仪器分析课程教案

第一篇：仪器分析课程教案

第十二章 电解分析法和库仑分析法

一、基本要点：

1.熟悉法拉第电解定律；

2.掌握控制电位电解的基本原理； 3.理解控制电位库仑分析方法；

4.掌握恒电流库仑滴定的方法原理及应用。

二、学时安排：4学时

电解分析法包括两方面的内容：

1．利用外加电源电解试液后，直接称量在电极上析出的被测物质的重（质）量来进行分析，称为电重量分析法。2．将电解的方法用于元素的分离，称为电解分离法。

库伦分析法是利用外加电源电解试液，测量电解完全时所消耗的电量，并根据所消耗的电量来测量被测物质的含量。

第一节 电解分析的基本原理

一、电解现象

电解是一个借外部电源的作用来实现化学反应向着非自发方 向进行的过程。电解池的阴极为负极，它与外界电源的负极相连；阳极为正极，它与外界电源的

正极相连。

例如：在CuSO4溶液侵入两个铂电极，通过导线分别与电池的正极和负极相联。如果两极之间有足够的电压，那末在两

电极上就有电极反应发生。

阳极上有氧气放出，阴极上有金属铜析出。通过称量电极上析

出金属铜的重量来进行分析，这就是电重量法。

二、.分解电压与超电压

分解电压可以定义为:被电解的物质在两电极上产生迅速 的和连续不断的电极反应时所需的最小的外加电压。从理论上 讲，对于可逆过程来说，分解电压在数值上等于它本身所构成的 原电池的电动势，这个电动势称为反电动势。反电动势与分解电 压数值相等，符号相反。反电动势阻止电解作用的进行，只有当 外加电压达到能克服此反电动势时，电解才能进行。实际分解电 压并不等于（而是大于）反电动势，这首先是由于存在超电压之 故。

超电位（以符号η来表示）是指使电解已十分显著的速度 进行时，外加电压超过可逆电池电动势的值。超电压包括阳极超 电位和阴极超电位。对于电极来说，实际电位与它的可逆

电位之间的偏差称为超电位。在电解分析中，超电位是电 化学极化和浓差极化引起的，前者与电极过程的不可逆性有关。后者与离子到达电极表面的速度有关。超电位是电极极化的度

量。超电位的大小与很多因素有关，主要有以下几方面： 1．电极的种类及其表面状态； 2．析出物的形态； 3．电流 密度； 4．温度； 5．机械搅拌。

三、电解方程式

在电解过程中，外加电压(V),反电动势(E反)，电解电流(i)及电解池内阻(R)之间的关系可表示如下：

电解方程式是电化学分析法的基本定律之一。通过（1）可以计算出溶液电解所需的合理外加电压，以硫酸铜溶液为例，该电解池所需的外加电压为：

V = E反 + η+ iR = 0.91+0.72+0.05 =1.68V

四、两种电解过程

能斯特方程式有两方面的含义：

1．对于一定的氧化还原体系（即与还原态活度的比率决定电极电位。2．对于一定的氧化还原体系（即极表面氧化态与还原态活度的比率。

究竟哪一个起主导作用，这要看具体的电解过程。电解过 程有两种：控制电流电解过程和控制电位电解过程。在控制电流 电解过程中，外加电压一般较大，保证电极上总有化学反应不断 发生，电流强度基本保持不变。在控制电位电解过程中，调节 外加电压，工作电极的电位控制在某一定数值或某一小范围内，使被测离子在电极上析出，其它离子留在溶液中。第二节 电解分析法

一、.控制电流电解分析法 1．仪器装置

2．控制电流电解过程中的电位—时间曲线

电解过程中阴极电位与时间的关系曲线如图所示。

一定），电极表面氧化态

一定），电极电位决定电

电解一开始，阴极电位立即从较正的电位向负的方向变化，到电位达到的还原电位时，阴极电位符合能斯特方程式:

3．应用

用控制电流电解分析法测定的常见元素

控制电流电解法一般只适用于溶液中只含一种金属离子的情况。如果溶液中存在两种或两种以上的金属离子，且其还原电位相差不大，就不能用该法分离测定，所以选择性不高是该法的最大缺点。但这种方法可以分离电动序中氢以前和氢以后的金属。

二、控制阴极电位电解分析法

在控制阴极电位电解分析法中，调节外加电压是工作电极的电位控制在一定范围内或某一电位值，使被测离子在工作电极上析出，而其它离子还留在溶液中，从而达到分离和测定元素的目的。

1．装置2．阴极电位的选择

需要控制的电位值，通常是通过比较在分析实验条件下共存 离子的i-E曲线而确定的。从图中可以看出，要使甲离子还原，阴极电位须负于a，但要防止乙离子析出，阴极电位又须正与b，因此，阴极电位控制在a与b之间就可使甲离子定量析出而乙离 子仍留在溶液中。

3．控制电位电解过程中电流与时间的关系

在控制电位电解过程中，由于被测金属离子在阴极上不断还 原析出，所以电流随时间的增长而减小，最后达到恒定的最小值。由曲线图可知，电解电流随时间的增长以负指数关系衰减。阴极 电位虽然不变，但外加电压却随时间下降。因此，在控制阴极电 位电解过程中，需要不断的降低外加电压，同时电解电流也随时 间而逐渐减小。当电流趋于零时，说明电解已经完全。4．应用

控制阴极电位电解法的最大特点是它的选择性好，所以它的 用途较控制电流电解法广泛。只要阴极电位选择得当，可以使共 存金属离子依次先后在阴极上分别析出，实现分离或分别定量测 定。

第三节 电重量分析的实验条件 一．影响金属析出性质的因素 1．电流密度的影响 2．搅拌和加热的影响 3．酸度的影响

4．络合剂的影响

二、阴极干扰反应及其消除方法 溶解氧或氯的影响 阳极上的再氧化 Pt 阳极的溶解

第四节 库仑分析法基础

一、法拉第定律 法拉第定律包括两方面内容：

1．电流通过电解质溶液时，物质在电极上析出的质量与通过电解池的电量成正比，即与电流密度和通过电流的时间的乘积成正比。这是法拉第第一定律。

m ∝ Q

m ∝ i.t;Q = i.t

2．相同的电量通过各种不同的电解质溶液时，在电极上所获得的各种产物的质量与它们的摩尔质量成正比。这是法拉第第二定律。合并法拉第第一，第二定律可以得到

m = MB.i.t /F

式中，MB为电解产物的摩尔质量。MB /F 相当于通过1库伦电量使物质在电极上析出的质量。

二、电流效率

由法拉第电解定律可知，当物质以100%的电流效率进行电解反应时，那麽就可以通过测量进行电解反应所消耗的电量(库伦数)，求得电极上起反应的物质的量。所谓100%的电流效率，指电解时电极上只发生主反应，不发生副反应。影响电流效率的主要因素有：

溶剂的电极反应。

电解质中的杂质在电极上的反应

溶液中可溶性气体的电极反应

电极自身的反应

（5）电解产物的再反应

第五节 控制电位库仑分析法

原理和装置

控制电位库仑分析用控制电极电位的方法进行电解，并用库仑计或作图法来测定电解时所消耗的电量，由此计算出电极上起反应的被测物质的量。

测量电量的方法：

库仑计——氢氧气体库仑计的构造

它由一支带有活塞和两个铂电极的玻管同一支刻度管相连接，管中充以0.5mol/LK2SO4溶液。当有电流流过时，铂阴极上析出氢气，铂阳极上析出氧气，从右边管中电解前后液面差就可读出氢氧气体的总体积。在标准状况下，每库仑电量析出0.1739mL氢氧混合气体。根据法拉第定律，即可得到被测物质的量。

第六节 控制电流库仑分析法

一、基本原理和装置

1．.控制电流库仑分析基本原理

广义上说，控制电流库仑分析是指以恒定电流进行电解，测量电解完全时所消耗的时间，再由法拉第定律计算分析结果的分析方法。它可按下述两种类型进行：

(1)被测定物质直接在电极上起反应；

(2)在试液中加入大量物质，使此物质经电解反应后产生一种试剂，然后此试剂与被测物起反应。一般都按第二种类型进行。这种方法是在试液中加入适当的辅助剂后，以一定强度的恒定电流进行电解，由电极反应产生一种“滴定剂”。该滴定剂与被测物质发生定量反应。当被测物质作用完后，用适当的方法指示终点 8 并立即停止电解。由电解进行的时间t(s)及电流强度I(A)，可按法拉第定律计算被测物的量 2．仪器装置

二、指示终点的方法 1．.化学指示剂法

普通容量分析中所用的化学指示剂，均可用于库仑滴定法

中。例如，肼的测定，电解液中有肼和大量KBr，加入MO为指示剂，电极反应为：

电极上产生的Br2与溶液中的肼起反应：

NH2-NH2 + 2Br2 = N2 + 4HBr 过量的Br2使指示剂退色，指示终点，停止电解。2．电位法

利用库仑滴定法测定溶液中酸的浓度时，用玻璃电极和甘汞电极为检测终点电极，用pH计指示终点。此时用Pt电极为工作电极，银阳极为辅助电极。电极上的反应为：

由工作电极发生的反应使溶液中OH-产生了富余，作为滴定剂，使溶液中的酸度发生变化，用pH计上pH的突跃指示终点。

3．死停终点法

通常是在指示终点用的两只铂电极上加一小的恒电压，当达到终点时，由于试液中存在一对可逆电对（或原来一对可逆电对消失），此时铂指示电极的电流迅速发生变化，则表示终点到达。

三、库仑滴定的应用及特点

凡是与电解所产生的试剂能迅速而定量地反应的任何物质，均可用库仑滴定法测定。

表：库仑滴定应用实例

库仑滴定具有下列特点：

（1）不需要基准物质。

（2）不需要标准溶液。

（3）灵敏度高，适于微量和痕量分析。

（4）易于实现自动化和数字化，便于遥控分析。

第二篇：仪器分析课程感受

首先谈一谈我对学习这门课程的感受。上了研究生之后突然学习这么多仪器有些手忙脚乱，毕竟本科阶段研究内容是少的，多是老师传授，我们非主动的接受，数据分析自然也就没有接触。想到拿到课题之后就要进行实验，得数据，不由得硬着头皮对那些陌生的仪器开始关注起来。我不知道别的同学看到电子云，sp杂化这些术语有什么感受，我却是非常激动。因为让我回想起高中时为了参加化学竞赛，老师把我们带到合肥的168中学培训的那段时间。虽然只有一个多月，现在回想起来弥足珍贵。当时给我们上课的都是化学学术的大佬，在168中学那个会议厅似的大教室里给我们这些来自全国各地的半大孩子传输知识学问。自己那个时候还不晓得对知识饥渴的滋味，只是理解着尽力去听。台上的教授耐心讲解，娓娓道来，却也了解不少。现在在仪器分析这门课程中看到熟悉的面孔，仿佛看到了分别已久的老朋友。但是分别的时间太久，曾经是那么熟悉和了解取而代之的也只有生疏了。这不禁让我后悔，当年大好的资源摆在自己面前没有认真学习。不过现在有机会重温这些，并在接下来的研究生阶段中应用到自己的研究中，想想还是很开心的。这样学习起来也多了些许兴趣和信心。

我的研究方向是分子生物学，在实验中用到的仪器很多。和这门课相关的分析技术主要是高效液相色谱和紫外分析。下面对这两者的原理、用到的仪器和应用简单介绍下。

超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。因此其在蛋白质、多肽、代谢组学分析及其它一些生化领域里将会得到广泛应用。在提到“蛋白组学”或“代谢组学”时，与没有“组”的差别从分析的角度说就是样品量极大，需要在短时间分析成千上万的样品。UPLC不损失分离度的高速度优点在这里就能充分体现。多数生化样品及天然产物都十分复杂，在同样条件下，UPLC能分离的色谱峰比HPLC多出一倍还多。在同样条件下，UPLC的分辨率能够认出更多的色谱峰（质谱检测器-LCT）。

紫外分析仪是荧光技术的应用。荧光技术是某些物质受一定波长的光激发后，在极短时间内（10-8秒）会发射出波长大于激发波长的光，这种光称为荧光。这一发光现象在各方面的应用及有关的方法称为荧光技术。荧光技术在生物化学及分子生物学研究中应用主要包括以下几个方面：

1、物质的定性：不同的荧光物质有不同的激发光谱和发射光谱，因此可用荧光进行物质的鉴别。与吸收光谱法相比，荧光法具有更高的选择性。

2、定量测定：利用在较低浓度下荧光强度与样品浓度成正比这一关系可以定量分析样品中荧光组分的含量，常用于测定氨基酸、蛋白质、核酸的含量。

3、研究生物大分子的物理化学特性及其分子的结构和构象：荧光的激发光谱、发射光谱、量子产率和荧光寿命等参数不仅和分子内荧光发色基团的本身结构有关，而且还强烈地依赖于发色团周围的环境，即对周围环境十分敏感。利用此特点可通过测定上述有关荧光参数的变化来研究荧光发色团所在部位的微环境的特征及其变化。

4、利用荧光寿命、量子产率等参数可以研究生物大分子中的能量转移现象：通过该现象的研究，可以获得生物大分子内部的许多信息，如分子之间的相互作用、分子间结合的紧密程度、蛋白质、核酸分子的解聚程度等等。

由此，认真学习仪器分析这门课的相关内容会对我今后的研究有很大帮助。

最后谈一点我个人对这门课程的建议吧。仪器分析这门课的内容还是比较多的，学习起来也有一定的难度，需要认真对待。鉴于这门课庞杂的内容，其中涉及了许多化学，尤指有机化学的知识，我建议老师在上课的时候可以把一些简单的有机知识课前给我们讲解一点，每次课前一点点，或者推荐我们看一些有机教材，告诉我们哪些有机知识要自己温习理解，我想这样会更有助于之后图谱解析的。

第三篇：仪器分析课程学习心得

《仪器分析》学习心得

仪器分析是我们大学课程里的一门专业基础课，本着让我们在大学学习期间掌握有关仪器分析的一些常用方法的基础原理、特点和应用。通过老师的详细讲解，我认为这门课程对于我们将来参加科学研究或具体实际工作都是很有帮助的。通过学习，我也感触颇深，受益匪浅。

在老师讲的众多实验仪器中我对电感偶和等离子体（ICP）最为感兴趣，想法颇多。主要是因为，我现在跟随着唐老师做大学生创新实验——用吸附法处理含铬电镀废水，因此经常用到ICP，感觉ICP对我们的科研具有很大的帮助，方便我们测量分析实验结果，快捷方便。

1.1我简单讲一下，ICP的CP光谱议中等离子体焰的形成过程及原理。

ICP英文翻译过来是电感耦合等离子体，顾名思义，在炬管的切向方向引入高速氩气，氩气在炬管的外层形成高速旋流，通过类似真空检漏仪的装置产生的高频电火花使氩气电离出少量电子，形成一个沿炬管切线方向的电流.因为炬管放置在高频线圈内，通过高频发生器产生的高频振荡通过炬管线圈耦合到已被电离出少量电子的氩气上，使氩气中的这部分电子加速运动，撞击其他电子产生电离，形成雪崩效应,最终靠高频发生器连续提供能量，即可形成一个稳定的等离子体火焰。

样品气溶胶在ICP高温作用下经历了蒸发、原子化、电离、激发等过程。在听完课后，我感觉对这个过程还不是很清楚，我就上网搜索了相关ICP的自学资料来进一步学习。在学习后，我明白了这4个过程的具体内容。以ICP测量CaCl2样品为例，先通过去溶剂成盐粒，盐粒在高温下蒸发成气态，在通过离解成原子态，激发发射特征谱线测量。

1.2下面我大概讲一下ICP的样品前处理，测试参数的选取，标准曲线的绘制。

1.2.1样品前处理：样品在放入ICP前，应该经过分解。可以是采用酸溶、碱溶、灰化后酸溶和微波消解等。消解液可以是王水、KOH /NaOH、氢氟酸高氯酸组成的混合酸、王水与硫酸和磷酸组成的混合酸等。具体的消解可以看下面：。

1.2.2再进行测试参数的调整。主要调载气雾化压力、高频功率、辅助气、积分时间、蠕动泵速、进样量等参数。

1.2.3标准曲线的绘制。准确移取混合标准溶液，用5%稀硝酸配制标准溶液系列。标准曲线可以是标准曲线定量法、内标法及标准加入法。

1.3 ICP的优缺点。1.3.1优点：

（1）可以快速地同时进行多元素分析；（2）灵敏度较高，每毫升亚微克级；（3）基体效应低，较易建立分析方法；（4）标准曲线具有较宽的线性动态范围；（5）具有良好的精密度和重复性。1.3.2 缺点：

ICP测试测试存在着干扰效应，似有不足。包括一下四方面的干扰效应：

（1）物理干扰：样品溶液黏度、表面张力以及密度差异引起谱线强度的变化，主要表现为酸效应和盐效应；

（2）化学干扰：又称“ 溶剂蒸发效应”，是火焰光源经常发生的干扰效应；

（3）电离干扰：易电离元素进入ICP，推动电离平衡向中性原子移动，离子浓度降低，而原子浓度升高，谱线强度受到影响；（4）光谱干扰：比较常见，通常用干扰系数法来校正。特别是在我们学院买了一台ICP时，我们用铬溶液去调试，发现我们学院的ICP测的数据要略低于化院的数据。

在测量Cr我经过老师允许尝试的操作了ICP，发现要将我们现在所学的仪器分析知识运用于实际的测试操作中，这个差距还是很大的。但是想在实际操作中顺利操作，必须打好理论基础，不然我会损坏仪器，更不能准确的测量。

1.4最后，我想针对这门课程，想向老师谈谈对这门课的看法。老师您在详细讲解仪器分析的理论知识后，可以带着我们去学院5楼看看我们学院的液相色谱，气相色谱及刚进来的ICP。虽然我们自己也可以去5楼让实验室的老师给我们讲解，但是有老师专业的讲解，可能效果会好点。另外老师可以在课堂与我们互动点，多提点问题，多相互交流，那样上课的效果更好。

第四篇：仪器分析课程论文

色谱分析技术在植科专业相关实验和教学中的应用

2011—2012 学年第一学期

课程名称： 仪 器 分 析

班 级： 09级植物科学与技术（2）班

学 号：

学生姓名：

摘 要：本文通过对色谱分析的一些方法的简要分析和与我们植物保护学院植物科学与技术专业的联系来向大家论述相关知识和信息。我们专业有许多实验都要借助于色谱分析方法才能够圆满的完成相关实验。因此，色谱分析技术在我们专业能够得到很好的运用与发挥。同时也因为色谱分析方法的发展才引领了科技的进步，进而取得了一系列的科技成果。

关键词：色谱；实验；化学；应用

正 文：

一、色谱分析法的起源、分类及其原理

1、色谱分析法的起源[1]

色谱法起源于20世纪初，1906年俄国植物学家米哈伊尔·茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。由于这一实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为Хроматография，这个单词最终被英语等拼音语言接受，成为色谱法的名称。汉语中的色谱也是对这个单词的意译。

2、色谱分析法的分类[2]

色谱分析法根据流动性的性质可以分为：气相色谱分析法和高效液相色谱分析法两种。气相色谱分析法具有高分离效能、高检测性能、分析时间快等优点，因此应用比较广泛。而高效液相色谱分析法也因其高效、快速而得以广泛应用。根据物质的分离机制，又可以分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等类别。

3、色谱分析法的简单原理[3] 色谱分析法是一种利用混合物中诸组分在两相间的分配原理以获得分离的方法。其过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。

二、色谱分析法在相关学习实验中的应用

1、植物生理学相关实验

（1）、叶绿素的提取与分离实验 先从菠菜叶片中，用有机溶剂将叶片中的色素提

[4]取出来；然后利用纸层析，在圆形的滤纸中心用毛细管进行点样（少量多次，尽量均匀，形状规则）；再以汽油做扩散剂将叶绿素进行扩散，进而得到叶片内色素的主要成份。此试验应用的纸层析法是色谱分析法的一种较常用的方法，不仅见效快、成本低、现象明显、重复性强，而且易于操作，适合于教学研究和学生实验，同时也有利于色谱分析法的发展。

[5]（2）、植物组织呼吸强度及呼吸商的测定的实验 用直径4mm和2000mm的色谱柱装上担体。采用热导检测器[6] 检测，柱温为60℃，进样器温为40℃，以氦气为载气，气体流速为20ml/min；再用微量注射器分别抽取不同量的纯O2和纯CO2，注入气相色谱仪中，并记录O2和CO2出峰时间和不同量的峰值。进而描绘出进样量中O2和CO2的绝对量和峰值的标准曲线。然后运用相关知识计算植物组织呼吸强度及呼吸商的测定的实验。

2、分子生物学相关实验

[7](1)、糖蛋白的分离和纯化实验 糖蛋白是存在与植物体内的一种大分子化合物，本实验主要运用三种色谱柱（Sepharose CL－6B、S－Sepharose、SynChropak RP－PC16）依次进行分离和纯化。首先，使用Sepharose CL－6B色谱柱进行初步的分离，然后再将流出液通过S－Sepharose色谱柱进行初步的纯化，使得样品中的各组分的分离更彻底，最后用SynChropak RP－PC16色谱柱进行最终的纯化，最后将吸附柱上的大分子洗脱出来，一般用0.1%TFA和65%乙腈进行脱洗28分钟即可得到纯品。

3、生物化学相关实验

[8]（1）、检验莨菪碱和东莨菪碱的分离效果实验 用碱性氧化铝作为吸附剂，撤在玻板上，然后路套有调节荡层厚度的塑料环的破棒置于玻板一端，用手推至另一线即可。然后，用样品进行点样，接着用有一定倾斜度的薄层色谱进行展开；最后对其进行显色，用改良德氏试剂喷雾显色。显色剂用小型喷雾器喷出，雾点要小，与薄层保持一差距离，或可在展开剂尚未蒸干以前喷雾显色，以免将薄层表面吹坏。如果分离效果好，则显色后共显现两个斑点，莨菪碱及东莨菪碱各显一个斑点。

[9]（2）、从绿色叶片中制备线粒体实验 试验前供拭材料放在暗处2—3天，取材前再给光照I一3小时，这种暗处理消除了细胞中大量淀粉，有利于相系统中的分配行为。试验材料为生长健壮的嫩叶片。首先将较大的叶脉除去，然后取100g叶片、洗净、剪碎加200m1冷的A液。在4℃下于组织捣碎机中高速匀浆2次，每次5—7秒钟。8层妙布过滤。滤液以600xg离心10分钟。上清液再以11000xg离心10分钟．沉淀悬浮于B液，并用B液洗2次。用11000xg离心l0分钟收集沉淀。此即线粒体的粗制品。

线粒体的纯化是在Dextran—PEG相[10] 系统中进行的。相系统的成分为：6.1％DextranT500，6.1％PEG、2mMKCl、0.3M蔗糖和5mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)。新制备的相系统，放置约1小时就可以形成明显的上下两相。此时Dextran分布在下相，PEG在上相。取5m1上相液悬浮线粒体粗制品。再加入4ml下相液，充分混合后，用600xg离心3—4分钟。此时大部分叶绿体颗粒及色素分配到上相，所以上相为绿色。尤其在上层的界面处分布着大量叶绿体颗粒。而在下相液中游离色素和叶绿体颗粒很少，几乎为白色透明液体。在下相液的界面处分布着大量的线粒体。小心地吸出绿色的上相液。注意不要破坏它的界面，以免把线粒体带出。然后再加入5m1新的上相液，与下相液充分混合后，依照以上步骤，重复分配2次。最后用7倍体积的B液稀释含线粒体的下相液，并用500xg离心3分钟，上清液再以11000xg离心10分钟收集沉淀，此即纯化的线粒体。

4、植物化学相关实验

[11]（1）、从番茄中提取番茄红素和β—胡萝卜素首先，将新鲜番茄洗净，捣碎成浆状后，称取15g左右放人烧瓶中，添加20ml 95％乙醇，热水浴回流5分钟，温度不应高于85℃，趁热过滤，滤渣转移至烧瓶备用；然后，向烧瓶中加人20ml二氯甲烷，热水浴回流7分钟（温度应低于55℃）,冷却，过滤，滤渣转移回烧瓶，再添加10ml二氯甲烷，重复操作,合并乙醇和两次二氯甲烷的提取液，倒入分液漏斗中，添加5ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置,分出有机相，用无水硫酸钠干燥,过滤，将滤液蒸馏以回收大部分溶剂，所剩溶液继续在通风橱内水浴蒸干备用；最后，用氧化铝装柱，石油醚洗脱。开始之前，应将自制的有色物料平铺在氧化铝上，用滴管添加少许石油醚后，打开活塞，放出石油醚，直至与柱顶平齐。黄带（β一胡萝卜素）移动快，红带（番茄红素）移动慢。待黄带完全从柱上洗去后，换用氯仿继续洗脱红带。将两份洗脱液在通风橱内水浴蒸干，得到的就是两种较纯的色素。

[12]（2）、槲皮素与金雀异黄素的分离与提纯实验 槲皮素(quercetin)、金雀异黄素(genistein)同属于黄酮类化合物，具有广泛的抗肿瘤、抗血小板、抗氧化等药理作用[13～14]。首先，精确配制SDS浓度为0.0081，0.01，0.02，0.03，0.04，0.05mol·L-1的水溶液作为展开剂(0.0081mol·L-1为SDS的CMC)进行实验，并在一定浓度下依次分别加入体积分数为2%，4%，6%，8%的甲醇、异丙醇、正戊醇、正丁醇、冰乙酸。新华三号滤纸切割成2.5cm×12cm的纸条，毛细管点样。药品溶解在甲醇中，展开前层析缸密闭，以展开剂蒸气饱和1h，上行法展开约10cm左右。点样量：Q，Q1，Q2均为0.5μl，而G，G1，G2则均为2μl(因G，G1，G2的检出灵敏度较低)。然后，以10g·L-1FeCl3溶液喷洒后，各药品点显紫黑色，以初步鉴定样品酚型结构的存在。在365nm的紫外光照射下，对原始样品点、非SDS溶液展开并经50g·L-1AlCl3甲醇溶液喷洒的样品迁移点、SDS胶束水溶液展开并经50g·L-1AlCl3甲醇溶液喷洒的样品迁移点,3种不同情况下的荧光表现进行比较。

三、现代色谱分析法的应用

近年来，有越来越多的色谱分析成果问世，比如：多孔性聚合物填料在高效液相色谱中的应用、高速逆流色谱技术在植物特殊化学成分研究方面的应用、智能色谱的诞生及其应用以及超临界流体色谱的迅猛发展等等。这些都极大的促进了当今世界科技的快速发展，反过来快速发展的科技又给色谱分析技术的发展提供的动力。这种“双赢”的局面正迎合了这个信息高速传播、生活娱乐节奏加快的当今世界，是一个良好的循环发展系统。相信色谱分析技术必定能够更好更快的发展。

参考文献： [1].王瑞芬.现代色谱分析法的应用.北京：冶金工业出版社,2006 [2].敖潇潇.分析化学中的色谱法分类.河南：河南科技杂志,2011 [3].李艳红.分析化学.北京:石油工业出版社,2008

[4].陈建勋.植物生理学实验指导.广州：华南理工大学科技出版社,2002 [5].李合生.植物生理生化实验原理和技术.北京：高等教育出版社,2000 [6].杜斌.实用现代色谱技术.河南：郑州大学出版社,2009

[7].师治贤.生物大分子的液相色谱分离和制备.北京：科学出版社,1996 [8].张志良.植物生物化学技术和方法.北京：农业出版社,1986

[9].B.L.威廉斯，K威尔逊编.实用生物化学原理和技术.北京：科学出版社,1979

[10].郅文波,邓秋云,宋江楠等.高速逆流双水相色谱法纯化卵白蛋白.生物工程学报,2005 [11].陈亚.有机化学实验.昆明:云南科技出版社,2004 [12].刘文,邓亦峰,梁念慈.槲皮素和金雀异黄素硫酸酯合成方法的改进及其HPLC-MS的鉴定.中药材JOURNAL OF CHINESE MEDICINAL MATERIALS,2008

[13].Ioku K,Tsushida T,Takei et al.Antioxidative avtivity of quercetin and quercetin monoglucoside in solution and phospholipid bilayers.Biochim Biophys Acta,1995,1234(4):99.[14].Barnes S,Peterson TG.Biochemical targets of the isoflavone genistein in tumor cell lines.The Society for Experimental Biology and Medicine,1995,208:103.

第五篇：仪器分析教案

第三节 高效液相色谱法的主要类型及其分离原理

【教学目标】

1.掌握液-液分配色谱法及化学键合相色谱法的分离原理，分配系数、固定相的类型和特点 2.熟悉高效液相色谱法的主要类型 3.熟悉高效液相色谱法的主要类型

4.了解各类高效液相色谱法的特点及应用 【教学重点】

液-液分配色谱法及化学键合相色谱法；分离原理；分配系数 【教学难点】

分配系数；分配系数与组分流出顺序的关系 【复习题】

1.气相色谱法有哪几种类型？各类气相色谱法的固定相与流动相的类型是什么？ 2.各类气相色谱法的分离原理是什么？ 3.分配系数的定义是什么？意义是什么？

【讲授新课】

与气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是固定液、吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。

根据其分离原理不同，高效液相色谱法可分为几种类型：

一． 液-液分配色谱法及化学键合相色谱法

（一）液-液分配色谱法

1.固定相：将液体固定液涂渍在担体上作为固定相。

流动相：液体。

且要求，流动相液体与固定相液体互不相溶。

2．分离原理：溶解——溶解分配平衡过程（组分溶解在固定相中—组分溶解在流动相中），类似于液液萃取机理。

溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

3.分配系数：

当样品中的被测定组分在固定相和流动相中达到动态平衡时，可以用分配系数来描述这个分配平衡过程：

其中，（1）分离的顺序决定于分配系数的大小：

固定相对某组分的溶解力大于溶剂对某组分的溶解力，K↑，后流出色谱柱 固定相对某组分的溶解力小于溶剂对某组分的溶解力，K↓，先流出色谱柱

（2）某色谱条件下，两组分分配系数差值为零，则代表两组分在该色谱条件下不能分离。4.分类：

正相液-液色谱法：固定相极性＞流动相极性，极性较小组分先出峰，极性较大组分后出峰 适于分离极性较强的物质

反相液-液色谱法：固定相极性＜流动相极性

极性较大组分先出峰，极性较小组分后出峰 适于分离非极性至中等极性的物质

（二）化学键合相色谱法：

（1）固定相：将固定液通过化学反应共价键合到担体（硅胶）表面作为固定相。

流动相：液体。

（2）分离原理：同液-液分配色谱法。（3）分配系数：同液-液分配色谱法。（4）分类：同液-液分配色谱法。

（三）液-液分配色谱法与化学键合相色谱法的对比

液-液分配色谱法 化学键合相色谱法 与担体结合方式 涂渍 共价键合

柱效对比 较低 较高

固定液是否流失 是 否

能否进行梯度洗脱 否 能

另外，化学键合固定相表面固定液一般多为单分子层，因此无液坑，液层薄，传质速度快；且有载样量大，化学性能稳定，重现性高，色谱柱寿命长等优点。目前已经逐渐取代了传统的液液分配色谱，成为液相色谱法中使用最广泛的方法。

二．液-固吸附色谱法

1.固定相：液固吸附色谱法的固定相是固体吸附剂。吸附剂是一些多孔的固体颗粒物质，在它的表面通常存在吸附中心点，可以有效地从气体或液体中吸附其中某些成分。流动相：液体

2.分离原理：吸附——吸附竞争平衡过程（组分吸附在固定相上—流动相吸附在固定相上）

流动相中的溶质分子X（流动相）被流动相S带入色谱柱后，在随流动相流动的过程中，发生如下交换反应：

其作用机制是被分离组分（溶质分子X）与流动相（溶剂分子S）争夺吸附剂表面吸附活性中心的结果（竞争吸附）。在这个过程中，交换能力较强的溶质分子会竞争得到更多的吸附中心点，从而在色谱柱中移动较慢，从而达到分离的目的。3.分配系数：

其中，（1）分离的顺序决定于分配系数的大小：

吸附剂对某组分的吸附力越强，K↑，后流出色谱柱 吸附剂对某组分的吸附力越弱，K↓，先流出色谱柱

（2）某色谱条件下，两组分分配系数差值为零，则代表两组分在该色谱条件下不能分离。

4.应用：

液固色谱法适用于分离分子量中等，能溶于有机溶剂的非离子性化合物，此外，液固色谱法对于分离具有不同官能团的结构相似的化合物、异构体有较高的选择性。

三．离子交换色谱法

1.固定相：是一种带电荷的官能团的固定基质，称为离子交换剂。为保证交换剂的电中性，基质上还存在带相反电荷的离子，称为反离子。

目前常用的三大类离子交换剂基质：合成树脂、纤维素、硅胶。流动相：具有一定pH和盐浓度的缓冲溶液

2.分离原理：吸附——吸附竞争平衡过程（反离子吸附在固定相上—组分离子吸附在固定相上）

在离子交换过程中，流动相中存在的被分析离子（M+）与树脂上吸附的反离子（Y-）之间发生竞争吸附，可用下列平衡表示：

阳离子交换： 阴离子交换：

被分离样品中不同离子对交换剂具有不同的亲和力，在发生竞争吸附时，不同的样品离子交换反离子的能力也不同。对交换剂亲和力较强的样品离子，交换反离子的能力较强，从而在色谱柱中迁移速度较慢，从而达到分离的目的。3.分配系数：

以阴离子交换平衡过程为例，分配系数：

其中，（1）分离的顺序决定于分配系数的大小：

溶质中某离子与离子交换剂的相互作用越强，K↑，后流出色谱柱 溶质中某离子与离子交换剂的相互作用越弱，K↓，先流出色谱柱

（2）某色谱条件下，两组分分配系数差值为零，则代表两组分在该色谱条件下不能分离。

4.应用：

离子交换色谱法特别适用于分离离子化合物、有机酸和有机碱等能电力的化合物和能与离子基团相互作用的化合物。它不仅广泛地应用于有机物质，而且广泛地应用于生物物质的分离，如氨基酸、核酸、蛋白质等生物分子，还能用于维生素的混合物、食品防腐剂、血清等的分离。5.分类：

阳离子交换色谱和阴离子交换色谱

【小结】

1． 固定相：

液-液分配色谱法 将液体固定液涂渍在担体上作为固定相

化学键合相色谱法 将固定液通过化学反应共价键合到担体（硅胶）表面作为固定相 液-固吸附色谱法 吸附剂 离子交换色谱法 离子交换剂 2．分离原理

液-液分配色谱法 溶解——溶解分配平衡过程（组分溶解在固定相中—组分溶解在流动相中）化学键合相色谱法 溶解——溶解分配平衡过程（组分溶解在固定相中—组分溶解在流动相中）液-固吸附色谱法 吸附——吸附竞争平衡过程（组分吸附在固定相上—流动相吸附在固定相上）离子交换色谱法 吸附——吸附竞争平衡过程（反离子吸附在固定相上—组分离子吸附在固定相上）3．各种色谱法的分配系数表示方法虽各不相同，但分配系数与组分流出顺序的关系均可表述为，组分K↑，后流出色谱柱；组分K↓，先流出色谱柱。

【作业】

课后习题 2、6、9。

第九节 高效液相色谱法在食品检测中的应用

【教学目标】

1.了解高效液相色谱法在食品检测中的具体应用实例

2.能够通过实例系统地了解之前所学关于高效液相色谱法的具体内容 3.了解食品高效液相色谱法前处理知识 【教学重点】

外标法定量的运用 【教学难点】

不同定量方法的运用 【复习题】

1.液相色谱法的主要定量方法包括哪几种？

【讲授新课】

5.动物源食品呋喃唑酮残留量的测定

呋喃唑酮（痢特灵）是一种抗菌效果非常好的广谱抗生素药物，曾被广泛应用于家禽、家畜、水产品中的疾病预防和治疗。近年的研究表明，呋喃唑酮及其代谢物具有致基因突变和致癌性。美国1993年禁止呋喃唑酮作为兽药，欧盟将其列为违禁药品，我国农业部第235号公告中也规定动物性食品中呋喃唑酮检出限为不得检出。

（一）原理：反相色谱法

（二）色谱条件：

固定相：C18柱

流动相：乙腈—磷酸溶液 检测器：Uv-vis检测器 检测波长：367nm 流速：1.0ml/min 进样量：20ul

（三）测定方法： 1．试样前处理：

固体试料破碎→混合→初分离→浓缩→再分离→过滤→供试样液

2．测定方法（外标法）：

（1）标准对照品溶液的配制与测定：精密称取呋喃唑酮标准对照品适量，配制成一定浓度的溶液Cs。在上述色谱条件下得到色谱流出曲线，呋喃唑酮的保留时间在4.5min附近，得到呋喃唑酮峰的峰面积As。

（2）样品溶液测定：试样溶液在上述色谱条件下分离得到试样的色谱流出曲线，得到试样中呋喃唑酮的峰面积Ax。

（3）外标法计算：利用下式即可计算的出样品中的呋喃唑酮含量

二．高效液相色谱测定保健食品中的黄芪甲苷

黄芪是多年生草本豆科植物，药用历史悠久、广泛。皂苷是黄芪中的主要有效成分之一，而黄芪皂苷以黄芪甲苷为主。黄芪甲苷具有增强机体免疫力、抗氧化、促进细胞生长，抑制内毒素等作用。所以在一些保健食品中，黄芪甲苷作为功能性添加剂成分有添加。例如，蜂胶黄芪软胶囊、虫草鸡精口服液。

（一）原理：反相色谱法

（二）色谱条件：

固定相：C18柱 流动相：乙腈—水

检测器：二极管阵列检测器 检测波长：227nm 流速0.8ml/min 进样量：10ul

（三）测定方法（外标法峰面积标准曲线法）： 1．试样前处理：

虫草鸡精口服液试样→浓缩→定容→过柱（大孔吸附树脂）→浓缩→过滤→供试样液 2．测定方法：

（1）标准对照品溶液的配制与测定：精密称取黄芪甲苷标准对照品适量，配制为浓度从低到高的一系列溶液C1……C5（5.0，10.0，20.0，40.0，50.0μg/mL）。在上述色谱条件下依次得到相应色谱流出曲线，并得到峰面积A1……A5。

（2）标准曲线的绘制：以峰面积A对浓度进行线性回归，得线性回归方程，即为标准曲线。

（3）样品溶液测定：在标准曲线的线性范围内，加载供试样液，得到样品色谱流出曲线，测量其中黄芪甲苷对应峰的峰面积。

将样品黄芪甲苷峰的峰面积带入线性回归方程，利用标准曲线法即可算出样品中的黄芪甲苷含量。

三．高效液相色谱法同时进行测定食品中安赛蜜、糖精、苯甲酸、山梨酸和咖啡因

食品添加剂若使用不当，添加过量，就会对人体产生毒副作用。

（一）原理：反相色谱法

（二）色谱条件：

固定相：C18柱

流动相：甲醇—柠檬酸铵 检测器：Uv-vis检测器 检测波长215nm 流速1.0ml/min 进样量20μL 柱温40℃

（三）测定方法： 1．试样前处理：

（1）乳状液体样品（果奶、冰淇淋等）：

试样→沉淀蛋白质→过滤、脱气→供试样液

（2）澄清液体样品（汽水、可乐等）：

试样→脱气→稀释→过滤→供试样液

（3）固状样品（肉制品、酱脆菜等）：

试样→捣碎→加入溶剂→沉淀蛋白质→过滤、脱气→供试样液

2．测定方法（外标法峰高标准曲线法）：

（1）标准溶液配制：使用流动相配制安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、咖啡因标准溶液（1mg/mL），将各标准液按照安赛蜜、糖精钠、苯甲酸、山梨酸、咖啡因比例依次为5.0、4.0、5.0、5.0、5.0μg/mL混合，得到混合标准溶液。将混合标准溶液用水稀释成6个浓度C1……C6

（2）确定成分峰位置：首先用各自的标准溶液稀释，在色谱条件下进行分析，定性确定每个峰对应的成分。

（3）标准曲线：在上述色谱条件下，6个浓度的混合标准溶液分别得到相应色谱流出曲线，并得到峰高h1……h6。以峰高h对含量进行线性回归，得各种标准物质的线性回归方程，即为标准曲线。

（4）样品溶液测定：在标准曲线的线性范围内，加载供试样液，得到每种样品的色谱流出曲线，测量其中添加剂对应峰的峰高。

将样品添加剂相关峰的峰高带入线性回归方程，利用标准曲线法即可算出样品中各种添加剂的含量。

四．反相高效液相色谱法测定巧克力中香兰素

香兰素是重要的食用香料之一，是食用调香剂，具有香荚兰豆香气及浓郁的奶香，是食品添加剂行业中不可缺少的重要原料，广泛运用在各种需要增加奶香气息的调香食品中，香兰素是国家允许添加的食品添加剂，按国标添加不会对身体造成伤害。但大剂量食用可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝肾等。

（一）原理：反相色谱法

（二）色谱条件：

固定相：C18柱 流动相：甲醇—水 检测器：Uv-vis检测器 检测波长：280nm 流速：1.0ml/min 进样量：10μL 柱温：35℃

（三）测定方法： 1．试样前处理：

巧克力样品→加水加温溶解→定容→离心取上层清液→过滤→供试样液

2．测定方法：

外标法峰面积标准曲线法定量

参见实验二．高效液相色谱测定保健食品中的黄芪甲苷中的标准曲线测定方法

【小结】

1．样品预处理：根据样品状态不同采用不同的预处理方法，再利用相似相溶粗提取要测的成分。2．分析实例中用的是反相色谱，其固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，极性小于流动相（乙腈-水；乙腈-磷酸盐；甲醇-水；甲醇-柠檬酸）。且分析的样品都是弱极性、中等极性的样品。3．含量测定：外标法（标准曲线法、峰面积法、峰高法）

【作业】

课后题 10。