实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集

第一篇：实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集

实验2 土壤中稀有放线菌的分离--土壤样品采集 1 目的

1.1 了解微生物分离和纯化的原理 1.2 掌握常用的分离纯化微生物的方法 2 原理

从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。其基本原理是选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求,或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。3 材料 3.1 培养基

淀粉琼脂培养基(高氏I号培养基)，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基。3.2 仪器或其它用具 取样铲、塑料袋、记号笔、1．布点：按照土壤类型和作物种植品种分布，按土壤肥力高、中、低分别采样。一般150-300亩（不同地区可根据情况确定）采取一个耕层混合样，采样点以锯齿型或蛇型分布，要做到尽量均匀和随机。应用土壤底图确定采样地块和采样点，并在图上标出，确定调查采样路线和方案。

2．采样部位和深度：用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5～25cm处的土样0.5-1kg，在采样过程中，采取的混合样一般都大于该重量，所以要去掉部分样品，将所有采样点的样品摊在塑料布上，除去动植物残体、石砾等杂质，将大块的样品整碎，混匀，摊成园形，中间划十字分成四份，然后对角线去掉两份，若样品还多，将样品再混合均匀，再反复进行四分法，直至样品最终重量要求0.5-1公斤（试验用的样品2公斤）为止。如下示意图。一用取土器或锄头直接挖入耕层取样。每个点切取的土块宽度、厚度应基本一致。装入事先准备好的塑料袋内扎好。北方土壤干燥，可在10～30cm处取样。

3．采样方法、数量：1)面积小，地势平坦，肥力均匀的田块，采用对角采样法。2)面积中等，地势平整，有些肥力差异的田块采用棋盘式采样法。3)面积大，地势又不平坦，肥力不匀的田块采用蛇型线采样法。土样由20个样点组成。样点分布范围不少于3亩（各地可根据情况确定）。每个点的取土深度及重量应均匀一致，土样上层和下层的比例也要相同。采样器应垂直于地面，入土至规定的深度。采样使用不锈钢、木、竹或塑料器具。样品处理、储存等过程不要接触金属器具和橡胶制品，以防污染。每个混合样品一般取1kg左右，如果采集样品太多，可用“四分法”弃去多余土壤。

4．样品编号和档案纪录：做好采样记录：土样编号、采样地点及经纬度、土壤名称、采样深度、采样日期、采样人等。

第二篇：实验二_____土壤中放线菌的分离

实验讲义5 土壤中枯草芽孢杆菌分离方法

取土样时最好选取如花坛等地方的土样，去掉表层5~10cm的土壤后取样。

放入100ml三角瓶中，加入30ml水，常压加热至水沸腾后维持20min，取出，置28-37摄氏度培养24-48h，液面则产生黄白色皮膜。用接种环取皮膜适量于无菌水中分散，稀释涂布于蔗糖豆芽汁琼脂平皿，置28-37摄氏度培养24-48h，挑取典型菌落。

实验6

土壤中放线菌的分离（实训）

实验目的：1掌握配制合成培养基的一般方法。

2掌握稀释倒平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。3掌握平板划线法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。4掌握涂布平板法从土壤中分离放线菌的基本原理和基本操作技术。

实验材料：

药品：可溶性淀粉、KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O、FeSO4•7H2O、琼脂。其他：高压蒸汽灭菌锅、扭力天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、三角瓶、试管、牛皮纸、硫酸纸、线绳、无菌培养皿、铁锹、小铲、酒精棉球、镊子、玻璃铅笔。

实验原理：

高氏一号合成培养基是培养放线菌的培养基。这种培养基是采用化学成分完全了解的纯试剂配制而成的培养基，高氏一号培养基：碳源为可溶性淀粉、氮源为KNO3、NaCl、K2HPO4•3H2O、MgSO4•7H2O 作为无机盐，FeSO4•7H2O作为微生物的微量元素，提供铁离子等组成。

放线菌是重要的抗生素产生菌，主要分布在土壤中，其数量仅次于细菌，一般在中性偏碱性、有机质丰富、通气性好的土壤中含量较多。由于土壤中的微生物是各种不同种类微生物的混合体，为了研究某种微生物，就必须把它们从这些混杂的微生物群体中分离出来，从而获得某一菌株的纯培养。分离放线菌常用稀释倒平板法。根据放线菌的营养、酸碱度等条件要求，常选用合成培养基或有机氮培养基。如果培养基成分改变，或土壤预先处理（120℃热处理1h），或加入某种抑制剂（如加数滴10%酚等），都可以使细菌，霉菌出现的数量大大减少，从而淘汰了其它杂菌。再通过稀释法，使放线菌在固体培养基上形成单独菌落，并可得到纯菌株。

实验步骤：

1.高氏一号合成培养基的制备

高氏一号琼脂培养基（培养放线菌用）

可溶性淀粉20g，硝酸钾1g,氯化钠0.5g，K2HPO4 •3H2O 0.5g，MgSO4•7H2O 0.5g，FeSO4•7H2O 0.01g，琼脂20g，水1000ml，pH7.2～7.4。

配制时，先用冷水，将淀粉调成糊状，倒入煮沸的水中，在火上加热，边搅拌边加入其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。112℃灭菌20分钟。

2.土壤中放线菌的分离（1）待测样液的制备

选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等，土样取回后应尽快投入实验。

称土样1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中，振荡10～20min，使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散，此即为10-2浓度的菌悬液，静置30s。另取装有9ml无菌水的试管3支，编号10-

3、10-

4、10-5。用无菌吸管无菌操作取10-2浓度的土壤悬液1ml并加入编号10-3的无菌试管中，并吹吸吸管2~3次，使与9ml水混匀，即为10-3浓度的土壤稀释液。依此类推，直到稀释至10-5的试管中（每个稀释度换1支无菌吸管）。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。（2）稀释倒平板法分离土壤中放线菌

-5-4-5-4取2支1毫升移液管分别从10、10菌悬液中吸取1毫升菌悬液，分别注入编号10、10的培养皿内。将温度为45～50℃的高氏一号培养基倒入上述各培养皿内，轻轻旋转使菌悬液充分混合均匀，凝固后，将培养皿倒扣放置在温暖处（28℃左右），每天观察培养基表面有无微生物菌落。（3）涂布平板法分离土壤中放线菌

取2套无菌平皿，在皿底贴上标签，注明土壤稀释液的稀释度（10-

4、10-5）、组别、姓名、操作日期等。每个稀释度做一个培养皿。然后在每皿中倒入已溶化并冷至50℃左右的高氏一号培养基15~20ml左右，待冷凝成平板。

用无菌吸管从浓度最小稀释液开始，每次吸取0.1ml加到一组相应编号（10-5）的高氏一号平板上（每次吸取前，吸管要在液体内吹吸几次），再依次将10-4的土壤稀释液加到相应平板上。用无菌刮棒（从浓度小的稀释液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀。（4）平板划线法分离土壤中放线菌

取一培养皿置于实验台上，左手将培养皿打开稍许，向培养皿内注入熔化的营养固体培养基10～12毫升，轻轻转动培养皿，使其中的培养基分布均匀，平放桌上，使其凝成平板。然后在皿底用蜡笔划分A、B、C、D几个区。每组两个平板培养基。

将培养皿底部用姆指和无名指固定成倾斜状态，在火焰旁将培养皿稍微打开。在此同时，用环状接种针在火焰旁取少许10-2浓度的土壤稀释液，迅速送入培养皿内，在平板培养基的一边，作第1次平行划线 6～7条，转动培养皿约70°角，用烧过冷却的接种针，通过第1次划线部分作第2次平行划线，然后再用同样方法，作第3次平行划线。划线时，接种针应与平板表面成30°角左右。不要使接种针碰到培养皿边缘，也不要将培养基划破。（5）培养

接种完毕，将平皿放入28℃恒温箱培养7天，观察平皿上放线菌（主要是链霉菌）菌落。（6）挑菌落

待三种方法的平板长出菌落后，鉴定微生物类群，并根据镜检结果，判断是否已分离到了纯菌种。如果菌种很纯，则可转移到斜面培养基上进一步培养。转种至斜面，菌种用牛皮纸包好，置4℃冰箱中保存。

准备实验内容：

问曾老师借 无菌刮棒 打火机 酒精灯

无菌报纸包（1个）

99mL水/三角瓶（玻璃珠）

5支移液管 3支9mL水的试管

培养皿6套 枪头（1mL/0.1mL）

高氏一号培养基500mL（150mL三角瓶2个，200mL试管）思考题：

1.检查接种后培养物的生长情况和染菌情况。

2.观察与记录以下内容。

大小

形状

边缘颜色

表面代谢物

种类 3.如何区分放线菌和真菌、细菌？

放线菌菌落小而紧密、干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现出不同的色泽。霉菌菌落的话应该是比较大的，可能是大而疏松也可能大而紧密，其他一些跟放线菌都差不多，比如都是颜色多种多样，与培养基紧密结合难于挑取。但在气味上有很大差别，放线菌具有泥腥味，而霉菌具有霉味。还有一点就是放线菌菌落周围琼脂平面会有变形的现象。若稀释平板的稀释度不够，放线菌会被抑制了或者菌落太小，而其他细菌的菌落又太多，不容易找到。

第三篇：土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取实验报告

土壤中放线菌的采集、分离、培养、发酵及提取

实验目的：

1、从土壤中分离产抗生素的放线菌

2、放线菌的培养

3、放线菌的发酵产生活性物质

4、放线菌产生的活性物质提取。实验原理：

放线菌是一类呈菌丝状生长，主要以孢子繁殖。放线菌与人类的生产和生活关系极为密切，目前广泛应用的抗生素约80%是各种放线菌所产生的。

许多临床应用的抗生素均由土壤中分离的放线菌产生。采用选择培养基可分离土壤中的放线菌。产抗生素的放线菌经液体培养后，其分泌的抗生素存在于离心所得的上清液中，可采用微生物的抑菌试验进行检测，从而筛选到所需的抗生素产生菌，并对其进一步培养，繁殖，发酵，最终提取我们所需的抗生素。实验器材：

1、土壤

2、培养基：高氏一号培养基、种子培养基、发酵培养基

3、其他：重铬酸钾、培养皿、牛津杯、接种环、酒精灯，无菌涂棒、三角锥瓶、高压蒸汽灭菌锅、天平、药匙、烧杯、量筒、玻璃棒、试管、牛皮纸、线绳等。实验步骤：

一、土壤放线菌株的采集

采集样品：选定取样点（最好是有机质含量高的菜地），按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等。

样品（土壤）处理：室温风干

二、土壤中放线菌的分离、培养

1、配制淀粉培养基

淀粉琼脂培养基（高氏培养基）

可溶性淀粉2g；硝酸钾0.1g；磷酸氢二钾0.05g；氯化钠0.05g；硫酸镁0.05g；硫酸亚铁0.001g；琼脂2g；水100ml.先把淀粉放在烧杯里，用5ml水调成糊状后，倒入95ml水，搅匀后加入其他药品，使它溶解。加热到煮沸时加入琼脂，不停搅拌，待琼脂完全溶解后，补足失水。调整PH到7.2-7.4，分装后灭菌，备用。

2、土壤悬液梯度稀释

① 将5.0g土壤加入到50ml灭菌的生理盐水中，震荡10min制备土壤悬液。

② 用无菌吸管吸取1ml土壤悬液，加入到9ml灭菌的生理盐水中10倍稀释。

③ 按1：:1稀释至10-

3、10-

4、10-5，将3块灭菌平板分别标记10-

3、10-

4、10-5，稀释过程应在无菌条件下进行。

3、将高氏一号培养基加热溶化，待冷至55-60℃时，加入3%的重铬酸钾数滴（大约100ml加0.3ml），混合均匀。分别吸取0.1ml稀释液于灭菌平皿中，再加入10-15ml恒温于55℃的含有重铬酸钾的淀粉琼脂培养基中，轻轻旋转混合均匀。

4、平皿倒置于培养箱28℃恒温培养一周左右。

5、将平皿上的放线菌菌落跳去在淀粉琼脂平皿上四区划线进行分离纯化，28℃恒温培养一周左右，观察放线菌菌落特征。

6、将纯化好的菌落转入到斜面，4℃条件下进行保存。

三、抗菌谱的测定

1、挑取一个放线菌的菌落接种到含有250ml淀粉液体培养基的三角瓶，28℃恒温培养一周左右。

2、将2ml培养8h的大肠杆菌分别加到200ml灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基中混合均匀，每培养皿中倒入20ml，凝固后待用。

3、在上面培养皿中均匀放入4个牛津杯，每个牛津杯中加入1ml放线菌发酵培养液。培养皿放入37℃培养箱恒温培养12h。

4、测量抑菌圈的大小。

四、发酵

1、配制种子培养基

蔗糖22.5g，黄豆粉12.5g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙2g，蒸馏水1000ml，PH值7.2,121℃灭菌20min。

2、配制发酵培养基

蔗糖45g，黄豆粉25g，磷酸氢二钾0.2g，氯化钠1g，硫酸钠0.1g，硫酸亚铁0.01g，碳酸钙3g，蒸馏水1000ml，PH7.2。121℃灭菌20min。

3、种子液的制备

将试管斜面菌种转管活化，28℃培养7天后，以接种取一环孢子转入装有50ml种子培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-1 培养4天。

4、发酵培养

以6%的接种量将种子液转接入装有50ml初始发酵培养基的250ml三角摇瓶中，于28℃200r/min-

1培养4天。

5、活性检测

发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，杯碟法测定抗菌活性（同三）。

五、提取

1、发酵液经4000r/ min-1 离心15min，取上清，用乙酸乙酯以1:1的比例进行萃取。

2、活性检测

将萃取液浓缩，杯碟法测定抗菌活性（同三）。

第四篇：土壤中放线菌的分离和纯化实验

土壤中放线菌的分离和纯化实验

一、实验目的

1、制作MS培养基的方法，掌握母液的保存方法。

2、掌握培养基的灭菌方法。

掌握外植体的消毒和超净工作台的使用。

4、掌握放线菌的分离纯化及染色的基本流程；

5、掌握高氏一号培养基的配制方法；

6、复习分离纯化放线菌的基本操作技术、培养方学会使用高压蒸汽灭菌锅。

7、培养微生物实验的设计思路和动手能力。

二、实验材料

高压蒸汽锅、培养瓶、石斛的愈伤组织、超净工作台，酒精灯、酒精棉球、镊子、电子天平、称量纸、烧杯、量筒、显微镜、三角锥形瓶、无菌培养皿、接种环、酒精灯、分析天平；接种环、载玻片、盖玻片、玻璃珠、移液枪、剪刀

三、实验原理

植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）

第 1 页 或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体,在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。

四、实验步骤

1、配制MS培养基8L，称取马铃薯1600g、香蕉400g、蔗糖240g、活性炭8半勺、琼脂80g、配制 母液。

2、配制培养液时应注意：

①在使用提前配制的母液时，应在量取各种母液之前，轻轻摇动盛放母液的瓶子，如果发现瓶中有沉淀、悬浮物或被微生物污染，应立即淘汰这种母液，重新进行配制；为防止母液被微生物污染，有机母液放在冰箱里4℃保存；

②用量筒或移液管量取培养基母液之前，必须用所量取的母液将量筒或移液管润洗2次；

③量取母液时，最好将各种母液按将要量取的顺序写在纸上，量取1种，划掉1种，以免出错。溶化琼脂 用粗天平分别称取琼脂9 g、蔗糖30 g，放入1 000 mL的搪瓷量杯中，再加入蒸馏水750 mL，用电炉加热，边加热边用玻璃棒搅拌，直到液体呈半透明状。然后再将配好的混合培养液加入到煮沸的琼脂中，最后加蒸馏水定容至1 000 mL，搅拌均匀。

需要注意的是，在加热琼脂，制备培养基的过程中，操作者千万不能离开，否则沸腾的琼脂外溢，就需要重新称量、制备。此外，如果没有搪瓷量杯，可用大烧杯代替。但要注意大烧杯底的外表面不能沾水，第 2 页 否则加热时烧杯容易炸裂，使溶液外溢，造成烫伤。调pH 用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH试纸测培养基的pH，一直调到培养基的pH为6（5.8~6.5）左右为止。培养基的分装 溶化的培养基应该趁热分装。分装时，先将培养基倒入烧杯中，然后将烧杯中的培养基倒入锥形瓶（50 mL或100 mL）中。注意不要让培养基沾到瓶口和瓶壁上。锥形瓶中培养基的量约为锥形瓶容量的1/5～1/4。每1 000 mL培养基，可分装25～30瓶。培养基分装完毕后，应及时封盖瓶口。用2块硫酸纸（每块大小约为9 cm×9 cm）中间夹1层薄牛皮纸封盖瓶口，并用线绳捆扎。最后在锥形瓶外壁贴上标签。

3、高压灭菌 培养基的高压灭菌包括以下几个步骤。

第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。如果没有金属小筐，可以在两层锥形瓶之间放一块玻璃板隔开。

第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如装有蒸馏水的锥形瓶、带螺口盖的玻璃瓶、烧杯、广口瓶（以上物品都要用牛皮纸封口），用报纸包裹的培养皿、剪刀、解剖刀、镊子、滤纸、铅笔等。

第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121 ℃下，灭菌20 min。灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固后再使用。

第 3 页 4,、再在操净工上进行消毒，先用紫外线照射30MIN，然后送风，关闭紫外灯，改 用日光灯，对手用酒精进行消毒，对培养基表面也要用酒精进行消毒。准备工作好了，就进行接种。并且要在酒精灯旁边进行操作，避免污染。镊子要在双孔灭菌器上进行灭菌。

4、接种完成后要整理工作台，并且把培养瓶拿到培养架上进行日光培养。

五、放线菌的提取步骤

5、（1）称取土样2.00g，在火焰旁加到一个盛有48ml无菌水并装有玻璃珠的100ml锥形瓶中。振荡20-30min，使样品的菌体、芽孢或孢子均匀分散。静止20-30s，标记为编号1。

6、（2）按照一定的梯度进行稀释（该实验采用10倍梯度）

①取3个各装有9.5ml无菌水的25ml锥形瓶，分别按照顺序标记好2、3、4.②在超净工作台上，用微量移液器从1号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到2号锥形瓶中，摇匀后，再用微量移液器从2号锥形瓶中移取0.5ml土壤悬液加到3号锥形瓶中，依此类推，7、分别将土壤悬液制成10-

1、10-

2、10-

3、10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-

8、10-

9、10-10的土壤稀释液。

六、稀释涂布法分离土壤中放线菌

8、（1）倒平板

9、将配制好并且灭菌的高氏一号培养基加热融化，待冷却至55—60℃时，往高氏1号培养基中加入1ml的0.5%重铬酸钾, 然后分别倒平板。方法是在超净工作台，右手持盛培养基的三角烧瓶，置火焰旁

第 4 页 边，左手拿平皿并松动瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出。令三角瓶瓶口在火焰上灭菌，左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养液约15ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待冷凝后即成平板。共制备6个平板（一个稀释度做3个平行样品）。

10、（3）涂布平板

11、用1ml无菌吸管分别精确地吸取10-

4、10-

5、10-6的稀释菌液1ml，对号放入编好号的无菌培养皿中，每一浓度对应两个平板。用无菌涂布棒（从浓度小液开始）将加入平板培养基上的土壤稀释液在整个平板表面涂匀，涂完一个平板用酒精灯灭菌。

12、（4）倒置平板

13、将培养基平板倒置（防皿盖的冷凝水下滴），置于28度培养箱中培养3d14、15、5、放线菌的纯化

16、（1）倒平板

同上

17、（2）平板划线

18、将蘸有菌种的接种环在平板培养基上做以Z字行划线，每划完一次要充分燃烧接种环烧掉残余微生物，再从上一次划线处末点开始下一次划线。划线完毕后盖上培养皿盖，倒置与恒温箱中培养。

6、放线菌的观察玻璃纸法

19、将玻璃纸剪成培养皿大小，用旧报纸隔层叠好后灭菌。

第 5 页 20、将高氏一号琼脂培养基熔化后在火焰旁倒入无菌培养皿内，每皿倒15ml左右，待培养基凝固后，在无菌操作下用镊子将无菌玻璃纸履盖在琼脂平板上即制成玻璃纸琼脂平板培养基。

21、（3）用接种环挑取纯化后的放线菌，在玻璃纸上划线接种。

22、（4）将接种的玻璃纸琼脂平板置28—30℃下培养。

23、（5）在培养至3天，5天，7天时，从温室中取出平皿。在超净工作台上，打开培养皿，用无菌镊子将玻璃纸与培养基分离，用无菌剪刀取小片玻璃纸置于载玻片上用显微镜观察。

7、放线菌保藏

斜面低温保藏法

长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至 2—8 ℃的冰箱中保藏，保存 2—4 个月，移种一次。

将纯化培养后的放线菌接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生

第 6 页

第五篇：土壤肥料教案-实验一

实验一 土壤样品的采集与制备

一、实验目的

土壤样品的采集与制备是搞好土壤分析工作的一个重要环节，它关系到分析结果是否具有应用价值、是否准确以及由此得出的结论是否正确、可靠。

二、采集土壤样品的要求

1、样品具有代表性 避免特殊的采样部位，采样点分布要均匀、多点和随机，可采用蛇形采样法、对角线采样法和棋盘式采样法（P111 图实-1）。

2、采样深度 根据化验目的决定采样深度，一般采集耕层0~20CM的土样。

3、采样时间 根据化验目的决定采样时间。如果调查随时出现的问题，可随时采样；为了制定施肥计划而测土，必须在收获后、施基肥前进行采样。

4、采土工具 可用土钻或小铲进行采土，土钻垂直入土20CM处；用小铲采土，要先挖成一铲宽、20CM深的小土坑，然后从垂直面铲取一铲宽、1CM厚的土壤即可（P112图实—2）。

5、样品数量 可反复用四分法去掉过多的土样，最后减少至0.5~1KG（P112图—3）。

三、仪器用具

取土铲、塑料布、土壤袋、土壤筛、圆木滚、广口瓶、盛土盘、标签、铅笔。

四、实验步骤

采样——物理分析——化学分析

五、注意事项

1、有些土壤成分需用新鲜土样，不能风干。

2、在过筛时，可借助研钵进行磨细。

3、如果要测定微量元素，在采样和处理过程中不能接触金属器具。

实验二 土壤质地的判别

一、实验目的

通过土壤质地可以了解土壤肥力状况，为提高土壤肥力和因土种植作物提供参考。生产上，土壤质地可以通过手测法进行测定。本实验目的要求掌握手测法测定土壤质地。

二、实验原理

土壤中的土粒有砂粒、粉粒和黏粒，土粒的大小、硬度、光泽、黏性等各不相同，根据手的感觉，可以大体上区分各级土粒的多少，进而判别出土壤质地类型。

三、仪器用具

木板、圆木棍等。

四、实验步骤

1、干测法

2、湿测法

五、注意事项

1、手测法主要用于田间快速判别土壤质地类型。

2、对于大批样品的测定，至少应选取10%的土样量于室内采用比重计法（黏度分布仪法）测定，以校正手测法较大的误差。

实验三 土壤含水量的测定

一、实验目的

土壤水分是土壤的重要组成部分，也是土壤的重要肥力因素。测定土壤含水量可作为播种、排灌、耕作、施肥的依据，对指导农业生产有重大的意义。本实验目的是要求掌握水分测定方法。

二、仪器用具与试剂

天平（感量0.01g、0.001g）、烘箱、干燥箱、称样皿、铝盒、小刀、量筒、滴管、无水酒精等。

三、实验方法

(一)烘干法

1、方法原理

2、操作步骤

⑴取有盖铝盒，洗净、烘干，在天平上称重（W1）。注意底、盖编号配套。⑵按要求用土钻取不同深度的土样，放入铝盒，取样量以约占铝盒体积的1/3为宜。立即将铝盒盖上，带回实验室称重（W2）。

⑶将铝盒盖打开后，放入烘箱中，在——温度下烘6h左右。

⑷关闭烘箱，盖上铝盒，放进干燥器中（干燥器内的干燥剂要经常更换或处理），待冷却至室温后称重。

⑸打开铝盒盖，放入烘箱中再烘2h，冷却，称重至恒重（W3）。

3、结果计算

（二）酒精燃烧测定法

1、方法原理

2、操作步骤

⑴用1/100天平称铝盒（带盖）质量（A）。

⑵用铝盒称土样5g左右，注意取样均匀，称重（B）。

⑶用量筒加酒精5ML于铝盒中，稍加振荡至均匀湿润，使土面平整。⑷点燃酒精（注意勿使火柴掉入土样中），使其自行燃烧，火焰烧尽前不宜翻拨，以免将土壤毛细管堵塞，反而降低蒸发速度。

⑸火焰熄灭后，再加入酒精2~3Ml继续燃烧，通常燃烧2~3次即可，烧至恒重为止。合盖冷却称重（C）。土样呈单粒松散即已干燥。

3、结果计算

四、注意事项

1、烘干法测含水量使用感量0.001g的分析天平称量。烘干温度不得超过——，温度过高易造成土壤有机质的碳化损失。

2、酒精燃烧法不能测有机质含量高的土壤样品，操作室要防止土样损失。

实验四 土壤容重的测定

一、实验目的

土壤容重能表明土壤松紧及孔隙状况，又可用来计算土壤孔隙度及单位面积一定深度的土壤质量，为计算土壤水分、养分、有机质等提供基础数据。通过实习使学生掌握测定土壤容重和计算孔隙度的基本方法。

二、实验原理 土壤容重是单位体积原状土壤（包括孔隙）的干土质量。因此，用已知体积的取土器“环刀”取土，烘干称重，即可计算出土壤容重。

三、仪器用具

土铲、小刀、天平（感量0.01g）、铝盒、酒精或烘箱、环刀。

四、实验步骤

1.取环在天平上称重。

2.选定待测地块，将环刀垂直压入待测土层中。环刀进入土层时不要左右摇动，以保持自然状态。3.用土铲挖开环刀周围土壤，并取出装满土的环刀，用小刀小心削平环刀上下端突出的土，使与环刀口相齐，并擦净环刀外面的土，带回室内。

4.把装满土的环刀在室内称总质量。减掉环刀本身质量即为湿土质量。5.用铝盒取土5~10g，放入烘箱烘干，或用酒精燃烧法测定含水量。

五、结果计算

六、注意事项

1.土壤容重测定也可将装满土壤的环刀直接于105℃±2℃的烘箱烘干。2.用小刀削平土面时，应防止切割过分或不足。

实验五 土壤含水量的测定

一、实验目的

通过实验，熟悉各种地形、地貌特征及其分布规律；初步掌握土壤剖面设置、挖掘和观察记载技术，并能对土壤生产特性进行初步评价。

二、实验原理

“地”是地表各种自然因素相互联系的一个整体。田间认地就是了解当地土壤、地形、地貌、地下水、地表水、植被和利用状况等。“土”是农业生产的基础。田间识土就是通过对土壤各种性状、利用状况、周边的环境条件、灌溉设施及有关的农业措施等的观察、记录和分析，制订土壤利用、改良和培肥的规划及措施。

三、实验用具与试剂

铁锹、土铲、土盒、钢卷尺、剖面刀、放大镜、布口袋（或塑料袋）、标签、铅笔、土壤剖面记载表、土壤硬度计、土壤标准比色卡、标本盒、10%稀盐酸溶液、水。

四、实验步骤

(一)田间认地

从山顶往下直到河边，可以观察到各种各样的“地”，如山坡地、岗坡地、交接洼地、四平地等。由于成因不同和发育时间不一，不同地理位置上，地形地貌、成土母质、水土流失、植被等情况有很大的差异。

(二)田间识土

1、土壤质地的手测法测定

2、记录土壤利用情况

3、灌溉设施和条件。

4、周边环境条件。

5、土壤剖面的挖掘、观察、记录和样品的采集等及对土壤性状的综合评价。(三)土壤剖面的观察记载

1、剖面点的选择和挖掘

土壤剖面点的设置一定要有代表性。剖面要设置在地形、母质、植被等因素一致的地段，一般选在地块的中央，要避免田边、地角、路旁、沟渠附近及粪堆上，应能够代表整个地块的情况。剖面坑的大小，一般为宽0.8~1.0m，长1.5~2m，宽1.0~1.5m。土层厚度不足1m则挖至母质层；地下水位高时，挖至地下水面或到达地下水位。

挖掘剖面时应注意：①剖面观察面要垂直向阳；②挖出的表土与底土要分别堆在土坑两侧，避免回填时打乱土层；③观察面的上方不得堆土和站人，保持观察面的自然状态；④坑的后方呈阶梯形，便于上下工作，并节省挖土量。

2、剖面的观察记载

（1）剖面层次的划分。耕作土壤大体分为耕作层、犁底层、心土层和底土层；水稻土划分为淹育层、渗育层、潴育层和潜育层。记载每个层次的厚度。

（2）土壤颜色。土壤颜色的命名采用复名法，有主次之分。描述时主色在后，副色在前，如灰棕色，即棕色为主，灰色为副。还可加上浅灰棕色。

（3）土壤质地。在野外鉴定土壤质地可用手测法。

（4）土壤结构。在各层分别掘出较大土块，于1m处落下，然后观察其结构体的外形、大小、硬度、颜色，并确定其结构名称。可分为粒状、团粒状、核状、块状、柱状、片状等。

（5）土壤紧实度。野外鉴定时可根据土钻（或竹筷）入土的难易进行大致划分。不如或稍加压力土钻即可入土，为疏；加压力时土钻能顺利入土，为松；土钻要用力才能入土，取出稍困难，为紧；需用大力土钻才能入土，取出很困难，为极紧。

（6）土壤干湿度。土壤干湿度是指土壤剖面中各土层的自然含水状况。土壤呈干土块或干土面，手试无凉意，用嘴吹时有尘土扬起，为干；手试有凉意，用嘴吹时无尘土扬起，为润；手试有明显潮湿感觉，可握成土团，但落地即散开，放在纸上能使纸变湿，为湿润；土样放在手中可使手湿润，能握成土团，但无水流出，为潮湿；土壤水分过饱和，用手握土块时有水分流出，为湿。

（7）新生体和侵入体。新生体是土壤形成过程中产生的物质，它不但反映出土壤形成过程的特点，而且对土壤的生产性能有很大的影响。土壤新生体常见的有砂姜、假菌丝体、锈纹锈斑、铁锰结核等。侵入体是指外界混入土壤中的物体，如石块、贝壳、砖瓦片、铁木屑、炉渣等，它反映了人为因素的影响适度。

（8）石灰性反应。用10%稀盐酸直接滴在土壤上，观察泡沫反应的有无、强弱。（9）酸碱度。用混合指示剂比色法测定。

（10）植物根系。土层中根系交织，4条／c㎡以上，为多量；根系适中，2~4条／c㎡，为中量；根系稀疏，只有1~2条／c㎡，为少量；没有根系，则为无。

五、注意事项

1、在野外工作一定要做好充分的物质准备。

2、挖掘面时尽可能减少对农作物的影响。

3、对于生产中的问题，要注重向当地的种植户请教

实验六 土壤有机质含量的测定

一、实验目的

土壤有机质是土壤的组分，是植物养分的重要来源，对改善土壤理化、生物性质起重要作用。因此测定土壤有机质含量是判断土壤肥力高低、培肥土壤的重要指标。

二、实验原理

在加热条件下，用过量的重铬酸钾—硫酸溶液氧化土壤有机碳，多余的重铬酸钾用硫酸亚铁按标准溶液滴定，以样品和空白消耗重铬酸钾的差值计算出有机碳量。

三、实验用具

油浴锅（高20~26cm，内装工业用固体石蜡）、硬质试管（18~25cm×200mm）、铁丝笼（与油浴锅配套，内有若干小格，每格可插入一支试管）、滴定管（10.00mL、25.00 mL）、温度计（300℃）、电炉1000W）。

四、试剂配置

1、重铬酸钾—硫酸溶液

2、重铬酸钾标准溶液3、0.2mol/L硫酸亚铁按标准溶液

4、邻菲啰啉

五、实验步骤

称取通过0.25mm孔径筛的风干土样0.05～0.5g（精确到0.00 01g，称样量根据有机质含量范围而定），放入硬质试管中，然后从滴定管准确加入10.00mL0.4mOl／L重铬酸钾—硫酸溶液，摇匀并在每个试管口插入一玻璃漏斗。将试管插入铁丝笼中，再将铁丝笼深入已在电炉上加热至185～190℃的油浴锅内，使管中的液面低于油面，要求放入后油浴温度下降至170～180℃，待试管中的溶液沸腾时开始计时，5min±0.5 min后将铁丝笼从油浴锅中提出（如果有试管夹预先住试管，铁丝笼没必要提出），冷却片刻，擦去试管外的油液。把试管内的消煮液及土壤残渣无损地转入250mL三角瓶中，用蒸馏水冲洗试管及小漏斗，洗液并入三角瓶中，使三角瓶内溶液的总体积控制在50～60mL。加3滴邻菲啰啉指示剂，用硫酸亚铵标准溶液滴定剩余的，溶液的变色过程是橙色—蓝色—棕红。

同时做空白实验，取大约0.2g灼烧过后浮石粉或土壤代替土样，其他步骤与土样测定相同。

六、结果计算

七、注意事项

1、测定土壤有机质必须采用风干样品。

2、如样品中含Cl较多，可加一定量（0.1g）的硫酸银消除部分干扰。

3、消煮时间对分析结果有较大影响，应尽量准确。

4、油浴锅应根据材质不同定期强制更换，以防止石蜡渗漏引发火灾。

5、消煮好的溶液颜色，一般影视橙黄色或黄中稍带绿色。

6、土壤样品处理过程中，应注意用静电吸附等方法跳出植物根、叶等有机残体。

7、在计算结果时，采用的是风干土样的质量。

实验七 土壤酸碱度的测定

一、实验目的

土壤酸碱度（pH）是土壤的基本性质，对植物生长及土壤理化、生物性质有很大影响。了解土壤酸碱反应，可以因土种植和进行土壤改良与培肥。

二、实验原理

采用电位法测定土壤pH，是将pH玻璃电极和甘汞电极（或复合电极）插入土壤悬液或浸出液中构成一原电池，测定其电动势值，再换算成pH。在酸度计上测定，经过标准溶液定值后可直接读取pH。水土比例对pH影响较大，尤其对于石灰性土壤稀释效应土壤除测定水浸土壤pH外，还应测定盐浸pH，即以1mOl／LKC1溶液浸取土壤H+后用电位法测定。本庆方法适用于各类土壤pH的测定。

三、实验用具

酸度计（精确到0.01pH单位,有温度补偿功能）、pH玻璃电极、饱和甘汞电极（或复合电极）、搅拌器。

四、试剂配制

1、去除CO2的蒸馏水 煮沸10min后加盖冷却，立即使用。

2、氧化钾溶液 称取74.6gKC1溶于800mL蒸馏水中,用稀氢氧化钾和稀盐酸调节溶液pH为5.5～6.0，稀释至1L。

3、pH4.01（25℃）标准缓冲溶液 称取径110～120℃烘干2～3h的邻苯二甲酸氢钾10.21g溶于蒸馏水，移入1L容量瓶中，用蒸馏水定容，贮于聚乙烯瓶。

4、pH6.87（25℃）标准缓冲溶液 称取经110～130℃烘干2～3h的磷酸氢二钠3.533g和磷酸二氢钾3.388g溶于蒸馏水，移入1L容量瓶中，用蒸馏水定容，贮于聚乙烯瓶。

5、pH6.87（25℃）标准缓冲溶液 称取经平衡处理的硼砂3.800g溶于无CO2的蒸馏水中，移入1L容量瓶中，用蒸馏水定容，贮于聚乙烯瓶。、硼砂的平衡处理是将硼砂放在盛有蔗糖和食盐饱和水溶液的干燥器内平衡两昼夜。

五、实验步骤

1、仪器校准

各种pH计和电位计的作用方法不尽一致,电极的处理和仪器的使用按仪器说明书进行。将待测液与标准冲溶液调到同一温度，并将温度补偿器调到该温度值。用标准缓冲溶液校正仪器时，先将电极插入与所测试样pH相差不超过2个pH单位的标准缓冲溶液，启动读数开关，调节定位器使读数刚好为标准液的pH，反复几次至读数稳定。取出电极洗净，用滤纸条吸干水分，再插入第二个标准缓冲溶液中，两标准液之间允许偏差0.1个pH单位，如超过则应检查仪器电极或标准液是否有问题。仪器校准无误后，方可用于样品测定。

2、土壤水浸液pH的测定 称取通过2mm孔径筛的风干土壤样品10.0g于50mL高型烧杯中，加25mL去CO2蒸馏水，以搅拌器搅拌1min，使土粒充分分散，放置30min后进行测定。将电极插入待测液中（注意玻璃电极球泡下部位于土液界面处，甘汞电极插入上部清液），轻轻摇动烧杯以除去电极上的水膜，促使其快速平衡，静置片刻，按下读数开关，待读数稳定（在5s内pH变化不超过0.02）时记下pH。放开读数开关，取出电极，以水洗涤，用滤纸条吸干水分后即可进行第二个样品的测定。每测5～6个样品后需用标准液检查定位。

3、土壤氯化钾盐浸提液pH的测定 当土壤水浸Ph〈7时，应测定土壤盐浸提液pH。测定方法除用1mOl／LKC1溶液代替去CO2蒸馏水以外，其他测定步骤与水浸pH测定相同。

六、注意事项

1、长时间存放不用的玻璃电极需要在蒸馏水中浸泡24h，使之活化后才能进行正常使用。暂时不用的可浸泡在蒸馏水中，长期不用时应干燥保存。甘汞电极腔内要充满饱和氯化钾溶液。玻璃电极的内电极与球泡之间、甘汞电极内电极和陶瓷芯之间不得有气泡。

2、标准缓冲溶液在室温下一般可保存1～2个月，在4℃冰箱中可延长保存期限。用过的标准缓冲溶液不要倒回原液中混存，发现浑浊、沉淀就不能再使用。

3、温度影响电极电位和水的电离平衡，温度补偿器、标准缓冲溶液、待测液温度要一致。标准缓冲溶液pH随温度稍有变化。

4、依照仪器使用说明书，至少使用两种pH标准缓冲溶液进行pH计的校正。

5、测定批量样品时，最好按土壤类型将pH相差大的样品分开测定，可避免因电极响应迟钝而造成的测定误差。

6、如果复合电极质量不稳定，会导致读数稳定时间延长，因此，测试期间应经常检查复合电极是否正常。

7、测量时土壤悬浮液的温度与标准缓冲溶液的温度之差不应超过1℃。

实验八 土壤碱解氮的测定

一、实验目的

土壤碱解氮也成为土壤有效氮，它包括无机铵态氮、硝态氮和土壤含氮有机物中交易分解的部分。土壤碱解氮含量可以反应近期内土壤氮素的供应状况，了解土壤肥力高低，作为指导合理施用氮肥的依据。

二、实验原理

旱地土壤由于硝态氮含量叫高，需加还原剂还原，再用1.8mol/L氢氧化钠溶液处理土样，在扩散皿中，土样于碱性条件下水解，使易水解氮经碱解转化为氨态氮，由硼酸溶液吸收，以标准酸滴定，计算有效氮含量。对于水稻土和经常淹水的土壤，由于硝态氮含量甚微，不需加还原剂，因此氢氧化钠溶液浓度采用1.2mol/L。本方法适用于各类土壤。

三、实验用具

恒温培养箱、扩散皿、半微量滴定管。

四、试剂配置

1、氢氧化钠溶液 称取72.0g氢氧化钠溶解于水，稀释至1L。

2、氢氧化钠溶液 称取48.0g氢氧化钠溶解于水，稀释至1L。

3、锌—硫酸亚铁还原剂 称取50.0g磨细并通过0.25mm孔径筛的硫酸亚铁及10.0锌粉混匀，保存于棕色瓶中。

4、碱性胶液。

5、盐酸标准溶液。

6、定氮混合指示剂。

7、硼酸溶液。

五、实验步骤

称取通过2mm孔径筛的风干土样2g和1g锌—硫酸亚铁还原剂，均匀平铺于扩散皿外室内。在扩散皿内室加入2mL 20g/L 硼酸溶液。在皿的外室边缘图上碱性胶液，盖上毛玻璃，旋转数次，使毛玻璃与皿边完全黏合，在慢慢转开毛玻璃的一边，使扩散皿外室露出一条狭缝，迅速加入10mL 1.8mol/L氢氧化钠溶液于扩散皿外室，立即将毛玻璃盖严。

水平地轻轻转动扩散皿，使氢氧化钠溶液与土样充分混合，然后小心地用橡皮筋两根交叉成十字形圈紧，使毛玻璃固定。放在恒温培养箱中于40℃保温24h±0.5h。将扩散皿取出，用0.01mol/L盐酸标准溶液滴定内室硼酸中吸收的氨量，颜色由蓝色刚变紫红色即达终点。滴定时应用细玻璃棒搅动内室溶液，不宜摇动扩散皿，以免溢出。

六、七、结果计算 注意事项

1、由于碱性胶液的碱性很强，在涂胶液和恒温扩散时，必须特别细心，谨慎污染内室。

2、据最新研究表明，土壤有效氮素含量指标与植物实际需要的相关性并不是很强。

实验九 土壤速效磷的测定

一、实验目的

土壤速效磷含量是判断近期内土壤磷素供应能力的一项重要指标，可作为合理分配和施用磷肥的依据之一。

二、实验原理

碳酸氢钠溶液除可提取水溶性磷外，也可以抑制钙离子Ca2+的活性，使一定量活性较大的Ca-P盐类中的磷被浸出，也可使一定量的活性Fe-P和Al-P盐类中的磷通过水解作用而浸出。由于浸出液中Ca、Fe、Al浓度较低，不会产生磷的再沉淀。浸提取液中的磷，在一定酸度下用钼锑抗还原显色成磷钼蓝，蓝色的深浅在一定浓度范围内与磷的浓度成正比，故可用比色法测定。土壤浸出的磷量与土液比、液温、振荡时间及方式有关。本方法严格规定土液比为1：20，浸提液温度为25℃±1℃，振荡提取时间为30min。

本方法适用于石灰性土壤；中性土壤及睡到土也可参照使用。

三、实验用具 恒温往复式振荡机或普通振荡机及恒温室、分光光度计或紫外——可见分光光度计、塑料瓶、无磷滤纸。

四、试剂配置

1、无磷活性碳粉

2、氢氧化钠溶液

3、碳酸氢钠浸提剂

4、酒石酸锑钾溶液

5、钼锑贮备液

6、钼锑抗显色剂

7、磷标准贮备液

8、磷标准溶液

五、实验步骤

称取通过2mm孔径筛的风干土样2.5g，置于200mL塑料瓶中，加入约1g无磷活性碳粉，加入25℃±1℃的碳酸氢钠浸提剂50.0.mL，摇匀，在25℃±1℃温度下，于振荡器上用180r/min±20r/min的频率振荡30min±1min，立即用无磷滤纸过滤于干燥的150ml三角瓶中。

吸取滤液10.0ml于25ml比色管中，加入显色剂5.0mL,慢慢摇动，排出CO2后加蒸馏水定容至刻度，充分摇匀。在室温高于20℃处放置30min，用空白溶液为参比，用1cm光径比色皿在波长700mm处比色，测量吸光度。

标准曲线绘制。

六、七、结果计算 注意事项

1、测定时也可采用波长880mm比色，浸提时可不加活性炭退色。

2、如果土壤速效磷含量高时，应减少浸提液的吸样量，并加浸提剂补足至10.0mL后显色，以保持显色时溶液的酸度，计算时按所取浸提液的分取倍数计算。

3、用NaHCO3溶液浸提速效磷时，温度影响较大，应严格控制浸提温度。

4、土样风干和贮存后，测定的速效磷含量可能有所改变，单一般无大影响。

5、对于酸性土壤，一般采用Bray法。

实验十 土壤速效钾的测定

一、实验目的

土壤速效钾包括土壤溶液中的钾和土壤胶体吸附的钾，是判断近期内土壤钾素供应能力的一项重要指标，作为指导合理施用钾肥的依据之一。

二、实验原理

以中性1mol/L已算铵溶液为浸提剂时，NH4+与土壤胶体表面的K+进行交换，连同水溶性钾一起进入溶液。浸出液中的钾直接用火焰光度计或院子吸收分光光度计测定。本方法适用于各类土壤速效钾含量的测定。

三、实验用具

往复式或旋转式振荡机、火焰光度计或原子吸收分光光度计、塑料瓶。

四、试剂配置

1、乙酸铵溶液

2、钾标准溶液

五、实验步骤

称取通过2mm孔径筛的风干土样5.00g,，置于200mL塑料瓶中，加入50.0mL乙酸铵溶液（土液比为1：10），盖紧瓶塞，摇匀，在15~25摄氏度下，150~180r/min振荡30min,干过滤。滤液直接在光焰光度计上测定或经适当稀释后用原子吸收分光光度计测定。同时做空白实验。

六、注意事项

1、含乙酸铵的钾标准溶液不能久放，以免长霉影响测定结果。

2、若样品含量过高需要稀释时，应采用乙酸铵浸剂稀释定容，以消除基体效应。