革兰染色和血浆凝固酶实验

革兰染色和血浆凝固酶实验

实验目的：

掌握革兰染色法的原理以及实验步骤；理解血浆凝固酶试验的原理；掌握血浆凝固酶试验的操作方法以及结果判断。

试验仪器及试剂：

仪器：载玻片、特种铅笔、试管夹、酒精灯、打火机、接种环、染色盘、显微镜

试剂：龙胆紫溶液、碘溶液、脱色液、沙黄溶液、生理盐水、蒸馏水、菌种、金黄色葡萄球菌培养物、EDTA抗凝兔血浆等

实验原理：

革兰染色：细菌的不同显色反应是由于细胞壁对乙醇的通透性和抗脱色能力的差异，主要是肽聚糖层厚度和结构决定的。经结晶紫染色的细胞用碘液处理后形成不溶性复合物，乙醇能使它溶解，所以染色的前二步结果是一样的，但在G+细胞中,乙醇还能使厚的肽聚糖层脱水，导致孔隙变小，由于结晶紫和碘的复合物分子太大，不能通过细胞壁，保持着紫色。在G-细胞中，乙醇处理不但破坏了胞壁外膜，还可能损伤肽聚糖层和细胞质膜，于是被乙醇溶解的结晶紫和碘的复合物从细胞中渗漏出来，当再用衬托的染色液复染时，显现红色。红色染料虽然也能进入已染成紫色的G+细胞，但被紫色盖没，红色显示不出来。

血浆凝固酶试验：致病的葡萄球菌可分泌游离型凝固酶到菌体外，游离型凝固酶能被血浆中的协同因子激活为凝酶样物质，将液态的纤维蛋白原转变为固态的纤维蛋白而使血浆凝固。

实验步骤：

革兰染色：1.标记：用特种铅笔在载玻片上画一个小圈，用来大致确定菌液滴的位置。

2.涂片：滴加一小滴无菌生理盐水与洁净载玻片上，用打火机点燃酒精灯灼烧接种环，待接种环冷却后在培养基中取细菌，然后将菌落或菌苔轻轻涂布散开（菌液标本可直接涂在载玻片上），涂片完成消毒接种环，熄灭酒精灯。

3.干燥：涂片后在室温下自然干燥，也可在酒精灯上略加温，使之迅速干燥，但勿靠近火焰（火焰上方15cm左右，可用手背试温，要求以玻片背面触及手背皮肤热而不烫为宜）

4.固定：用高温进行固定，即用夹子夹取载玻片一端，标本面朝上，在酒精的外焰快速来回移动3~4次，共约3~4秒，放置待冷却后染色

5.染色：（1）初染：龙胆紫溶液染色10

s

后用蒸馏水冲洗，沥去水分

（2）煤染：碘液染色10

s

后用蒸馏水冲洗，沥去水分

（3）脱色：脱色剂脱色10-20

s

后用蒸馏水冲洗，沥去水分

（4）复染与水洗：沙黄溶液染色10

s

后用蒸馏水冲洗，自然干燥后镜检

6.显微镜观察

血浆凝固酶试验：1.取一张载玻片做好标记，一侧滴加生理盐水作为对照，一侧滴加兔血浆

2.接种环灼烧消毒，待冷却后用接种环挑取金黄色葡萄球菌在生理盐水侧涂匀；接种环灼烧消毒，待接种环冷却后再跳去金黄色葡萄球菌在兔血浆侧涂匀，5-10秒内观察结果

实验结果：

实验分析：

革兰染色：1、涂片时动作要轻柔，使其薄而均匀，动作过大会改变细菌的排列形式

2、固定这一步骤能杀死细菌，固定细菌结构，保证菌体能牢固地黏附在载玻片上，以免水洗时被水冲掉，并且能改变菌体对染料的通透性。

3、龙胆紫是碱性染料可与细菌的DNA

结合使细菌呈紫色

4、媒染剂的作用使增强染料与细菌的亲和力更好地加强染料与细菌的结合5、脱色是革兰染色的关键步骤，目的是帮助染料从被染色的细菌中

脱色，利用细菌对染料脱色的难易程度不同而将细菌加以区分；革兰阳性细菌不易被脱色剂脱色，而革兰阴性菌则易被脱色

6、复染的目的是使脱色的细菌重新染上另一种颜色，以便与未脱色菌进行比较

7、革兰阳性菌经染色后呈紫色而革兰阴性菌呈红色，另外要注意，在实验中经常会出现假阳性和假阴性的结果，假阳性主要是由于脱色不完全，可能是由于涂片过厚,或者是结晶紫染色过度，导致脱色不完全。假阴性可能是因为细胞固定过度，造成细胞壁通透性的改变，而出现假阴性结果;另外,细胞培养时间太长,可能已经有部分细胞发生死亡或者自溶,也导致细胞壁通透性的改变而出现假阴性结果。

血浆凝固酶试验：1、血浆凝固酶是鉴定致病性葡萄球菌的重要指标。

2、运用玻片法血浆凝固酶试验可检测游离型凝固酶，使用EDTA抗凝兔血浆试验效果最佳。

3、血浆凝固酶试验结果的判断:出现明显的凝聚颗粒为阳性、无凝集颗粒为阴性。