第一篇：病原菌分离培养总结
病原菌的分离培养方法
一、基本原理
植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
二． 病原真菌的分离培养（花生褐斑病为例）
1.分离的准备工作
（1）分离材料准备：花生褐斑病叶片：病斑圆形或近圆形暗褐色、黑褐色，淡黄色晕圈。背面有许多黑色小点，呈同心轮纹状排列。
（2）培养基的准备: PDA培养基,加热熔化，紫外灭菌后倒板； （3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、70％酒精、0．1％升汞、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。（升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心）。
2.组织分离法
（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；
（3）取花生褐斑病的症状典型病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块病组织数块。（选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。）（4）表面消毒：用菌培养皿一次准备流程（75%酒精—0.1%升汞—无菌水—无菌水—无菌水），将病组织放人70％酒精中浸3—5s后，按无菌操作法将病组织移人0．1％升汞液中分别表面消毒1 min左右（如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些），然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
（5）用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。
（6）将培养皿倒置放人25 ℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。
（7）除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，并且根据保湿培养的结果进一步确定；
（8）在无菌条件下，用打孔菌落边缘挑取小块移入培养基上，在25℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可保存。
三． 病原细菌的分离培养（萝卜黑腐病为例）
1.分离的准备工作
（1）分离材料准备：萝卜黑腐病俗称黑心、烂心，该病是由细菌引起的病害。主要危害叶和根。幼苗期发病子叶呈水浸状，根髓变黑腐烂。叶片发病，叶缘多处产生黄色斑，后变“V”字形向内发展，叶脉变黑呈网纹状，逐渐整叶变黄干枯。病菌沿叶脉和维管束向短缩茎和根部发展，最后使全株叶片变黄枯死。萝卜肉质根受浸染后，透过日光可看到暗灰色病变；横切萝卜可看到维管束呈放射线状、黑褐色；重者呈干缩空洞，维管束溢出菌脓，这一点与缺硼引起的生理性变黑不同。
（2）培养基的准备:PDA，后划线纯化NB；
（3）分离工作仪器与用品：超镜工作台、培养箱、无菌培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、70％酒精、酒精灯、火机、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉等。
2.黑腐病菌分离（1）工作前用肥皂洗手，无菌操作前还要用70％酒精擦拭双手；在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。
（2）酒精灯放入中间合适位置，点燃后不要在移动，保证火焰周围无菌环境；
（3）取萝卜黑腐病块茎，用75 %酒精进行表面消毒；用灭菌解剖刀切去表面，并向内切取病组织，切成长条小块（2mm*3mm），用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放3-5块。（在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染）。
（4）将培养皿倒置放人28 ℃左右恒温箱内培养。一般3—4d后观察待分离菌生长结果；若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。
（5）根据菌落的一致性初步确定长出的菌落，选择长出的三种菌落（黄、红、生防），分别在无菌条件下在NB培养基进行划线；在28℃左右恒温箱内培养，数经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养；最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。（6）观察到的菌落特征：萝卜黑腐病菌，圆形，同心环状，内环呈金黄色，外围白色菌脓，湿润，随环隆起、凹陷，半透明，边缘不整齐。
四．资料查询其他分离培养方法
1.病原真菌 稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0．5～1．0ml。
(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化开冷却到45～50C的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。为大体估计培养基温度，可将盛培养基的器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为45~50C。
(5)将培养皿翻转后置恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌。将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。
2.病原细菌
病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：
(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在30C恒温箱中2—4h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。
(2)将病组织先用0．1％升汞表面消毒0．5--2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20—60min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼．冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28C恒温箱中培养。1—3d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
五． 常用的几种典型的病原菌分离方法
1．斑点病原菌的分离。从病斑部分切取每边3—5mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移人0．1％的升汞水溶液中处理3—5rain，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。
2．维管束组织内病原菌的分离。从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。
3．根腐病病原菌的分离。根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。
4．肉质组织中病原菌的分离。多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。
5．种子内病原菌分离。将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。
6．孢子分离法。能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。
7．土壤带菌分离法。为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。
第二篇：藻类的分离和培养
藻类的分离和培养
微型藻类的分离和培养方法基本上与菌类的方法相似，但还需加上光照条件，并以液体培养为主。在大量培养时，可不必考虑无菌条件。
一、目的
学习藻类的分离和培养方法
二、药品、材料和用具
水生生物培养槽，玻璃片（面积稍大于培养槽），橡皮管，显微镜，三角烧瓶，试管，筛绢，棉塞，微吸管，凹玻片，灭菌锅，载玻片，吸管，培养皿，人工光源，木盆（或小型实验池），充二氧化碳气钢瓶，抽气泵，离心机。
土壤抽出液，青霉素，链霉素，琼脂，硝酸钙，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，过磷酸钙，硫酸镁，氯化钾，碳酸钠，三氯化铁，硅酸钠，葡萄糖，蛋白胨，硫酸铵，硝酸铵，氯化钙，碳酸氢钠，钼酸，氯化钠，柠檬酸铁，硫酸锰，人尿，海泥抽出液，食盐。
三、操作
生长在静水或水流缓慢河流中的藻类，培养比较容易。取到实验室后，要立刻从材料瓶中移到宽大的水生生物培养槽内。为了培养大的丝状藻，要利用宽的、不高的容器。这些容器要用玻片盖住，以防止培养物受灰尘沾污。倒入容器的水要达到容器高度的一半，或稍多些，使水面上还有充分空气。在容器边缘，要用一小块纵切橡皮管垫住，可使玻片不致紧贴容器，空气才能进入容器中。细微的藻类如团藻目、硅藻门能很好地生活于培养皿中。很多藻类如颤藻属、水绵属的若干种、轮藻属等可在实验室中保存很多年。
在迅速流动水中生长的藻如丝藻属、毛枝藻属等比较难于培养，因为它们要求经常输入氧气。在水层较高水中，在高容器中，这些藻类迅速地死亡。为了把这些藻类保存到实验时，应当把它们分成一些小部分，放在水层较薄的、宽的容器内，并须常常换水，把空气吹入水中。还可以用橡皮管把水生生物培养槽和水龙头连结起来，建立有流水的水生生物培养槽。
在水生生物培养槽中培养藻类时，应尽可能创造和保持藻类天然生存条件。把藻类培养在从采集藻类那一水域取来的水中，或其他天然水（尤其不能用自来水，因其中含很多氯气，必要的话，也须置较长时间，或加以煮开），或在水中加入混合养料，这些养料是由制造有机物质所必需的矿质盐构成。
在夏季，不要把藻类培养物放在直射太阳光下，而要放在凉爽的场所，例如向北窗台上。在秋、冬季节，如希望藻类保持积极生活活动状态，就要把培养物移到有人工光照处。
以上是一般藻类粗放的培养、保存方法。如要作较深入实验，需注意以下问题：
1．藻种的分离
藻类培养首先要有藻种。从天然水域的混杂生物群中，用一定方法把所需藻类个体分离出来，而获纯种培养。这种方法称为藻种分离和纯化，又称纯培养法。
真正的“纯种培养”是指在排除包括细菌在内的一切生物的条件下进行的培养。这是进行科学研究不可缺少的技术，而在生产性培养中不排除细菌的称之为“单种培养”。
（1）采样和预备培养：首先要采集有需要分离藻类的水样，采回后在显微镜下检查。如发现需要分离的藻类数量较多时，可立即分离。若数量很少，最好先进行预备培养，待其增多后，再分离。
用作预备培养的培养液，各种藻类是不同的，对一些难以培养的藻类一般加入土壤抽出液较好。预备培养液营养成分浓度应小些，一般只有原配方的1/4～1/2。如水样中藻类种类较多，就应使用几种不同的培养液，使藻类在适合于自己繁殖的培养液中繁殖起来。
可用三角烧瓶或试管作培养容器，加入容量1/4～1/3培养液。然后把经筛绢过滤除去大型浮游生物的水样接种进去，放在合适温度下或室内靠北窗口下培养。在培养附着藻类时，容器可静止不动；而培养浮游藻类时，应该每天摇动一次。
有的藻类在普通培养液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困难。此时需改变培养液浓度，加入葡萄糖、蛋白胨等有机物，补充微量元素和辅助生长物质，加入土壤抽出液，就有可能获较好效果。
土壤抽出液制作方法：先在试管底部，加入高约1cm土壤（采用腐殖化的农田和庭院土）。再加入水使达5cm，塞上棉塞，采用蒸气间隙灭菌，每天灭菌1小时，连续二天。由于气泡上升，棉塞可能弄脏。因此，最好先在水中煮一段时间，使气泡跑掉后，再加棉塞进行灭菌。
（2）分离方法：常用下列四种。
1）微吸管（毛细管）分离 选直径较细（约5毫米）玻管，在火焰上加热，待快熔时，快速拉成口径极细的微吸管。将稀释适度藻液水样，置浅凹载玻片上，镜检。用微吸管挑选要分离的藻体，认真仔细地吸出，放入另一浅凹载片上，镜检这一滴水中是否达到纯分离的目的。如不成功，应反复几次，直至达到分离目的为止。然后移入经灭菌的培养液中培养，一般在每个培养皿中接20～30个个体。从分离出少量细胞扩大培养到200毫升的培养量，如硅藻一般需20天以上。为了较长时期保存藻种，可将分离到的藻种用青霉素（1000～5000单位或链霉素（20ppm）处理后，获得较纯藻种。
此法操作技术要求高，要细心。往往吸取一个细胞，要反复几次才能成功，且适于分离个体较大藻类。
2）水滴分离法 用微吸管吸取稀释适度藻液，滴到消毒过载片上，水滴尽可能滴小些，要求在低倍镜视野中能看到水滴全部或大部分。一个载片上滴2～4滴，间隔一定距离，作直线排列。如一滴水中只有几个所需同种藻类个体，无其他生物混杂，即用吸管吸取培养液，把这滴水冲入装有培养液并经灭菌试管或小三角瓶中去。如未成功，需反复重做，直到达到目的。
此法简便易行，尤其适宜于分离已在培养液中占优势种类。分离受少量生物污染培养液中的藻类多用此法。操作时同样要求细致、认真，使用工具及培养液经严格消毒。
3）稀释分离法 把含有需要分离的藻类而又混杂有其他生物的水样，取其一定量，用培养液稀释。通过稀释到适宜程度的方法，达到把原混杂生物单个分离培养的目的。
首先把水样稀释到每一滴含有一个左右的生物细胞（也可能一个都没有，也可能有两个），在稀释过程中配合显微镜检查，调节稀释度，然后准备装有1/4容量培养液的试管20支，每一试管加入稀释适宜水样一滴，摇匀，进行培养。待藻类生长繁殖达一定浓度时，再检查是否达到分离目的，若未达到，再重复做。
此法操作简单易行，但有一定程度盲目性，比不上水滴分离法效果好。
4）平板分离法 这个方法的培养基制备和分离方法，与菌类的平板分离法基本相同，只是培养基配方不同。也可将稀释藻液装入消毒过的小型喷雾器中（可使用医用喉头喷雾器），打开培养皿盖，把藻液喷射在培养基平面上，形成分布均匀的薄层水珠。
接种后，盖上盖，放在适宜的光、温条件下培养。一般经过十余天，就可在培养基上发生互相隔离的藻类群落，通过显微镜检查，寻找需要的纯藻群落，然后用消毒过的接种环移植到另一平板培养基培养，也可直接移植到装有培养液并经过灭菌的试管或小三角烧瓶中，加消毒棉花塞子，进行培养。
此法较繁，但难度不大，而且可看到是否污染杂菌，对于分离已污染杂菌培养液的藻类更合适。
5）底栖藻的分离 在显微镜或放大镜下挑取个体，一般可接种在固体培养基平板上，反复挑选、培养。
6）分离浮游蓝藻 可利用其浮力大，易浮起在水面的特性；分离硅藻则可利用其易沉淀的特性。
用以上各种方法分离到藻种，需放在适宜光照条件下（靠南或北窗口附近光线充足处，但严防阳光直射）培养，有条件的可控制温度和利用人工光源。培养时，每天轻轻摇动1～2次，但需注意勿把培养液沾湿棉塞，避免杂菌污染。经一段时间后，培养物颜色逐渐变深。再经一次显微镜检查，如无其他混杂生物，才达到单种培养目的。
2．藻种的培养
获得单种培养后，一方面扩大培养，另一方面可把藻种作较长时间保存，需要时随时取出使用。藻种培养要求比较严格，培养容器可用各种不同大小的三角烧瓶，容量有100、300、500、1000毫升，适于逐渐扩大培养。培养容器和工具需经煮沸灭菌或使用化学药品灭菌后，用煮沸水冲洗，培养液用加热灭菌法灭菌。按种后瓶口用灭菌纸包扎，放在适宜光、温条件下培养，每天轻轻摇动二次。大约二周后进行一次移植。藻种在培养过程中必须定期用显微镜检查，保持不受其他生物污染。
3．藻种的保藏
可接在固体培养基上，在常温、弱光下保藏半年到一年；也可在低温下（冰箱内）保藏，每天接受短时间（几个小时）弱光，可保藏2～3年；如不照光，只能保藏几个月。保藏藻种所用培养基的营养成分浓度应比正常培养基高一些，一般可增加一倍，琼脂量为1～1.5％。也可在固体培养基上，再加培养液，然后接种到培养液中，可以避免固体培养基干涸，保藏效果比单用固体好。
4．培养液和培养基的配方
配方极多，每种配方主要适用于一定藻种，这里介绍比较常用的几种：
水生4号和克诺普（Knop）培养液，一般用于绿藻；蓝藻可用朱氏10号或水生105号无氮培养基（后者适于固氮蓝藻）；硅藻可用朱氏10号和水生硅1号培养基；另外还有海产绿藻、硅藻的培养基。常用培养基配方见表1。
以上用水量都是加至1000mL，海藻培养液用海水，如无海水可用淡水1000mL加30克食盐代替。土壤抽出液用菜园土1份和水2份比例混合搅匀，静置，取上清液；海泥抽出液也可用同样比例制备。如配制固体培养基，可在培养液内加入1.5％琼脂。
从以上各种配方，可看到配制藻类培养液的几条原则：
（1）要有适量氮源（除固氮蓝藻外），如氨盐、硝酸盐、有机氮等。
（2）应包括主要元素钾、磷、镁、硫、钙等。
（3）要考虑各种盐类总浓度和pH是否适合藻类需要，可用碳酸氢钠调节pH。
（4）要加入各种藻类需要的微量元素，如铁、锰、铜、锌等（后几种包括在土壤抽出液中）。
（5）要满足某些藻类特殊需要，如蓝藻需钼，硅藻需硅。
（6）要添加适量生长物质如维生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。
5．大量培养过程
包拈接种、培养、采收等。
（1）接种：一般要求选取生活力强、生长旺盛藻种。可先将浓缩藻种用连续稀释法，制备一定浓度的悬浮藻液，然后接入培养容器。接种时注意藻种和培养液比例要适当，使藻细胞在新培养液中达到一定数量。使一开始培养，藻类在培养液中占优势，另一方面还可缩短培养周期，这是培养得到成功的经验之一。在环境条件不很适合情况下，更需提高接种量。一般所用藻种浓度，根据藻类体积大小，每毫升30万～300万个，采用1∶2～1∶5的比例。还需注意接种时间，在自然光条件下，最好在上午8～10时，不宜在晚上。尤其是能运动种类，此时明显向上浮游，接种时可把上浮优质藻类吸出做藻种，起选种作用。
（2）培养管理：主要是使已接种培养物在相对稳定适宜环境中大量繁殖生长。要注意以下因素：
1）二氧化碳浓度在开放式不通气方法培养中，搅拌是十分必要的，可以增加水和空气的接触面，使空气中二氧化碳溶解到培养液中，而且帮助沉淀藻类细胞上浮获得光照。在通气培养中，培养液内应维持二氧化碳浓度在0.1～5％之间。
2）光照强度 利用太阳光源培养时，一般在室内培养可放在近窗口地方，防止强直射光照射。或利用人工光源（60～100瓦电灯或日光灯），需1500～3000勒克斯/厘米2。
3）温度 适温一般在10～30℃之间，最适温常为20～25℃。若在室外培养，夏季中午高温，冬季早晚低温，常造成不利影响，需设法调节。
4）无机营养 应不断添加新鲜培养液，及时补充被藻吸收后减少了的某些元素。
5）注意pH变化 如变动过大，可用酸、碱调节。
6）适当控制培养物中藻细胞浓度 过高会引起光照和无机营养不足，并导致pH上升。一般控制在0.3g（干重）/L范围内。
7）及时观察和检查藻类生长情况 可以通过培养物呈现的颜色、藻类细胞运动情况、是否有沉淀附壁、菌膜及敌害生物污染迹象等观察而了解一般的生长情况。藻种和中继培养每半月进行一次全面显微镜检查。大量培养中发现有不正常现象，应立即镜检，目的有两个：了解藻细胞生长情况，并检查有无敌害生物污染。
（3）采收：培养液中藻体的适时采收，既是培养的目的，也是继续培养的手段。因为通过采收一部分藻体，可使藻细胞浓度保持恒定。通常在培养物细胞浓度达到干重0.4～0.5克/升时，即可采收培养总量1/3的藻体。
采收时，先搅拌培养物，取出1/3量藻液，置于沉淀缸中，加入2％～3％明矾或6％饱和石灰水。约1～2小时，藻细胞即可完全沉淀，取出沉淀，离心、浓缩、烘干。在大型培养池中采收藻体，可另外设计适当的工艺流程。
第三篇：微生物的分离与培养
病原物的分离与培养
病原物的分离与培养在植物病害的研究中具有重要意义，分离、培养病原菌的方法是植物病理学研究工作中最常应用的实验技术。一方面，在一个新的病害研究中，通过分离与培养获得病原物的纯培养，完成柯氏法则，以明确该病病原；研究病原物的生物学特性和病害循环（侵染、病程等等）。所谓病原物的分离，即把该病原菌从发病组织上与其他微生物分开；所谓病原物的培养，即将分离的病原菌移到可以让这种病原菌正常生长的营养基质即培养基上，从而获得其纯培养。病原物的分离与培养，需经以以几个步骤: 1.有关器皿的灭菌和消毒； 2.制作培养基； 3.病原菌的分离 4.病原菌的培养。－、灭菌与消毒
灭菌与消毒是两个不同的概念。灭菌则是指杀死一切微生物的营养体和孢子。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，在植物病理学实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、辐射和使用化学药品等方法。
(一)热力灭菌
热力灭菌分干热灭菌和湿热灭菌两类。
1．干热灭菌
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质疑固性与其本身的含水量有关。在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高(160～170℃)，时间长1～2 h。但干热灭菌温度不能超过180 ℃，否则包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。干热灭菌使用的仪器是烘箱。
干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时酌试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。涂布平板用的三角玻棒也可在蘸有乙醇后进行灼烧灭菌。通常所说的干热灭菌是在烘箱内利用高温干燥空气(160～170℃)进行灭菌。此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌。
进行干热灭菌要注意以下问题：物品不要摆得太挤，以免妨碍空气流通；灭菌物品不要接触烘箱内壁的铁板，以防包装纸烤焦起火；在升温过程中，如果红灯熄灭，绿灯亮，表示箱内停止加温；电烘箱内温度未降到70℃以前，切勿自行打开箱门以免骤然降温导致玻璃器皿炸裂。湿热灭菌
(1)高压蒸汽灭菌 此法是将物品放在密闭的高压蒸汽灭菌锅内，0.1MPa，121℃保持15～30 min进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化，以达到彻底灭菌。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等，也可用于玻璃器皿的灭菌。
(2)常压蒸汽灭菌 在不具备高压蒸汽灭菌的情况下：常压蒸汽灭菌是一种常用的灭菌法。对于不宜用高压蒸汽灭菌的培养基如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等可采用常压蒸汽灭菌。这种灭菌方法可用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行，也可用普通蒸笼进行灭菌。由于常压，其温度不超过100℃，仅能使大多数微生物被杀死，而芽孢细菌却不能在短时间内杀死，因此可采用间歇灭菌以杀死芽孢细菌，达到彻底灭菌的目的。
常压间歇灭菌是将灭菌培养基放人灭菌器内，每天加热100℃，30 min，连续3 d，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养物取出放室温下18～24 h，使其中的芽孢发育成营养体，第二天再加热100℃，30 min，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。
(二)过滤除菌
许多材料例如血清、抗生素及糖溶液等用加热消毒灭菌方法，—均会被热破坏，因此采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有：
(1)蔡氏过滤器 该过滤器是由石棉制成的圆形滤板和一个特制的金属（银或铝）漏斗组成，分上、下两节。过滤时，用螺旋把石棉板紧紧夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液臵于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板。根据其孔径大小，滤板分为3种型号：K型最大，作一般澄清用；EK滤孔较小，用来除去一般细菌；EK-S滤孔最小，可阻止大病毒通过。使用时可根据需要选用。
(2)微孔滤膜过滤器 这是一种新型滤器，其滤膜是用醋酸纤维酯和硝酸纤维酯的混合物制成的薄膜。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装臵的塑料盖盒组成。出口处可连接针头，入口处可连接针筒。使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分。但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。实验室中用于除菌的微孔滤膜孔径一般为0.22μm，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的微孔滤膜。微孔滤膜过滤除菌的主要操作步骤为：
① 组装、灭菌 将0.22μm孔径的滤膜装入清洗干净的塑料滤器中，旋紧。压平，包装灭菌后待用(0.1MPa、121.5℃灭菌：20 min)。连接。将灭菌滤器的入口在无菌条件下，以无菌操作方式连接于装有待滤溶液注射器上，将针头与出口处连接并插入带橡皮塞的无菌试管中。
② 压滤 将注射器中的待滤溶液加压缓缓挤压过滤到无菌试管中。滤毕，将针头拨出。压滤时，用力要适当，不可太猛太快，以免细菌被挤压通过滤膜。
提示: 整个过程应在无菌条件下严格无菌操作以防污染，过滤时应避免各连接处出现渗透现象。
(三)辐射灭菌 紫外线灭菌是用紫外线灯进行的。波长为200～300 nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260 nm的杀菌力最强。在波长一定的条件下，紫外线的杀菌效率与强度和时间的乘积成正比。紫外线杀菌机理主要是因为它诱导了胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA的交联，从而抑制了DNA的复制。另一方面，由于辐射能使空气中的氧电离成[O]，再使O2氧化生成臭氧(O3)，或使水氧化生成过氧化氢(H2O2)。O3和H2O2有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。
注意事项: 紫外线对眼结膜及视神经有损伤作用，对皮肤有刺激作用，故不能直视紫外线灯光，更不能在紫外线灯光下工作。紫外线灯距照射物以不超过1.2 m为宜。
此外，采用60Co-γ射线灭菌，也已广泛用于不能进行加热灭菌的纸、塑料薄膜，各种积层材料制作的容器以及医用生物敷料皮等的灭菌。γ射线灭菌的最大优点是穿透力强，可在厚包装完好条件下灭菌。
(四)化学药品灭菌
化学药品消毒灭菌法是应用能抑制或杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。能破坏细菌代谢机能并有致死作用的化学药剂为杀菌剂，如重金属离子等；只是阻抑细菌代谢机能，使细菌不能增殖的化学药剂为抑菌剂，如磺胺类及大多数抗生素等。化学药品对微生物的作用是抑菌还是杀菌以及作用效果还与化学药品浓度的高低、处理微生物的时间长短、微生物的种类以及微生物所处的环境等有关。
植物病理学实验室中常用的化学药品有2％煤酚皂溶液(来苏尔)、0.25％新洁尔灭、0.1％升汞、3％～5％酌甲醛溶液、75％乙醇溶液等。
消毒与灭菌不仅是从事植物病理学和整个生命科学研究必不可少的重要环节和实用技术，而且在医疗卫生、环境保护、食品、生物制品等各方面均具有重要的应用价值。根据不同的使用要求和条件选用合适的消毒灭菌的方法。
二、培养基的制作
1、目的要求
了解培养基的配制原理，掌握培养基的制备方法。
2、基本原理
在植物病理学研究工作中经常要使用各种不同的培养基。培养基是按照生物生长繁殖所需要的各种营养，用人工方法配制而成的营养基质。其中含有碳源、氮源、无机盐、维生素以及水分等。微生物在培养基上生长繁殖还必须在最适pH范围内才能生长得更好，因此，对不同种类的微生物应将培养基调节到一定的pH范围。－般而言，真菌调节到微酸，细菌调节到微碱。
培养基的种类很多，不同的微生物所需要的培养基不同。依物理性状可分为液体的、固体的和半固体的三种。固体培养基是在液体培养基中加入1.5 %～2 %的琼脂，半固体培养基是加入0.2 %～0.5 %的琼脂。琼脂(agar)起凝固作用，一般微生物均不能分解利用。
根据营养物质来源的不同，培养基可分为天然、半合成和合成培养基三类。天然培养基是以自然界原有的有机物为材料经灭菌后制成，如马铃薯、胡萝卜、水果、大麦粒、高粱粒等。半合成培养基中既有一些天然的有机物质，又有一些成分简单或明确的化合物。如常用的马铃薯葡萄糖培养基(PDA)、肉汁胨培养基(NA)等。合成培养基是由一些成分明确的化合物配制而成的，无任何成分不明确的物质，常用于研究微生物的生理生化性状，如查氏(Czapek)培养基等。
根据培养基用途不同，可分为生长繁殖培养基、富集培养基、贮存培养基、选择性培养基和鉴别培养基等。在植物病理学研究中，最常用培养基有马铃薯葡萄糖培养基，主要用于分离培养病原真菌。
在培养基配制完之后，必须经过灭菌，以便彻底杀死其中原有的一切微生物。
3、材料、试剂与仪器 材料 马铃薯。
试剂 葡萄糖、琼脂等。
仪器与用品 高压蒸汽灭菌锅、pH试纸(或酸度计)、试管、铝锅、搅拌棒、三角瓶、烧杯、漏斗、量筒、纱布、棉花、天平等。
4、操作步骤
PDA培养基(马铃薯葡萄糖培养基)马铃薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20g、蒸馏水1000 ml，自然pH。
在PDA培养基配方中也可用蔗糖代替葡萄糖，这样配制的培养基也称为PSA培养基。(1)称量 称量去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g。提示：琼脂加入的量取决于琼脂的质量，质量好的15 g就够了，质量差的应适当增加。另外，在夏天气温较高时，适当增加用量。
(2)将马铃薯切成小块，放入锅中，加水1000 ml，煮沸30 min。用纱布滤去马铃薯残渣。
(3)将马铃薯滤液放回锅中，加入琼脂，加热熔化。
提示：在琼脂熔化的过程中，需要用玻璃棒不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
(4)加入葡萄糖 葡萄糖溶解后，加入适量的水以补充加热过程中损失的水分，定容至1000 ml。
提示：通常在制作培养基的锅内用红蓝铅笔标记出不同体积的刻度，如1 000 ml、2000 ml等，在定容时直接将水加至已标记的刻度即可。
(5)分装 根据不同的实验目的，可将配制的培养基分装于试管内或三角瓶内。分装试管，其量为管高的1／5，灭菌后制成斜面。分装三角瓶的容量以不超过三角瓶容积之一半为宜。
(6)加塞 在管口或瓶口塞上棉塞。棉塞要用未脱脂的经弹松的棉花，棉塞可过滤空气，防止杂菌侵入并可减缓培养基水分的蒸发，故在植物病理学研究工作中普遍使用。
正确的棉塞是形状、划、、松紧与管口或瓶口完全适合，过紧时妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的，且棉塞过小往往容易掉进试管内。正确的棉塞头较大，约有1／3在外，2／3在试管内。分装过程中注意不要使培养基沾染在管(瓶)口上以免浸湿棉塞，引起污染。
(7)包扎 加塞后，将试管用线绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳扎好。用记号笔注明培养基名称、配制日期、组别、制作人等。
(8)灭菌 将上述培养基以0.1MPa，121℃，高压蒸气灭菌20 min。
(9)搁臵斜面 将灭菌的试管培养基竖臵冷至50℃左右(以防斜面上冷凝水太多)，将试管口端搁在玻棒或其他合适高度的器具上，搁臵的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜。
培养基经灭菌后，必须放在37℃温箱培养24h，无菌生长者方可使用。
PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用l mol／L NaOH或l mol／L HCl溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。
三、病原菌的分离培养和纯化
1、目的要求
(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。
(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。
(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。
2、基本方法
植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。
为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。
3、材料、仪器与用具 3.1 材料
(1)稻瘟病（叶、病节、病穗颈）(Pyricularia oryzae)。(2)柑桔炭疽病（Colletotrichum gloeosporioides）。(3)黄瓜灰霉病（Botrytis cineria）。(4)番茄灰霉病（果）(Botrytis cinerea)。
(5)黄瓜菌核病（果）(Sclerotinia sclerotiorum)。(6)黄瓜细菌性角斑病（叶）(Pseudomonas syringae pv．1achryrnans)。
(7)水稻白叶枯病（叶）(Xanthomonas campestris pv．oryzae)。(8)白菜软腐病（叶）(Erwinia carotovora subspp．carotovora)。
3.2．培养基 PDA培养基；肉膏蛋白脉培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。
3.3．仪器与用品 超净工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70％酒精、0.1％升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、不锈钢锅等。
4、实验操作
(一)病原真菌的分离
1．组织分离法 其步骤为：
(1)取灭菌培养皿一个，臵于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：无菌操作应注意下面几点：工作前将所需的物品都放在超净工作台内；操作前用肥皂洗手，操作时还需用70 ％酒精擦拭双手；无菌操作时，呼吸要轻，不要说话。
（2）用无菌操作法向培养皿中加入25％乳酸1～2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60℃左右的PDA培养基倒人培养皿中，每皿倒10～15 ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。
提示：加入25％乳酸1～2滴，可减少平板上出现污染细菌菌落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20μg／m1)可以抑制G+ 细菌生长；加多黏霉素B(5.0μg／ml。)可以抑制G-细菌生长；加链霉素(40μg／ml)或氯霉素(50μg／m1)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45℃左右(以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处，)切取小块(每边长3～4 mm)病组织数块。
提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健组织的部分分离。
（4）将病组织放入70％酒精中浸3～5s后，按无菌操作法将病组织移入0.1％升汞液中分别表面消毒0．5、1、2、3、5 min(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。
提示：先用70％的酒精浸2～3 s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70％的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至l min)升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3～5 min。
(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4～6块。
提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。
(6)将培养皿倒臵放入25℃左右恒温箱内培养。一般3～4 d后观察待分离菌生长结果。
(7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25 ℃左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长即得该分离病菌纯菌种，便可臵于冰箱中保存。
提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的菌落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。
在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移入平板培养基上，完成分离工作。
2.稀释分离法
(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。
(2)用灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0.5～1.0 ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。
(4)将熔化并冷却到45～50℃的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1～2滴25％乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。
提示： 倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，不利于分离。
(5)将培养皿翻转后臵恒温箱(25℃)中培养，数日后观察菌落生长情况。
(6)挑菌 将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，臵25℃左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。
(二)病原细菌的分离
病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。
除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒入培养皿中，凝成平板后，翻转放在30℃恒温箱中2～4 h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用0.1％升汞表面消毒0.5～2 min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡20～60 min，让细菌释放到灭菌水中。
(3)用灭菌的接种铒，(接种环)；蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼，冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。
提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。
(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后，翻转培养皿，放在26～28℃恒温箱中培养。1～3 d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。
(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。
(三)真菌、细菌培养性状
1．真菌培养性状观察 取已分离，纯化的某种真菌菌种；按前述稀释分离法中(1)～(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
2．细菌培养性状观察
(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在牛肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过2～3 d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。也要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。
第四篇：土壤微生物的分离培养技术实验报告
重庆大学研究生专业实验教学
实验报告书
实验课程名称： 实验指导教师： 学
院： 专业及类别： 学
号： 姓
名： 实验日期： 成绩：
重庆大学研究生院制
一、实验目的
1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法；
2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；；
3、学习习近平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能；
4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。
二、实验原理
1、培养基的种类
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。
已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。
培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。
2、接种方法与无菌接种
将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。
划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。研究霉菌形态时就常用此法。
穿刺接种是用针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。该法常用于厌氧菌种的保藏或微生物的动力研究。
混浇接种是先将待接的微生物放入培养皿中再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就被稀释了。待平板凝固后，置于适宜温度下培养，就可以长出单个菌落的微生物。
涂布接种是将菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出单个菌落的微生物。
本实验采用的是划线接种。为了防止接种时引入其它微生物，整个操作过程均需在无菌操作台上进行，还需对操作员的双手进行酒精消毒，每次划线前都需灼烧接种环，接种时才打开培养皿且不能全部打开，接种完马上关上。
三、实验器材
1、仪器
培养皿、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、15ml离心管、试管架、镊子、电磁炉、锅、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、酒精灯、天平、滤纸等。
2、材料
土豆、琼脂、蒸馏水、酒精、土壤样品
四、实验步骤
1、土壤稀释液的配制
① 在菜地用九点取样法取适量土壤样品，具体操作为：在菜地选取九个取样点，在每个取样点取相同量的表层土壤（10cm左右），然后将其混合均匀；
② 称取1g土壤样品与99ml蒸馏水，将其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸馏水于15ml离心管中，再用移液枪取1ml前一步已配制的土壤溶液于离心管中，摇匀，即为10-3的土壤溶液；
④ 重复前一步，将土壤溶液稀释为10-
4、10-
5、10-
6、10-
7、10-8一系列稀释液。
2、土豆培养基的制备
① 用天平称取200g土豆，清洗干净后去皮切丁；
② 用量筒量取1000ml蒸馏水与电磁炉锅中，再加入已准备好的土豆，将其煮烂；
③ 从锅中取出已煮烂的土豆，用纱布过滤，滤液待用； ④ 称取20g琼脂与滤液中，再用蒸馏水定容至1000ml；
⑤ 在制备好的滤液中加入0.1ml菌液，然后放入高温灭菌锅中，在121℃下灭菌20min；
⑥ 取出已灭菌的土豆培养基，待其熔化后冷却至60℃，倒入每付平板约15-20ml，待其凝固后便可使用。
3、微生物的接种与分离
① 将接种需要的所有器材均放置于无菌操作台上；
② 用浸泡在酒精里棉花给双手灭菌，点燃酒精灯，右手拿接种环，左手拿培养基；
③ 将接种环放在火焰上烧灼，待其冷却后在10-6土壤稀释液中蘸取少量液体，打开培养基的一部分，采用划线接种，使之形成单菌落，一共划线3-4次，每划线一次就需在火焰上烧灼一次；
④ 重复上步，接种10-
7、10-8的土壤稀释液的微生物；
⑤ 接种完的培养基放在恒温培养箱中倒置培养48h，取出观察。
五、结果与思考
1、实验结果
图1 实验结果如图1所示。由图1可知，采用划线接种土壤微生物的培养皿里有单菌落出现，这说明划线接种能达到分离培养的目的。
学习过微生物这门课程的同学都知道，真菌的菌落较大且疏松，菌丝细长，呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑，孢子会呈现红色、褐色、绿色、黑色、黄色等不同的颜色；细菌的菌落较小，形状表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多为白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有细菌。
2、思考题
⑴在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？
答：这么做的主要目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，以使下次划线的菌种直接来自于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少，从而达到分离菌株的目的。
⑵为什么要把培养皿倒置培养？
答：①操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌，倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上；
②培养过程中，细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物，释放热量及有水排出，如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中，影响菌落的生长;③如果培养目标是收集细菌代谢物，而且代谢物易溶于水，倒着培养可能会方便收集。
六、实验总结 我本科所学专业是材料科学与工程，本次实验是我高中后第一次接触微生物方面的知识。在本次实验课里，段老师先给我们详细讲解了微生物分离培养方面的许多理论知识，然后才进入了理论环节。在实验操作过程中段老师一直在我们旁边观察我们的实验操作过程，一旦出现错误，会立即指出并耐心的给我们讲解应该怎么做，我担心自己从来没做过微生物培养方面的实验会做不好，段老师还一直在旁边鼓励我，并给我讲解了许多微生物分离培养方面的知识，最后我独立完成了本次实验。此次实验课，我真的是受益匪浅，学到了许多微生物分离培养方面的知识，十分感谢段老师。
图2 如图2所示，本次微生物分离培养实验中，有些培养皿里菌落很少，只有一个，有的甚至没有。我认为出现这种情况原因可能是：划线接种时，未等接种环冷却就开始接种，微生物可能被高温杀死；在接种时，酒精灯火焰太大，进行接种操作的全过程又离酒精灯火焰很近，这也可能将微生物杀死。
第五篇：魔芋论文：岚皋县魔芋软腐病和白绢病病原菌的分离鉴定和生物防控初探
魔芋论文：岚皋县魔芋软腐病和白绢病病原菌的分离鉴定和生物防控初探
【中文摘要】本文主要是对陕西省安康市岚皋县蔺河乡光明村和立新村等不同自然村魔芋软腐病与白绢病病原微生物的分离纯化,致病性测试,生物学特性的研究,运用生理生化和分子生物学方法鉴定其病原微生物。通过室内特定条件对病原菌在不同温度、不同酸碱度、不同抗生素与不同药剂等条件下的生长状况及生物学特性表现的差异性进行试验,提出防控措施。对岚皋县分离得到的魔芋软腐病病原菌的形态特征,生物学特性,致病性等进行了初步研究,结果表明导致魔芋致病的病原菌最适生长温度25-30℃,40℃以上均不能生长;它可利用葡萄糖和乳糖,不能利用麦芽糖、蔗糖和淀粉。通过致病性试验发现此病菌主要以土壤传播和伤口感染为主。通过16S rDNA序列分析,初步确定该致病菌为Pectobacterium sp.,在系统发育地位上与胡萝卜软腐果胶菌胡萝卜(Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.)关系最近,相似性为98.64%。通过对种芋的处理以及温度,酸碱度等室内条件下试验,发现在种芋的处理上,对种芋处理的时间要把握好,最多不超过1小时。软腐病原菌最适宜生长的酸碱度范围为pH 5.0～8.0之间,其它范围较不适宜,尤其以强酸区表现更为明显。魔芋软腐病原菌最适生长的温度范围为25℃～30℃之间,不适生长的温度范围为6℃以下和38℃以上区间,其中停止生长的上、下限温度各为40℃和5℃。从安康市岚皋县魔芋中分离得到白
绢病病原菌,观察其形态特征和生物学特性,考察其致病性特点,并测定其ITS序列。白绢病菌丝最适生长温度为25-35℃,pH为6-9,可利用乳糖,半乳糖,葡萄糖,甘露醇,麦芽糖等为唯一碳源;利用甲硫氨酸、尿素、硝酸钾、硫酸铵和蛋白胨为唯一氮源;由ITS序列鉴定分离自岚皋县魔芋白绢病的病原菌为半知菌亚门,丝孢纲,无孢目,小核菌属的齐整小核菌(Sclerotium rolfsii Sacc.)。通过ITS鉴定技术,准确鉴定出引起魔芋白绢病的致病菌种类,并研究了该致病菌的生物学特性,为实际种植防治该病提供了理论依据。生物防控方法研究中,主要选用了10种抗生素做药敏实验,氨苄青霉素的效果最好,其次是青霉素,氯霉素,井冈霉素。在拮抗菌的筛选中,其中J-1的拮抗效果最明显,拮抗机理需要再深入研究,为魔芋软腐病害的生物防治提供理论。
【英文摘要】This paper is mainly for soft rot and southern blight of konjac purification of pathogens, pathogenicity tests, biological characteristics, the use of biochemical and physiological identified by molecular methods of pathogenic microorganisms in different villages such as Guangming and LixinVillage, Langao County, Ankang City, Shaanxi Province.Specific conditions of the laboratory pathogens at different temperatures, different pH, different agents such as antibiotics, and under different growth conditions and differences in biological characteristics to test the
performance of proposed control measures.The pathogenicity, morphological character and biological character of soft rot-causing bacteria, which isolated from Amorphalluskon jac growing in Langao county, Shaanxi province, were determined firstly.The results showed that the optimum temperature for these isolates were 25-30℃, but can’t grow beyond 40℃.They can utilize glucose and lactose, but not maltose or starch or maltose.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.16S rDNA sequence analysis of strains showed that they belonged to Pectobacterium sp.and were very closely related to Pectobacterium carotovora sub sp.carotovora, p.c.c.with 98.64% sequence identity.From line treatment, by species and temperature, pH and other tests under laboratory conditions, found in the handling of species of taro, taro on the kinds of processing time to grasp, no more than 1 hour.The best optimum growth of soft rot bacteria’s pH range between pH5.0 ~ 8.0, other than the appropriate range of areas, particularly in the strong acid is more obvious.This bacteria of the original optimum growth temperature range between 25℃-30℃, the temperature range of above 38℃and below 6℃is not suitable, when the temperature below 5℃or above 40℃, the bacteria
stopped growing.The southern blight-causing bacteria were isolated from Amorphalluskon jac collected in Langao county.The becteria were identified by an almost complete ITS gene sequence analysis together with the morphological and biological properties..The results showed that the optimum temperature and pH for these isolates were 25 to 35℃and pH 4-7, respectively.They can utilize glucose, lactose, maltose, galactose and mannitol as solely carbon resource, and use methionine, unrea, potassium nitrate, ammonium sulfate and peptone as solely nitrogen.The test of pathogenicity to Konjac reavealed that the pathway to widely spread was by soil and infection was through cutting of plants.The analysis of ITS sequences of strains showed that they belonged to Sclerotium rolfsii Sacc., Agonomycetales, Hyphomycetes and Deuteromycotina.The pathogenic bacteria that cause sclerotium rolfsii disease have been determind by the ITS sequence analysis method.The results of this experiment will provide a theoretical basis for disease prevention.Prevention and control methods in biological research, mainly used to do 10 kinds of antibiotics susceptibility test, ampicillin was the best, followed by penicillin, chloramphenicol and Jinggangmycin.Screening of antagonistic bacteria in which the
antagonistic effect of J-1 the most significant antagonistic mechanism requires further in-depth research, to provide biological control of konjac soft rot damage theory.【关键词】魔芋 软腐病 白绢病 分离鉴定 生物防控
【英文关键词】Konjac Soft rot Southern Blight Isolation and Identification Biological control 【目录】岚皋县魔芋软腐病和白绢病病原菌的分离鉴定和生物防控初探摘要5-6
ABSTRACT6-7
10-11
第一章 文献综述1.2 魔芋研究进展12-15
1.3.1 魔芋软腐10-2011-121.1 引言1.3 魔芋病害研究进展
12-14病研究进展14-15
1.3.2 魔芋白绢病的研究进展
1.4 软腐病1.3.3 魔芋其他病害的研究进展
15-1816-17和白绢病综合防控措施的研究进展施措施15-1617-181.4.2 生物防控措施1.5 研究内容
1.4.1 农业防控措1.4.3 药剂防控
1.6 立题依据及研究意义18-20究20-32第二章 魔芋软腐病病原菌的分离鉴定与生物学特性研2.1 采样地概况2.2.1 主要试剂2.3 方法
2.2 材料20-2120-2121-22
2.2.2 主要培养基2.3.1 样品采集22
2.3.3 目的菌的形态
21-252.3.2 目的菌分离纯化
22-23观察与生物学特性的研究23
2.3.4 目的菌的致病性研究
23-25
2.4 结2.3.5 病原菌的16S rDNA 序列研究
果与分析25-2626-2825-302.4.1 分离株与致病性检测结果2.4.2 病原菌形态观察结果与生物学特性2.4.3 分子鉴定
28-30
2.5 讨论
30-32第三章 魔芋白绢病病原菌的分离鉴定与生物学特性研究32-4132-34测定343.1 材料与方法3.1.2 病原菌的分离与纯化
32-3634
3.1.1 采样3.1.3 致病性的3.1.4 病原菌丝体的形态观察及生物学特性测定3.1.5 病原菌的ITS 序列分析36-39
35-36
3.2 结果34-35与分析3636-39
3.2.1 病原菌分离与纯化与致病性3.2.2 病原菌形态观察与部分生物学特性3.3 讨论
3.4 结论
41-464143-4543-44参考文献致谢
39-41
第四章 魔芋软腐病生物防控研究初探41-4341-434344-4550-51544.1.1 试验材料4.2 结果与分析4.2.2 拮抗菌的抑菌率4.3 小结附录
45-46
4.1 材料与方法4.1.2 试验方法
4.2.1 分离菌4.2.3 药敏性实验46-50
缩略词作者简介
51-5353-54
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