环境中微生物的检测和分离纯化实验报告

第一篇：环境中微生物的检测和分离纯化实验报告

环境中微生物的检测和分离纯化

一． 实验原理

1.微生物的分离与纯化

土壤中含有丰富的微生物，可以从中分离纯化得到很多有价值的菌株。

微生物常用的分离方法是平板分离法，根据某种微生物对生长条件的不同要求供给它适宜的培养环境，再用稀释涂布平板法或稀释后平板划线分离，纯化该微生物，直到得到纯菌株。

2.平板菌落计数法

将待测样品经适当稀释后，其中微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中含的菌落数。

二． 实验材料与试剂

1.土壤稀释溶液

2.取液器（1000ml 1支），培养箱，培养皿（12个），无菌有帽试管，三角瓶，无菌涂棒，接种环，1000ml无菌吸头若干，记号笔，酒精灯，火柴，试管架。

三． 实验步骤

（一）.无菌平板制备

1.采用叠皿法把牛肉冻蛋白膏培养基倒入灭好菌的培养皿中，制作无菌平板

（二）.周围环境中微生物的检测

2.取一平板，分成6个区，做好标记。同一个人同一根手指头按如下要求用力一致进行操作：分别用未洗过的手指头，自来水打湿的手指头，自来水认真洗过的手指头，洗手液洗过一遍的手指头，洗过两遍的，洗手液洗过又用酒精棉球消毒后的手指头 在六个区上涂抹。（平板1）

3.取一平板，分区，分别用使用过的纸巾，硬币，旧纸币，餐卡在不同区拖动。（平板2）

4.在培养基上方抖动头发数次。（平板3）

5.取一平板，分区，用无菌接种环分别蘸一滴自来水，河水，豆浆在不同区划线。（平板4）

6.用无菌牙签取一点牙垢在培养基上划线。（平板5）

7.取两个平板，一个打开在实验台上放置30分钟，另一个在酒精灯火焰边打开皿盖1分钟。（平板6）

8.取一平板，打开盖，咳几下。（平板7）

（三）.从土壤中分离微生物

1.采土样

2.制备土壤稀溶液

3.涂布

吸取100ml稀释好的土壤稀溶液，较均匀地滴在平板上，再用无菌涂棒涂布均匀，涂1—2分钟

4.培养

将培养基平板倒置于37℃下培养24小时

5.菌落计数

四．实验结果

1.平板1：从未洗到用酒精消毒总体趋势是菌落数越来越少，用自来水洗过和用洗手液洗过一遍的菌落数差不多；

平板2：旧纸币和硬币的菌落数要多；

平板3：抖头发的地方附近长出许多菌落；

平板4：自来水菌落最多，其次是河水，河水的菌落分布成“牛”字形，和当时划线的形状一样，再其次是豆浆；

平板5：划线的地方长出许多菌落；

平板6：放在试验台上的平板长出各种形状的菌斑菌块，在酒精灯旁的基本没有菌落；平板7：咳几下的基本没有菌落。

2.三张平板均被大片菌苔完全覆盖，无法计数。

五． 实验讨论

1.有关洗手液我了解到大部分洗手液都只有杀菌而没有除垢作用，因为其中含有60%到

70%的酒精，酒精含量低于60%，杀菌效果会很差，我们用的洗手液可能是酒精含量偏低，所以只用洗手液洗手是不够的。最好的洗手方法是，先用肥皂洗手去除污垢，再使用洗手液杀菌润肤。钱上有很多细菌，少接触，勤洗手。经查阅有关资料我了解到，牙垢中的细菌主要是正常口腔内存在的链球菌、厌氧菌等。牙垢堆积到一定厚度之后，其内部紧挨牙齿表面的细菌因为与空气隔绝开始转入无氧呼吸。无氧呼吸在此处产生的酸不能及时被唾液冲走，因此会腐蚀珐琅质中的矿物成分，并进一步促进龋齿的形成。在牙根处堆积的牙垢也会刺激牙龈，导致牙周炎等牙周疾病。所以要饭后刷牙。空气中有多种多样的细菌。咳几下没有细菌的原因可能是没有使口腔中喷出的气流或飞沫落到培养基上。

2.第二个实验失败的原因可能是滴加的溶液过多，或是取液位置不对细菌浓度很大

第二篇：微生物分离实验报告（定稿）

微生物分离实验报告

实验仪器及材料

土样：18号土样 试剂及培养基

培养基：果胶酶筛选培养基；几丁质酶真菌筛选培养基；果胶酶划线分

离培养基；几丁质酶划线培养基；细菌半固体培养基；淀粉培养基；葡萄糖酵解培养基；乳糖酵解培养基；蛋白胨水培养基

a)试剂：草酸铵结晶紫染液、番红复染液等各种染料以及卢戈氏碘液、95%

乙醇、5%孔雀绿水溶液、无菌水等

仪器

锥形瓶（500mL×2；300mL×2；100mL×3）、培养皿（20套）、试管（20支）、移液管（3支）、烧杯、玻璃棒、载玻片、盖玻片、光学显微镜、涂布棒、U型管、德汉氏小管、酒精灯、漏斗、接种环、滤纸、棉塞、牛皮纸、无菌操作台、灭菌锅、纱布等

细菌的筛选，分离纯化及鉴定 细菌的筛选

土样处理

配制生理盐水：在烧杯中配置200ml0.85％的生理盐水，用移液管各移取9ml于五支洁净试管，再移取90ml配置好的生理盐水于三角烧瓶，并放入少许玻璃珠，包好灭菌；

加土样：冷却后准确称取10g土样放入盛有90ml无菌生理盐水并带有少许玻璃珠的三角烧瓶中，充分震荡摇匀，然后放在30℃恒温培养箱中静置15min。

果胶酶菌种筛选

梯度稀释：用一支无菌吸管吸取1ml土壤悬液加入到盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，此为10-1稀释液，以此类推制成10-

2、10-3两种稀释度的土壤溶液（如下图）；

涂布：配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，分别写上10-

1、10-3两种稀释度字样，每稀释度标记三皿，然后用无菌吸管分别由10-

3、10-1两管土壤稀释液中吸取适量对好放入已写好稀释度的平板中央位置，每皿准确放入0.2ml，用无菌玻璃棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，其方法是将菌液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之均匀分布，然后改变方向90度沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处改变方向用涂布棒再涂布几次；

培养：将平板倒置于30℃恒温箱中培养1-2天；

果胶酶透明圈平板检测：取10-1涂布平皿，用0.5％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，则说明水解圈内的菌有水解果胶的能力；

菌落描述：取此菌进行菌落形态描述，就菌落的大小（大、中，小），颜色（白，黄，粉红等），干湿（干、湿），边缘（整齐，不整齐），表面（光滑，粗糙，有无突起等）分别进行阐述并详细记录； 细菌的分离纯化

划线分离：制备果胶酶划线培养基，灭菌后倒平板，挑取具有水解圈的菌种，第一次划线分离培养1-2天后取分离所得单菌落再进行第二次划线分离，划线分离的具体方法是：先在平皿上划定区域，然后将接种针在火焰上进行灭菌操作，取含菌种的培养皿，在火焰上方（注意：不

图 细菌的划线分离示意图

能离火焰太近）打开培养皿盖，先拿接种针在上盖处划线以降温，然后用接种针轻挑所选菌落一到两下，将平皿盖上放好，再取刚刚冷却了的干净平皿在1区进行划线接种操作。操作完毕后对接种针进行灭菌操作，完成后在火焰上方打开平皿盖，将接种针冷却后从1区引线到2区，再如图所示划线，划完后引线到3区，同上进行划线，划线完毕后盖盖平放；

纯种保藏：再配制一份普通细菌培养基，分装试管后灭菌，制得斜面，将纯种划线接种在斜面上培养保存并进行下一步的鉴定。

a)纯种果胶酶水解能力的测定

配制果胶酶筛选培养基，110度灭菌20-30分钟，冷却后倒平板在培养皿盖周边用记号笔做好标记，将分离纯化的细菌点种于平板上（注意：点种的量不宜过多，以3～4个为宜），在30℃培养箱中培养1～2天，取培养后的平皿用0.5％的刚果红染色15-20min后，倒掉刚果红，用1mol/L的NaCl脱色几分钟至观察到透明圈，测量并记录透明圈的大小

b)简单染色步骤 i.涂片 取一块载玻片，在上边用胶头滴管加半滴无菌水，用接种环无菌操作将沾有菌的接种环置于载玻片上的无菌水种涂抹，待看到微弱的浑浊即可；（注意取菌不要太多）

ii.干燥与固定

涂菌面朝上，通过火焰以干燥并固定菌物，固定过程应使载玻片通过火焰2-3次，注意温度的控制，过热的温度会将细菌杀死，温度以手背感觉微微发烫为标准；

iii.染色

将载玻片平放于载波片支架上，滴加结晶紫染液覆盖涂菌部位即可，染色1.5min iv.水洗

倾去染液，将载玻片的涂菌面朝下，自来水冲洗，水流不宜太急、太大，至洗出水无色为止；

v.干燥

用吸水纸吸去多余水分后自然干燥； vi.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态。

c)革兰氏染色步骤 i.涂片

先在载玻片一侧用记号笔标记间隔的四个区域，在另一侧四个区域的位置分别滴加半滴无菌水。分别取四种活跃生长期菌种（大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，枯草杆菌和一种自选菌）按常规方法涂片（不宜过厚），用酒精灯按照简单染色中所述干燥和固定的方法对四种菌进行干燥和固定。

ii.初染

滴加草酸铵结晶紫染液使之覆盖涂菌部位，染色1.5min后水洗； iii.媒染

先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，再用碘液覆盖1min后水洗； iv.脱色

先用乙醇冲去水迹，然后用95%乙醇覆盖脱去色素，脱色约30s，立即用水冲洗；

v.复染

先用番红洗去水迹，然后滴加番红复染1.5min后水洗； vi.镜检

将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌。分别以大肠杆菌与金黄色葡萄球菌所染颜色作为对照，来判断枯草杆菌以及另一种自选菌的染色结果。

d)芽孢染色步骤 i.涂片，加热干燥及固定

在洁净盖玻片接近中部两处分别滴一滴无菌水，分别接种枯草芽孢杆菌及梭状芽孢杆菌。然后按照常规方法加热干燥及固定；

ii.孔雀绿加热染色

用木夹夹住载玻片，向载玻片上滴加5%孔雀绿水溶液使之完全覆盖涂菌部位，然后在酒精灯上微微加热（孔雀绿着色能力强，加热可使较难染色的芽孢染成绿色，且再难洗脱）至染液冒蒸汽开始计时并维持5min，注意加热时应以有蒸汽微微冒出为宜，过热或加热不足均会影响观察效果，且加热时在载玻片上随时补加染液，切勿让涂片干涸；

iii.水洗

水洗一定要等载玻片冷却后进行，否则可能导致载玻片的破裂。具体水洗按常规方法进行； iv.复染

用0.5%番红水溶液复染2min； v.水洗并干燥

按常规方法水洗后自然干燥； vi.镜检

先在低倍镜下寻找视野范围，然后换用高倍镜调焦，最后加香柏油在油镜下仔细寻找两种细菌以及其周围或内部染成绿色的芽孢。

e)半固体穿刺法观察细菌运动性 i.配制培养基

配制半固体牛肉膏蛋白胨培养基，分装于4支试管内，110度灭菌20-30分钟，正立于烧杯中冷却至室温；

ii.在无菌操作台上右手握接种针,以针挑取菌苔.垂直刺入半固体琼脂培养的中心直至接近(但勿触及)试管底,然后循原路退出。如图所示：

iii.接种完成后在30℃条件下培养两天观察并判断其运动性。

第三篇：血清γ-球蛋白的分离纯化实验报告

血清γ-球蛋白的分离纯化

一、目的与要求

1、掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。

2、熟悉盐析、离心、层析、电泳等生化基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。

3、学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案，技术路线，质量监控和保证措施。

二、实验原理

血清蛋白有300多种，可粗略的分为清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡萄糖凝胶G-25脱去球蛋白中的盐分最后用DEAE纤维素阴离子交换柱便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白,其反应机理如下：

C2H5

H

纤维素-O-(CH2)2-N(C2H5)2

纤维素-O-(CH2)2-N+……H2PO4

H++H2PO4

DEAE纤维素离子交换柱

COOH

C2H5

α、β、γ球蛋白

NH2

COO

H

经过盐析和脱盐的球蛋白液

纤维素-O-(CH2)2-N+…α和β

G

PH6.3

NH2

交换到柱上的α和β-球蛋白

H2PO4

COOH

γ-球蛋白

NH3+

被DEAE柱分离纯化的γ-球蛋白

被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。

三、仪器和材料

仪器：离心机，1.5×40cm层析柱，层析架或滴定台，核酸-蛋白检测仪，部分收集器，紫外分光光度计，色谱柱，电泳槽，电泳仪。

材料：马血清，Sephadex

G-25×200g，DEAE-32×200g。

四、实验步骤

（一）分离纯化步骤

1、取3mL,4℃预冷血清，加入3mL

4℃预冷的饱和硫酸铵。边滴边摇。

2、静置大于10min后，3500rpm离心15min，弃去上清液，将沉淀溶于少量的生理盐水。从中取0.5mL用于测定蛋白质含量。

3、将剩余的样品上Sephadex

G-25柱，用0.02

mol/L

pH6.5的NH4AC缓冲液洗脱，每管收集3

mL，用于绘制洗脱曲线，选择颜色最深（即浓度最高管）的取0.5mL留待电泳用。

4、将剩余的蛋白质溶液上已平衡好的DEAE-32柱（装一半的柱子），用0.02

mol/L

pH6.5

NH4AC缓冲液洗脱，用干净的试管收集，并用20%磺基水杨酸检测是否有蛋白流出，并绘制洗脱曲线，收集的蛋白质溶液即为γ球蛋白（留少量电泳用，0.5ml测[Pr]）。

5、柱子再生。先用0.3mol/L高盐缓冲液，再用0.02mol/L缓冲液平衡。

（二）电泳步骤

1、安装垂直板电泳槽，按表配制分离胶溶液。用滴管吸取分离胶溶液，沿管壁注入玻璃板至距上端3cm处(插梳为准)

2、立即用滴管沿凝胶管壁加人蒸馏水约0.5cm高度，加水时应注意减少胶液表面的震动与扩散。加蒸馏水的目的，隔离空气中的氧和消除凝胶柱表面的弯月面，使凝胶表面平坦（加水时切勿呈滴状滴入胶液）。

3、静置30分钟，在凝胶表面与水之间出现清晰的界面，表示聚合已完成（注：刚加水时看出有界面，后逐渐消失，等再看出清晰界面时，表明凝胶已聚合）。用滴管吸去凝胶管的水层，并用滤纸条（无毛边）轻轻吸去凝胶表面残留的水分，注意不要损伤已聚合的凝胶表面。

4、按表制备浓缩胶，沿管壁加入浓缩胶，插上梳子，静置15分钟，待凝胶聚合后，待用。

5、加入10倍稀释的甘氨酸一Tris缓冲溶液于电泳槽中，用注射针排除样品孔中的气泡，样品与样品处理液1：1混合后，用微量注射器上样。

6、将上电泳槽的电极接至电泳仪的负极，下电泳槽的电极接至电泳仪的正极，接通电源，刚开始5分钟内6-7

mA／板，待示踪染料迁移到下口约0.5cm处时，就可停止电泳，切断电源（电泳时间约为

2／小时左右）。

7、剥胶

取下玻璃板，用带有10cm长的注射针头，内盛蒸馏水作润滑剂。将针头插人胶与玻璃板之间，边注水边慢慢推针前进，靠水流压力和润滑作用使玻璃板与凝胶分开。

8、固定，染色与脱色

固定染色液染色过夜，用脱色液脱色.9、染色，加入染色液，染色过夜。

10、拍照，记录结果。

五、实验结果与分析

**

血清样由于蛋白质种类较多，区带不清。脱盐后，样品中剩余蛋白质为α、β、γ-球蛋白，从结果中可以看到几条较为明显的区带。γ-球蛋白的电泳结果显示其分离的较为纯净。

六、注意事项

1、上样前要将使用过的柱子重生。

2、上样时要注意3个相切：缓冲液与柱床表面相切；样品与柱床表面相切；洗样时缓

冲液与柱床表面相切。

3、用琼脂糖封胶时一定要封延时，防止漏胶。

4、配胶时要按照顺序加样，配完后要立刻混匀。

5、剥胶时要在水冲洗的情况下进行。

第四篇：水及食品中微生物的检测(实验报告)

水及食品中微生物的检测

××××××××××

食品微生物检验方法为食品监测必不可少的重要组成部分。它不仅是衡量食品卫生质量的重要指标之一，也是判定被检食品能否食用的科学依据之一。通过食品微生物检验，可以判断食品加工环境及食品卫生环境,能够对食品被细菌污染的程度作出正确的评价，为各项卫生管理工作提供科学依据,提供传染病和人类，动物和食物中毒的防治措施[1]。食品微生物检验是以贯彻“预防为主”的卫生方针，可以有效地防止或者减少食物中毒人畜共患病的发生，保障人民的身体健康；同时，它对提高产品质量，避免经济损失，保证出口等方面具有政治上和经济上的重要意义。

水是食品生产中的重要原料，必须符合饮用水的标准、水是否合乎标准，除需对其感官质量、放射性物质、与健康有关的无机成分等进行分析测定外，还必须对微生物进行检测。通常通过水中细菌总数和大肠杆菌群数来确定水的卫生质量，如果水源被粪便污染，则有可能也被肠道病原菌污染而引起伤寒、痢疾、霍乱等肠道疾病的流行，但肠道病原菌在水中数量较少，又容易变异死亡。因此，从水中特别是自来水中分离病原菌有困难。而大肠杆菌是肠道好氧菌中最普遍和数量最多的一种，所以，常将其作为粪便污染的标志，即根据水中大肠杆菌的数目来判断水源是否被污染，并间接测水源受肠道病原菌污染的可能性。一般规定，1ml自来水总的总菌数不得超过100个；每1000ml自来水中大肠菌群不超过3个。同样，细菌总数和大肠菌群数也是大多数食品微生物指标中的两项指标，只是数量要求随不同的食品而异。

细菌总数是指被检样品经过处理（如剪碎、研匀），在一定条件下培养后，所得1g或1ml检样中所含细菌菌落的总数。由于一个活细胞能形成一个菌落，因此，菌落就是待测样品所含的活菌数。由于每种细菌都有一定的生理要求（如对氧、培养温度、培养基的pH等），所以，培养时应该用不同的培养条件及不同的生理条件去满足其要求，才能将各种细菌都培养出来。但在实际工作中，一般都只用一种常用的方法去作细菌菌落总数的测定，所得结果指包括一群能在牛肉膏蛋白胨琼脂上或其他培养基上生长的嗜中温性需氧菌的菌落总数。本实验通过取样对自来水和黄酒中的微生物进行了检测，以期了解该两样样品中微生物含量是否符合饮用标准，并熟悉水及食品中微生物的检测方法。

食品在食用前的各个环节中，被微生物污染往往是不可避免的。评价食品被微生物污染的程度，要采用微生物检验指标采进行。常采用的微生物检验指标为三项细菌指标，即细菌

数量(主要是菌落总数)、大肠菌群最近似数（MPN）和致病菌[2]。

1.材料与方法

1.1材料

湖水、黄酒

1.2培养基

肉膏蛋白胨琼脂培养基；乳糖胆盐发酵培养基；伊红美蓝固体培养基；乳糖发酵培养基；

1.3仪器

恒温培养箱（温州康鼎净化工程有限公司）；超净工作台（苏州宏瑞净化科技有限公司）；蒸汽式高压灭菌锅（诸城市永泰机械有限公司）。

1.4细菌总数的测定

1.4.1采样

瓶装发酵酒的取样：用点燃的酒精棉球灼烧瓶口灭菌，用石炭酸纱布盖好，再用灭菌开瓶器将瓶启开，倒入500ml灭菌磨口瓶中，覆盖一灭菌纱布，轻轻震荡使气体逸出，待检。

湖水的取样：将无菌带玻璃塞的广口瓶浸入离湖面10-15cm水下，盛满后将瓶口盖好，再从水中取出，待检或保存于4℃冰箱保存。1.4.2检样稀释

将1ml待测液加入含9ml无菌水的试管中，制成10-1稀释液，再吸取1ml稀释液加入到含含9ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液，同法，配制稀释度为10-

3、10-

4、10-5的稀释液。1.4.3倾注培养

选择10-4和10-5两个稀释液，分别取1ml于平皿内，及时倒入约45℃肉膏蛋白胨琼脂培养基约15ml，摇动混匀，待凝固后将平皿倒置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h后取出，计算平板内菌落总数。

1.5大肠菌群检验

1.5.1 检样稀释

将1ml待测液加入含9ml无菌水的试管中，制成10-1稀释液，再吸取1ml稀释液加入到含含9ml无菌水的试管中，制成10-2稀释液。1.5.2乳糖胆盐发酵

分别取1、10-

1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，于36±1℃的恒温箱里倒置培养24±2h，如乳糖胆盐发酵管不产气则可报告为大肠菌群阴性；如有产气者，则按下列程序进行。1.5.3分离培养

将产气的发酵管分别接种于伊红美蓝琼脂平板上，于36±1℃恒温箱倒置培养18-24h。观察菌落形态，做革兰氏染色和复发酵证实实验。1.5.4复发酵证实实验

在伊红美蓝琼脂平板上挑取：①紫红色，具有金属光泽的菌落；②深红色，不带或略带金属光泽的菌落；③淡红色，中心较深的菌落。具有以上特征的菌落均为可疑大肠杆群菌落，挑取1-2个进行革兰氏染色，同时对应接种到乳糖发酵管内进行复发酵，于36±1℃的恒温箱倒置培养24±2h，观察产气情况。凡在乳糖发酵管内产气、革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性；如不产气或革兰氏阳性，则可报告大肠军群阴性。

2结果与分析

2.1细菌总数

表1 湖水的细菌总数测定结果

样品 1 2平均菌落数 菌落总数（个/ml)

取湖水、黄酒稀释度为10-4和10-5的稀释液于牛肉膏蛋白胨培养基内混合培养，每一稀释度2个平板。将平皿倒置于36±1℃的恒温箱内培养24±2h后取出，采用肉眼直接观察计数各平板的菌落数，并计算两者的菌落数，结果如表1所示。

由表可知湖水的细菌含量为1.25*105个/ml，比黄酒的细菌含量高。查阅资料得，1ml自来水的总菌数不得超过100个，本实验所测的样品湖水和黄酒中的菌落总数均超过100个，所以细菌都超标，不符合安全标准。

湖水10-4 12 13 12.5

1.3×105

湖水10-55 5

黄酒10-4

0 0 0

<1×104

黄酒10-5

0 0 0

2.2大肠菌群检验结果

表2 湖水及黄酒的大肠菌群检验的结果

伊红美篮平板上

稀释度 管号 乳糖胆盐发酵

有无可疑菌落

1003 1

10-13 1

10-23

分别取黄酒和湖水1、10-

1、10-2稀释液1ml注入乳糖胆盐发酵管，每个稀释度接种3管，进行乳糖胆盐发酵的实验。结果如表2所示。湖水的三个稀释度的九只试管中大肠菌群均为阳性，即都含有大肠杆菌。而黄酒的三个稀释度的九只试管中大肠菌群均为阴性。查MPN检索表可得出每100ml湖水中大肠菌群最可能数>2400个，每100ml黄酒中大肠菌群最可能数<30个。这表明了湖水中大肠杆菌含量较高，而黄酒中大肠杆菌含量较低。

无气泡

无

红色

无气泡 大肠杆菌群阴性

无气泡

无

红色

无气泡 大肠杆菌群阴性

无气泡

无

红色

无气泡 大肠杆菌群阴性

革兰氏染色 复发酵

结论

3讨论

食品中的微生物有许多种类，有的可导致人类产生疾病，有的对人类无害，也有的可产生一些不能令人忽视的代谢产物，因此食品中的微生物，尤其是一些致病微生物常常是作为人类是否能够食用该食品的重要指标。特别是近年来随着环境污染的加剧和生态平衡的不断破坏，可导致人类感染的致病菌的种类越来越多，病原微生物对人类的威胁越来越大。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染致病微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒，对人们的危害极大，快速检验方法是社会的迫切需要。

参考文献 ：

[1] 龙夫.食品微生物快速检测技术动向[J].食品安全, 2004, 6:55-56

[2] 陈庆森, 冯永强.食品中致病菌的快速检测技术的研究现状与进展[J].食品科学, 2003, 24(11): 148-152

第五篇：土壤微生物的分离培养技术实验报告

重庆大学研究生专业实验教学

实验报告书

实验课程名称： 实验指导教师： 学

院： 专业及类别： 学

号： 姓

名： 实验日期： 成绩：

重庆大学研究生院制

一、实验目的

1、了解分离与纯化微生物的基本原理及方法；

2、了解倒平板配制土豆培养基的方法与平板划线分离的基本操作技术；；

3、学习习近平板菌落计数的基本原理和方法，并掌握其基本技能；

4、初步观察来自土壤中的几类微生物的菌落形态特征，并能判断菌的类型。

二、实验原理

1、培养基的种类

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴别、保存各种微生物或积累代谢产物。一般的培养基应包含适合微生物生长的6大营养素即水分、碳源、氮源、能源、无机盐和生长因子。培养基的种类很多，根据培养成分的不同可分为天然培养基、合成培养基与半合成培养基；根据物理状态的不同又可分为液体培养基和固体培养基。微生物的分离、纯化、记数等方面的研究常常使用的就是固体培养基。本实验就是使用的固体培养基。

已配制好的培养基必须立即灭菌，如来不及灭菌，应暂存冰箱，以防止其中微生物生长繁殖而消耗养分和改变培养基酸碱度所带来不利影响。

培养基的原材料来源十分广泛，本实验采用的原材料为土豆。

2、接种方法与无菌接种

将微生物的培养物或含有微生物的样品移植到培养基上的操作技术称之为接种。接种是微生物实验及科学研究中的一项最基本的操作技术。接种的关键是要严格的进行无菌操作。微生物的接种方法很多，划线接种、三点接种、穿刺接种、混浇接种与涂布接种是几种常用的接种方法。

划线接种是最常用的接种方法，即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可以达到接种的目的。常用的接种工具为接种环、针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。三点接种是把少量的微生物接种在平板表面，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察研究它们的形态。研究霉菌形态时就常用此法。

穿刺接种是用针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺。该法常用于厌氧菌种的保藏或微生物的动力研究。

混浇接种是先将待接的微生物放入培养皿中再倒入冷却至45℃左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就被稀释了。待平板凝固后，置于适宜温度下培养，就可以长出单个菌落的微生物。

涂布接种是将菌液倒入平板上，再用涂布棒在表面迅速的作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可以长出单个菌落的微生物。

本实验采用的是划线接种。为了防止接种时引入其它微生物，整个操作过程均需在无菌操作台上进行，还需对操作员的双手进行酒精消毒，每次划线前都需灼烧接种环，接种时才打开培养皿且不能全部打开，接种完马上关上。

三、实验器材

1、仪器

培养皿、量筒、滴管、吸水纸、烧杯、三角瓶、酒精灯、玻璃棒、接种环、15ml离心管、试管架、镊子、电磁炉、锅、恒温培养箱、高温灭菌锅、无菌操作台、酒精灯、天平、滤纸等。

2、材料

土豆、琼脂、蒸馏水、酒精、土壤样品

四、实验步骤

1、土壤稀释液的配制

① 在菜地用九点取样法取适量土壤样品，具体操作为：在菜地选取九个取样点，在每个取样点取相同量的表层土壤（10cm左右），然后将其混合均匀；

② 称取1g土壤样品与99ml蒸馏水，将其配制成100ml的土壤溶液； ③ 用移液管取9ml蒸馏水于15ml离心管中，再用移液枪取1ml前一步已配制的土壤溶液于离心管中，摇匀，即为10-3的土壤溶液；

④ 重复前一步，将土壤溶液稀释为10-

4、10-

5、10-

6、10-

7、10-8一系列稀释液。

2、土豆培养基的制备

① 用天平称取200g土豆，清洗干净后去皮切丁；

② 用量筒量取1000ml蒸馏水与电磁炉锅中，再加入已准备好的土豆，将其煮烂；

③ 从锅中取出已煮烂的土豆，用纱布过滤，滤液待用； ④ 称取20g琼脂与滤液中，再用蒸馏水定容至1000ml；

⑤ 在制备好的滤液中加入0.1ml菌液，然后放入高温灭菌锅中，在121℃下灭菌20min；

⑥ 取出已灭菌的土豆培养基，待其熔化后冷却至60℃，倒入每付平板约15-20ml，待其凝固后便可使用。

3、微生物的接种与分离

① 将接种需要的所有器材均放置于无菌操作台上；

② 用浸泡在酒精里棉花给双手灭菌，点燃酒精灯，右手拿接种环，左手拿培养基；

③ 将接种环放在火焰上烧灼，待其冷却后在10-6土壤稀释液中蘸取少量液体，打开培养基的一部分，采用划线接种，使之形成单菌落，一共划线3-4次，每划线一次就需在火焰上烧灼一次；

④ 重复上步，接种10-

7、10-8的土壤稀释液的微生物；

⑤ 接种完的培养基放在恒温培养箱中倒置培养48h，取出观察。

五、结果与思考

1、实验结果

图1 实验结果如图1所示。由图1可知，采用划线接种土壤微生物的培养皿里有单菌落出现，这说明划线接种能达到分离培养的目的。

学习过微生物这门课程的同学都知道，真菌的菌落较大且疏松，菌丝细长，呈绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，无固定大小，多有光泽，不易挑，孢子会呈现红色、褐色、绿色、黑色、黄色等不同的颜色；细菌的菌落较小，形状表面或光滑黏稠，或粗糙干燥，易挑起，多为白色。由此可知土壤里既含有真菌又含有细菌。

2、思考题

⑴在平板划线法中，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？

答：这么做的主要目的是杀死上次划线后接种环上残留的菌种，以使下次划线的菌种直接来自于上次划线的末端，使每次划线菌种数目减少，从而达到分离菌株的目的。

⑵为什么要把培养皿倒置培养？

答：①操作时培养皿盖上可能粘有水珠或者细菌，倒着培养可以避免培养皿盖上的水珠或者微生物落在培养皿上；

②培养过程中，细菌在代谢繁殖过程中会产生一些有害于细菌生长繁殖的代谢物，释放热量及有水排出，如果不倒着培养会有水珠滴落到培养基中，影响菌落的生长;③如果培养目标是收集细菌代谢物，而且代谢物易溶于水，倒着培养可能会方便收集。

六、实验总结 我本科所学专业是材料科学与工程，本次实验是我高中后第一次接触微生物方面的知识。在本次实验课里，段老师先给我们详细讲解了微生物分离培养方面的许多理论知识，然后才进入了理论环节。在实验操作过程中段老师一直在我们旁边观察我们的实验操作过程，一旦出现错误，会立即指出并耐心的给我们讲解应该怎么做，我担心自己从来没做过微生物培养方面的实验会做不好，段老师还一直在旁边鼓励我，并给我讲解了许多微生物分离培养方面的知识，最后我独立完成了本次实验。此次实验课，我真的是受益匪浅，学到了许多微生物分离培养方面的知识，十分感谢段老师。

图2 如图2所示，本次微生物分离培养实验中，有些培养皿里菌落很少，只有一个，有的甚至没有。我认为出现这种情况原因可能是：划线接种时，未等接种环冷却就开始接种，微生物可能被高温杀死；在接种时，酒精灯火焰太大，进行接种操作的全过程又离酒精灯火焰很近，这也可能将微生物杀死。