细胞生物学实验总结

第一篇：细胞生物学实验总结

细胞自主实验方法总结

自主实验是在老师的指导和帮助下学生自己设计实验且自己准备实验所需的一切准备工作来完成的实验。平时做实验老师占重要地位但自主实验中学生占重要地位。自主实验中学生自己思考设计出实验方案，实验所需试剂，实验方法和步骤然后按该方案来做实验。

老师让学生做自主实验的原因是老师想培养学生的动手能力，合作能力，想让学生独立思考，想让学生亲自动手做实验，最重要的一点是把理论知识结合实践。

细胞培养是在体外模拟体内的生理环境，培养从机体中取出的细胞，并使之生存和生长的技术为细胞培养技术。

本实验采用了微量全血培养技术，培养人体外周血小淋巴细胞,使原处于 G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 进而进行有丝分裂，增殖成功率高、技术方法完善。把体外增殖的小淋巴细胞裂解,对细胞核染色体进行染色和 固定,制得人染色体标本,用于进行染色体组型分析，取得了令人满意的效果。

人和动物细胞培养是动物细胞工程的一项基本技术。目前,动物细胞培养主要用于通过大量的细胞培养获得有经济价值的生物产品和细胞本身。1966 年以前基本上用 Mo o r he a d 等，1960年建立的人外周血白细胞培养技术,该方法比较完善,成功率高。但缺点是取血量多,手续较麻烦。近30 多年来国内外绝大多数均采用微量全血培养技术,不但取血量少,而且可略去一些繁琐操作过程,如离心、分离血浆等,做起来既方便,也节省人力和物力, 比较适于推广和使用。

本实验对实验操作要求比较高。实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。操作做成中也要保证不污染。

第二篇：细胞生物学实验思考题

细胞生物学实验思考题

1、为什么暗视场照明的视场暗黑，而样品像明亮？相差显微镜镜检时，为什么要用绿色滤色镜观察活体样本？

暗视场显微镜照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的；

为获得好的效果，要用波长范围窄的单色光，选用绿色滤光镜，不但可满足这个要求，而且绿色可吸收红外光，减少发热。

2、为什么活细胞不易染色，从细胞生物学角度解释原因。

染色剂一般有剧毒，而细胞膜具有选择透过性，会将一部分对细胞有害的物质阻挡在细胞外，所以活细胞难以染色。而当细胞死亡后，细胞膜失去选择透过性，染色剂得以进入，细胞就被染色。

3、简述中性红染液、詹纳斯绿B染液用于细胞超活染色的原理。

Janus green B活体细胞染色的机理：Janus green B是毒性较小的碱性染料，可专一性地对线粒体进行超活染色，这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使染料始终保持氧化状态（即有色状态），呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

Neutral red 碱性染料活体染色的机理：neutral red为弱碱性染料，对液泡系（即高尔基体）的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能与液泡中某些蛋白质有关。

4、什么是细胞骨架？它有何主要功能？

生物学中细胞骨架指真核细胞中与保持细胞形态结构和细胞运动有关的纤维网络。包括微管、微丝和中间丝。

细胞骨架不仅在维持细胞形态，承受外力、保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用，而且还参与许多重要的生命活动，如：在细胞分裂中细胞骨架牵引染色体分离，在细胞物质运输中，各类小泡和细胞器可沿着细胞骨架定向转运；在肌肉细胞中，细胞骨架和它的结合蛋白组成动力系统；在白细胞(白血球)的迁移、精子的游动、神经细胞轴突和树突的伸展等方面都与细胞骨架有关。另外，在植物细胞中细胞骨架指导细胞壁的合成。

5、列举你所知道的动、植物细胞中由微丝组成的结构。

肌原纤维、微绒毛、应力纤维

6、显示细胞骨架的原理是什么？说明实验中使用的TritonX-100、戊二醛、考马斯亮蓝R-250的作用。

原理：用考马斯亮蓝对细胞骨架进行染色，染色观察前，应首先用去垢剂抽提掉胞质中的除骨架以外的其他蛋白。

TritonX-100：非离子型去垢剂，可使细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提。

戊二醛：固定细胞

考马斯亮蓝R-250：蛋白质染料，对细胞骨架染色。

7、显示脂类时，制片及染色有何特殊之处？

制片时需要用10%甲醛钙固定液进行固定，要求用苏丹Ⅲ饱和溶液染色，但是对不同部位的脂类进行处理时有区别。

8、简述Fenulgen反应的原理和实验的关键步骤。

原理：DNA经弱酸水解后，嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键打开，并且使脱氧核糖与磷酸间的磷脂键打开，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基，醛基在原位与Schiff试剂结合，形成紫红色复合物，使细胞内含有DNA的部位呈紫红色的阴性反应。关键步骤：①Schiff试剂遮光染色30min，一定要遮光；

②压片时，一定要压均匀，否则细胞会重叠，影响观察； ③洗玻片上的试剂，要注意样品不被洗掉。

9、试述差速离心法分离细胞器的原理。

在一定的离心场中（选用离心机的一定转速），球心颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。在一均匀的悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。

10、试述密度梯度离心法分离细胞器的原理。

用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

11、为什么要事先向小鼠腹腔注射淀粉肉汤悬浮液？吞噬细胞的变形运动及吞噬作用的生物学机理是什么？

①诱导小鼠腹腔大量产生巨噬细胞，使其聚集； ②细胞膜具有一定的流动性。

第三篇：细胞生物学实验考总结

一、显微镜

答：1.构造主要分为三部分--机械部分、照明部分、光学部分；

2.显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜放大倍数的乘积；

3.对光—打开光圈，将聚光器上升，调节反光镜的方向，使光线射入镜筒中，直到求得明亮而均匀的视野为止，或打开电源，调节光照亮度旋钮，直到光亮度最适宜为止。

二、用不同PH的固绿染色液染色显示细胞内碱性蛋白和酸性蛋白时，为什么标本事前需要经过三氯醋酸处理？

答：处理核酸以避免对蛋白质观察的影响

三、用甲基绿—派罗宁混合染液染色，为什么可使细胞内的DNA与RNA分别显示出来？

答：利用DNA和RNA聚合程度的不同而对碱性染料有不同的亲和力，可进行选择性染色。由于甲基绿分子上有两个相对的正电荷，它对聚合程度高的DNA有强的亲和力；而派罗宁分子只有一个相对的正电荷，它仅和聚合程度较低的RNA相结合。由此，DNA和RNA可被分别染色。

四、细胞化学的解释

答：细胞化学方法是在保持细胞结构的基础上，利用某些化学试剂与细胞内的一些物质发生化学反应，并使其最终的反应产物变为有色的沉淀，从而可定性地指出某些化学成分在细胞中的位置。

五、溶血原理

答：当溶质分子透入红细胞使胞质内溶质浓度增加时，导致水分的摄入，当红细胞膨胀到一定程度时细胞膜破裂，发生溶血（溶血就是浓密的不透明的红细胞悬液突然变成红色透明的血红蛋白溶液的过程）。

六、细胞内各组分如何分离？分离原理是什么？

答：细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内的各种组分分级分离出来。

七、生长区的特点

答：生长区细胞略呈方形，排列紧密，染色较深。此区细胞大多处于分裂状态，易于见到许多处于不同分裂期的细胞。

八、终变期的特点

答：染色体更为粗短，形成Y、V、O、X等形状，终变期末核膜、核仁消失。

九、说明动植物细胞有丝分裂的区别

答：1.前期纺锤体的形成：植--细胞两极发出纺锤丝，形成纺锤体；动—由已经复制的，移向两极的两组中心体发出星射线，由星射线形成纺锤体。

2.末期子细胞的形成：植—在赤道板位置上出现细胞板，扩展形成细胞壁，结果形成两个子细胞；动—细胞膜从细胞的中部向内陷，把细胞质缢裂成两部分，使一个细胞分裂成两个子细胞。

十、比较有丝分裂与减数分裂过程的异同点

答：1减数分裂过程中细胞连续分裂两次，而有丝分裂过程中细胞只分裂一次；

2减数分裂的结果是染色体数目减半，而有丝分裂的结果是染色体数目不变；

3减数分裂后，一个细胞形成四个含有不同遗传物质组合的子细胞，而有丝分裂后，一个细胞只形成两个遗传物质相同的子细胞；

4减数分裂过程中有其特有的同源染色体配对和同源非姐妹染色单体间的局部交换，而有丝分裂没有。

十一、超活染色法

指从活的生物体分离部分细胞和组织，使之保持其生活状态，然后用活体染色剂进行染色的一种方法

十二、中性红

液泡系特殊的活体碱性染料，一方面具有溶解类脂的特性，容易浸润、穿越细胞膜类脂双分子层而进入细胞内；另一方面，中性红染料分子（胶粒）表面带有阳离子，可彼此吸引，使其胶粒被固定堆积于液泡内而被染色

第四篇：《细胞生物学实验》教学大纲

《细胞生物学实验》教学大纲

课程名称：细胞生物学实验

课程编号：12030037

课程类别：专业基础课/必修课

学时/学分： 24/0.75

开设学期：第四学期

说明

一、课程性质

细胞生物学实验是生物科学和生物工程专业一门重要的必修基础课程，在生命学科的本科教学中有着十分重要的地位。通过实验，不仅使学生加深对细胞生物学理论知识的理解和认证，同时通过对细胞生命现象的观察和亲手操作，使学生获得有关细胞生命活动的感性知识，有效地提高理论课的教学效果，并使学生掌握细胞生物学实验的基本原理、方法和技能，培养和提高学生实验设计和应用各种实验技术的能力，培养和训练学生的创新意识和创新能力，培养严谨的科学态度和实事求是的作风，提高发现问题、分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事教学或科学研究打下坚实的基础。

二、教学目标

通过细胞生物学实验，使学生们更加牢固地掌握细胞生物学基本知识和基本理论，对细胞的结构和功能有全面、真实的认识，使学生们掌握细胞生物学的基本实验方法和技能。

三、学时分配表 序号

实验项目实验 时数 实验

类型

内容与要求 小计实验1细胞膜的渗透性及细胞凝集反应4设计性了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度，掌握细胞凝集反应的实验方法及细胞凝集的原理实验2叶绿体的分离与荧光观察3验证性掌握荧光显微镜的原理和使用方法；观察叶绿体的自发荧光与次生荧光；

通过对植物叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法实验3植物细胞骨架的观察4验证性掌握光学显微镜观察植物细胞骨架的原理和方法实验4鸡血细胞的体外融合6综合性了解PEG诱导细胞融合的基本原理，通过PEG诱导鸡红细胞之间的融合实验，初步掌握细胞融合技术实验5巨噬细胞吞噬现象的观察7综合性通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡血红细胞的活动观察，加深理解细胞吞噬作用的过程和意义；掌握小白鼠腹腔注射给药方法和颈椎脱臼处死法合计24

四、实验方法与要求建议

本课程采用传统的实验教学方法，2人一组操作，结合多媒体、小组讨论与集体讨论、实验设计、教学录像、细胞生物学小知识和小技巧介绍等多种教学手段，帮助学生通过本课程的学习全面地掌握细胞生物学的基本实验方法与技能以及实验设计的思路，以提高学生从事教学和科学研究的综合素质。

要求学生认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具；实验中严格按操作规程进行，仔细观察，及时记录实验现象及结果，认真做好每一天的实验报告；实验结束后仔细分析和总结实验结果；使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，对任何自己不熟悉的实验仪器都不要随意操作；在操作过程中发现任何意外现象都要及时向任课教师报告；在实验过程中制造的任何垃圾都要丢到垃圾筐里（或先放在自己的桌面废物缸内），严禁随地投弃。

五、考核方式及要求

1.考核方式：考试（√）；考查（）

2.成绩评定：

计分制：百分制（√）；五级分制（）；两级分制（）

成绩构成：实验成绩（100分）=实验预习（10％）+实验态度、卫生、安全（10％）+实验操作（25％）+实验报告（25％）+实验考试（30％）。

本文

实验一 ?细胞膜的渗透性及细胞凝集反应

一、实验性质

实验类别：专业基础课/必修

实验类型：设计性

计划学时：4学时

实验分组：2人/组

二、实验目的

1.了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度，分析影响细胞膜渗透性的因素；

2.理解凝集素使细胞发生凝集反应的原理，观察细胞的凝集现象。

三、实验的基本内容和要求

1.制备羊血细胞悬液，加1份羊血和10份0.17mol/LNaCl溶液。

2.制备土豆凝集素的。

3.取10支试管分别加入1mL稀释羊血和10mL不同浓度的试剂，观察是否溶血，如不溶血，观察溶液的颜色有无深浅的变化。

4.用滴管吸取土豆凝集素和2%红细胞悬液各一滴，置载玻片上，充分混匀，静置20min后于低倍镜下观察血球凝集现象。以PBS液加2%红细胞悬液作对照实验。

四、实验仪器设备及材料

10ml移液管、1ml移液管、试管架、试管、烧杯、显微镜、粗天平、载玻片、盖玻片、土豆块茎、0.17mol/L氯化钠、0.17mol/L硝酸钠、0.12mol/L硫酸钠、0.17mol/L氯化铵、0.17mol/L醋酸铵、0.12mol/L草酸铵、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L丙酮、新鲜羊血（加抗凝剂）、PBS缓冲液

五、实验操作要点

1.血细胞悬液的制备

2.低渗溶液

3.血红细胞的渗透性实验

4.土豆凝集素的制备

5.凝集反应

六、实验教学建议

先让学生通过查资料和实验指导书提前预习该实验，实验课上让1-2位学生来讲实验原理，操作步骤，其他同学做补充，老师做点评和总结，指出实验中注意事项等。学生自己以小组为单位配置所有药品并进行实验。

实验二 叶绿体的分离与荧光观察

一、实验性质

实验类别：专业基础课/必修

实验类型：验证性

计划学时：3学时

实验分组：2人/组

二、实验目的

1.通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法；

2.观察叶绿体的自发荧光和次生荧光，并熟悉荧光显微镜的使用方法。

三、实验的基本内容和要求

叶绿体的分离与观察、菠菜叶片徒手切片观察。

四、实验仪器设备及材料

研钵、粗天平、纱布、量筒、离心管、滴管、普通离心机、荧光显微镜、普通光学显微镜、0.35mol/L的NaCl、0.01%丫啶橙、新鲜菠菜

五、实验操作要点

1.叶绿体的分离与观察

2.菠菜手切片观察

六、实验教学建议

先让学生通过查资料和实验指导书提前预习该实验，实验课上让学生来讲实验原理和操作步骤，其他同学做补充，老师做点评和总结，指出实验中注意事项之后学生再进行实验等。

实验三 植物细胞骨架的观察

一、实验性质

实验类别：专业基础课/必修

实验类型：验证性

计划学时：4学时

实验分组：1人/组

二、实验目的

了解细胞骨架的结构特征及制备技术。

三、实验内容

制备植物细胞骨架、用光学显微镜观察细胞骨架的原理和方法。

四、实验仪器设备与试剂

1.材料：洋葱鳞茎

2.试剂

(1).磷酸盐缓冲液

(2)M缓冲液

(3)1% TritonX-100：用M缓冲液配置。

(4).2%考马斯亮蓝R-250： 46.5ml甲醇、7 ml 冰醋酸、46.5ml蒸馏水。

(5).3%戊二醛：用6mmol/L磷酸盐缓冲液配置。

(6).0.2M磷酸盐缓冲液。

3.器材和仪器：小烧杯 镊子 滴管 载玻片 盖玻片 显微镜

五、实验操作要点

1.取材：撕取洋葱鳞茎内表皮细胞（约1cm2大小）置于装有6mmol/L磷酸盐缓冲液的烧杯中，使其下沉；

2.抽提：吸去磷酸盐缓冲液，用1% TritonX-100处理20~30min.；

3.冲洗：吸去TritonX-100，用M缓冲液洗3次，每次10min；

4.固定：3%戊二醛固定30min；

5.冲洗：6mmol/L磷酸盐缓冲液洗3次，每次10min；

6.染色：0.2%考马斯亮蓝R-250染色20min；

7.制片：用蒸馏水洗1-2次，将标本置于载玻片上，加盖片；

8.观察：光镜下可见表皮细胞的轮廓，细胞内存在着染成蓝色、粗细不等的纤维网络结构，即为构成细胞骨架的微丝束。

六、实验教学建议

先让学生通过查资料和指导书提前预习该实验，实验课上让学生来讲实验原理，其他同学做补充，老师做点评和总结，指出实验中注意事项，学生进行实验。

实验四 鸡血细胞的体外融合一、实验性质

实验类别：专业基础课/必修

实验类型：综合性

计划学时：6学时

实验分组：2人/组

二、实验目的

掌握细胞融合原理，应用PEG融合细胞的方法以及细胞融合率的计算。

三、实验内容

动物细胞的制备、融合和观察。

四、实验仪器设备与试剂

1.材料：家鸡

2.试剂：

(1).50%PEG（MW4000）

(2).Hanks液

(3).0.85%生理盐水

(4).肝素

3.器材和仪器

注射器、试管、离心管、移液管、酒精灯、载玻片、盖玻片、水浴锅、普通光学显微镜、离心机

五、实验操作要点

1.鸡血细胞的获得

2.促融剂的配制

3.鸡红细胞的收集

4.细胞融合反应

5.终止反应

6.镜检

六、实验教学建议

先让学生通过查资料和指导书提前预习该实验，实验课上让学生来讲实验原理，其他同学做补充，老师做点评和总结，指出实验中注意事项，学生进行实验。

实验五 巨噬细胞吞噬现象的观察

一、实验性质

实验类别：专业基础课/必修

实验类型：综合性

计划学时：7学时

实验分组：2人/组

二、实验目的

1.通过对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察，加深理解细胞吞噬作用的过程及其意义；

2.掌握小鼠腹腔注射给药和脊椎脱臼处死方法。

三、实验内容与要求

对小白鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞活动的观察、理解细胞吞噬作用的过程；掌握小鼠腹腔注射给药和脊椎脱臼处死方法。

四、实验仪器设备与试剂

（一）器材

显微镜、解剖盘、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片、注射器、吸管、吸水纸

（二）试剂

1.0.85%生理盐水

2.Alsever溶液

3.4％台盼蓝染液

4.6％淀粉肉汤(含台盼蓝染液)

（三）材料

1.小白鼠

2.1% 鸡红细胞悬液

自健康鸡翼静脉采血或从集市杀鸡处接血lml(防止污染)，放入盛有4ml AlseVer溶液瓶中，混匀置4℃冰箱保存备用(一周内使用)。使用前加入0.85％生理盐水离心(1 500r／min 10min)洗涤二次，再用生理盐水配成l％浓度悬液。

五、实验操作要点

1.在实验前—天，给小白鼠腹腔注射6％淀粉肉汤(含台盼蓝)1m1。注射时，先用右手抓住鼠尾提起，放在实验台上，用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳和头颈皮肤，将鼠体置于左手心中，把后肢拉直，用左手的无名指和小指按住尾巴与后肢，前肢可用中指固定，即可在腹部后l／2处的一侧注射。进针勿过深，否则易损害肝及血管等，造成出血致死；

2.?实验时，每组取一只注射过淀粉肉汤的小白鼠，腹腔注射l％鸡红细胞悬液lml，轻按小白鼠腹部，使悬液分散；

3.?20min后，用脊脱臼法处死小鼠(右手抓住鼠尾，用力向后拉，左手拇指与食指同时向下按住鼠头，使脊髓与脑髓间断开致鼠死亡)；?

4.将小鼠置于解剖盘中，剪开腹部，把内脏推向一侧，用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液；

5.?每人取一张干净载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片，置显微镜下观察。

六、实验教学建议

先让学生通过查资料和指导书提前预习该实验，实验课上让学生来讲实验设计思路，其他同学做补充，老师做点评和总结，指出实验中注意事项、学生进行实验。

参考教材

[1]细胞生物学实验（第二版).杨汉民主编，高等教育出版社 [2]细胞生物学实验指导.李素文主编，高等教育出版社

[3]细胞生物学实验教程.安利国主编，科学出版社

第五篇：提交 细胞生物学实验教案汇总

细胞生物学实验

Cell Biology Experiment

目 录

1.显微镜的结构及细胞形态观察、大小测量和死活细胞鉴定 2.液泡系和线粒体的活体染色 3.叶绿体的分离与观察

4.DNA的细胞化学——Feulgen反应 5.多糖的显示——PAS反应

6.细胞内碱性蛋白和总体蛋白的原位显示 7.细胞骨架的光学显微观察和永久制片技术 8.植物原生质体的制备与融合 9.蚕豆根尖微核试验 10.膜的通透性

11.血细胞的分化和不同类型血细胞的观察

实验报告要求

1．注意页面四边留白，不要挤到页边！2．抬头填写完整。

3．注意事项自己总结，不要抄袭！4．组长检查后上交存档。

生物绘图注意事项

1．2H 以上绘图铅笔削尖、绘图橡皮、直尺

2．边看显微镜边按视野中实际情况绘图，以精确为主，不能艺术加工。

3．应找到最典型、最能说明绘图目的的物像来绘图。先轻勾出轮廓，检查无误后，再以准确清晰的线作最后描绘。

①实线表示轮廓，虚线表示被遮蔽但需表现的轮廓，线粗细应均匀有规律

②圆点的疏密表示明暗、凹凸（越暗的地方点越多）点点时笔尖直立，点大小、疏密要均匀、整齐、浑圆，不能像“，”。

4．用尺向右侧引出水平指示线，线右端平齐字注在右侧。图下方写上所画图的名称及放大倍数。图的右侧和下方需写文字说明，所以图应绘在绘图纸上偏左上方的位置。

5．一幅图只要详细画出部分结构，其余勾画出轮廓即可。

规范

不规范

实验一 普通显微镜的使用及细胞形态观察、大小测量和死活细胞鉴定

一、实验目的

1．熟悉普通光学显微镜的基本构造和性能，掌握使用方法。2．了解细胞的一般形态和基本结构。

3．掌握显微测微尺的使用，对细胞大小有一直观认识。4．了解鉴定死活细胞的方法。

二、实验原理

1．显微测微尺的使用

镜台测微尺：表示绝对长度，长1 mm，分成100小格，每小格为0.01mm。不被用来直接测量，而是用它来校正目镜测微尺，故其质量对所测微体影响极大。

目镜测微尺：是一块比目镜筒内径稍小的有标尺的圆形玻璃片，标尺长10毫米、分为100格。需要镜台测微尺校正为绝对长度再测定细胞大小。

2．死活细胞鉴定:台盼蓝是一种低毒的活体染色剂，只能透过质膜受损的细胞或死细胞。

三、实验用品 1．试验材料：

洋葱内表皮细胞

口腔上皮细胞、（人的口腔上皮细胞是扁平、多边形的，形状不很规）

2．试剂

0.2%台盼蓝溶液 3．仪器

测微尺（2套）、普通光学显微镜、刀片、镊子、玻璃滴管、吸水纸、牙签。

四、试验方法

一、细胞死活的鉴定

0.2%台盼蓝染色5-10分钟后进行观察。

二、细胞大小测量

1）测量时，镜台微台尺换成样本，2)目镜测微尺来测量细胞的大小

3)改变显微镜的放大倍率，则需对目镜测微尺重新进行标定。

三、细胞形态的观察

五、注意事项

取口腔黏膜上皮细胞注意的问题

1．口腔上皮细胞主要分布在口腔两侧颊部。用消毒牙签的钝端，在漱净的口腔任意一侧的颊部，轻轻刮几下。

2．取材前，口腔一定要用清水漱净，去除口腔内的食物残渣。

3．用方签在口腔壁上轻轻刮动，不要刮在牙缝里，因为牙齿上刮下来的是食物碎屑，不是口腔上皮细胞。

六、作业

1．绘制口腔黏膜上皮细胞及洋葱内表皮细胞图（2-3个细胞）

2．列表写出洋葱内表皮细胞长轴、短轴长度，并计算平均值。（取3个细胞）3．取口腔黏膜上皮细胞注意的问题 4．生物绘图注意事项

实验二 线粒体和液泡系的超活染色与观察

一、实验目的

1、了解细胞和细胞器的超活染色技术。

2、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡的形态、数量和分布,了解植物细胞液泡系的发育过程。

二、实验原理

活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。它的目的是显示活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活染技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。

根据所用染色剂的性质和染色方法的不同，通常把活体染色分为体内活染与体外活染两类。体内活染是以胶体状的染料溶液注入动、植物体内，染料的胶粒固定、堆积在细胞内某些特殊结构里，达到易于识别的目的。

体外活染又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。

活体染色之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是染料的电化学特性起重要作用。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此就发生了吸引作用。但不是任何染料都可以作为活体染色剂之用，应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，而且总要配成稀淡的溶液来使用。一般是以碱性染料最为适用，可能因为它具有溶解在类脂质的特性，易于被细胞吸收，Janus green B和中性红两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色各有专一性。

线粒体是细胞内重要的细胞器，线粒体内膜上分布有细胞色素氧化酶，该酶能使詹姆斯绿B保持在氧化状态，呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而细胞质中的染料被还原成无色。液泡 5

是细胞内浓缩产物的主要场所，有十分重要的功能。中性红是液泡的特殊染色剂，将液泡染成红色。在活细胞中，细胞质和细胞核不着色。如果细胞死亡，染料会弥散开来，使核着色。

三、实验用品

（一）器材

显微镜、恒温水浴锅、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、吸管、牙签、吸水纸等。

（二）试剂

1、Ringer 溶液 生理盐水、缓冲液

氯化钠0.85g（变温动物用0.65g）；氯化钾 0.25g ；

氯化钙 0.03g ；蒸馏水100ml 2、10%、1/3000中性红溶液

称取0.5中性红溶于50ml Ringer溶液，稍加热（30-40度）使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。

临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。3．1%、1/5000詹姆斯绿B溶液

称取50mg詹姆斯绿B溶于5ml Ringer溶液中，稍加 微热（30-40度）使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液1ml加入49ml Ringer溶液，即成1/5000工作液，装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。

（三）材料

人口腔上皮细胞、洋葱鳞茎内表皮细胞、小麦幼根根尖。

四、实验方法

(一)线粒体的超活染色与观察

1、人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色观察

载玻片→ 37℃水浴锅的金属板→滴两滴詹纳斯绿B染液

牙签→从口腔粘膜刮取上皮细胞→放入载玻片染液→染色10-15分钟（注意不可使染液干燥, 必要时可再加滴染液）→盖上盖玻片用吸水纸吸去四周溢出的染液→观察 2.洋葱鳞茎表皮细胞线粒体的超活染色

载玻片→撕取一小片洋葱鳞茎内表皮滴→一滴詹纳斯绿B染液→染色10-15分钟 吸去染液→加一滴Ringer液，注意使洋葱内表皮展平→盖上盖玻片→观察

（二）液泡系的超活染色与观察

刀片→小麦幼苗根尖→切一纵切面→中性红染色5-10分钟

吸去染液→加一滴Ringer液→盖上盖玻片→镊子轻轻下压盖玻片→观察 五．实验结果

在小麦根尖细胞制片中，可见细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分空间，将细胞核挤到细胞一侧贴近细胞壁处。六．注意事项

1、詹姆斯绿B溶液现用现配，以保持它的充 分氧化能力。

2、实验中速度要快，以免组织细胞死亡。

七、作业 ．画出你所观察到的线粒体和液泡的图像.2 ．总结实验成功或失败的原因.实验三 叶绿体的分离与观察

一、实验目的

通过植物细胞叶绿体的分离，了解细胞器分离的一般原理和方法。

二、实验原理

细胞器分离的过程包括两个主要阶段：破碎细胞和细胞组分的分离。叶绿体的分离采用在等渗溶液中进行组织匀浆、分离。叶绿体的分离采用差速离心或密度梯度离心法进行。差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。差速离心的分辨率不高，沉降系数在同一个数量级内的各种粒子不容易分开，常用于其他分离手段之前的粗制品提取。

三、实验用品

1.材料： 菠菜叶片

2.试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液

3.仪器：普通离心机、天平、显微镜、镊子、载玻片、盖玻片、离心管、吸水纸等

四、实验方法

1.菠菜叶片(去叶脉)3g → 0.35mol/L氯化钠15ml→研磨(冰浴)→匀浆过滤(6层纱布)→滤液在1000rpm离心2min→弃沉淀，上清液3000rpm离心5min →去上清液→沉淀为叶绿体(混有部分细胞核)，用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮 →滴片观察

2.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用用普通光学显微镜观察叶绿体的形态结构 3.菠菜叶手切片观察

新鲜菠菜叶，刀片切出一斜面置于载玻片上，滴加1-2滴NaCl溶液，盖上盖片，显微镜下观察。用镊子摄取或刀片刮取新鲜菠菜叶片叶肉，滴加1-2滴NaCl溶液，作临时装片。

五、实验结果

1.普通光镜下，可看到叶绿体为绿色橄榄型，高倍镜下可看到叶绿体内部含有较深的绿色颗粒，即基粒。

2.菠菜叶手切片在普通光镜下可以看到三种细胞：表皮细胞、保卫细胞、叶肉细胞。叶肉细胞呈长方形或类方形，内含大量带有绿色的叶绿体颗粒。另外，视野下还可见到大量散在的点状或类圆状叶绿体颗粒。

3.红辣椒细胞中有许多红色小颗粒，这就是杂色体。杂色体分散在细胞质中。

六、注意事项

1.叶绿体的分离应在等渗溶液(0.35mol/L氯化钠)中进行,以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。

2.分离过程最好在0-5℃的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。3.离心机使用：离心管要平衡

七、作业

1.根据显微观察结果，绘制菠菜叶的结构模式图。

实验四 细胞骨架的光学显微观察和永久制片技术

一、实验目的

掌握植物细胞内细胞骨架的光学观察方法，了解细胞骨架在细胞内的分布特点。

二、实验原理

细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。

光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100处理细胞，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮蓝R250染色，使得胞质中细胞骨架得以清晰显现。

Triton X-100：是非离子型表面活性剂（去污剂）。适当浓度的Triton X-100处理细胞时，可将细胞质膜中和细胞质中的蛋白质和全部脂质被溶解抽提，但细胞骨架系统的蛋白质不受破坏而被保存。这样，使细胞骨架图像更清晰。

考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝，但是由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的应力纤维（微丝束），直径约40nm左右。

戊二醛能固定，较好的保存细胞骨架成分。

M－缓冲液： 稳定F-肌动蛋白使得细胞骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张，便于观察。磷酸缓冲液（PBS）：含有生理盐水，可使细胞不被破坏，能保持原有状态下的结构。

三、实验用品 1.实验材料

新鲜洋葱鳞茎的内表皮。2.实验器材

普通光学显微镜、10mL小烧杯、镊子、刀片、载玻片、盖玻片、载玻片、盖玻片、、擦镜纸、PH 计、水浴锅。3.试剂：

M－缓冲液、磷酸缓冲液（PBS）、3%戊二醛、1%Triton-100、0.2%考马斯亮蓝R250

四、试验方法

21.用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片（约0.5cm大小若干片），置于1.5ml离心管中，加入PBS（1.5mL左右），使其下沉（10min左右）。2.吸去缓冲液，用1%Trion X-100处理15-20min。3.吸去Trion X-100，用M缓冲液洗3次，每次5min。4.用3%戊二醛固定30min。

5.PBS（1.5ml左右）洗3次，每次3min，滤纸吸去残液。6.0.2%考马斯亮蓝R250染色至少30min。

7.蒸馏水洗涤2次，然后将样品置于载玻片上，加盖玻片，在普通光学显微镜下观察。8.选取观察效果好的制作永久切片于脱水剂中每级5-10min，第一滴阿拉伯树胶封片。

五、实验结果

观察：镜下可见洋葱表皮细胞轮廓，微丝束呈深蓝色。转换高倍镜观察，转动微调，可见细胞骨架的立体结构。

六、注意事项：

1.撕取洋葱鳞茎内表皮不可带茎肉，样本要展开铺平。

2.去垢时间不要超过30min。

3.染色时间需掌握好，必要时可分别设不同染色时间比较。

4.由微丝组成的应力纤维（张力纤维）是一种动态结构，细胞充分贴壁铺展时纤维挺直、丰富；反之，细胞收缩变圆，应力纤维弯曲，甚至部分解聚消失而显稀少。

七、作业

绘出植物细胞骨架微丝的分布图。（2-3个细胞）补充：

① 6mmol/L PBS(pH6.8)A液：NaH2PO4·2H2O 936mg/1000ml B液：Na2HPO4·12H2O 2148mg/1000ml

工作液：A液53.7ml + B液46.3ml（用NaHCO3调pH值至6.8）② M缓冲液（pH值7.2）咪唑 50mmol/L KCl 50mmol/L MgCl2 0.5mmol/L EGTA 1 mmol/L EDTA 0.1 mmol/L 巯基乙醇1 mmol/L 甘油4 mmol/L 加蒸馏水至1000ml，用1mol/L HCL调pH值为7.2。

③ 1%TritonX-100: TritonX-100 1ml M缓冲液99ml ④ 0.2%考马斯亮蓝R250染液： 考马斯亮蓝R250 0.2g 甲醇 46.5ml 冰醋酸 7ml 蒸馏水 46.5ml 5.3%戊二醛

25%戊二醛12ml PBS（2液）88ml ⑤脱水剂 50%乙醇 70%乙醇 95%乙醇 100%乙醇 二甲苯

实验五 DNA的显示—— Feulgen反应

一、实验目的

1、了解Feulgen染色反应原理；

2、掌握Feulgen染色的方法，观察染色结果。

二、实验原理

根据DNA经盐酸水解后，打开了嘌呤碱基和脱氧核糖连接的键，在脱氧核糖的一端形成游离的醛基。这些醛基就在原位与Schiff试剂结合，形成紫红色的化合物。所以凡有DNA的部位，就呈现为紫红色。

Feulgen反应是特异性显示DNA的最经典方法，即可进行DNA定位显示，又可用显微分光光度计进行定量分析。Feulgen反应对组织中DNA的检测具有高度专一性。组织中除DNA外还有多糖、RNA和其他自由醛基可以被盐酸酸解掉。

三、实验用品

四、实验方法

①取小麦根尖和洋葱内表皮（绿豆大小）浸入预热至60℃的1N HCl中水解，时间10 min。10

②蒸馏水洗后，转入Schiff液中避光染30 min，待根尖变为深红色； ③在新配亚硫酸水中洗3次，每次 1 min；

④自来水洗 5 min，在载玻片上切下深红色根尖备用； ⑤制片镜下观察，根尖镊子捣碎压片。

五、注意事项

六、作业

绘图描述所观察到的试验结果。

实验六 多糖的显示——PAS反应

一、实验目的

通过PAS反应，了解糖原显示的基本原理、方法以及糖原在细胞中的分布。

二、实验原理

PAS反应是显示多糖的最经典、也是最直接的细胞化学方法。用具有强氧化作用的过碘酸处理使多糖中葡萄糖的乙二醇基氧化成两个游离的醛基，醛基与Schiff试剂结合可形成紫红色的化合物，颜色深浅与多糖含量成正比。单糖易被抽提掉，多糖包括糖原、粘多糖、粘蛋白、糖蛋白、糖脂、淀粉和纤维素。

三、实验用品

1.材料：马铃薯块茎

2.试剂：0.5%高碘酸、schiff试剂、亚硫酸水、70％酒精 3.器材：显微镜、刀片、镊子、载玻片、盖玻片、水浴锅

四、实验方法

1、取马铃薯块茎切成薄片，浸入过碘酸溶液10分钟；

2、用70％的酒精冲洗1次；

3、将薄片放入Schiff试剂中20－25分钟；

4、在新配亚硫酸水中洗3次，每次 1 min；

5、蒸馏水洗片刻；

6、将薄片放在载玻片上吸去水分，加上盖玻片，镜下观察。

五、注意事项

按上述操作，细胞中水溶性糖类已丧失，被染色的是不溶性的碳水化合物。

六、作业

绘制实验结果，并描述。

实验六 细胞内碱性蛋白和总体蛋白的原位显示

一、实验目的

1.掌握细胞内酸、碱性蛋白的鉴别方法； 2.了解酸、碱性蛋白在细胞内的分布情况。

二、实验原理

蛋白质是一种两性电解质，在碱性环境中，蛋白质带负电，在酸性环境中，蛋白质带正电。所以，利用各种蛋白质在不同ph下，因等电点不同而产生的与固绿染液（一种弱酸性染料它对碱性物质的亲和力强）结合能力的差异。对细胞中的蛋白质染色，可使细胞内的酸性蛋白（等电点偏向酸性）和碱性蛋白（等电点偏向碱性）分别显示。总体蛋白pI4.7-6.75，组蛋白pI8.5。试验用酸性染料pH2.2，碱性染料pH8.0 核酸的存在会影响实验结果,用三氯醋酸处理可提出核酸。

三、实验用品

1、试验材料

洋葱鳞茎内表皮或根尖

2、试剂

10%福尔马林、5%三氯醋酸、0.1%酸性固绿染料（酸染）、0.1%碱性固绿染料（碱染）

3、器材

显微镜、水浴锅、载玻片、盖玻片、吸水纸

四、实验方法

1.材料固定 洋葱鳞茎内表皮若干片，10%福尔马林固定液中固定15min，蒸馏水洗2次。2.抽提核酸 5％三氯醋酸中90℃，15min，蒸馏水洗数次（3min以上）以冲去痕迹的三氯醋酸。3.染色

①一张片滴加0.1％碱性固绿(pH8.0)中染色5～10min。

②另一张片滴加0.1％酸性固绿(pH2.2)中染色5～10min(视染色深浅而定)。

蒸馏水冲洗（3min），盖上盖片镜检。

五、实验结果

用PH2.2酸性固绿染液染色结果，细胞中蛋白质均被染成绿色，此即总体蛋白在细胞内的分布。总体蛋白-碱性蛋白=酸性蛋白。

用pH8.0碱性固绿染液染色结果，只有细胞核内染色质被染绿色（或浅蓝色），此即碱性蛋白在细胞内的分布。

六、注意事项

使用三氯醋酸处理的目的？

用5%TCA提取DNA是该实验中的关键。DNA必须被提取，以使染色质的负电荷下降，用热TCA提取核酸后，固绿在碱性pH下，碱性蛋白可以选择性地被染色，如未被提取，不能染色，或整个切片染成蓝绿色，水洗或进入酒精即褪色。

七、作业

1、绘制酸、碱性蛋白在细胞内的分布图。

2、总结本次实验的得失。

实验八 植物原生质体的制备与融合

一、实验目的

1.学习植物原生质体的分离制备技术，观察原生质体形态。2.学习细胞融合技术，观察融合细胞的形态及变化。

二、实验原理

除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体，是开展基础研究的理想材料。植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，常用酶解法分离原生质体，其原理是使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分，除去细胞壁。

细胞融合又称细胞杂交指离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。许多化学、物理学和生物学方法可诱导原主质体融合，现在被广泛采用并证明行之有效的融合方法是聚乙二醇(PEG)法、高Ca高pH法和电融合法。PEG作为一种高分子化合物，20～50％的浓度能对原生质体产生瞬间冲击效应，原生质体很快发生收缩与粘连，随后用高Ca高pH法进行清洗，使原生质体融合得以完成。

三、实验用品

1.器具：显微镜、离心机、离心管、剪刀、镊子、吸管、小培养皿、载片、盖片、300目滤网。

2.试剂：酶混合液、洗涤液、20%蔗糖液、PEG溶液、高钙高pH溶液

(1)酶混合液(9CPW):

(2)洗涤液（9CPW）1％纤维素酶

pH 5.6 0.5-0.7％果胶酶

27．2 mg／L KH2PO4 101.0 mg／L KNO3 1480．0 mg／L CaCl2·2H2O 246．0 mg／L MgSO4 0．16 mg／L KI 0．025 mg／L CuSO4 9％ W／V甘露醇

500mg／L MES pH 5.6(3)PEG融合液（pH 5.6）40% PEG(MW 1000-6000)0.3 mol/L葡萄糖 3.5mmol/L CaCl2·2H2O 0.7mm0l/L KH2PO4（4）高钙高pH溶液（pH 10.5）0.1mol/L CaCl2·2H2O 0.1mol/L甘露醇 0.05mol/L Tris 3.材料：菠菜、韭菜叶片

四、实验方法

1、分离原生质体

① 撕叶下表皮

② 酶解 将撕去下表皮的叶片剪成0.5mm宽小块，放在盛有5mL酶液的小培养皿或带盖三 角瓶中，让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层，在25-28℃下酶解60-90分钟。可镜检有较 多原生质体后停止。

2、收集纯化

①用300目网过滤除去未完全消化的残渣。

②酶解液转移至10mL离心管中，配平，以800rpm离心5分钟以上，使原生质体沉降。移液管吸上清，剩下原生质体及残渣于管底。

③加入3ml CPW洗涤液，轻轻吹打均匀，相同条件下离心2-5分钟，弃上清，以彻底去除酶液。

④加入少量CPW洗涤液，轻轻吹打均匀，用注射器向离心管底部缓缓注入20%蔗糖约2—3mL，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液。

⑤以600rpm离心10分钟，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体，注射器针头轻轻插入离心管底部吸取碎片和蔗糖溶液，再吸去上清。

3、制备效果检测（1）血球计数板计数（2）原生质体活力测定

形态识别（完整、饱满、颜色鲜艳）

中性红染色（液泡变红）

台盼蓝染色（不能显色）

观察10个视野计算：

存活率=（活性原生质体/原生质体总数）×100%

4、原生质体融合

（1）取原生质体液两滴，间隔5mm滴于载玻片上，静置8—10分钟，使原生质体沉降。

（2）在两液滴之间滴加一滴40％的PEG溶液，使三液滴相连（可转动载玻片使其混匀）室温下（15-20 ℃）静置5-10分钟，观察原生质体聚集（粘连）现象。

（3）滴加高钙高PH洗液，转动载玻片使其混匀，观察原生质体融合过程。

五、作业

1.按镜下观察绘制2-3个原生质体。2.计算原生质体浓度和存活率。

3.描述原生质体融合过程。

实验九 蚕豆根尖微核检测技术

一、实验目的

1、了解细胞微核形成的机理及其形态特点，2、学习植物根尖细胞的微核检测技术。

二、实验原理

微核试验(The micronucleus test，MNT)是以动植物为材料，采用细胞生物学手段，观测其出现的微核率来表示材料受遗传损伤程度的一种检测遗传毒物的方法。微核是指位于细胞质中独立于主核、直径小于主核，完全与主核分开的圆形或椭圆形的微小核。是真核生物细胞中的一种异常结构，它是由于细胞受到损伤后，由细胞分裂过程中丧失着丝粒的染色体断片或落后染色体产生的。这些断片或染色体在分裂过程中行动滞后，在分裂末期不能进入主核，便形成了主核之外的核块。

蚕豆根尖细胞微核技术已发展的相当成熟，具有较高的灵敏性，作为检测化学品遗传毒性的方法，得到了广泛应用。而且在测定监测淡水污染物和检测化学诱变剂的研究已列入国家生物监测技术规范（水环境部分），并推广应用于大气、废水、土壤等的致突变活性检测。

三、实验用品 1.材料：蚕豆 2.器材

显微镜、恒温培养箱、纱布、镊子、载玻片及盖玻片等。3.药品

盐酸（5mol/L）、70%乙醇、卡诺固定液（用乙醇和冰醋酸以3:1（v/v)混合配制）、石炭酸品红、硫酸铜、待测液。

四、实验步骤

1、浸种催芽

将实验用蚕豆按需要量放入盛水烧杯中，在25℃下浸泡24～48小时，此间至少换水两次，所换水应25℃预温。

种子吸胀后，用纱布松散包裹置瓷盘中，保持温度，在25℃温箱中催芽12～24小时。

待初生根长出2～3mm时，再取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25℃继续催芽，经约36-48小时，大部分初生根长至1～2cm左右，此时可用来进行实验。

2、根尖染毒：

选取初生根生长良好，根长一致的6～8粒种子，放入盛有待测液的培养皿中，阳性检测采用200mg/L硫酸铜,对照用蒸馏水处理，处理时间6-24h，处理液浸没根尖。

3、恢复培养：处理后的根尖用自来水浸洗3次，每次2～3min，洗净后在蒸馏水中恢复培养24h。

4、固定：切取1cm左右的根尖，用卡诺氏固定液固定24h后弃去固定液，固定后的根如不及时制，可换入70%的乙醇溶液中置4℃冰箱中保存备用。

5、酸解：用蒸馏水浸洗固定好的幼根2～3次，每次5分钟，吸净蒸馏水，加入5mol/L盐酸将幼根浸没，室温下酸解10min，幼根软化即可，弃去盐酸，漂洗根尖2～3次，每次1～2分钟，彻底洗净盐酸。

6、染色：截下1-2mm长的根尖，滴加适量的石炭酸品红染液，染色10min，加盖玻片，压片观 15

察。

五、注意事项

1、培养蚕豆时需勤换水

2、处理蚕豆时要将根部浸没于处理液中

3、固定液要现配现用

六、实验结果

污染指数PI值评价水质标准表

污染指数PI值 水质污染等级

基本无污染 0 ～ 1.5 轻污染 1.5 ～ 2.0 中污染 2.0 ～ 3.5 重污染 3.5以上

七、作业

绘图、计算微核千分率和污染指标。

实验十 细胞膜的渗透性

一、实验目的

1.了解溶血现象及其发生机制。

2.了解细胞膜的渗透性及各种物质进入细胞的速度。

二、实验原理

细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障，是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。小的、亲脂性的、非极性分子（如O2、CO2、N2、苯）容易溶解于脂双层，可迅速透过脂双层。小的、不带电荷的极性分子（如水、脲、甘油等）如果足够小时，也能很快透过脂双层；大的、不带电荷的极性分子（如葡萄糖，蔗糖等）以协助扩散或主动运输进入细胞；对于带电荷的分子或离子，由于这些分子的电荷及高的水化度，因此不管多小，都很难透过脂双层的疏水区，它们要通过载体介导的主动运输方式跨膜运输。

将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，有的溶质可进入，有的溶质不能进入，进入红细胞的溶质能提高红细胞的渗透压，使水进入红细胞，引起溶血。由于不同溶质透入速度不同，溶血时间也不同，因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。

三、实验用品

1．材料: 鸡血溶于含有抗凝剂的等渗液中（肝素钠0.2mg/mL,一般范围在 0.01-0.2mg/mL；等渗液为0.85% NaCl）2．器材：

试管，试管架，滴管，载玻片，盖玻片，光学显微镜。3．试剂：

低渗溶液：0.0085% NaCl和0.032mol/L葡萄糖；

等渗溶液：0.85% NaCl、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇。10% TritonX-100、2%TritonX-100。

四、实验步骤

1、制备血液稀释液

①抗凝剂的制备：首先称取1克肝素钠粉末，然后加入0.17 M NaCl溶液ml（1∶10的比例），混合均匀，制成肝素抗凝剂。

②血液稀释液的制备：鸡翼下静脉取新鲜血液，按比例（肝素抗凝剂:血液=1∶10）混合均匀，配制成经肝素抗凝的血液。

③按比例（经肝素抗凝的血液∶0.17 M NaCl 溶液=1∶10）混合均匀，形成一种不透明的红色液体。

2、低渗溶液溶血现象观察：

取试管一支加蒸馏水3ml和稀释的鸡血1滴或2滴轻混一下，然后静止注意观察溶液的颜色变化。结果：由于红细胞发生破裂，造成100%红细胞溶 血，使光线比较容易透过溶液，溶液颜色由浑浊的红色逐渐变透明，此即为溶血现象。记录下这个过程所要的时间。

3、鸡红细胞的渗透性记时比较

1）分别取2只试管，各加入3ml的0.85% NaCl、0.0085% NaCl和0.032mol/L葡萄糖 加入2-3滴血红细胞悬液；

2）分别取3只试管，各加入3ml的 0.32 mol／L葡萄糖，0.32 mol／L甘油，0.32 mol／L乙醇，加入2-3滴血红细胞悬液；

3）分别取2只试管，各加入3ml的10% TritonX-100、2%TritonX-100；加入2-3滴血红细胞悬液，观察反应现象。记下时间（自加入稀释血液到溶液逐渐由红色变为透明澄清，红血球全部溶血所需时间），填入表一的空格中。

4、溶血结果的判断

不溶血：液体分2层，上层浅黄色透明，下层红色不透明，镜检红细胞完好。不完全溶血：溶液混浊，上层变红色，镜检有部分红细胞破裂。完全溶血：液体变红而且透明，镜检发现细胞全成碎片。

5、显微观察

血液红细胞的观察滴一滴稀释的血液于载玻片上，盖上盖玻片。用光学显微镜观察细胞的种类、形状和颜色。

细胞破碎的观察在上一步的载玻片的一端滴加清水，在另一端吸水，并在显微镜下观察细胞的破裂。

五、实验结果

将观察到的现象记录，并进行分析。

编号

试

剂

是否溶血

时间

分析原因 2 3 4 5 6

0.85% NaCl 0.0085% NaCl 0.32 M葡萄糖 0.32 M 甘油 0.32 M 乙醇 10% TritonX-100

六、注意事项

1.试管中有红细胞和测试溶液时，不应强力摇晃，以免造成人为的红细胞破裂。

2.取鸡血动作要非常迅速，否则鸡血会凝固。或者先把抗凝剂加入到烧杯中，再加入新鲜的鸡血，边加边震荡即可。

3.长时间在等渗溶液中，由于活细胞会产生代谢产物积累，也会产生溶血，试验时间不宜超过1h。

4.装不同试剂试管注意编号，吸管也要专用切勿混淆，以保证实验结果的准确性。补充：

一、细胞膜的功能

分隔形成细胞和细胞器，为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境，膜的面积大大增加，提高了发生在膜上的生物功能；

屏障作用，膜两侧的水溶性物质不能自由通过； 选择性物质运输，伴随着能量的传递；

生物功能：激素作用、酶促反应、细胞识别、电子传递等；

物质转运功能：细胞与周围环境之间的物质交换，是通过细胞膜的转运功能实现的，其主要转运方式有四种，即单纯扩散、易化扩散、主动转运、入胞和出胞作用。

细胞膜的受体功能：受体是细胞识别和结合化学信息的特殊结构，其本质是蛋白质。

二、常用抗凝血剂包括：

1.非肠道用药抗凝血剂：如肝素；

2.香豆素抗凝血剂类：常用的有双香豆素、华法令和新抗凝等，通过拮抗维生素K使肝脏合成凝血酶原及因子Ⅶ、Ⅸ和Ⅹ减少而抗凝；

3.抗血小板凝集药物：如阿司匹林，对血小板环氧化酶有抑制作用；

4.蛇毒溶栓剂：如去纤酶、抗栓酶和清栓酶，可溶解已形成的血栓使血管再通，从而起到抗凝血作用。

肝素的作用机理

肝素在体内、体外均有强大抗凝作用。与其带大量负电荷有关，可使多种凝血因子灭活。这一作用依赖于抗凝血酶III（antithrombin

III，AT

III）。At

III是凝血酶及因子Ⅻα、Ⅺα、Ⅸα、Ⅹα等含丝氨酸的蛋白酶的抑制剂。它与凝血酶通过精氨酸-丝氨酸肽键相结合，形成At

III凝血酶复合物而使酶灭活，肝素可加速这一反应达千倍以上。

实验十一 血细胞的分化和不同类型血细胞的观察

一、实验目的

1、学习掌握人血涂片和染色的方法。

2、了解各种血细胞的形态特征。

二、实验原理

瑞氏染色液主要染料由碱性美蓝和酸性伊红两种成分组成, 它们与细胞内的嗜酸性和嗜碱性的各种物质既有物理的吸附作用，又有化学的亲和作用, 各种细胞成分化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样，因此使细胞呈现出不同的色彩.伊红和美蓝只能溶解在有机溶剂中，而滴在水中很快形成沉淀，所以染色液必须配成甲醇等有机溶液，临用时加到水或缓冲液中，才能在一定的环境下离解成有色的阴离子伊红和阳离子美蓝，而与细胞中的不同物质相亲和被染色。如滴加到水中很快发生沉淀，容易形成沉渣。

甲醇兼溶剂和起固定细胞两种作用。甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。缓冲液作用：

染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在6.8，偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。缓冲液配制（pH6.4-6.8，弱酸性）。

A：红细胞，B：嗜酸性粒细胞，C：单核细胞，D：中性粒细胞，E：嗜碱性粒细胞，F：淋巴细胞

三、实验用品

显微镜、载玻片、采血针、75%酒精、消毒棉球、瑞氏染液、PBS、吸耳球。

四、实验方法

1.消毒 先按摩取血部位，使血流通畅；再用酒精消毒取血部位（如无名指指尖、耳垂）。2.取血 待酒精干后，刺破皮肤，使血自然流出，或挤压出血。取干净载片，让血滴在离载片一端中4～5毫米处，注意手指持握载片的边缘，勿触及其表面。不能使载片接触取血部位的皮肤。必须两人密切配合，抓紧时间，一人取血，另一人迅速推片。

3.推片 这步最重要，但又不易推均匀。以左手拿该片的两端，迅速用右手取一块边缘光滑的载片做推片。将其一端置于血滴前方，向后移动到接触血滴，使血液均匀分散在推片与载片的接触处，成一直线。然后使推片与载片呈30°～40°角，轻轻移动，然后由前向后推为一均匀的薄片。涂片推好后，迅速在空气中摇，使之自然干燥。

4.染色 将瑞氏染液(伊红-亚甲基蓝)滴在血膜上，至染液淹没全部血膜，染半分钟。加等量蒸馏水(或缓冲液)与染液，加好后，立即用嘴将两液吹匀。混合再染5分钟。最后用蒸馏水把染液冲掉，用吸水纸吸干，自然干燥后，即可观察。5.观察

五、注意事项

1.染色时间与染液浓度,室温高低,细胞多少有关。染液越淡,室温越低, 细胞越多,所需染色时间越长或应适当增加染液量,因此染色时间应视具体情况而定。特别是更换新染料时必须经试染,摸索最佳染色条件。

2.染液不可过少,以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净。冲洗时应用流水将染液冲去,不能先倒掉染液,以免染料沉着于血片上。

3.判断染液是否起到了染色的作用，可在冲洗染色液前观察染液有无一层黄色的金属光泽，如果没有，则表示染色失败。

4.如染色太浅，可按照原来步骤重染。

六、作业

1.绘制自制血涂片中的各种血细胞（至少一种白细胞）。2.用简练的语言概括血液的主要成分和作用。