为维持温度恒定，须在夹套中以冷却水循环流过。③通气、搅拌：空气进入发酵罐前先经空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进人，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。为了延长气泡滞留时间，可在罐内装挡板产生涡流。搅拌的目的除了溶解氧之外，可使培养液中微生物均匀地分散在发酵罐内，促进热传递，以及为调节pH而使加入的酸和碱均匀分散等。

第五部分 发酵产物的分离提取

提取方法：

过滤

离心与沉降

细胞破碎

萃取

吸附与离子交换

色谱分离

沉析（盐析、有机溶剂沉析、等电点等）

膜分离

结晶

干燥

分离提取过程的几个注意的问题：

水质

热源去除（石棉板吸滤、活性碳吸附、过离子交换柱）

溶剂回收

废物处理

生物安全性