高效液相色谱法操作规程

第一篇：高效液相色谱法操作规程

高效液相色谱法操作规程

1． 目的： 规范高效液相色谱法检验操作。

2． 范围： 适用于本公司中药材用高效液相法的检验。3． 责任： 检验室主任和相关检验员对本操作规程的实施负责。4． 内容： 4.1 标准名称

高效液相色谱法{中华人民共和国药典（2000年版一部）附录VID}。4.2 对仪器的一般要求

所用的仪器为高效液相色谱仪。色谱柱的填充剂和流动相的组分应按各品种项下的规定。常用的色谱柱填充剂有硅胶和化学键合硅胶，后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用。离子交换填充剂，用于离子交换色谱；凝胶或玻璃微球等填充剂，用于分子排阻色谱等。除另有规定外，柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。

在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法项下对溶剂的要求。

正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外，其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。一般色谱图约于20分钟内记录完毕。

4.3 系统适用性试验

按各品种项下要求对仪器进行适用性试验，即用规定的对照品对仪器进行试验和调整，应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度、重复性和拖尾因子。

4.3.1 色谱柱的理论板数（n）

在选定的条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和半峰高宽（Wh/2），按n=5.54（tR / Wh/2）2 计算色谱柱的理论板数。如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数，应改变色谱柱的某些条件（如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等），使理论板数达到要求。

4.3.2 分离度

定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。分离度（R）的计算公式为：

R = 2(tR2tR1)

W1W2式中：tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；

tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的峰宽。除另有规定外，分离度应大于1.5。4.3.3 重复性

取各品种项下的对照溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%。也可按各品种校正因子测定项下，配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别进样3次，计算平均校正因子，其相对标准偏差也应不大于2.0%。

4.4.4 拖尾因子

为保证测量精度，特别当采用峰高法测量时，应检查待测峰的拖尾因子（T）是否符合各品种项下的规定，或不同浓度进样的校正因子误差是否符合要求。拖尾因子计算公式为：

T=W0.05h 2d1式中：W0.05h为0.05峰高处的峰宽；

d1 为峰极大至峰前沿之间的距离。除另有规定外，T应在0.95—1.05之间。4.4 测定法

定量测定时，可根据供试品的具体情况采用峰面积法或峰高法。测定杂质含量时，须采用峰面积法。

4.4.1 内标法

加校正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：

校正因子（f）=

AS/CS AR/CR式中：AS——为内标物质的峰面积或峰高；

AR——为对照品的峰面积或峰高； CS——为内标物质的浓度； CR——为对照品的浓度。

再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分（或其杂质）和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：

含量（CX）=f·

AX AS/CS式中：AX 为供试品（或其杂质）峰面积或峰高；

CX 为供试品（或其杂质）的浓度。f、AS和CS的意义同上。

当配制校正因子测定用的对照溶液和含有内标物质的供试品溶液使用同一份内标物质溶液时，则配制内标物质溶液不必精密称（量）取。

4.4.2 外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量

按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品和供试品待测成分的峰面积（峰高），按下式计算含量：

AXAR式中各符号意义同上。含量（CX）=CR

4.4.3 加校正因子的主成分自身对照法

测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种正文中，用于校正杂质的实测峰面积。

测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节仪器灵敏度（以噪音水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰高约达满量程的10%—25%或其峰面积能准确积分（面积约为通常条件下满量程峰积分值的10%），然后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积比较，依法计算各杂质含量。

4.4.4 不加校正因子的主成分自身对照法

当没有杂质对照品时，可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照溶液并调节仪器灵敏度后，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，前者的记录时间除另有规定外，应为主成分保留时间的若干倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。

若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。

4.4.5 面积归一化法

由于峰面积归一化法测定误差大，因此，本法通常只能用于粗略考察供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。方法是测量各杂质峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率，即得。

由于微量注射器不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中某杂质或主成分含量时，以定量环进样为好。

第二篇：气相及液相色谱法基础知识

气相色谱法基础知识

一、气相色谱的简要介绍

气相色谱法是二十世纪五十年代出现的一项重大科学技术成就。这是一种新的分离、分析技术，它在工业、农业、国防、建设、科学研究中都得到了广泛应用。气相色谱可分为气固色谱和气液色谱。气固色谱的“气”字指流动相是气体，“固”字指固定相是固体物质。例如活性炭、硅胶等。气液色谱的“气”字指流动相是气体，“液”字指固定相是液体。例如在惰性材料硅藻土涂上一层角鲨烷，可以分离、测定纯乙烯中的微量甲烷、乙炔、丙烯、丙烷等杂质。

二、气相色谱法的特点

气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。由于样品在气相中传递速度快，因此样品组分在流动相和固定相之间可以瞬间地达到平衡。另外加上可选作固定相的物质很多，因此气相色谱法是一个分析速度快和分离效率高的分离分析方法。近年来采用高灵敏选择性检测器，使得它又具有分析灵敏度高、应用范围广等优点。

三、气相色谱法的应用

在石油化学工业中大部分的原料和产品都可采用气相色谱法来分析；在电力部门中可用来检查变压器的潜伏性故障；在环境保护工作中可用来监测城市大气和水的质量；在农业上可用来监测农作物中残留的农药；在商业部门可和来检验及鉴定食品质量的好坏；在医学上可用来研究人体新陈代谢、生理机能；在临床上用于鉴别药物中毒或疾病类型；在宇宙舴中可用来自动监测飞船密封仓内的气体等等。

气相色谱专业知识气相色谱

气相色谱是一种以气体为流动相的柱色谱法，根据所用固定相状态的不同可分为气-固色谱(GSC)和气-液色谱(GLC)。气相色谱原理

气相色谱的流动相为惰性气体，气-固色谱法中以表面积大且具有一定活性的吸附剂作为固定相。当多组分的混合样品进入色谱柱后，由于吸附剂对每个组分的吸附力不同，经过一定时间后，各组分在色谱柱中的运行速度也就不同。吸附力弱的组分容易被解吸下来，最先离开色谱柱进入检测器，而吸附力最强的组分最不容易被解吸下来，因此最后离开色谱柱。如此，各组分得以在色谱柱中彼此分离，顺序进入检测器中被检测、记录下来。气相色谱流程

载气由高压钢瓶中流出，经减压阀降压到所需压力后，通过净化干燥管使载气净化，再经稳压阀和转子流量计后，以稳定的压力、恒定的速度流经气化室与气化的样品混合，将样品气体带入色谱柱中进行分离。

分离后的各组分随着载气先后流入检测器，然后载气放空。检测器将物质的浓度或质量的变化转变为一定的电信号，经放大后在记录仪上记录下来，就得到色谱流出曲线。

根据色谱流出曲线上得到的每个峰的保留时间，可以进行定性分析，根据峰面积或峰高的大小，可以进行定量分析。气相色谱仪

由以下五大系统组成：气路系统、进样系统、分离系统、温控系统、检测记录系统。

组分能否分开，关键在于色谱柱；分离后组分能否鉴定出来则在于检测器，所以分离系统和检测系统是仪器的核心。气相色谱仪

液相色谱法

液相色谱法

气相色谱不能由色谱图直接给出未知物的定性结果，而必须由已知标准作对照定性。当无纯物质对照时，定性鉴定就很困难，这时需借助质谱、红外和化学法等配合。另外大多数金属盐类和热稳定性差的物质还不能分析。此缺点可高效液相色谱法来克服。液相色谱法就是用液体作为流动相的色谱法。1903 年俄国化学家M.C.茨维特首先将液相色谱法用于分离叶绿素。原理和分类 液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效（又称高压）液相色谱法。

①液固吸附色谱。高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

②液液分配色谱法。基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱。前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性化合物的分离。

③离子交换色谱法。基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。薄壳型离子交换树脂柱效高，主要用来分离简单的混合物；多孔性树脂进样容量大，主要用来分离复杂混合物。

④凝胶渗透色谱法[1]。又称为尺寸排阻色谱法。1959年首先用于生物化学领域。以溶剂为流动相，多孔填料（如多孔硅胶、多孔玻璃）或多孔交联高分子凝胶为分离介质的液相色谱法。当混合物溶液入凝胶色谱柱后，流经多孔凝胶时，体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过，较早地被冲洗出柱外，而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去，较晚地被冲洗出来，混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。用凝胶渗透色谱的优点是：分离不需要梯度冲洗装置 ；同样大小的柱能接受比通常液相色谱大得多的试样量；试样在柱中稀释少，因而容易检测；组分的保留时间可提供分子尺寸信息；色谱柱寿命长。它的缺点是：不能分离分子尺寸相同的混合物，色谱柱的分离度低；峰容量小；可能有其他保留机理起作用时引起干扰。凝胶渗透色谱法为测定高聚物分子量和分子量分布提供了一个有效的方法，此外还可用来分离齐聚物、单体和聚合物添加剂等。

⑤离子色谱法。采用柱色谱技术的一种高效液相色谱法，样品展开方式采用洗脱法。根据不同的分离方式，离子色谱可以分为高效离子色谱、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换。离子排斥色谱法用高容量的树脂，分离机理主要是利用离子排斥原理。流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。

离子色谱仪由淋洗液贮存器、泵、进样阀、分离柱、抑制柱、电导检导器和数据处理单元等组成。离子色谱仪最重要的部件是分离柱，装有离子交换树脂。抑制柱是抑制型离子色谱仪的关键部件，其作用是将淋洗液转变成低电导部分，以降低来自淋洗液的背景电导，同时将样品离子转变成其相应的酸或碱，以增加其电导。分离阴离子，抑制柱填充强酸性阳离子交换树脂；分离阳离子，抑制柱填充强碱性阴离子交换树脂。检测器分通用型检测器与专用型检测器。前者如电导检测器，对检测池中所有离子都有响应；后者如紫外-可见分光光度计，对离子具有选择性响应。

离子色谱法具有快速、灵敏、选择性好和同时测定多组分的优点。尤其对于阴离子的测定，离子色谱的出现是分析化学中的一项突破性的新进展。离子色谱法主要用于测定各种离子含量，广泛应用于水、纸浆和漂白液、食品分析、生物体液、钢铁和环境分析等各个领域。

设备 高效液相色谱仪由输出泵、进样装置、色谱柱、梯度冲洗装置、检测器及数据处理和微机控制单元组成。输出泵的功能是将冲洗剂在高压下连续不断地送入柱系统，使混合物试样在色谱中完成分离过程。常用的进样方式有3种：注射器隔膜进样、阀进样和自动进样器进样。色谱柱的功能是将混合物中各组分分离。梯度冲洗又称溶剂程序，通过连续改变冲洗剂的组成，改善复杂样品的分离度，缩短分析周期和改善峰形，其功能类似于气相色谱中的程序升温。检测器的功能是将从色谱柱中流出的已经分离的组分显示出来或转换为相应的电信号，主要有紫外吸收检测器、荧光检测器、电化学检测器和折光示差检测器，其中以紫外吸收检测器使用最广。现代化的仪器都配有计算机，以实现自动处理数据、绘图和打印分析报告

第三篇：牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版-新

牛奶中阿维菌素类药物残留检测—高效液相色谱法 安全要求

该检验的提取、净化步骤应在通风橱中进行，操作中需着工作服、戴口罩手套，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器集中处理。急救措施

皮肤触到有机溶剂或酸,用清水清洗，溅入眼中用纯水灌洗。适用范围

该操作规程适用于牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的制样及测定。职责

进行该项检验的检验员必须按该操作规程进行检验，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。

检测原理

用乙腈提取试料中残留的阿维菌素类药物，加水稀释，加三乙胺使溶液呈弱碱性，C18固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。方法灵敏度

本方法在牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为1µg/kg，定量限均为2µg/kg。

注意事项

7.1 整个净化步骤控制C18柱流速约在1～2 mL/min； 7.2 C18柱使用过程中除特别说明外，应避免柱床干涸。材料、仪器、试剂的准备及基本要求

除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。8.1 阿维菌素标准品

含量≥95.7% 8.2 多拉菌素标准品

含量≥92.6% 8.3 伊维菌素标准品

含量≥93.9% 8.4 乙腈

色谱纯 8.5 甲醇

色谱纯 8.6 三氟乙酸酐 8.7 三乙胺

8.8 异辛烷

8.9 N-甲基咪唑

8.10 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者

8.11 固相萃取柱洗涤液；取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 µL，混匀。8.12 衍生化试剂

a)A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。现用现配。b)B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）。现用现配。8.13 1 mg/mL 阿维菌素类药物混合标准贮备液：

分别称取阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品10 mg，精密称定，于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成阿维菌素类药物浓度为1 mg/mL的混合标准贮备液，-20℃保存，有效期6个月。

8.14 10 µg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：

准确量取混合标准贮备液0.25 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释并配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为10 µg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。8.15 1 µg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：

准确量取10 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为1 µg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。

8.16 高效液相色谱仪（配荧光检测器）8.17 分析天平

感量0.00001 g 8.18 天平

感量0.01 g 8.19 振荡器

8.20 离心机 8.21 涡旋混合仪

8.22 聚丙烯离心管

mL

8.23 氮吹仪

8.24 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者 8.25 微孔滤膜

0.45 µm 检验步骤 9.1 试料的制备

9.1.1 取混匀后的供试样品，作为供试试料。

9.1.2 取混匀后的空白样品，作为空白试料（阴性对照）。

9.1.3 取混匀后的空白样品5 g,添加1 µg/mL的工作液0.05 mL，作为空白添加试料。

9.2 标准曲线的制备

精密量取1 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.02、0.05、0.1 mL，于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度；精密量取10 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.25 mL，于50 mL量瓶中，0.1、0.3 mL至10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度分别为2、5、10、50、100、300 ng/mL的阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液，各取1.0 mL于各自的10 mL试管中，于50 ℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，将系列标准溶液，供高效液相色谱测定，从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

9.3 提取

9.2.1 称取(5±0.05)g试料，于50 mL离心管中，加乙腈8 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，5000 r/min离心10 min。

9.2.2 收集上清液于另一50 mL离心管中。残渣再重复提取一次。9.2.3 合并两次上清液，加水15 mL和三乙胺50 µl，混匀，备用。9.4 净化

9.4.1 依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗涤液5 mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2 将备用液过柱，抽干。加异辛烷3 mL洗涤，抽干。

9.4.3 用乙腈5 mL洗脱。收集洗脱液于10 mL试管中，50 ℃下用氮气吹干。备用

9.5 衍生化

向试管中依次加入衍生化试剂A液100 µL和衍生化试剂B液150 µL，密闭，涡动10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 µL，涡动10 s，密闭反应30 min，加650 µL甲醇混匀。经0.45 µm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。

9.6 测定 9.6.1 色谱条件

9.6.1.1 色谱柱：C18柱，（250×4.6 mm，粒径5 µm）；或相当者； 9.6.1.2 流动相：乙腈+水（90+10，v/v）；

9.6.1.3 流速：1.8mL/min；

9.6.1.4 检测波长：激发波长： 365 nm，发射波长：475 nm； 9.6.1.5 柱温：40 ℃； 9.6.1.6 进样量：20 µL。9.7 测定法

9.7.1 试样溶液和50 ng/mL的标准溶液，作单点校准，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样溶液测定过程中应参插注入标准溶液，以便准确定量。空白、添加、标准溶液高效液相色谱图见附录及附加说明。9.7.2 试剂空白试验

除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。9.8 结果计算和表述

试料中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量（μg/kg），按下式计算：

X = 式中:

X

——试料中相应的阿维菌素类药物的残留量，μg/kg； C

——试样溶液中相应的阿维菌素类药物的浓度，ng/mL； V

——衍生化后试样的总体积，mL； m

——供试试料的质量，g。

注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9.9 结果判定

CV m9.9.1 线性范围

阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在2～300 ng/mL范围考察线性，计算回归方程，其相关系数应≥0.995。9.9.2 准确度

本方法在2～50 μg/kg添加浓度的回收率为70～120 %。9.9.3 精密度

本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。9.9.4 判定

当方法学考察结果符合上述规定时，供试组织中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量单个及之和Xi＜检测限时，判定为未检出；方法检测限≤Xi＜最高残留限量时, 判i1i1nn定为符合规定； Xi1ni≥最高残留限量时，判定为不符合规定。

注：仅当Xi≥方法检测限时，Xi为参与阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素总残留量求和计算，故求和公式中0≤n≤3。

9.10 附录及附加说明

阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在牛奶中的最高残留限量

药物名称 阿维菌素 多拉菌素 伊维菌素

标志残留物 阿维菌素

多拉菌素 22，23-二氢伊维菌素

动物品种

牛 牛 牛

组织

奶 奶 奶

MRL（µg/kg）不得检出 不得检出 10

附 录 A（资料性附录）高效液相色谱图

LU ***00510152025

图A.1 牛奶空白色谱图

minLU ***200510152025min

图A.2

阿维菌素类药物标准溶液色谱图（50 ng/mL）

LU ***020510152025min3

图A.3 牛奶中空白添加阿维菌素类药物色谱图（10 ng/g）

图中色谱峰: 1-阿维菌素；2-多拉菌素；3-伊维菌素。

第四篇：液相色谱法为您解决“瘦肉精”检测

液相色谱法为您解决“瘦肉精”检测

自瘦肉精事件发生以来，北京赛恩森科技一直密切关注，通过参考各种检测方法，迅速作出了力亲实验的行动，作出并规范了动物组织中盐酸克伦特罗（瘦肉精）检测的全套解决方案。

具体测定方法如下：

1.适用范围

适用于动物肌肉和肝脏中盐酸克伦特罗药物的检测。

2.提取

将5g动物组织、15 mL乙酸乙酯、3 mL10%碳酸钠溶液置于50 mL离心管中，10000 rpm均质2 min。6000 rpm下离心2 min，将上清液转至另一离心管中。用15 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并提取液。

向乙酸乙酯提取液中加入5 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液，涡动1 min，然后再6000 rpm下离心1 min，收集下层水相。重复萃取一次，合并下层水相，用2.5 mol/L NaOH溶液调节pH至5.2，待净化。

3.净化

活化/平衡：依次向Welchrom® P-SCX（60mg/3mL）中加入3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 30 mmol/L盐酸溶液，流出液弃去；

上样：将上述提取液加入柱中，流出液弃去；

淋洗：依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，淋洗液弃去，并将小柱抽干；

洗脱：用2×2 mL 5% 氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃下氮气吹干；

4.检测

50% 甲醇溶解残渣，涡动振荡1 min,过0.22μm滤膜，装入进样小瓶，进样10μL分析。

5.色谱条件：

仪器： LC-3010系列HPLC（二元高压梯度）

色谱柱： C18 液相色谱柱（4.6 mm x 150 mm, 3 μm）

流动相： 0.01 M磷酸缓冲液：甲醇=65:35 流速： 0.7 mL/min 进样量： 20 μL 柱温： 30 °C

检测波长： 244 nm 运行时间：11 min

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北京赛恩森科技

2011.08.22

第五篇：手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量

手性高效液相色谱法检测恩替卡韦中光学异构体杂质的含量

作者单位：(浙江大学药学院药物分析和药物代谢研究室，杭州 310031)【摘要】 采用chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，建立了正相高效液相色谱(nphplc)法直接拆分恩替卡韦与其光学异构体的方法。考察了流动相组成、酸碱性对柱效、分离度、保留时间等参数的影响。经优化，以正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v)为流动相，流速0.5 ml/min;检测波长261 nm。在此条件下，恩替卡韦与光学异构体分离度>4.2;光学异构体的检出限为0.12 mg/l，在0.25～4.0 mg/l浓度范围内有良好的线性关系;日内与日间精密度rsd<4.0%;按标准加入法计算，加样回收率在87.0%～100.8%之间;rsd<3.0%;按外标法计算，加样回收率在98.2%～110.4%之间;rsd<3.0%。本方法可作为恩替卡韦原料药中光学异构体杂质限量的控制方法。

【关键词】 恩替卡韦，光学异构体，高效液相色谱法，手性拆分

引 言

慢性乙肝病毒感染一直是全球公共卫生的难题，开发抗乙肝病毒药物也一直是个热点。目前，我国临床上应用的抗病毒治疗药物主要有两类： α干扰素和核苷或核苷酸类似物，主要包括拉米夫定、阿德福韦和阿昔洛韦[1,2]。2005年3月美国fda批准了新一代抗hbv核苷类似物恩替卡韦(entecavir，etv，商品名baraclude)上市[3]。恩替卡韦是一种鸟嘌呤核苷类似物(图1)，图1 恩替卡韦及其光学异构体的化学结构

fig.1 structures of entecavir and its optical isomer在磷酸激酶的作用下在体内形成活性三磷酸化合物，拮抗hbv所需天然底物脱氧鸟苷三磷(dgtp)，抑制hbvdna聚合酶和逆转录酶，阻断hbv复制。细胞内作用半衰期为15 h，在人体内不被肝细胞代谢，主要从肾脏排出体外。同时，其耐药性好，可有效治疗慢性乙型肝炎，临床应用前景良好[4,5]。

由于手性药物在合成过程中可能引入光学异构体杂质，故采用手性分离方法检查合成产品中光学异构体含量。恩替卡韦及其光学异构体手性分离方法未见报道。本研究采用直接手性hplc法拆分两光学异构体，建立恩替卡韦中光学异构体杂质限量检查方法。

实验部分

2.1 仪器、试剂及材料

lc10a型高效液相色谱仪、spd10a型紫外可见光检测器(日本岛津公司);chiralpak adh手性柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本diacel 公司)。乙醇(tedia)、正己烷(burdick & jackson)及异丙醇(tedia)均为色谱纯;三氟乙酸(国药集团化学试剂有限公司);三乙胺(分析纯，上海化学试剂采购供应五联化工厂);恩替卡韦及其光学异构体(99.87%，浙江医药股份有限公司新昌制药厂)。

2.2 色谱条件

色谱柱：chiralpak adh手性柱;流动相：正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.05∶0.05，v/v);流速0.5 ml/min;检测波长261 nm;柱温：室温;灵敏度：0.005 aufs;进样量20 μl。

2.3 溶液制备

2.3.1 恩替卡韦供试液及自身对照液的制备 准确称取适量恩替卡韦于50 ml容量瓶中，加乙醇超声溶解，定容，作为储备液(500 mg/l)。准确移取储备液2 ml于10 ml容量瓶中，加正己烷异丙醇(50∶50，v/v)混合溶液(以下简称混合稀释液)定容，得恩替卡韦的供试品溶液(100 mg/l)。取适量供试品溶液，用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。

2.3.2 光学异构体对照品溶液的制备 准确称取适量异构体于100 ml容量瓶中，加乙醇超声溶解，定容，作为异构体的储备液(50 mg/l)。准确移取储备液2 ml于10 ml容量瓶中，加混合稀释液定容，作为异构体的对照品溶液(10 mg/l)。

2.3.3 恩替卡韦与异构体混合溶液的制备 取2 ml恩替卡韦供试品溶液和4 ml异构体的储备液于10 ml容量瓶中，加混合稀释液定容，即得浓度各为20 mg/l的混合溶液。

结果与讨论

3.1 不同极性调节剂对保留时间、柱效和分离度的影响

由表1可见，当流动相为正己烷和异丙醇时，调节比例，样品和异构体未达基线分离。加入三氟乙酸，保留时间随着三氟乙酸的增加有所减少，仍未达基线分离，但峰型好。加入三乙胺，两者未分开，但能使异构体的保留时间缩短。再改变正己烷和异丙醇比例，两者分离，但是分离度仅为1.18，理论塔表1 流动相的优化板数都小于650。在流动相中加入乙醇后发现流动相中的乙醇含量明显影响保留时间、分离效果和理论塔板数。乙醇含量越高，理论板数越大。同时乙醇和异丙醇的比例也明显影响分离效果，乙醇比例增高，分离度和理论板数提高，保留时间也增加。当流动相为正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(70∶12∶18∶0.1∶0.05，v/v)时，分离效果理想(图2c)。

3.2 酸碱性对柱效、分离度和保留时间的影响

3.2.1 三乙胺的影响 固定流动相中正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸(70∶12∶18∶0.1, v/v)的比例，改变三乙胺用量，考察三乙胺含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知，随着三乙胺含量增加，理论板数和分离度逐渐提高，保留时间稍有缩短。当流动相中三乙胺比例为0.05%和0.1%时，理论板数、分离度和保留时间基本一致。考虑到碱性大对手性柱的损害大，故选择三乙胺用量为0.05%。

3.2.2 三氟乙酸的影响 固定流动相中正己烷异丙醇乙醇三乙胺(70∶12∶18∶0.05, v/v)的比例，改变三氟乙酸用量，考察三氟乙酸含量对样品和光学异构体柱效、分离度和保留时间的影响。由表2可知，随着三氟乙酸含量的增加，分离度逐渐降低，但均大于3.5。保留时间逐渐变小，理论板数变化不明显。综合考虑选择三氟乙酸含量为0.05%。图2 流动相对恩替卡韦及其光学异构体分离的影响

a.正己烷异丙醇三氟乙酸(nhexane: isopropyl alcohol: trifluoroacetic acid)(60∶40∶0.05，v/v);b.正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid)triethylamine(tea)(75∶20∶5∶0.1∶0.05，v/v);c.正己烷异丙醇乙醇三氟乙酸三乙胺(nhexane: isopropyl alcohol: ethanol: trifluoroacetic acid: tea)(70∶12∶18∶0.1∶0.05, v/v)。表2 流动相中三乙胺和三氟乙酸含量对恩替卡韦光学异构体拆分的影响

3.3 系统适用性、检出限和线性关系

取配制的恩替卡韦与异构体的混合溶液，连续进样5次，记录峰面积，得恩替卡韦峰面积rsd为2.3%，光学异构体rsd为3.1%;分离度为4.3;恩替卡韦的保留时间约为21～23 min;光学异构体的保留时间约为30～33 min。理论板数按恩替卡韦峰计>2200，色谱图见图3。

取混合溶液(恩替卡韦及其光学异构体各约20 mg/l)，用混合稀释液逐步稀释，测得恩替卡韦及其光学异构体的检出限均为0.12 mg/l(s/n=3)。

外标法：精确移取适量异构体对照液至10 ml容量瓶中，用混合稀释液定容，制成异构体浓度分别为4.08, 2.04, 1.02, 0.51和0.255 mg/l的系列溶液进样。标准加入法：精确移取异构体对照液4, 2, 1, 0.5和0.25 ml，分别置于10 ml容量瓶中，每份加入恩替卡韦储备液2.00 ml，用混合稀释液定容，所得系列溶液中恩替卡韦浓度为100 mg/l，光学异构体浓度分别为4.08, 2.04,图3 恩替卡韦及其光学异构体的色谱图

a.恩替卡韦和光学异构体的混合溶液(mixture of entecavir and optical isomer);b.光学异构体(optical isomer);c.恩替卡韦(entecavir)。1.02, 0.51和0.255 mg/l，进样，记录色谱图。以浓度(x)对峰面积(y)作线性回归，外标法回归方程为y=27206x-2387.3，r=0.9992;标准加入法回归方程为y=27005x+58.287，r=0.9998。光学异构体在0.25～4 mg/l浓度范围内有良好的线性关系。由曲线的斜率可知，两条标准曲线几乎平行，说明恩替卡韦的存在对微量光学异构体的测定影响不大。

3.4 稳定性实验、精密度与相对保留时间

取恩替卡韦(100 mg/l)和光学异构体(1.0 mg/l)混合液，于0, 15和25 h进样测定，观察光学异构体峰面积变化情况。结果测得峰面积rsd为2.1%，表明测定溶液室温放置25 h稳定。

取适量恩替卡韦储备液9份，分别加入不同量的光学异构体溶液，用混合稀释液稀释，制成恩替卡韦浓度各为100 mg/l，含光学异构体高、中、低浓度分别为2.0, 1.0和0.5 mg/l的测定液，每个浓度平行3份，每份重复进样2次，取平均峰面积计算。同法于不同天操作，计算日间精密度。测得日内精密度rsd<1.5%，日间精密度rsd<4.0%(n=3)。

光学异构体的相对保留时间(tr1)以恩替卡韦峰的保留时间(tr2)为参比，计算光学异构体的相对保留值(r= tr1/tr2)。光学异构体相对于恩替卡韦的保留值为1.429±0.004，rsd<1.0%。

3.5 光学异构体的浓度校正因子

准确称取适量恩替卡韦和光学异构体，分别加乙醇溶解、定容，制成储备液。准确量取各储备液适量，加混合稀释液稀释成浓度各为20 mg/l的混合溶液。再逐步稀释成4, 2, 1, 0.5和0.25 mg/l，进样，记录色谱图。根据不同浓度下恩替卡韦和光学异构体所得色谱峰面积，按下列公式计算光学异构体的浓度校正因子(f)。测得该光学异构体的浓度校正因子f=1.10±0.04，rsd=3.96%。f=(a样/a异)·(c异/c样)3.6 回收率实验

按日内精密度测定项下方法配制溶液，根据测得浓度和理论浓度分别计算标准加入法和外标法回收率，结果见表3，获得满意的回收率。表3 光学异构体的回收率实验

3.7 恩替卡韦原料药中光学异构体杂质的检查

取适量恩替卡韦，加乙醇制成0.5 g/l储备液，取该溶液适量，用混合稀释液稀释5倍作为供试品溶液。取供试品溶液适量，用混合稀释液稀释100倍作为自身对照溶液。取对照溶液20 μl进样，调节仪器灵敏度，使主成分峰高为满量程的10%左右;再精密量取供试品溶液和对照溶液各20 μl，进样，记录色谱图至40 min。如果在相对恩替卡韦峰保留时间(1.43±5)%处出现色谱峰，峰面积乘上1.10后与自身对照溶液比较，不得大于对照溶液主成分峰面积(<1%)。结果3批样品均未检出光学异构体杂质。

【参考文献】

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