ELISA原理及步骤(附教学视频)

第一篇：ELISA原理及步骤(附教学视频)

ELISA的操作步骤

教学视频：http://v.youku.com/v_show/id_XMjI1MjUwNTk2.html

方法一：用于检测未知抗原的双抗体夹心法：

1.包被：用0.05M PH9，碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg／ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。

2.加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。

3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB(四甲基联苯胺)底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm（若以ABTS显色，则410nm）处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

方法二：用于检测未知抗体的间接法：

用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日洗涤3次。加一定稀释的待检样品（未知抗体）0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时，洗涤。（同时做空白、阴性及阳性孔对照）于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体（抗抗体）0.1ml，37℃孵育30～60分钟，洗涤，最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。

酶联免疫分析技术(ELISA)

一、酶联免疫分析的基本原理和方法类型

1971年瑞典学者Engva11, 荷兰学者Van Weerman等分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。其基本原理与RIA相同。先将已知的抗体或抗原结合在某种固相裁体上，并保持其免疫活性。测定时，将待检标本和酶标抗原或抗体按不同步骤与固相载体表面吸附的抗体或抗原发生反应。用洗涤的方法分离抗原抗体复合物和游离成分。然后加入酶的作用底物催化显色，进行定性或定量测定。

ELISA可用于测定抗体，也可用于检测抗原。根据检测目的和操作步骤不向，有以下三种类型的常用方法。

1.间接法

此法是测定抗体最常用的方法。将已知抗原吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。见下图：

操作步骤：

①用已知抗原包被固相载体； ②加待检标本，经过温育(37℃2h)，使相应抗体与固相抗原结合。洗涤，除去无关的物质；

③加酶标抗抗体．再次温育(37℃2h)与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体；

④加底物显色。终止反应后，目测定性．或用酶标仪测光密度值定量测定。

2． 双抗体夹心法

此法常用于测定抗原。将已知抗体吸附于固相载体．加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标抗体和底物进行测定。见下图：

操作步骤： ① 用已知特异性抗体包被固相载体； ② 加待检标本，经过温育使相应抗原与固相抗体结合；洗涤，除去无关的物质； ③ 加酶标特异性抗体，与已结合在固相抗体上的抗原反应；洗涤，除去未结合的酶标抗体； ④ 加底物显色。终止反应后，目测定性或用酶标仪测量光密度值进行定量测定。

此法适用于多价大分子抗原的检测，而不能用于测定半抗原等小分子物质。

3． 竟争法

此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。

以测定抗原为例．将持异性抗体吸附于固相载体；加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。见下图：

操作步骤：

① 用已知特异性抗体包被固相载体； ② 测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原，经过温育，使二者与固相抗体竞争结合；对照管只加一定量酶标抗原．与固相抗体直接结合。分别洗涤，除去未结合的成分； ③ 加底物显色。

对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物显色反应较弱。分别测定两管的光密度(OD)值，根据对照管与测定管OD值之比．计算标本中待测抗原含量。

二、ELlSA方法的技术要点

1． 固相载体和免疫吸附剂的制备

ELISA法最常用的固相载体是聚苯乙烯，其对蛋白质有较强的物理吸附性能，不影响抗体和抗原的免疫活性；且价格低廉，并可制成各种形状的制品。

与固相载体结合的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被(coating)，由于载体不同，包被的方法也不同。使用聚苯乙烯制品为载体一般多采用物理吸附法。除载体的理化性质外，受缓冲液的离子强度、pH值、包被时的温度和时间等多种因素的影响。

很多蛋白质、细菌脂多糖、脂蛋白、糖脂及变性的DNA等均易吸附在聚苯乙烯表面。用于包被的蛋白质浓度一般为1-10μg／m1，每个凹孔内加100—200μl。包被液的蛋白量过大，可能会造成蛋白质分子的多层化．在洗涤时一部分蛋白分子容易被洗掉。包被用抗原或抗体的最适工作浓度，最好是预先经过选择。

用抗原或抗体包被后。固相载体表面往往尚残留少量未饱和的吸附位点。其后加入的血清标本和酶结合物中的蛋白质也会部分地被非特异吸附，导致本底偏高。为此．常用1％—5％BSA，或含5％—20％小牛血清的pH9.6碳酸盐缓冲液注满凹孔，37℃作用1h，可以消除此种干扰。这一过程称为封闭(blocking)。2． 抗原和抗体

如同免疫荧光技术和放射免疫测定一样，用于制备酶标记物和包被固相载体的抗原要求纯度高，抗原性完整；抗体需特异、效价高、亲和力强，并具有较高的比活性。如将抗体IgG用木瓜蛋白酶水解为Fab片段，再与酶连接，可以减少非特异性吸附，检测效果更佳。McAb的应用，进一步提高ELISA法的特异性和灵敏度。使用针对抗原分子中不同决定簇的两种McAb分别作为固相抗体和酶标抗体用于双位点夹心法，测定时可以将待检标本和酶标抗体同时加入，简化了操作程序。通常采用特异性较高的McAb作为固相包被抗体，与酶标记的多克隆抗体相结合进行检测，结果更为满意。

3、常用的酶及其底物

在ELISA法中，用于标记抗体或抗原的酶与免疫酶组织化学技术基本上相同。但所用底物被酶裂解后，应能生成可溶性有色产物，适合用分光光度计(酶标仪)测量光密度值，籍以定量测定样品中待捡抗原或抗体的含量。常用酶及其底物见表下：

第二篇：视频传输类型及原理简介

视频传输类型及原理简介

视频传输

规定：视频设备的输入输出阻抗75Ω（相互配接和通用性）

种类：

1、基带同轴传输。

2、基带双绞线传输。

3、射频调制解调传输。

4、光缆调制解调传输。

5、视频数字（网络）传输。

6、微波传输。

7、无线天线视频监控系统。

一、基带同轴传输：｛0～6M，1Vp-p，75Ω｝

图：

同轴电缆是唯一可以不用附加传输设备也能有效传输视频信号方法。（绝对衰减最小）。突出矛盾就是频率失真，在传输通道视频失真度条件下，75-5可传输120m（200m以上可观察到失真）。

“频率加权放大技术”目前已成熟，仅用一个末端补偿设备，75-5→2000m；若前后补偿，可到3000m。

单端不平衡传输，一根为信号线；一根为零线，优点：传输阻抗，不受外界干扰和不对外产生干扰。缺点：分布参量值较大，损耗严重。线越长越严重。线缆衰减是指线缆传输信息期发生的能量降低或损耗，它遵循一种叫趋肤效应和近似效应的物理定理，随着频率的增加会增大，导体内部的电子流产生的磁场迫使电子向导体表面聚集，频率越高这个表层越薄，这一效应对电缆的衰减影响相当显著，且衰减与频率的平方根近似成正比。

可知要求75-5≤200m

75-7≤400m

75-9≤600m

75-13≤800m

如超过800m，不建议用同轴传输，由于分布参数更大，寄生干扰引入，图像质量下降。

二、双绞线传输：

图：

平衡传输方式：不平衡输入的视频经发送器A转换为平衡输出，传输回路的两根线分别是幅度相等相位相反的差分信号，在接收器B中将平衡信号再转换回不平衡信号，以便与现行设备配接。

由于双绞线上的两个信号大小相等，极性相反，且两线相绞（不断改变方向），这样线间的寄生电抗与其相邻电抗也极性相反大小相等。（两线完全平衡时）图：

C1、C2、„Cn是每对双绞线每一绕结的分布电容。

L1、L2、„Ln是每对双绞线每一绕结的感应电感。

电容C总= C1+C2+„+Cn+(-Cn+1)总感应电感L总LALB LALB

LA=L1+(-L3)+„+Ln

LB=-L2+L4+„+(-Ln+1)

当绕结基本平衡时：Cn= Cn+1，L总=0，C总=0

这表明从传输信号的角度分析两线间的寄生电容、寄生电感趋于零，但对外界干扰信号而言上述结果并不存在。（干扰信号在两根线上幅度极性都一样）

由于一般通信双绞线的特征阻抗都不是75Ω，为了同输入设备和输出设备匹配，收、发器，有的设备在收、发器设定了调节旋钮，以保证正确匹配。

由于双绞线的特征阻抗不稳定，视双绞线种类、长度和布线环境不用而变化，上述的阻抗变换调节只是一种常用典型双绞线时的大约阻抗，在实际工程中布线环境的千差万别，走线不可避免地拐弯打折，使其特征阻抗无法调整准确（施工中要注意）。

双绞线传输视频信号具有优势，但并非所有双绞线都可用于该系统，目前普遍采用5类超五类UTP，该类线8芯，除传输图像信号外，同时可传送音频信号，控制信号，供电电流和其他信号，布线方便，利用率高。

从线缆本身的传输特性看，双绞线是各类传输方式中，传输衰减和频率失真最大的一种线缆，400m双绞线同同轴电缆1000m相当。

所以，需要频率加权放大补偿能力。

由于分布电容原因，选择这种传输方式时不能使用屏蔽双绞线。

在室外使用注意防雷：因输入端对感应电压非常敏感，一旦电缆在某一段被雷电感应，运算放大时会被瞬间击穿。（速记室外不使用双绞线）

三、射频调制解调传输（“宽频共缆”“一线通”电控技术）

“宽频”是针对视频“0～6MHz”而言，充分利用5～550MHz可同时传输四十多、音频信号，并在系统中预留了报警，广播布线传输空间。

“共缆”指的是多系统，多信号可以通过“一根电缆”双向传输。

图：

原理：通过宽频调制器将图像信号调制到高频载波，使多路信号可在同轴电缆中上行传输，传输到控制室经过单路或多路视频解调，解调出标准视频信号。

对前端镜头、云台等控制信号通FSK数据调制器进行数据载波调制，调制到38MHz载波上通过同轴电缆下行传输，经过宽带调制器把控制信号解调为RS485控制模式输出给解码器，从而达到对云台的控制。

宽频共缆监控采用成熟稳定的，FDM（频分复用）和FSK（移频键控）技术。首先将同轴电缆的0～1000MHz划分为不同的传输通道（上行、下行、报警传输、隔离带），8MHz为一频道。然后将利用移频键控（指视频调幅调制、音频调频调制及FSK数据调制）技术,将不同的信号调制到不同的通道上，通过一根“电缆”上行、下行同时传输，使多系统、多信号共缆。

传输距离：（1～5km）适用（成本）

具有抗干扰能力强、传输距离远、布局易、价格低等。

四、光缆调制解调传输

光缆是一种频带最宽，传输衰减非常低，抗干扰性能非常高的优质传输介质。光端机传输技术也很成熟，单路、多路、单向、双向、音频、视频、控制、模拟、数字等。

图：

视频信号的传输路径：“C”VF进入发射机的（VTDEOIN）接口，经PFM调制，电光转换，变成光信号经适配器注入光纤，经光纤传输至光接收机，光电转换，PLL锁相解调，还原成VF信号进入

控制数据传输路径：从指挥中心发出的控制数字信号从光接收机数据入口（DATEIN）进入光端机，经PFM调制，电光转换，变成光信号经适配器注入光纤，经光→前端光端机，经光电转换，PLL锁相解调，恢复控制码，经数据接口输出到解码箱，控制

光端机传输视频，一般都用两次调制解调（模拟光端机：调幅—调光；数字光端机：数字调制—调光）

传输过程需配件：

1、光跳线：连接作用，光端机与光纤连接起来。有FC、ST、SC跳线（从光跳线的连接上看），有3m、5m、10m（从光跳线长度看）。

2、终端盒：（熔接盒）主要是保护光跳线和光纤之间熔接处，光纤熔接机将光纤和跳线熔接进终端盒。（前端复处一个，终端一个）。

3、法兰盘：一种连接器，通常光端机上有一个光纤接口，这就是法兰盘，也就是连接光跳线和光端机连接器（规格有：FC、ST、SC）

主要问题：铺设和后期维护难度大，成本较高，由于采用两次调制解调，其信噪比，特别对高频信噪比影响较大。采样位数不大，图像还原比较“硬”（高频细节丢失）。还要了解：信噪比、光功率、接收灵敏度、动态范围。

五、视频数字（网络）传输

数字传输从原理上彻底避免了模拟传输对信号失真度的苛刻要求以及信号干扰等。技术上也有足够高的传输分辨率和图像清晰度。

同模拟系统区别：有损传输，无论何种方式、还原后图像质量比模拟差。由于受网络传输带限制，目前主流的视频压缩方式为MPEG4或者H.264。我国AVS-S（AVS安防标准）也是未来的主要视频压缩方式。

数字视频图像分辨力一般在CIF—4CIF之间（352×288—704×576像素PAL）MPEG4压缩方式在4CIF、4Mbps、低压缩比时，水平方向分辨率可以对应到480TVL（704×0.7），H.264较MPEG4有近1～1.5 倍的效率，是压缩技术的发展方向。目前能够完全支持H.264算法的高运算性能DSP还没有出现。

原理：本地就近存储、用现有网络（校园网等）传输终端还原。

技术瓶颈：网络带宽限制。

谈一下比特与字节

存储的量度标准一般是字节（B），宽带的量度原理是bps（比特每秒）就CCTV而言：1个字节就是8比特，谈论网络时“比特率”，涉及存储能力时“字节”。

举例：如果一个摄像机一秒钟记录十张图像，每个图像15kB，那么在经过100兆比特每秒的以太网线路时，有多少个摄像机能够共享？另一终端上，记录

满一个200GB硬盘驱动需要多长时间？

六、微波传输系统

无线传输监控视频信号的几种方式：

1、300～1400MHz移动视频传输系统：该系统采用COFDM（车载移动系统）调制及MPEG2压缩技术，新闻采访、现场直播等。缺点一路图像。

2、1.2GHz以2.4GHz无线传输器。（只能在室内使用），避开900MHz频段干扰，干扰小，传输距离有限：10～50束。图像有限，没有云台控制。（小型仓库、超市、办公室等）

3、2.4GHz无线网络（11M×40→4M带宽）（20km）

是基于802.11B/G无线局域网，发展成室外点对多点组网应用而来，由于是基于无线IP传输技术，监控信息传输都是基于数字化传输，传输质量、传输距离、云台控制都能实现。

无委会有规定：2.4GHz频段不允许在室外使用，频道少，易受干扰。（不建议用此频段）

4、2.5～2.7GHz，3.5GHz宽带无线接入系统。（专用网络）

基于点对多点的数字调制的宽带无线传输系统，满足视频

无委会规定申请、审批（广电、运营商），才能用5、5.8GHz宽带无线接入系统（基于IEEE802.11A标准的无线网络）（20km）高吞吐量、高可靠性、卓越的传输距离和高性价比，5.8GHz无线宽带接入产品一般采用DFDM（正交频分多路复用技术）

可接供高达54Mbps（或以上）的空中速率，信道宽度为（54M的40%→20MHz）支持MPEG4、H.264等格式的数字视频流。

方案实现：无线网络（视距）；中继（非视距）

示意图：每个监控区装置固定在装有固定云台摄像机，通过开放的S、C无线，将监控机实时图像传回指挥中心，并可通过局域网、广域网、因特网实现多媒体通信，达到资源信息共享。

七、无线视频监控系统

传统的有线视频监控有一个弊端。用线缆、用因特网（往往图像传输质量不变、带宽、时延）

实现中这距离视频监控：基于IP协议的无线视频监控更方便：

摄像机、视频服务器、无线连接器→传至用户计算机网络上

在网络中任意一台计算机上面都可以通过授权观看，用鼠标或键盘可控制前端。火车上：利用防区无线可实现每节车厢视频监控。

以上所有视频监控传输方式，在安防系统应用很普遍，有的一种、二种、甚至更多。设计者可根据实际情况、用户要求进行设计。

第三篇：网球教学原理-网球入门教学基本步骤

网球教学原理-网球入门教学基本步骤

入门教学基本步骤

1，无拍练习，包括滚，停，抛，接，拍等玩球动作。2，一人正手颠球。3，一人正手颠落地球。4，一人双手反手颠球。

5，一人正反手轮换颠球，各颠两下。6，两人距离两米互相正手颠落地球。7，两人距离两米互相反手颠落地球。8，两人距离三米互相正手颠落地球。9，两人距离三米互相正反手轮换颠落地球。10，两人隔网小小场正手大幅度跑动颠落地球。11，两人隔网小小场反手大幅度跑动颠落地球。12，两人隔网小小场正反手轮换大幅度跑动颠落地球。13，两人隔网小场正反手轮换大幅度跑动击球。

14，两人隔网小场正手加大动作幅度击球（推挡，平击，上旋都可以，因人而异）。15，两人底线正反手对打。16，高举法发球。17，大场比赛。入门教学基本定理 1，很少人天生能打网球，一般应经过入门学习。各人入门找感觉差别极大，同一动作，一些人仅需几秒钟，一些人却需几十分钟。同一个人，一个动作需几分钟，另一动作可能需几十分钟。

2，基本步骤越靠前的动作越简单，越容易有感觉。3，前边步骤动作越熟练，后边步骤动作越快来感觉。4，后边步骤动作有感觉的，同一动作的前边步骤必定也有感觉。

5，从哪个步骤开始因人而异，天赋好的可直接从13步骤开始，幼儿应从1步骤开始，集体授课应从2步骤开始，一般人从10步骤开始。

6，找感觉难的动作不宜练太长时间，与其苦苦找感觉，不如推前一步骤先熟练较简单的。

7，不必练到十全十美，有七成熟练可转练下一步骤。8，动作合理，避免伤害，轻松自然地击球的都是好动作，不必强求学员学某种标准动作。

9，这些教学基本原理对学新动作，改错误动作同样有效。10，时间长的熟练过程适宜运用比赛，数回合等轻松有趣的游戏。

简易教法八步骤入门课程

1，正手颠球。目标是稳定颠球10下，要求拍在腰际，球比眼高。常见缺点的改进方法，拍面保持水平，不晃动，眼睛盯紧球，手掌向上握拍才是正手。大多数人能轻松过关，少数人需经过短期练习，极个别人需较长时间练习。此步骤过关解决网球击球两个基本要素：在甜点打球，拍面和网球的入射角垂直。过关需要眼，手，脚的感觉统合。

2，正手颠落地球。目标是稳定颠球10下，同样要求拍在腰际，球比眼高。常见缺点的改进方法，拍面保持水平，不晃动，用身体起伏打球，眼睛盯紧球。此步骤基本能轻松过关，过关后解决了击球节奏的要素。

3，正手小小场隔网颠落地球。教练首先示范颠落地球两下，第三下用同样的动作颠球过网，要求学员照做，有一半人第三下的动作不能和前两下一致，不自觉地改变了拍面角度，引导他们颠球过网的动作和颠落地球动作一致后才可以直接一次颠过网。隔网颠球要求有抛物线，比网高半米，落在离网两米的范围内。要求在右前方颠球。有意送球到不同位置练习脚步移动，先练同方向移动，再练反方向移动。以上练习步骤需按部就班，前边未过关不宜练下边的。

4，双反手小小场隔网颠落地球。方法和上步骤完全一样，只是正手改成双反手。如果遇到少数过关困难的，可让他们增加反手颠球和反手颠落地球的练习。

5，正反手小小场隔网移动中颠落地球。先教准备动作，左手扶着拍颈，右手放松虚握拍柄，拍头竖起对着鼻子，双脚轻微弯曲。送球到正手位，复习3步骤，过关后送球到反手位，复习4步骤，过关后不规则地交叉送正反手位。

6，逐步后退到小场对打。在5步骤熟练的基础上逐步送较长的球，一米一米推进，直到整个小场。在这个步骤学员的拍面角度本能会自动调整，无需教练引导，此类自动调整击球动作的人类本能是简易教法的科学基础。送球到前后左右不同位置练习正反手击球，留意观察缺点提醒改正。击球动作基本合理后，对学员说，从现在开始你已学会打网球，然后和他打一场11分的小场比赛，不准截击，只许打落地球。为了增加乐趣，设定取得一分有奖品。多数人比赛一场的动作已很好，少数未能熟练击球的，可增加数回合的游戏，逐步增加回合目标，达到50回合的动作已可以。

7，高举法发球，自由式握拍，握紧后举高拍子，拍头指向前方，拍面水平挡住抛球方向，抛球后，拍头本能向后拉开然后反弹向上伸展到最高点轻轻扣球到发球区里。在小小场发30球，在小场底线发30球，在大场一二区各发20球。

8，大场比赛。两人以下单打，三人以上双打，不够人教练顶，教练不能主动得分。第一盘4次发球机会，第二盘3次，以后正常。

经过八步骤学习后的学员基本算入门，以后每次打球前按第6步骤做热身，最好和教练对打，初学者在前几节课的动作未定型，常会重犯错误需要教练不断提醒改正。多数人两节课可完成入门，少数人需四节课。简易教法四节课入门课程

一对一每节课一个半小时，超过一人需延长授课时间，保证每人上场时间足够一小时。

第一课，学习1至6步骤。

第二课，复习6步骤，改缺点，半小时。学发球，一小时。

第三课，复习6步骤，改缺点，10分钟。复习发球20分钟。大场比赛，一小时。

第四课，复习6步骤，改缺点，10分钟。大场比赛80分钟。入门八步骤引导方法

为方便讲述，先定义三个名称，单打的区域叫大场，发球区的一侧区域叫小场，小场离网二米距离内的区域叫小小场。

1，正手颠球。

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可以在场外练，一对多。

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教练先示范颠3下，然后让学员颠，不必提任何动作要求，目标是稳定地颠球10下，要求拍在腰际，球比眼高。

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教练注意观察学员的缺点提示改正，颠球不稳改进方法，拍面保持水平，不晃动，眼睛盯紧球。

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正反手不分的，让他反手颠得熟练后再改正，手掌向上握拍才是正手。

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动作不放松的多数左手僵硬，提示他把左手放松。

2，正手颠落地球。

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可以在场外练，一对多。

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教练先示范颠3下，然后让学员颠，不必提任何动作要求，目标也是稳定地颠球10下，同样要求拍在腰际，球比眼高。

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球到处走的改进方法，拍面保持水平，不晃动，眼睛盯紧球，用身体起伏的节奏打球。

3，正手小小场隔网颠落地球。l

教练首先示范颠落地球两下，第三下用同样的动作颠球过网，要求学员照做。

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有些学员第三下不自觉地改变了拍面角度，引导他们第三下要和前边两下的动作一致。此步骤要求在身体右前方颠球到教练的小小场中间，在送球的过程不断观察不正确动作并提醒改正。

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注意每次提醒只能改正一个缺点，不宜同时改两个，改正一个后才可再提新缺点。

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打不中球的改正方法：拉拍到身体右前方，拿拍对准球底，用最简单的动作将球轻轻颠送过网。

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击球点偏后的改正方法：如上。拉拍位置不是身后而是身右，感觉论和姿势论的最大差别就是这里，姿势论要求侧身，拉拍，感觉论要求不要侧身，不要拉拍，初学网球如果用侧身拉拍的方法很难打中球，就算打中球击球点也偏后。

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隔网颠球要求有抛物线，比网高半米，落在小小场范围内，不符合要求的，引导他打球的底部，控制力量使抛物线顶点在球网上方。

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没有用脚找球而是用手找球的改正方法：保持拍与身体的距离基本固定，只准靠脚步移动找球。此步骤的站位尽量用开放式，避免用交叉脚的封闭式。

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找到感觉后尽快开始练步法，让学员知道，打网球脚步是最重要的，手的动作很简单就可以，练步法的方法，有意送球到不同位置练习脚步移动，先练同方向移动，再练反方向移动，不准用反手，只准用正手，送球方向变化尽量多，强迫他的脚步多移动。这时的来回快，移动快，教练要注意控制运动量，发现他呼吸急促就要让他休息，或者叫他累时要求休息。初学网球的人体能一般都不行，五次以后才可以。

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以上练习步骤需按部就班，前边未过关不宜练下边。

4，双反手小小场隔网颠落地球。

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双反比单反易学，用双手握拍，拉拍到身左侧颠送球过网，站位可以开放式也可以封闭式。

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有了前边的基础，一般人这步骤比第3步骤容易很多。

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练步法也与前一样，只准反手不准正手，强迫脚步多移动。

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遇到上手慢的人要心中有数，不能急，不能责怪，要有耐心，不要打击他的自信心，多送些易打的球过去，耐心等待他激活感觉的那一刻。

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在一个动作未有感觉时，不要急着转学新动作。但也不要等动作十全十美才转，有7成合格就行，留一些以后慢慢完善。

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如果遇到少数过关困难的，可让他们增加反手颠球和反手颠落地球的练习。

5，正反手小小场隔网移动中颠落地球。

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先教准备动作，左手扶着拍颈，右手放松虚握拍柄，拍头竖起对着鼻子，双脚轻微弯曲重心下蹲。l

送球到正手位，复习3步骤。l

过关后送球到反手位，复习4步骤。

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过关后不规则地交叉送球到正反手位，熟悉正反手转换，继续巩固已学的动作，注意观察重犯的错误，及时提醒改正。

6，逐步后退到小场对打.l

引导方法是送球技巧，先易后难，根据熟练程度增加跑动范围，最后达致前后左右四个位置都可以熟练击球。

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此步骤的小场比赛是非常重要的引导方法，和P&S计划的对抗练习原理相同，要让学员在比赛中学会控球，教练不要主动得分，还有数回合数也是重要的引导方法，允许两跳击球，允许击球出界，不允许下网，要求打出尽量多的来回，这和P&S计划的合作练习原理相同。

7，高举法发球。

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是很重要的感觉论方法，入门，提高，职业选手改缺点等所有环节的发球都有用。

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可以一对多教，首先站在小小场位置发，教练先发3球给学员模仿，观察学员的缺点逐一提醒改正。l

常见的缺点抛球太低或太高，太前或太后，不会放松，总想加力打。

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一般人发30至50球可以有感觉，必须有感觉后才可以后退到发球线练。

8，大场比赛。

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够人上场教练就做裁判兼教练，不够就当运动员兼教练，边比赛边讲解。

第四篇：瘦肉精检测原理及操作步骤

瘦肉精检测原理及操作步骤？

时间：2011-03-22 来源： 作者：

一、测定原理

“瘦肉精”克仑特罗竞争酶标免疫检测方法快速测定的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体（第二抗体）。加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第一抗体）与第二抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原），标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。在单波长450 nm处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓度成反比。

二、试剂盒的组成

每个盒中（包括标准分析孔）材料如下：

（1）1×96孔板（12排×8孔），包被有第二抗体（兔IgG抗体）；（2）6个标准液（300ul/瓶）为克仑特罗水溶液。浓度分别为0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg；（3）1个克仑特罗过氧物酶标记物浓缩液12 ml（红色帽）；（4）1个克仑特罗抗体浓缩液12 ml（黑色帽）；（5）1个酶基质/发色剂11 ml（蓝色帽）；（6）1个反应停止液，1 mol/L硫酸14 ml（黄色帽）；（7）1个缓冲液25 ml，酶标记物及抗体浓缩液稀释用。

三、试验材料

1、设备

微孔板酶标仪（450 nm）、均质器、冷冻离心机、离心管（50 ml）、微量可调移液器（单道、八道）、RIDAC18柱、滤纸（0.45μm）。

2、试剂

甲醇（分析纯、100%）、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0）、500 mol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0）、1 mol/LNaOH。

四、储存条件

试剂盒保存于2-8℃，不要冷冻。不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与干燥剂一起重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，避免直接暴露在光线下。

五、试剂变质的迹象

发色剂有任何颜色表明已变质，应当弃之。0标准的吸光值小于0.6时，表示试剂可能变质。

六、样品处理

1、尿样

尿样一般不用处理，取20清亮尿样直接测定。如果尿样混浊要过滤或离心至得到清亮尿样。

2、肝脏、肉样

粉碎的5g样品与25ml50 mmol/L HCL混合，振荡1.5 h，以达到均质的目的。称6g均质物（相当于1 g肝脏），加入离心管中。10-15℃条件下（非常重要）4000转/min或更高的转速离心15 min。转移上清液到另一个离心管中，加300μl 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0），简单混合并在4℃保存至少1.5 h或过夜（非常重要）。10-15℃条件下（非常重要）4000转/min或更高的转速离心15 min。分离全部上清液（应是清亮的，非常重要），使其升至室温（20-24℃），然后用RIDAC18柱纯化。

RIDAC18柱纯化样品必须在室温条件下（20-24℃），并严格控制过柱时流速。用3 ml甲醇洗涤柱子，控制流速为1滴/s。用2ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0），洗涤柱子。肝脏、肉样的全部上清液进柱，控制流速为1滴/4s。用2 ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液pH 3.0），洗涤柱子，流速为1滴/s。用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2 min，干燥柱子。用1 ml甲醇洗脱样品，控制流速1滴/4s。在50-60℃并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶剂。用1 ml蒸馏水溶解干燥的残留物，取20μl进行分析。

3、饲料

取10ｇ饲料样品，用10 mmol/LHCL溶解，连续震荡10 min，用滤纸过滤，在滤液中加入120μl 1mol/L NaOH进行中和，检查pH，用NaOH控制PH值在6.5-7.5之间，取上清液20μl进行分析。稀释倍数为25（即含有0.04 g饲料样品/ml）。

七、测定步骤

第一步：所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温（20-24℃），测定操作在20-24℃下进行。

第二步：用盒中缓冲液以体积1﹕10的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液（黑色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡。

第三步：取出实验需要数量的微孔板条，足够标准和样品所用的数量，标准和样品做两个平行试验，记录标准和样品的位置。剩余的微孔板条放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，置于2-8℃冷藏。

第四步：每个微孔中底部加100μl稀释后的抗体溶液，室温（20-24℃）孵育微孔板15 min，避免光线照射。

第五步：孵育的同时进行酶标记物的稀释，用盒中缓冲液以体积1﹕10的比例稀释实际用量的克仑特罗酶标记物浓缩液（红色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡，避光放置。

第六步：洗板，甩出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，直到纸上无明显水迹（拍打3次），以保证完全除去孔中的液体。用250μl蒸馏水充入孔中，再次甩掉微孔中液体，并在吸水纸上拍打，重复操作两次。加洗涤水的移液器管尖必须置于微孔上方约0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离抗体带入洗涤水中。洗板后立即进行下一步操作，不要让板孔干燥。

第七步：加入20μl标准或处理好的样品到各自的微孔底部，标准和样品做两个平行实验。

第八步：加入100μl稀释了的酶标记物至微孔底部，轻轻震荡微孔析并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触到孔中的混合物，避免交叉污染。

第九步：室温孵育微孔板30 min，避免放置，尽可能每隔10 min轻轻振荡1次，准备好酶基质/发色剂，并注意避光放置。

第十步：洗板，同第六步。在洗板过程中加洗涤水的移液器置于微孔板上方0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离酶标记物带入洗涤水中。

第十一步：不要让板孔干燥，迅速加入100μl酶基质/发色剂到每个孔中，步骤操作要迅速，避免头尾反应时间相差过长，轻轻振荡板并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触微孔中的混合物，避免交叉污染。

第十二步：室温暗处孵育微孔板15 min，暗处避光放置，同时准备好反应停止液。

第十三步：每孔加入100μl反应停止液，混匀，60 min内用酶标仪测量450 nm处波长吸光度值。

八、结果

所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸光度值再乘以100，并且以百分比的形式给出吸光度值。

吸光度值（％）＝ ×100

计算的标准值（吸光度值）绘成一个对应克仑特罗浓度（mg/kg）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在200-2000 ng/kg范围内应当成为线性。相对应每一个样品的浓度（ng/kg）可以从校正曲线上读出

第五篇：秦皇岛科三考试步骤附路线图及灯光考试

秦皇岛科三考试步骤：

起点：公交站附近

1、绕车一周后向后看开车门上车

2、上车主要四步：右手调座椅，左手安全带，右手检查空挡，调倒车镜，最后打火（用力但不能时间长）

3、灯光考试：打开远光灯---随机---打开远光灯---随机---打开远光灯----随机---打开远光灯----灯光考试结束关闭所有灯光。（随机中发生故障无法移动及雾天行驶出现概率最大，每一步灯光操作必须听完语音提示后操作5秒内完成，关闭灯光时注意远光灯回位）

4、起步主要四步：一打方向，二鸣喇叭，三踩离合挂档，四放手刹。然后缓抬离合看倒车镜起步

5、起步后加油门，回正转向灯，加到二档，二档保持二十迈行驶，听直线行驶指令，完成后继续保持二十迈行驶，听前方公交车站指令点刹车，继续行驶，听到已通过公交车站后打右转向灯看倒车镜三秒后向右变更车道，保持右转向灯听前方路口右转指令后点刹车，看倒车镜三秒后向右变更车道进入右转车道后右转，看倒车镜观望路口后右转进入中间车道，转向灯回正，加力踩油门二档换三档，听加减档操作指令后继续踩油门车速在35迈以上不超过40迈时三档换四档，不踩油门停留两秒后，四档换三档。继续减速三档换二档，听前方通过直行路口指令点刹车，保持中间车道继续行驶，听前方路口请掉头指令，打左转向灯点刹车接近路口时二档换一档，在车头到第二段白虚线后看倒车镜观望路口三秒后左转进入最左侧车道，车身调整后踩油门一档换二档，听前方路口请左转指令后打左转向灯点刹车观望路口三秒后左转进入最右侧车道，回正转向灯。听请超越前方车辆指令后打左转向灯看倒车镜三秒后变更到左侧车道，回正转向灯，听请返回原车道指令后打右转向灯继续行驶三十到四十米看倒车镜三秒后变到右侧车道回正转向灯。继续行驶听变更车道指令后，打左转向灯看倒车镜三秒后变更进入左侧车道，回正转向灯。继续行驶听前方通过学校区域后点刹车继续行驶，听通过学校区域后打右转向灯看倒车镜三秒后变到右侧转弯车道，回正转向灯，保持二档20迈继续行驶，听前方路口请右转指令后打右转向灯点刹车看倒车镜观望路口后右转，回正转向灯后继续行驶，听前方通过人行横道线指令后点刹车继续行驶，（如果不在右侧转弯车道应该提前打右转向灯，看倒车镜三秒后变更到右转车道，不能压白实线）听前方路口请右转指令后打右转向灯、点刹车、看倒车镜观望路口后右转进入中间车道，回正转向灯后继续行驶听请靠边停车指令后打右转向灯踩着离合点刹车二档换一档进入右侧车道，点踩离合刹车，先调整车身然后逐渐往边上靠，调整基点是雨刷器突起与白线重合，目标是压井篦子或倒车镜中门把手接近挨到白线。待目标达到后踩离合踩刹车停车。

6、停车：挂空挡、拉手刹，转向灯回位，松离合松刹车，关火，解安全带，看倒车镜三秒后下车，关闭车门。终点：公交站附近

重点注意：

1、保持车速要慢，与前车拉开三十到四十米距离，他快你慢，他慢你更慢（千万不能点刹车时熄火），防止前车熄火或错误操作影响考试。

2、观察路口交通，防止被安全员踩刹车踩死，特别是左转时，远处有车快速加油通过，近处有车慢速靠近路口，待机加油从车后通过。

3、注意刚起步时第一项有可能是加减档，所以起步车速不能太慢。

4、以上是最佳路线，遇特殊情况时选择合适车道再变回。灯光考试：

路线图：