第一篇：微生物实验室真菌检查质量控制流程
微生物实验室真菌检查质量控制流程
一、目的
规范微生物实验室管理程序，确保临床报告的质量。
二、适用范围
微生物实验室的各类真菌检测。
三、职责
实验室检验人员均必须熟知并遵守本程序。
四、程序
(一)临床样本的采集与处理
1.皮屑
边缘、疱壁、脓液、深层趾（指）间皮屑或活动边缘皮屑，取材前75%酒精消毒，作KOH涂片。
2.甲屑
用细挫或牙科磨钻取病甲与正常甲交界处并且贴近甲床部的甲屑，作KOH涂片。
3.毛发
取病发（变色，无光泽，弯曲，脆易折断，松动易拔除）15根，75%酒精消毒，3～5根作直接镜检。
4.脓液
无菌采集，注意颗粒，用无菌蒸馏水稀释后寻找。可作革兰染色，常规的KOH涂片。5.CSF
采集于无菌试管3～5ml，立即送检。置冰 箱不宜超过1h。离心后以无菌吸管吸取离心沉淀物1ml，作墨汁涂片镜检。
6.血液
无菌抽血3～5ml立即于无菌抗凝管中，BHIB:血标本量为培养基量的1/10，37℃5～7d出现浑浊或菌团，挑取镜检同时移种SDA（注：每天检查完毕后需摇动培养基，37℃震荡培养可加速真菌的生长，提高检出率。不作直接检查，因其直接检查阳性率低。
7.体液、痰液、尿液、粪便
①体液标本量10ml离心沉淀取2ml沉淀液做直接镜检培养。②晨痰3～5ml集于无菌瓶中(无菌生理盐水漱口数次后)，挑取黏液或脓性部分：KOH涂片培养。③早晨中段尿或清洁尿10ml，离心取沉淀液1ml做KOH涂片培养（SDA每管种0.5ml）。④拭子：一般尽量不用，缺点：A.不能得到足量的标本；B.采集的标本也不易从棉花纤维上分离下来;C.容易干竭。采集标本后应迅速放入内装1~2ml无菌蒸馏水的试管送检KOH涂片培养。⑤纸盒送检，挑取黏液、脓血、乳酪样部分KOH涂片培养（加抗生素）注：单纯培养阳性，不一定有临床意义，KOH涂片发现菌丝，有诊断意义。
8.组织：标本置无菌平皿中立即送检，置无菌匀浆器加2ml蒸馏水，研磨成浆或1～2mm的小块，KOH 涂片培养。
(二)涂片染色和直接镜检的质控
1.氢氧化钾/复方氢氧化钾法：标本置于载玻片上，加一滴浮载液，盖上盖玻片，放置片刻或微加热，即在火焰上快速通过2～3次，不应使其沸腾，以免结晶，然后轻压盖玻片，驱逐气泡并将标本压薄，用棉拭或吸水纸吸去周围溢液，置于显微镜下检查。检查时应遮去强光，先在低倍镜下检查有无菌丝和孢子，然后用高倍镜观察孢子和菌丝的形态、特征、位置、大小和排列等。
2.胶纸粘贴法：用1cm×1.5cm的透明双面胶带贴于取材部位数分钟后自取材部位揭下，撕去复带在上面的底板纸贴在载玻片上，使原贴在取材部位的一面暴露在上面，再进行革兰染色或过碘酸锡夫染色，在操作过程中应注意双向胶带粘贴在载玻片上时不可贴反，而且要充分展平，否则影响观察。
革兰染色检查法：在载玻片上滴1滴生理盐水，将所采集的标本均匀涂在载玻片上，自然干燥后，火焰固定或甲醇固定。再选择革兰染色方法，染色后，以油镜观察。
3.染液的质量控制
（1）革兰染液每次新配置和使用中每周一次进行质控，并进行记录。（2）氢氧化钾/复方氢氧化钾每周进行一次质控。(三)真菌鉴定质量保证
1.对酵母样真菌如念珠菌或隐球菌在常规临床细菌室已有较成熟的方法学，可用显色培养基。
2.常规鉴定丝状真菌主要依赖于其生长过程中形态变化和特点，所以要求从事丝状真菌检测的检验人员应作专业短期培训；任何实验室都应建立规范的涂片鉴定方法，要正确区分酵母样真菌或丝状真菌、毛霉菌和曲霉（有顶囊），对不常见的真菌不要轻易作为污染菌报告。(四)结果报告
1.药敏岗位检验人员综合真菌鉴定和药敏结果形成检验报告并签名，微生物实验室负责人或指定人按照相关抗菌药物试验标准操作规程核对药敏结果，尤其注意异常和少见结果。
2.告病人结果之前，应确定质控在可接受范围。3.经双人双核后的报告单交报告发放员分发到各病房或门诊病人，注意签收并记录。缺乏审核者得报告结果，应由微生物实验室负责人或指定人在 24 小时内进行评估。
4.血培养阳性涂片为真菌和脑脊液墨汁染色发现隐球菌的初步报告经核实后，按《三级报告程序》报告。5.完成分析后的微生物标本，检验人员应按照《检验后标本保存程序》安全保管标本和平板，要求有明确标识以备复查。3-5 日后，由废弃物处理岗位人员按照《废弃物处理程序》处理。
遇到来自临床或病人对检验结果的抱怨，应按照《投诉与抱怨处理程序》处理。
第二篇：微生物,真菌实验（范文模版）
青 岛 农 业 大 学
兽医微生物学课程论文
题 目：姓 名：学 院：专 业：班 级：学 号：指导教师：
病原真菌的分离鉴定
动物科技学院 动物医学
2014年月 13 日
病原真菌的分离鉴定
动医1205
李春成20121450 摘要：制作固体培养基，将A、B、D三种真菌接种到培养基和盖玻片上进行3-5d的培养（温度为28℃，观察真菌在固体培养基上的生长表现，在显微镜下观察小培养中的真菌形态，用美蓝染色液染酵母菌，进一步观察其形态。关键词：真菌；分离；形态；接种 引言：
真菌在自然界分布广、数量大、种类多。有些真菌可引起人和畜禽疾病，有些霉菌还产生毒素，直接或间接的危害人类和动物健康。了解真菌的培养方法，认识其形态十分重要。
真菌中的酵母菌是单细胞微生物，细胞核和细胞质有明显的分化，个体直径比真菌大10倍左右，多为圆形或卵圆形。酵母菌无性繁殖主要是出芽生殖，在特殊的情况下能形成假菌丝，有性繁殖是通过结合产生子囊孢子。用美蓝染色液制成水浸片，不仅可以观察其外形，还可以区分死活细胞。
霉菌的营养体是分支的丝状体，分为基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝又分化出繁殖菌丝，不同霉菌的繁殖菌丝可以形成不同的孢子。
霉菌的菌丝较大，细胞易收缩变形，且孢子容易飞散，所以指标本是常用乳酸石炭酸棉蓝染色液。此染色液制成霉菌标本片的特点是：细胞不变形，具有杀菌防腐作用，且不易干燥，能保持较长的时间，溶液本身呈蓝色，有一定的染色效果。
利用培养在玻璃纸上的霉菌作为观察材料，可以得到清晰、完整、保持自然状态的霉菌形态。
制作霉菌封闭标本，一般用石炭酸棉染色液封片，其中含有甘油，不易干燥，石炭酸有防腐作用，棉蓝有一定的染色作用，便于观察。1材料和方法 1.1材料
待鉴定的三种真菌A、B、D
1.1.1培养基 PDA培养基 1.1.2仪器
悬液、载玻片、盖玻片、无菌培养皿、湿盒，1mL无菌注射器、生理盐水、酒精灯等 1.2方法
1.2.1划线分离：将接种环经火焰灭菌冷却后，取待测的真菌，按照细菌的平板划线分离法进行平板划线，即用接种环从待测培养基上蘸取菌种在平板上划1/5-1/4，划毕灼烧灭菌接种环，待冷却后，于第二段处再做划线，且从第一段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第三段再做划线，且从第二段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。冷却后，于第四段再做划线，且从第三段处引线，划毕，灼烧灭菌接种环。
1.2.2小培养：用注射器吸取液体培养基于载玻片上，将接种环在火焰下灭菌，挑取待检菌放于液体培养基上，待液体培养基将要凝固，但仍有部分呈液体状时，盖上盖玻片，标记好菌种。
1.2.3酵母菌水浸片的制备：先取干净的载玻片滴上生理盐水1-2滴，将接种环在火焰下灭菌，挑取酵母菌少许，均匀涂在液滴中，再将美蓝染色液滴于载玻片上，染色2-3min后加盖玻片。（注意切勿产生气泡）然后低倍镜和高倍镜观察其细胞形态、芽殖方式。2.结果与分析 2.1观察三个培养基：A菌在固体培养基上菌落呈油脂状，表面光滑、湿润、粘稠，颜色呈黄色。B菌在固体培养基上菌落为毡状，颜色是绿色，具有典型的放射状皱纹。D菌在固体培养基上菌落密集，最初呈白色，孢子呈黑色。
2.2实验现象
2.2.1小培养形态鉴定现象
前三图均在40X下观察）
A菌体呈圆形、卵形或椭圆形，内有细胞核、液泡和颗粒体物质。光镜下可见细胞质所在范围及细胞壁的影子，高倍镜中可现细胞核。B菌菌丝呈无色，有分隔，其分生孢子梗经过多次分支，产生几轮对称或不对称的小梗，形如扫帚，称为扫帚体。D菌菌丝无隔，有匍匐菌丝和假根，假根着生处有直立向上孢子囊梗，其顶端彭大成孢子囊，孢子囊底部有半球形囊轴。
2.2.2美兰染色现象
显微镜下看到的是单细胞, 不形成菌落的真菌，无色细胞为活酵母菌细胞，蓝色细胞为已死的酵母菌细胞。
3.讨论
本次试验做的还可以，试验结果都能看到，现象比较明显，不过，显微镜聚焦不是很好，看的不是很清楚，现象也不太明显，在做小培养时充分发挥了团队合作精神，使得试验做的很快（因为做小培养时，液体培养基温度不那么高了，凝固时间很快），做美兰染色时，也很注意没有弄进气泡，不影响观察。4.结果
经以上试验可得出，A为酵母菌；B为青霉菌；D为根霉菌。
4.参考文献
兽医微生物实验教程
胡贵学
2006
第三篇：检验科微生物室室内质量控制流程
检验科微生物室室内质量控制流程
一、实验室仪器设备的性能维护
微生物室常用仪器设备主要包括：细菌培养箱、细菌鉴定及药敏测试仪、显微镜、高压灭菌器、冰箱、水浴箱等。这些仪器设备的质量维护对于检验结果的质量保证至关重要。性能维护方法及维护频率参照制造商提供的使用手册进行。如使用手册中未详细注明或实验室自身无法完成，由生产厂家协助解决，每年至少一次。
二、培养基的质量控制
要求对培养基进行两方面的质量控制：无菌试验以及已知菌生长试验。无菌试验一般为随机抽样3-5%，在35℃条件下培养48h，每批培养基至少进行一次无菌试验；已知菌生长试验的前提条件是实验室有足够的已知菌储备，其中包括标准菌株(如ATCC或NCTC标准菌株)及经过准确鉴定的临床分离菌。如果条件允许，提倡使用标准菌株。已知菌生长试验应明确预期结果。每批培养基至少进行一次已知菌生长试验。
三、细菌染色的质量控制
在临床细菌学检查过程中，革兰染色和抗酸染色使用频率最高。1．革兰染色IQC要求：利用标准菌株(金黄色葡萄球菌ATCC25923及大肠埃希菌ATCC25922)或其他已知的革兰阳性菌及革兰阴性菌至少每周进行一次质量验证。
2．抗酸染色：利用已知的抗酸杆菌(AFB)阳性涂片每周或在更新炭酸复红染液时至少进行一次质量验证。
四、细菌鉴定或鉴别常用试验的质量控制
细菌鉴定或鉴别试验的IQC就是利用已知菌或标准菌株(如ATCC或NCTC标准菌株)进行鉴定或鉴别试验相关影响因素的质量监控。应用频率较高的试验IQC每周至少一次，频率较低的试验IQC随标本一同进行。
五、微生物药物敏感试验的质量控制
临床常用抗微生物药物敏感试验包括一般β-内酰胺酶测试、超广
谱β-内酰胺酶(ELBLs)测试、纸片扩散法药敏试验以及定量药敏试验(即MICs测定法)。1．一般β-内酰胺酶测试的质量控制：至少每周一次。质控菌株可使用临床分离的已知菌株，但最好使用标准菌株，如淋病奈瑟菌ATCC31426(β-内酰胺酶阳性绿脓杆菌ATCC27853)和淋病奈瑟菌ATCC43069(β-内酰胺酶阴性或金黄色葡萄球菌ATCC25923)。
2．ESBLs测试的质量控制：美国临床实验室标准化协会(CLSI：原NCCLS)目前仅提供了肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌ESBLs的测试标准。其测试标准参照最新的CLSI文件。质量控制随临床测试菌株一同进行。
3．纸片扩散法及MIC测定法药敏试验的质量控制：质控试验条件、质控菌株选择及质控允许范围参照最新的CLSI规定。频率为每周至少一次。
4．某些耐药菌检测的质量控制：一些耐药菌株如高水平氨基糖苷类耐药的肠球菌、苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌以及万古霉素耐药的肠球菌等的IQC具体方法、质控菌株及质控预期结果参见最新的CLSI规定。质量控制随临床测试菌株一同进行。
第四篇：微生物实验室检查标准剖析
微生物实验室检查标准
1实验室建筑布局与流程安全、合理；实验区与办公区、生活区分开。实验区分清洁区、半污染区和污染区；人流、物流、信息流有效分隔。2 实验人员的办公区或生活区应当有饮水和休息的场所,有存放 私人物品的设施(衣橱)。3 实验区设有门禁系统。实验区入口处有警示语提示，如“特殊工作区,未经允许, 请勿 入内”;有生物危险警示标志，警示标志标明生物危险级别。5所有二级生物安全实验室入口处有生物危险标识、授权人员方可进入警示语、生物危险级别、危险因子、责任人、紧急联系电话等信息。6实验室入口处设有更衣区或挂衣装臵，个人便装与实验工作服分开放臵且有标识(使用与未使用的工作服也要分开放臵)。7实验室出口处有在黑暗中可辨认的照明或发光指示标志，紧急出口有区别于普通出口的标识，紧急发光疏散指示标识在黑暗中可辨认。8实验室按功能分区，各功能区标识清楚：采血区，样本接收区 和检测区明确分开。
9实验室门带锁，能自动关闭，有可视窗；在门上或其上方、左 右侧有实验室工作状态的文字或灯光讯号显示。
10应保障实验室的通风和换气，可采用自然通风，如采用机械通风，应定期监测空气流向和速度，应保证有不少于每小时3-4次 的通风换气次数；自然通风的实验室窗户应能打开，并有防节肢动物进入的纱窗，有防止啮齿类动物进入的相关措施。
11每间实验室靠近门口处设有洗手池，水龙头为感应式或采用肘 动，膝动，脚踏操作。将可能产生过多热量、烟雾、蒸汽、气味或有害物质的设备 与普通工作区隔离，并安装适当的排风罩。有可靠的电力供应和应急照明，能保证重要设备的不间断供 电。14 实验室内必须有足够的空间以满足安全操作、清洁、维护 的需要。15 实验室内有足够的储存空间来摆放随时使用的物品，以免实验台和走廊的混乱；在实验室的工作区外应有供长期使用的储存间。16实验室墙壁、天花板和地面平整、易于清洁、不渗水、耐腐蚀、不易附着灰尘、防静电；地面防滑，不得铺设地毯。
17实验室的采光或人工照明满足工作需要，无强光和反射光；室温可控制，应使工作人员感到舒适(16 ℃～28 ℃)；采取有效措施降低工作区的噪音(≤60 dB)。
18重点位臵应备有急救物品，显著位臵张贴医疗救助电话等信 息。19实验室有洗眼设施，必要时有应急喷淋装臵。
20实验台面光滑、不透水、耐腐蚀、耐热和易于清洁；实验台、架、设备的边角以圆弧过渡，不得有突出的尖角、锐边、沟槽；相互间保持一定距离，必要时采取防倾倒措施。
21合理设臵，摆放适宜的灭火器具，以及其他常用工具如锤子、扳 手、螺丝刀、梯子和绳子等。生物安全管理体系建设
22二级生物安全实验室，应按《辽宁省可感染人类病原微生物二级生物安全实验室备案管理规定（试行）》的规定办理备案手续，并将所开展的实验活动报受理备案的卫生行政部门备案后才可开展相应的实验活动。
23单位设有生物安全管理委员会，委员会成员由机构负责人、实验室管理者、安全员、感染控制人员、检验技术人员等相关人 员组成； 主要职责是：①制定本单位的生物安全政策和操作规范，审议实验室管理制度；②审查开展的实验项目是否符合本单位生物安全要求，对操作的生物因子进行危险度评估；③审查操作程序，监督检查相关政策、法律法规和规程的执行情况；④审查突发事故应急预案，对实验室安全事件进行风险评估，提出处理和改进意见；⑤监督工作人员的准入、培训与健康监护等；⑥其他有关生物安全管理的事宜。24实验实验室设立单位的法定代表人对本单位实验室生物安全负责，授权主管领导及实验室负责人具体负责实验室生物安全工作；实验室负责人是实验室生物安全第一责任人，负责制定安全制度和程序，实施实验室安全计划。安全计划应包括教育、培训、审核及评估等。25实验室任命一名有适当资质和经验的实验室安全员协助管理安全事宜，安全员应是生物安全管理委员会成员，有权阻止不安全活动。26生物安全管理委员成员应熟悉微生物风险评估的目的，确定防护等级，制定SOP，选择个体防护装备，防止感染，避免不必要 的恐 慌； 明确微生物生物风险评估包括的内容：生物因子的种类、来源、传染性、致病性、传播途径、在环境中的稳定性、感染剂量与浓度、预防和治疗等。
27生物安全政策、法律法规及标准收集齐全。包括(但不限于)：①《病原微生物实验室生物安全管理条例》；②《医疗废物管理条例》及《医疗卫生机构医疗废物管理办法》；③《实验室生物安全通用要求》；④《生物安全实验室建筑技术规范》；⑤《医 学实验室安全要求》；⑥《可感染人类的高致病性病原微生物菌(毒)种或样本运输管理规定》；⑦《人间传染的病原微生物名录》；⑧《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法》；⑨《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》；⑩ WHO《实验室生物安全手册》第三版(2004)。28编制有实验室生物安全手册。手册内容包括(但不限于)：①介绍实验室概况，描述生物安全质量方针、目标、编制手册目的、依据、使用范围，并对手册的发布，修订和更新做出规定；②实验室安全管理要求：包括管理体系及组织结构，各级管理人员和部门职责，实验室管理制度等；③实验室安全技术要求：包括风险评估，健康监护，安全计划审核检查，实验室事件报告，人员培训，个体防护，内务管理，安全工作行为，各种应急预案和应急程序，样本运送，废弃物处臵等；④具体检测项目的微生物风险评估报告，实验操作技术规程等。29建立有生物安全管理制度。包括(但不限于)：①准入制度；②设施/设备监测，检测和维护制度；③健康监护制度；④生物安全工作 自查制度；⑤实验室资料档案管理制度；⑥生物安全管理及实验人员的培训制度；⑦意外事件处理与报告制度；⑧实验室安全保卫制度；⑩ 实验室内务管理制度。
30实验室编制有操作规程和技术规范。至少包括： ①生物安全实验室操作规程；②针对感染性材料的实验操作规程；③仪器设备的使用规程；④个人防护用品的使用规范；⑤实验室消毒规程；⑥废弃物的生物安全处理规程；⑦尖锐器具的安全操作规程；⑧紧急情况处理规程及应急预案等；⑨生物安全柜操作规程；⑩移液管和移液辅助器使用规程；○11 离心机使用规程；○12 匀浆器、搅拌器和超声处理器使用规程；○13 样本分离操作规程等。
31实验室有生物安全管理体系运行记录。包括(但不限于)：①实验室安全记录；②实验原始记录；③设备条件监控及检测记录；④消毒记录；⑤事故(职业暴露)记录；⑥人员培训记录；⑦员工健康档案；⑧废弃物处理记录。
32实验室主任认真履行职责：①熟悉生物实验室安全防护知识和有关法律法规、标准、制度、规程；②负责实验室管理、实验技术和生物安全工作；③对在本实验室从事实验活动的人员进行生物安全培训；④对进入实验室的工作人员进行审核和授权；⑤监督法规和规程的执行，纠正违规行为并有权停止相关活动；⑥负 责实验室紧急情况及事故的处臵，并向生物安全委员会或主管领导报告；⑦制定规定和程序确保实验室设施、设备、个人防护设备、材料等符合国家有关安全要求；⑧定期检查、维护、更新以确保实验室设施、设备、个人 防护设备、材料等不降低其设计性能。
33实验室安全员应履行以下职责：①须熟悉实验室生物安全防护知识，负责实验室的安全检查； ②随时监督检查实验室技术规范和操作规程的落实情况；③发现不符合规定的行为或安全隐患，有权要求有关人员进行纠正；④对于发现的严重问题及时向实验室主任报告或直接向生物安全管理委员会报告；⑤负责向生物安全管理委员会提交所开展项目的“微生物风险评估报告”和“实验微生物操作规程”；⑥在获得批准后，负责项目相关实验按有关法规和操作规程执行；⑦项目结束后，应与实验室主任进行交接和记录。生物安全 管理 体系建设
34实验活动相关人员应进行上岗前培训。相关人员包括管理、技术、辅助人员及运输和清洁员；培训内容包括正确操作、工作及实验设施中潜在风险、消防知识、化学和放射安全、生物危险和 传染预防、急救知识等，保证所有员工掌握生物安全防护知识，实验技术规范，操作规程和相关技能，并经考核合格后，持证上岗，并有培训相关记录。
35对已取得上岗资格的工作人员，至少每2年应进行实验室生物 安全相关技术、法律法规、标准的培训，有培训记录。
36设臵实验室生物安全管理部门，配备专（兼）职管理人员，定期对实验室生物安全工作进行检查和监控；实验室定期组织生物安全自查，生物安全管理委员会每年至少组织一次生物安全检查，并有相关记录。37建立实验档案，记录实验活动情况和生物安全检查情况。对高致病性病原微生物实验活动的档案，其保存期不得少于20年。38在同一个实验室的同一个独立安全区内，只能同时从事一种高 致病性病原微生物的相关实验活动。从事高致病性菌(毒)种及样本的相关实验活动有2名以上工作人员共同进行。
39发生实验室感染或实验室工作人员出现与从事病原微生物实验活动相关的临床症状或感染体征时，应及时向单位报告，并派专人陪同就诊。
40实验室应建立健全生物安全事故应急预案，定期演习，并有记 录。41菌(毒)种及样本发生被盗、丢失、泄漏或人体感染等重大事故时，应采取必要的控制措施，并在2小时内报上级主管部门，同 时报所在地卫生行政部门；发生被盗、丢失、泄漏的还应及时向公安机关、环保部门报告。安全 设备 及个 体防 护
42实验仪器有状态标识(是否正常运行，负责人等信息)。43实验室所在建筑内或实验室内有高压蒸汽灭菌器(蒸汽能被回收)，每年定期检查和校验；并由经过培训的人员负责操作、维护和灭菌效果监测，有相关记录。
44实验室内配备有Ⅰ级或Ⅱ级生物安全柜，所有可能使致病微生物溅出或产生气溶胶的操作都必须在生物安全柜内进行，生物安全柜应定期检查和验证，需要时更换高效过滤装臵，有相关记录。45重要设备如培养箱、冰箱等要进行温度监测，并有记录。46离心机等设备机械性能处于良好状态，离心桶及转子定期检查，定期清除污染，建议使用螺旋盖的离心管或可密封的离心桶(安全杯)。
47实验室配有足够的与风险水平相应的洁净个体防护设备(如手套、防护服、实验用鞋、口罩、帽子和面部防护装备等)以及其他安全设备(如喷溅罩、移液辅助器、一次性接种环或接种环加热器、螺口盖瓶子或管子、微生物样本运送容器等)。个人防护防护设备和安全设备实验室工作人员能够正确使用。
48实验室内工作人员穿戴与操作相符合的个体防护用具(进入实 验室应穿防护服、工作时应戴口罩和帽子等)。
49操作感染性材料或接触污染容器要佩戴手套；手套使用前要进行气密性检查，手套用完后先消毒再摘除，随后洗手；接电话，开门或离开实验室时摘除手套。
50实验室内不得穿露脚趾的鞋，工作鞋为舒适、防滑、不渗液体 的平底鞋，当从事可能出现漏出的操作时可穿防水鞋。
51高速离心机或其他可能产生气溶胶的设备应臵于负压罩或其他排风装臵(通风橱、排气罩等)之中，并将其可能产生的气溶胶经高效过滤后排出。
52实验室应确保检测报告的生物无害性，宜采用电子通讯方式在清洁区打印，发放报告。在污染区出具的检测报告，需经消毒处理，达到生物安全后方可发出。菌毒种及样本管理 53菌(毒)种及样本必须有唯一性标识，并指定专人管理。54菌(毒)种及样本有严格的安全管理制度，内容包括菌(毒)种及样本的收集、运输、保藏、领用、开启、传代和销毁等。55菌(毒)种及样本的收集： 及时将收集、分离的有一定价值的菌(毒)种或样本及相关资料送专业实验室进行检测、鉴定、复核或保藏。56对引进或购买的病原微生物菌(毒)种或样本进行登记、检测、鉴定及复核。
57菌(毒)种及样本的运输：菌(毒)种或样本的运输需要三层包装系统，由内到外分别为主容器、辅助容器和外包装。①主容器必须防水、防漏，建议采用密闭，带螺旋盖的塑料容器，并贴上指示内容物的标签；②辅助容器为防水、防漏、结实及能密闭的塑料管或瓶，在主容器和辅助容器之间应填塞足量的吸收性材料；③在外包装内附有详细的检验申请单或样本、菌毒种信息单，在外包装外醒目位臵贴有生物危险标识。
58由艾滋病筛查实验室向确证实验室运送HIV标本时，标本一般为血清或血浆。运送应采用三级包装系统，第一层容器内装带盖的有HIV标本的试管，要求防渗漏；第二层容器保护第一层容器，要求耐受性好，防渗漏；第三层容器为外层包装，应易于消毒。在第三层容器外面要贴标签(数量、收、发件人)。HIV标本应由专人运送。59样本、培养物等在本建筑设施内传递时，采用两层包装，即主容器和运输容器；运输容器应为金属或塑料制品，可耐高压灭菌或耐受化学消毒剂作用，有容器盖，能密封不渗漏，容器需定期清毒；运输 时将主容器固定在架子上使装有标本的容器保持直立，并由专人运送。
60菌(毒)种及样本的保藏：有专人负责菌(毒)种及样本的保藏。61保藏的菌(毒)种及样本有详细的背景与实验资料和档案记录，出入库和存储有相关记录。
62保藏的菌(毒)种和样本应设立专册(卡)，详细记录名称、编号、来源、鉴定日期和结果、鉴定者、所用培养基、保藏的方法、传代次数等。
63有菌(毒)种的开启、复苏、鉴定、保存标准操作程序。64本单位领取和使用菌(毒)种及样本时要经实验室负责人批准，并有相关的使用和流向等记录。
65实验室应建立菌(毒)种和生物样本的销毁制度，销毁菌(毒)种和样本应经实验室负责人批准，必要时经单位负责人批准，并在专册(卡)上注销并注明原因、时间、方法、数量、经办人等。
66菌(毒)种及样本的销毁：按照感染废弃物处理方法进行销毁，有相关人员监督，有销毁及监督记录。感染 控制
67有实验室工作相关人员的免疫计划，并进行相应的免疫接种，有免疫接种记录。
68实验室有适当，有效的消毒设备(如喷雾器和甲醛熏蒸器等)，合理安装紫外线灯或三氧消毒机，定期维护和检测紫外线强度，有维护、强度检测和使用记录；实验室配备有有效的消毒液，有配制记录。69实验结束后对使用场所要清场，每天对实验室物表地、表和空气进行消毒，并有消毒记录。
70不得对任何利器剪、弯、折断；注射器双手重新戴套。71破碎或有缺口的玻璃器皿应丢弃而不重复使用、不能用手捡，应用毛刷、簸箕、镊子或夹子等器具，最好用塑料代替玻璃制品。72在工作区内不应配带戒指、耳环、腕表、手镯、项链和其他珠 宝，长发应束在脑后。
73发生感染性或潜在感染性物质溢出时，应立即用沙布或纸巾覆盖，在上面倒上消毒液，并作用适当时间(30分钟)，然后将沙布，纸巾及破碎物品移臵于废物盛装容器，随即用消毒液擦拭污染区域；并向实验室负责人报告，做好相关记录(时间、地点、溢出物、处理方法及效果)。
74对职业暴露进行正确处理和记录。实验室人员不得瞒报职业暴 露事件及安全隐患。医疗 废物处理
75每间实验室配有大小适宜，符合规范要求的医疗废物专用包装物和盛装容器，利器(包括针头、小刀、金属和玻璃等)应直接弃臵于利器盒或耐扎容器内，包装物和容器上有生物危险标识。76实验室废物产生地点有废物分类收集标识。
77感染性、病理性、损伤性医疗废物放入废物盛装容器后不得取出；医疗废物达到包装物和容器的四分之三时，应使用有效的封口方式封口，并及时从工作区运走。78从工作区运出的每个包装物和容器外表面应有警示标识，警示说明和中文标签，中文标签的内容包括：医疗废物产生单位、产 生日期、医疗废物类型(如感染性、损伤性、病理性、化学性、药物性和其它废物)以及需要的特殊说明等。
79包装物或容器的外表面被感染性废物污染时，应对被污染处进行消毒处理或增加一层包装；在操作、搬动或搬送医疗废物过程 中发现容器有破损、渗漏等情况，应立即采取重新封装等措施，并作相应的消毒处理。
80洁净的破损手套、口罩、帽子、隔离衣等废弃物，不得作为普 通生活垃圾遗弃，应与医疗废物一同处臵。
81实验室有废物处臵专职管理人员从事废物收集、运送、贮存、管理等；相关人员接受过法律法规、专业技术、安全防护以及紧急处理等知识的培训，考核合格后方可上岗，有培训及相关记录。82对从事废物收集运送、贮存的工作人员配备必要的个体防护用 品，定期进行健康体检及免疫接种。
83所有病原体的培养基、标本、菌种、毒种保存液、高致病性或潜在高致病性标本等在运出实验室之前应进行压力蒸汽灭菌或化学消毒处理后，再按感染性废物收集处理。84实验室污水须经无害化处理后排放。
85实验室有废物转运、交接记录，并保存登记记录。感染管理科
第五篇：真菌微生物的研究进展
论文题目：真菌微生物的研究进展
作者：华江涛 专业：生物化工工艺 班级： 生化1321 学号： 2013277102 指导老师：刘磊
2016年4 月12日
真菌微生物的研究进展
目录
第1章 传统微生物培养法.................................3 第2章 分子生物学方法...................................3 2．1基于PCＲ的克隆文库方法..........................3 2．2变性梯度凝胶电泳（DGGE）.........................3 2．3末端限制性长度多态性（T-ＲFLP）...................4 2．4实时荧光定量PCＲ..................................4 2．5荧光原位杂交（FISH）...............................4 2．6序列标签标记的高通量测序..........................4 第3章 宏基因组学技术（Metagenomics）.....................5 前景与展望........................................5 致谢......................................................6 参考文献..................................................6
摘要
真菌广泛存在于自然界，在生态系统中发挥着重要的作用。随着分子生物学技术在微生物多样性研究中的广泛应用以及宏基因组学技术的出现，打破了传统微生物培养法的局限性，人们对于真菌多样性的认识日渐提高。该文主要综述了研究真菌多样性方法的主要发展历程，介绍几种有关真菌多样性研究常用的分子生物学方法，包括基于PCＲ的克隆文库方法、变性梯度凝胶电泳、末端限制性长度多态性、实时荧光定量PCＲ、荧光原位杂交、序列标签标记的高通量测序以及宏基因组技术，并且阐述宏基因组学技术在此领域蕴含的巨大发展潜力
关键词
真菌；多样性；研究方法 Abstract Fungiwidelyexistsinnatureplayinganimportantroleintheecosystem．Thepervasiveapplicationofmolecularbiol-ogytechnologyinmicrobialdiversityandtheemergenceofmetagenomicbreakedthelimitationsoftraditionalmicrobialculturemeth-odsothatimprovethehumansrecognitionoffungaldiversity．ThispaperreviewedthemaindevelopmentcourseofstudyingfungaldiversityapproachesintroducedseveralcommonlyusedmethodsofmolecularbiologyonfungaldiversityresearchmainlyincludingclonelibraryPCＲbased，DenaturinggradientgelelectrophoresisTerminalrestrictionfragmentlengthpolymorphismeal-timeflu-orescentquantitativePCFluorescenceinsituhybridizationandbarcodedpyrosequencingndexpoundedthehugepotentialofmetagenomicsinthisfield．
Keyword fungi；diversity；method 正文
自然界中的微生物分布广、种类多、资源极其丰富，主要包括细菌、病毒、真菌等。迄今人们已发现的微生物物种仅为自然界中微生物总数的1%～10%［1］。微生物群落多样性是环境微生物多样性研究的核心内容。目前微生物多样性研究多局限于细菌，而对真菌的研究相对较少。研究真菌群落多样性可以了解真菌群落结构、真菌的种类和数量分布特点，并且可以进一步为控制和优化真菌群落结构提供参考，同时也是研究微生物群落多样性的重要内容。真菌遍布于自然界，据估计约有数百万种，已发现的仅9万余种，已发现的导致人类疾病的仅约400种。人类也生活在真菌包围的环境中，日常工作、生活中所接触到的真菌种类目 前的认知。因此，不论是自然环境还是人体都具有较高的真菌多样性。真菌多样性的研究方法很多，从国内外目前采用的方法来看，大致上可分为：传统的微生物培养法、分子生物学方法以及宏基因组学技术。随着现代科学技术的发展，越来越多的新技术、新方法用于真菌多样性领域的研究，使人们对真菌多样性的认识更加全面深入。
1传统微生物培养法
从传统上讲，真菌多样性的研究主要利用分离培养及形态学检测的方法，该技术在实验室被广泛使用。尽管各种新的培养技术不断出现，但此方法费时费力，敏感度和特异性也较低，也不能反应全部的真菌群落信息。Amann等曾根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学研究结果认为：在自然界中，通过实验室人工培养方法已经被分离和描述的微生物物种数量仅占估计数量的1%～5%，而其余大多数微生物种群还仍然未被分离和认识，因此，人们不能利用传统的微生物培养技术获得真菌多样性的全部信息，极大的限制了研究的广泛性。在临床致病菌的鉴定方面，培养的方法更为常用。Ｒasi等利用培养法对从伊朗花斑糠疹患者皮肤上分离得到的马拉色酵母菌进行鉴定过程中，发现球形马拉色菌是最常分离到的菌种，大约占31．3%，其次是糠秕马拉色菌（20．5%）等。Findley等［7］通过微生物培养法从10个健康成人的14个部位的皮肤分离真菌，经鉴定11个刚体部位和胳膊表面的优势真菌是马拉色菌属，通过比较，脚底、脚趾甲和趾间具有较高的真菌多样性。
2分子生物学方法
鉴于分离培养技术的局限性，近年来，利用不依赖培养的方法分析和鉴定微生物群落多样性的实验越来越普遍。自从Pace提出将分子生物学方法用于微生物多样性研究，微生物分子生态学得到了长足的发展。分子生物学技术应用于微生物群落结构分析使得对环境样品中占大部分的不可培养微生物的研究成为了可能。目前，大多数用于分析微生物群落结构的方法是基于PCＲ扩增的。在分析微生物群落结构多样性时，rＲNA是目前应用最广泛的分子标记，它具有在功能上高度保守，其序列上的不同位置具有不同的变异速率，存在于所有的有机体（病毒除外）内等优点。对于细菌而言，16SrＲNA分析在实际应用中最为广泛，与细菌相比，使用真菌18SrDNA只能鉴定到属或科的水平。真菌的非编码rＲNA区域，如ITS区域（Inter-naltranscribedspacer），进化快速，序列上的变化更加广泛，因此提供了更多的分类信息，弥补了18SrＲNA的局限性。虽然如此，在实际研究内容中仍然要根据对分类等级的不同要求来选择合适的分子标记。分子生物学方法的应用使在遗传水平上研究微生物多样性成为了可能，该方法可归纳为三方面：①基于PCＲ技术的研究方法，这些方法是对样品直接提取DNA或者ＲNA，然后对特定基因设计引物进行PCＲ扩增，再利用不同的方法进行分析，（Fluorescenceinsituhybridization，FI可以对微生物在特定环境中的存在与否、分布模式及丰度等情况进行研究，具有较高的灵敏性和特异性。③基于DNA序列测定的研究方法，分析具体碱基序列的分布情况，通过与生物信息学结合，进行数据比较分析，如元基因组（Metagenome）测序技术，成为研究难培养微生物或不可培养微生物多样性的重要方法。
2．1基于PCＲ的克隆文库方法
基于PCＲ的克隆文库方法使对不可培养微生物的分析成为可能，Pace提出将PCＲ产物进行克隆后测序，大大提高了对微生物群落结构的认识，是使用较为广泛的一种方法。目前已有研究采用针对18SrDNA及ITS的克隆文库构建技术对肠道内真菌群落的多样性进行分析，研究结果表明人肠道真菌多样性比较低，主要以不同亚型的芽囊原虫属为主
2．2变性梯度凝胶电泳（DGGE）
DGGE最初是lerman等［12-13］发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。1993年，Muyzer等［14］首次将其用于微生物群落多样性的研究。DGGE普遍用于分析环境中细菌、真菌、病毒群落的生物多样性。Kim等利用PCＲ-DGGE技术分析了日本和中国发酵豆瓣酱中的细菌和真菌群落多样性，确定了米曲霉和鲁氏酵母的存在。We-erasekera等［16］通过PCＲ-DGGE方法研究人唾液中的酵母菌，在其中六个样品中鉴定出两种酵母菌，分别是白色念珠菌和杜氏假丝酵母，有力的证明利用DGGE技术研究口腔中的酵母菌是一种相对快速便捷的方法。
2．3末端限制性长度多态性（T-ＲFLP）
T-ＲFLP技术是在末端限制性片段长度多态性技术基础上发展起来的，依据rDNA序列的保守性和特异性，选择具有系统进化标记特征的序列作为目 的序列。T-ＲFLP技术灵敏度高，对于评估复杂环境样品的多样性和快速的比较不同生态系统的微生物群落结构和多样性是一种有力的工具。Curlevski等［17］使用T-ＲFLP方法研究了澳大利亚商业化混交林和单一种植南洋杉林场土壤真菌群落的不同，通过对真菌的ITS区域进行分析表明子囊菌门的丰度最高，其次是担子菌门和接合菌门，但在不同类型的林场中它们的相对丰度存在差异。
2．4实时荧光定量PCＲ
（qPCＲ技术于1996年由美国AppliedBiosys-tems公司推出，是将荧光能量传递技术（Fluores-cenceresonanceenergytransfer，FＲET）应用于PCＲ，实现了PCＲ从定性到定量的飞跃。qPCＲ技术目前已得到广泛应用。李晓然等在对汾酒发酵过程和汾酒酒曲制作过程中细菌和真菌多样性的研究中，利用qPCＲ技术对整个过程中的细菌和真菌进行了定量，发现在汾酒发酵过程中真菌的数量保持相对稳定，在酒曲制作过程中真菌的数量整体上呈下降趋势。Li等通过qPCＲ方法研究了老年人舌背的真菌多样性，表明老年人口腔中的真菌多样性极高，并不仅限于念珠菌属，其多样性与老年人的健康状态也具有密切的关系。
2．5荧光原位杂交（FISH）
比起费时费力且难以展现全部微生物群落信息的依赖于培养的方法和难以实现定量分析的多种依赖于PCＲ扩增的分子生物学方法，使用探针杂交来研究微生物群落多样性是一种更为快速的方法。荧光原位杂交是以荧光标记的寡核苷酸探针来探测生态系统中微生物细胞的一种技术，不仅能研究自然或人工环境中的微生物个体，并且可以对微生物群落进行评估。Lepère等使用酪胺信号放大技术与FISH结合的方法，用18SrDNA特异性的引物分析了湖水中的真核超微浮游生物的主要类群，获得了真核浮游微生物的定量结果。虽然分子生物学方法目前是阐述微生物多样性的强有力技术手段，并且在真菌多样性研究中具有传统培养法无法比拟的优势，但是基于PCＲ扩增的各种方法及FISH等方法仍然存在着多种弊端，例如引物的偏向性、PCＲ存在的其他系统偏差以及FISH方法中由于引物的不匹配造成对分析结果的错误估计等。在实际的研究中，通常将多种技术综合使用，以避免由于方法原理本身所带来的不可避免的偏差，可提供更加全面准确的微生物多样性变化的信息
2．6序列标签标记的高通量测序
随着测序技术的发展，被称为“第二代测序（next-generationsequencing［NGS］）”技术在过去几年中不断涌现。其特点是：高通量，低成本，可以同时对多个单独的DNA分子进行测序，这一改进比
起每条序列需要单独分析的Sanger法具有巨大的优势。第二代测序技术主要包括罗氏454公司的GS-FLX测序平台、Illumina公司的SolexaGenomeAnalyzer测序平台和ABI公司的Solid测序平台［25］。自从Hamady等建立了在不同的样品PCＲ引物上分别添加序列标签（barcode）来作为高通量测序后根据序列区分不同样品的标记，高通量测序技术越来越广泛地应用到微生物群落多样性的分析中。综合比较二代测序平台，在研究微生物多样性方面应用较广泛的是焦磷酸测序（Pyro-sequencing）。李晓然等［18］利用真菌ITS1的焦磷酸测序，研究了中国传统汾酒发酵过程中的真菌群落多样性，分析了在汾酒发酵过程中真菌的变化以及主要存在的真菌菌种，其中有60%的ITS序列属于酵母菌科，丰度最高的是东方伊萨酵母，其次为啤酒酵母。Delhaes等利用焦磷酸测序的方法对囊泡纤维症患者的真菌多样性进行了研究，结果表明肺功能下降及临床状态不好的患者真菌多样性明显降低。Hoffmann等对人体肠道的真菌多样性进行研究，通过焦磷酸测序表明人肠道中的真菌共66个属，丰度较高的是子囊菌纲和担子菌类。
3宏基因组学技术（Metagenomics）
利用基于rDNA的分子生物学方法研究微生物多样性，对于庞大的微生物世界仍然是不足够的，远不能阐明微生物的生理生化代谢特征。1998年，Handelman等［29］首次提出宏基因组的概念，并第1次使用了Metagenomics这个词。宏基因组学技术是通过提取某一环境样品所有微生物的基因组DNA，或通过鸟枪法直接测序探究环境中微生物的群落结构和功能，或构建宏基因组文库及对文库进行筛选寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物。通过这两方面的研究，极大地丰富了我们对环境样品微生物多样性和其功能的认知。宏基因组学技术避开传统的微生物分离培养方法，直接从样品中提取总DNA来展开研究，理论上覆盖了环境样品中的全部微生物，在分析环境微生物复杂群落结构领域得到广泛应用。该技术在微生物多样性领域的研究，有关细菌方面的居多，而关于真菌群落多样性的研究为数并不多。Il-leghems等利用宏基因组学技术研究了可可豆自然发酵过程中的真菌和细菌群落多样性，研究结果表明，葡萄汁有孢汉逊酵母、仙人掌有孢汉逊酵母、啤酒酵母、发酵乳杆菌和巴氏醋杆菌是主要存在的菌种，并且确定了主要以乳杆菌为宿主的肌病毒科和长尾噬菌体的存在。这是第1篇利用宏基因组学技术并结合454焦磷酸测序研究自然发酵可可豆中群落多样性种系发生分析的报道，显示了宏基因组学技术相比于之前研究方法的优越性，能够获得更加全面的微生物群落信息。宏基因组学技术不仅在研究微生物群落结构方面蕴含巨大潜力，在发现新功能基因及活性物质方面也具有极大的优势。Cardoso等 在对被蜗牛侵袭的农作物进行宏基因组学分析中，第1次对其微生物群落和参与生物化学通路的主要基因进行了研究，发现变形菌门是主要的细菌门，其次是拟杆菌门和硬壁菌门，而病毒、真菌及古细菌的多样性稍低。另外，通过功能分析发现其中存在的大量微生物基因有助于宿主降解木质纤维素、对异生物质脱毒以及合成必需氨基酸和维生素，同时有利于蜗牛的适应性和广泛摄食，并且检测到2700多种编码糖苷水解酶区域和碳水化合物结合结构域的基因。通过宏基因组学技术不仅能够避免PCＲ扩增带来的偏差，全面而准确的研究微生物群落多样性，同时也为研究样品中微生物生化代谢、发现新功能基因和活性物质提供了极大的便利。宏基因组学技术在分析群落多样性中不可避免地也会存在一些弊端，例如测序产生的大量数据为后续的序列分析和处理带来了挑战，同时对计算机以及数据库的要求也在不断提高。尽管如此，宏基因组学技术本身所具有的巨大优势是目前其他研究方法不可比拟的。近年来，宏基因组学技术已经开始影响真菌生物学，逐渐成为研究真菌多样性的一个新的发展方向和研究热点，也增加了获得新生物活性物质的机会，显示宏基因组学技术在此方面蕴含的巨大发展潜力。
前景与展望
近年来，随着各种新技术的不断完善与发展，对真菌多样性的研究逐渐深入，利用这些新技术可以从不同的角度来研究真菌多样性，为环境微生物多样性和人体真菌病的诊断治疗奠定坚实的基础。值得一提的是，为了获得更为全面的真菌多样性信息，在条件许可的情况下可将几种方法结合起来使用。目前对于真菌多样性的研究是多方面的，不论是环境中、食品中还是定植于人体各部位的真菌，通过对其多样性的研究必能为指导实践提供理论基础。因此，真菌多样性研究方法的不断完善必将推动真菌多样性研究的快速发展。做生物的多样性和微生物代谢产物的多样性，永远是发现新药的无穷宝藏。随着生命科学的发展，一些新的抗真菌药物作用靶点的发现，必将有更多更有效的抗真菌抗生素被发现和应用。在过去的 20年间，刺白菌素类抗生素的发现和应用，更增强了从微生物代谢产物中寻找抗真菌抗生素的信心。在今后的若干年间，将会有更多的作用靶位用于抗真菌抗生素的筛选，并一定能够由此获得更多更有效的抗生素。
致谢
大学三年学习时光已经接近尾声，在此我想对我的母校，我的父母、亲人们，我的老师和同学们表达我由衷的谢意。感谢我的家人对我大学三年学习的默默支持;感谢我的母校安徽职业技术学院给了我我在大学三年深造的机会，让我能继续学习和提高;感谢生化班的老师和同学们三年来的关心和鼓励。老师们课堂上的激情洋溢，课堂下的谆谆教诲;同学们在学习中的认真热情，生活上的热心主动，所有这些都让我的三年充满了感动。这次毕业论文设计我得到了很多老师和同学的帮助，其中我的论文指导老师刘磊老师对我的关心和支持尤为重要。每次遇到难题，我最先做得就是向刘磊老师寻求帮助，而刘磊老师每次不管忙或闲，总会抽空来找我面谈，然后一起商量解决的办法。
我做毕业设计的每个阶段，从选题到查阅资料，论文提纲的确定，中期论文的修改，后期论文格式调整等各个环节中都给予了我悉心的指导。这几个月以来，刘磊老师不仅在学业上给我以精心指导，同时还在思想给我以无微不至的关怀，在此谨向刘磊老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意。
同时，本片毕业论文的写作也得到了白杨，江双双等同学的热情帮助。感谢在整个毕业设计期间和我密切合作的同学，和曾经在各个方面给予过我帮助的伙伴们，在此，我再一次真诚地向帮助过我的老师和同学便是感谢!
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