实验四：细菌的接种、培养和分离技术（5篇）

第一篇：实验四：细菌的接种、培养和分离技术

实验四：细菌的接种、培养和分离技术

一、实验目的与要求：

（1）掌握从环境（土壤、水体、活性污泥等）中分离培养细菌的方法，从而获得若干种细菌纯培养技能

（2）掌握细菌纯种分离的方法：稀释平板分离法和平板划线法。

（3）掌握几种接种技术：斜面接种技术、穿刺接种、稀释平板涂布法等。

二、实验原理

在土壤、水、空气或人及动、植物体中，不同种类的微生物绝大多数都是混杂生活在一起，当我们希望获得某一种微生物时，就必须从混杂的微生物类群中分离它，以得到只含有这一种微生物的纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

为了获得某种微生物的纯培养。一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。

三、实验器材

1、牛肉膏蛋白胨培养基

2、盛9ml无菌水的试管，盛90m1无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，1ml和5ml无菌 吸管，无菌培养皿；

3、接种环，土样，酒精灯等。

四、操作步骤

1、倒平板 将加热融化的牛肉膏蛋白胨培养基倒平板，并标明培养基的名称。

2、贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。

3、点燃酒精灯。

4、接种

取接种环 右手拿接种环(如握钢笔一样)、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。

环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触边壁，使其冷却。

取菌种 待环冷却后轻轻沾取经稀释10倍的土壤悬液-环，然后将接种环移出菌种管，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。

接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。常用的划线方法有下列二种：

⑴用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约70°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线(图A)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。

⑵将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线(图B)。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。

环灭菌 将接种环烧红灭菌。

5、挑菌 将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置25℃和28℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

四、注意事项

1、实验操作过程中无菌操作。

第二篇：细菌分离鉴定

细菌分离鉴定

目的要求：

熟悉临床标本中常见的病原性细菌的分离鉴定方法，细菌分离鉴定。

实验内容：

一、脓汁、咽拭子等标本中病原性细菌的分离与鉴定

(一)标本采集

1.脓拭子：用无菌棉签蘸取患处深部脓液或分泌物少许，置入无菌空试管内，送检。

2.痰拭子：用消毒容器收集病人痰液，用无菌棉签挑取脓稠痰块，置入无菌空试管内，送检。

3.咽拭子：嘱病人把口张大，用压舌板压住舌根，用无菌棉签迅速蘸取咽部分泌物，置入无菌空试管内，送检。

4.血标本：疑为败血症患者，在严格无菌操作下，静脉采血，床旁直接加入含50ml的肉汤瓶内，立即摇匀后送培养。

5.脑脊液：对疑似流脑患者，作腰椎穿刺取脑脊液，立即行直接床旁接种(送检过程中应注意保温)。

6.尿道、阴-道分泌物：对可疑淋病患者，男性可从尿道取材，取材时导尿管应进入尿道1cm～2cm，如为刚排尿，应等待1h左右;女性则可以从宫颈口取分泌物，当内窥器插入宫颈口后应稍等片刻，再旋转取出，取材应立即送检，不可放置冰箱。

(二)分离鉴定程序

待检标本可直接做涂片染色检查鉴定，必要时可做分离培养、生化反应及致病性鉴定。常见的致病性球菌检查程序如下。

直接涂片、革兰染色、镜检(形态、排列、染色性)

脓、痰、咽拭子

分泌物、脑脊液 观察菌落性状、溶血性、色素

血琼脂平板→ 涂片、染色、镜检

↑ 挑取可疑菌落 生化反应

血液、穿刺液 →肉汤培养基 纯分离 致病性测定

↓ 药敏试验

如培养液混浊时可涂片、染色、镜检

(三)常见临床标本的检查方法

1．脓拭子

在脓汁中除了球菌外，也有杆菌存在，例如革兰阳性的有炭疽杆菌、白喉杆菌、结核杆菌、枯草杆菌等，革兰阴性的有大肠杆菌、绿脓杆菌、变形杆菌等，此外尚可有真菌、放线菌、螺旋体等。

材料

(1)标本：脓拭子

(2)培养基：血琼脂平板

(3)兔血浆、白色滤纸片、无菌生理盐水、载玻片

方法 脓汁 → 革兰染色 → 镜检

↓ ↑

血琼脂平板 →观察菌落形态及溶血情况

↓

致病力试验

(1)将脓拭子作革兰染色，镜检(先作培养再涂片以免污染)，鉴定材料《细菌分离鉴定》。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。

(2)将脓汁涂布于血琼脂平板上，再以灭菌接种环作划线分离。置培养37℃培养18h～24h。

(3)经培养后据菌落特点及涂片检查结果进行初步识别，根据需要再作进一步鉴定。若菌落较大、溶血透明、产生金黄色色素、涂片为革兰阳性球菌并成堆排列时可能系葡萄球菌，应确定其为何种葡萄球菌;必要时再作血浆凝固酶试验及甘露醇发酵试验，确定其致病力。

2.咽拭子

咽喉中存在的细菌较多，可以有厌氧及需氧性链球菌、葡萄球菌、肺炎球菌、四联球菌、脑膜炎球菌、卡他球菌、喉杆菌、结核杆菌枯草杆菌、百日咳杆菌肺炎杆菌及绿脓杆菌等。此外也可有白色念珠菌奋森螺旋体等。本实验以咽拭子作为标本，重点检查病原性球菌。

材料

(1)标本:咽拭子。

(2)培养基:血琼脂平板。

方法

咽拭子

↓

血琼脂平板

↓

观察菌落形态及溶血性

↓

革兰染色，镜检

取标本涂布于血琼脂平板，再以灭菌接种环划线分离，置37℃培养18h～24h培养。标本放置4℃冰箱保存，待报告发出后再丢弃。

可根据下述特点进行鉴别：

(1)在菌落周围产生2mm～4mm宽、界线分明、完全透明的溶血环、涂片为革兰阳性球菌并呈链状排列，可能是乙型溶血性链球菌。

(2)菌落细孝半透明、有草绿色溶血环、涂片为革兰阳性球菌呈链状排列，可能为甲型溶血性链球菌。需要进一步与肺炎球菌区别时，可做胆汁溶菌试验及菊糖发酵反应。

菌落细小半透明、不溶血、涂片为革兰阳性链状排列的球菌时，为丙型链球菌。

(4)菌落扁平边缘隆起、中央稍凹、半透明、呈草绿色溶血、革兰染色为阳性双球菌、呈矛头状排列时为肺炎球菌，应以胆汁溶菌及菊糖发酵反应与甲型溶血性链球菌区分。

(5)菌落中等大孝表面光滑、呈灰色、革兰染色为阴性双球菌，呈肾形排列时，可能为脑膜炎球菌，需要进一步作氧化酶试验及糖发酵试验(接种于含血清之葡、麦、蔗糖发酵管中)。

二、粪便标本中肠道杆菌的分离与鉴定

(一)标本收集

取患者的粪便或肛-门拭子。

(二)鉴定程序

肠道杆菌为一大群革兰阴性杆菌，从形态及染色性上无法鉴别为何种菌，只能依靠生化反应和血清学反应进行鉴定。

患者粪便(粘液、脓血)→肠道选择、鉴别培养基(如ss、中国蓝、伊红美兰)

↓

挑取可疑菌落(据大孝颜色、透明度而定)

↓

双糖铁及其他鉴别培养基

↓

据结果分析鉴定

↓

玻片凝集(做出特异性诊断)

葡萄糖乳糖动力H2S尿素

⊕⊕±--艾希菌属非致病菌

⊕+---克雷伯菌属

⊕±+++变形杆菌

⊕-++-乙型副伤寒致病菌

⊕-+±-甲型副伤寒

+-++-伤寒杆菌

+----痢疾杆菌

第三篇：污水处理细菌培养规程(无接种污泥1)

污水处理好氧细菌培养规程

（无接种污泥）

一、培养前的准备工作

1、各构筑物建成，并经清池清除建筑垃圾，静压试验证明无渗漏，无下沉位移，最后按有关规程验收合格。

2、电器、机械、管路等全部设备建成并经单机试车、联动试车正常。最后按有关规程验收合格。

3、根据日后运行管理需要，有条件的污水处理厂（站）需进行最基本的常规化验测试，如pH、水温、COD、DO、生物相等，用以指导活性污泥的培养过程和日常运行。

4、基础数据的调查摸底，包括污水流量昼夜变化情况，水质（pH、水温、COD、BOD5/CODCr、含氮、含磷、有毒物质等）及其变化情况，各种设施和设备的技术参数。

5、根据处理水质状况备足必需的营养物(碳源：大粪及淀粉、氮源：尿素、磷源：普钙Ca（H2PO4)2)，以备缺什么补什么。

6、操作人员应熟悉整个系统的管道布置和公用工程方面的情况，了解污泥培养的基本过程和控制要求。

7、人员到位，自培养和驯化后一般应使系统连续运行，不能脱人。

8、编制必要的化验和运转的原始记录报表以及初步的建章立制。从培菌伊始，逐步建立较规范的组织和管理模式，确保启动与正式运行的有序进行。

二、培菌

1.向好氧池注入清水（同时引入生活污水）至一定水位，并注意水温 2.按风机操作规程启动风机，鼓风。

3.向好氧池投加经过滤的浓粪便水（当粪便水不充足时，可用化粪池和排水沟内的污泥补充。），使得污泥浓度不小于1000mg/L，BOD达到一定数值。

4.有条件时可投加活性污泥的菌种，加快培养速度。

5.按照活性污泥培养运行工艺对反应池进行曝气、搅拌、沉降、排水。水气体积控制在1：（5~10）。曝气时间采取6h充氧，4h停机的方式进行，排水参见7。

6.通过镜检及测定沉降比、污泥浓度，注意观察活性污泥的增长情况。并注意观察在线PH值、DO的数值变化，及时对工艺进行调整。

7.测定初期水质及排水阶段上清液的水质，根据进出水NH3-N、BOD、COD、NO3-、NO2-等浓度数值的变化，判断出活性污泥的活性及优势菌种的情况，并由此调节进水量、置换量、粪水、碳源、氮源、磷源的投加量及周期内时间分布情况

8.注意观察活性污泥增长情况，当通过镜检观察到菌胶团大量密实出现，并能观察到原生动物（如钟虫），且数量由少迅速增多时，说明污泥培养成熟，可以进生产废水，进行驯化。

三、活性污泥的驯化（调试）步骤

1.通过分析确认来水各项指标在允许范围内，准备进水。

2.开始进入少量生产废水，进入量不超过驯化前处理能力的20％。同时补充新鲜水、粪便水及氮源。

3.达到较好处理后，可增加生产废水投加量，每次增加不超过10～20％，同时减少氮源投加量。且待微生物适应巩固后再继续增生产废水，直至完全停加氮源。同步监测出水CODcr浓度等指标,并观察混合液污泥性状。在污泥驯化期还要适时排放代谢产物,即泥水分离后上清液。

4.继续增加生产废水投加量，直至满负荷。满负荷运行阶段,由于池中已培养和保持了高浓度、高活性的足够数量的活性污泥,池中曝气后混合液的MLSS达到5000mg/1,此过程同步监测溶解氧,控制曝气机的运行,并进行污泥的生物相镜检。

四、调试期间的监测和控制

在调试及运行过程有许多影响处理效果的因素,主要有进水CODcr浓度、pH值、温度、溶解氧等,所以对整个系统通过感官判断和化学分析方法进行监测是必不可少的。根据监测分析的结果对影响因素进行调整，使处理达到最佳效果。

1、温度 温度是影响整个工艺处理的主要环境因素,各种微生物都在特定范围的温度内生长。生化处理的温度范围在10～40℃,最佳温度在20～30℃。任何微生物只能在一定温度范围内生存，在适宜的温度范围内可大量生长繁殖。在污泥培养时，要将它们置于最适宜温度条件下，使微生物以最快的生长速率生长，过低或过高的温度会使代谢速率缓慢、生长速率也缓慢，过高的温度对微生物有致死作用。

2、pH值

微生物的生命活动、物质代谢与pH值密切相关。大多数细菌、原生动物的最适pH值为6.5～7.5，在此环境中生长繁殖最好，它们对pH值的适应范围在4～10。而活性污泥法处理废水的曝气系统中，作为活性污泥的主体，菌胶团细菌在7～8.5的pH值条件下可产生较多粘性物质，形成良好的絮状物。

3、营养物质

废水中的微生物要不断地摄取营养物质，经过分解代谢(异化作用)使复杂的高分子物质或高能化合物降解为简单的低分子物质或低能化合物，并释放出能量；通过合成代谢(同化作用)利用分解代谢所提供的能量和物质，转化成自身的细胞物质；同时将产生的代谢废物排泄到体外。

水、碳源、氮源、无机盐及生长因素为微生物生长的条件。废水中应按BOD5∶N∶P=100∶4∶1的比例补充氮源、含磷无机盐，为活性污泥的培养创造良好的营养条件。

4、悬浮物质SS 污水中含有大量的悬浮物,通过预处理悬浮物已大部分去除,但也有部分不能降解,曝气时会形成浮渣层,但不影响系统对污水的处理。

5、溶解氧量DO 好养的生化细菌属于好氧性的。氧对好氧微生物有两个作用：①在呼吸作用中氧作为最终电子受体；②在醇类和不饱和脂肪酸的生物合成中需要氧。且只有溶于水的氧(称溶解氧)微生物才能利用。

在活性污泥的培养中，DO的供给量要根据活性污泥的结构状况、浓度及废水的浓度综合考虑。具体说来，也就是通过观察显微镜下活性污泥的结构即成熟程度，测量曝气池混合液的浓度、监测曝气池上清液中CODCr的变化来确定。根据经验，在培养初期DO控制在1～2mg/l，这是因为菌胶团此时尚未形成絮状结构，氧供应过多，使微生物代谢活动增强，营养供应不上而使污泥自身产生氧化，促使污泥老化。在污泥培养成熟期，要将DO提高到3～4mg/l左右，这样可使污泥絮体内部微生物也能得到充足的DO，具有良好的沉降性能。在整个培养过程中要根据污泥培养情况逐步提高DO。

特别注意DO不能过低，DO不足，好氧微生物得不到足够的氧，正常的生长规律将受到影响，新陈代谢能力降低，而同时对DO要求较低的微生物将应运而生，这样正常的生化细菌培养过程将被破坏。

6、混合液MLSS浓度

微生物是生物污泥中有活性的部分,也是有机物代谢的主体,在生物处理工艺中起主要作用,而混合液污泥MLSS的数值即大概能表示活性部分的多少。对高浓度有机污水的生物处理一般均需保持较高的污泥浓度,本工程调试运行期间MLSS范围在:4.4～5.6g/l之间,最佳值为4.8g/l左右。

7、进水CODcr浓度，进水中有机物浓度对处理影响很大。

8、污泥的生物相镜检

活性污泥处于不同的生长阶段,各类微生物也呈现出不同的比例。细菌承担着分解有机物的基本和基础的代谢作用,而原生动物〈也包括后生动物〉则吞食游离细菌。污水调试运行期间出现的微生物种类繁多,有细菌、绿藻等藻类、原生动物和后生动物,原生动物有太阳虫、盖纤虫、累校虫等,后生动物出现了线虫。调试运行后期混合液中固着型纤毛虫,如累校虫的大量存在,说明处理系统有良好的出水水质。

9、污泥指数SVI,正常运行时污泥指数在800/mg左右。

第四篇：稠油四组分分离学生实验讲义

实验一

（二）柱层析法分离稠油中的四组份

实验目的：

1、了解复杂物质的柱层析分离分析方法；

2、掌握柱层析分离稠油四组分的操作；

3、复习过滤、旋转蒸发等操作步骤。实验意义：

稠油是一种成分复杂的非常规烃类资源，按照极性可分为饱和烃、芳香烃、胶质和沥青质四个组分。对稠油的研究首先要将其分成上述四个组分，再通过各种检测手段（IR、EL、GCMS、HNMR等）进行分析。

柱层析技术又称柱色谱技术，是根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，经多次反复分配平衡后，最终将组分分离的方法。

本实验通过稠油四组分柱层析方法分离，使学生掌握使用柱层析分离稠油四组分的实验方法和操作。实验仪器与试剂：

仪器：旋转蒸发仪、循环水式真空泵、索氏提取器、冷凝管、电热套、超声波清洗器、分析天平、25mL小烧杯、250mL平底烧瓶、滴管、玻璃棒、分离柱、洗耳球、长颈漏斗、11cm定性滤纸

试剂：中性三氧化二铝（100~200目）、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、甲醇（以上均为AR）、石英砂

实验步骤：

一、分离前准备

1、活化氧化铝

取中性氧化铝（100-200目）若干于瓷坩埚中，置于马弗炉，400-450℃煅烧6h；取出后放至干燥器中泠却至室温，加入1%（按氧化铝质量计）的蒸馏水，剧烈摇晃10min至混合均匀，干燥器中过夜备用。

2、溶解油样

取0.5g-0.6g油样于250mL平底烧瓶中，用80mL正己烷溶解，盖好盖子超声15min，静置十分钟。

3、准备四个250ml平底烧瓶贴上标签称重备用。

二、过滤与抽提

1、过滤油样

将滤纸折为菊花状，过滤之前准备好的油样。

2、抽提组分

将滤纸放入索氏抽提器，滤液中加入正己烷至液面高于电热套加热边缘；打开电热套至沸腾，抽提至抽提器中液体澄清为止，得到三组分溶液；取一烧瓶加入氯仿90ml，打开电热套至沸腾，抽提至抽提器中液体澄清为止，得到沥青质溶液。

三、柱层析分离三组分

1、填装柱子

层析柱中填充约20cm高活化好的氧化铝，敲打柱子5min至填充的氧化铝变实，铺上一层石英砂防止被冲开。

2、柱层析分离三组分

先倒入少量正己烷排出柱子中空气；至液面余约1cm时，缓慢倒入三组分溶液，并用少量正己烷将烧瓶中残留溶液洗净；少量多次倒入总量70mL正己烷，淋洗得饱和烃；接着少量多次倒入正己烷+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得芳香烃；最后少量多次倒入甲醇+二氯甲烷（30+30）混合液60mL，淋洗得胶质。

四、旋转蒸发，挥干称重

1、旋转蒸发

对分出的四组分溶液进行减压旋转蒸发，温度为40-45℃，蒸发至烧瓶中无液体为止。

2、称重

旋蒸后的重量减去烧瓶重量，计算出四组份的粗重及各组分所占百分比。数据处理：

某一组分% =（某一组分质量/四组份总质量）X 100% 问题思考：

1、稠油四组分的极性大小如何排列，依据是什么？

2、如柱子填充不实，对分离效果有何影响？

3、淋洗时为何每次加液要待液面余约1cm时？

4、实验过程中还有哪些操作会影响分离效果？

第五篇：土壤微生物的分离培养技术实验报告

重庆大学研究生专业实验教学

实验报告书

实验课程名称： 实验指导教师： 学

院： 专业及类别： 学

号： 姓

名： 实验日期： 成绩：

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；；

3、学习习近平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。

二、实验原理

1、培养基的种类

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。

已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。

培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。

2、接种方法与无菌接种

将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。

划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。研究霉菌形态时就常用此法。

穿刺接种是用针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。该法常用于厌氧菌种的保藏或微生物的动力研究。

混浇接种是先将待接的微生物放入培养皿中再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就被稀释了。待平板凝固后，置于适宜温度下培养，就可以长出单个菌落的微生物。

涂布接种是将菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出单个菌落的微生物。

本实验采用的是划线接种。为了防止接种时引入其它微生物，整个操作过程均需在无菌操作台上进行，还需对操作员的双手进行酒精消毒，每次划线前都需灼烧接种环，接种时才打开培养皿且不能全部打开，接种完马上关上。

三、实验器材

1、仪器

培养皿、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、15ml离心管、试管架、镊子、电磁炉、锅、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、酒精灯、天平、滤纸等。

2、材料

土豆、琼脂、蒸馏水、酒精、土壤样品

四、实验步骤

1、土壤稀释液的配制

① 在菜地用九点取样法取适量土壤样品，具体操作为：在菜地选取九个取样点，在每个取样点取相同量的表层土壤（10cm左右），然后将其混合均匀；

② 称取1g土壤样品与99ml蒸馏水，将其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸馏水于15ml离心管中，再用移液枪取1ml前一步已配制的土壤溶液于离心管中，摇匀，即为10-3的土壤溶液；

④ 重复前一步，将土壤溶液稀释为10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀释液。

2、土豆培养基的制备

① 用天平称取200g土豆，清洗干净后去皮切丁；

② 用量筒量取1000ml蒸馏水与电磁炉锅中，再加入已准备好的土豆，将其煮烂；

③ 从锅中取出已煮烂的土豆，用纱布过滤，滤液待用； ④ 称取20g琼脂与滤液中，再用蒸馏水定容至1000ml；

⑤ 在制备好的滤液中加入0.1ml菌液，然后放入高温灭菌锅中，在121℃下灭菌20min；

⑥ 取出已灭菌的土豆培养基，待其熔化后冷却至60℃，倒入每付平板约15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接种与分离

① 将接种需要的所有器材均放置于无菌操作台上；

② 用浸泡在酒精里棉花给双手灭菌，点燃酒精灯，右手拿接种环，左手拿培养基；

③ 将接种环放在火焰上烧灼，待其冷却后在10-6土壤稀释液中蘸取少量液体，打开培养基的一部分，采用划线接种，使之形成单菌落，一共划线3-4次，每划线一次就需在火焰上烧灼一次；

④ 重复上步，接种10-

7、10-8的土壤稀释液的微生物；

⑤ 接种完的培养基放在恒温培养箱中倒置培养48h，取出观察。

五、结果与思考

1、实验结果

图1 实验结果如图1所示。由图1可知，采用划线接种土壤微生物的培养皿里有单菌落出现，这说明划线接种能达到分离培养的目的。

学习过微生物这门课程的同学都知道，真菌的菌落较大且疏松，菌丝细长，呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑，孢子会呈现红色、褐色、绿色、黑色、黄色等不同的颜色；细菌的菌落较小，形状表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多为白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有细菌。

2、思考题

⑴在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？

答：这么做的主要目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，以使下次划线的菌种直接来自于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少，从而达到分离菌株的目的。

⑵为什么要把培养皿倒置培养？

答：①操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌，倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上；

②培养过程中，细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物，释放热量及有水排出，如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中，影响菌落的生长;③如果培养目标是收集细菌代谢物，而且代谢物易溶于水，倒着培养可能会方便收集。

六、实验总结 我本科所学专业是材料科学与工程，本次实验是我高中后第一次接触微生物方面的知识。在本次实验课里，段老师先给我们详细讲解了微生物分离培养方面的许多理论知识，然后才进入了理论环节。在实验操作过程中段老师一直在我们旁边观察我们的实验操作过程，一旦出现错误，会立即指出并耐心的给我们讲解应该怎么做，我担心自己从来没做过微生物培养方面的实验会做不好，段老师还一直在旁边鼓励我，并给我讲解了许多微生物分离培养方面的知识，最后我独立完成了本次实验。此次实验课，我真的是受益匪浅，学到了许多微生物分离培养方面的知识，十分感谢段老师。

图2 如图2所示，本次微生物分离培养实验中，有些培养皿里菌落很少，只有一个，有的甚至没有。我认为出现这种情况原因可能是：划线接种时，未等接种环冷却就开始接种，微生物可能被高温杀死；在接种时，酒精灯火焰太大，进行接种操作的全过程又离酒精灯火焰很近，这也可能将微生物杀死。