基因工程实验方案

第一篇：基因工程实验方案

实验

一、大肠杆菌质粒的提取与电泳检测

一、实验目的

学习质粒DNA提取的基本原理，理解各种试剂的作用，掌握质粒最常用的提取方法，为基因工程提供载体原料。

二、实验原理

将一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖或表达的工具较载体。细菌质粒是重组DNA技术中最常用的载体。质粒是一种独立于染色体外的稳定的遗传因子，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞总，大小从1—200kb不等。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒的复制和转录依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能复制，而宿主即使没有质粒也可以正常存活。但质粒的存在使得宿主细胞具有一些额外的特性，如对抗生素的抗性等。常用的质粒载体大小在2.7—10kb之间。如pBR32、pUC系列、pGEM系列和pBluescript(简称pBS)等。

细菌质粒的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对分子质量小，易于复性的特点进行的。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在较短时间内复性而染色体DNA不能复性。用碱变性方法提取质粒就是利用离子型表明活性剂SDS溶解细胞膜上的脂肪及蛋白，在pH高达12.6的碱性条件下染色体DNA氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，成了杂乱无章的片段。而相对分子质量较小的质粒 DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不完全分离，当pH4.8的NaAc或KAc高盐缓冲液调节pH至中性时，变性的质粒DNA可以完全形成互补链，又恢复到原来的构型。而染色体DNA不能恢复而形成缠连的网状结构，变性DNA与菌体的蛋白质凝聚成块。经过离心，出去的沉淀是变性的染色体DNA和蛋白质杂质，而上清液中的质粒DNA分子，则利用无水乙醇与盐凝聚形成沉淀。由于乙醇沉淀的时候，不光DNA还有性质相似的RNA也一起被沉淀下来。为了除去RNA，可以利用RNA酶进行处理，其后采用苯酚使RNA酶失活。出去RNA酶活性往往会采用一些复合物如苯酚、氯仿等，并且苯酚不仅使RNA酶失活，还能有效去除菌体的蛋白质等物质。因为只用无水乙醇沉淀，样品中还是混有蛋白质。所以为了获得高纯度质粒，应在无水乙醇沉淀前，先用苯酚进行处理，以便除去其中的蛋白质。

三、实验试剂

1.含质粒的大肠杆菌菌株

LB培养基：1%蛋白胨、0.5%酵母粉、1%Nacl、调pH7.2 抗生素：氨苄青霉素：母液100mg/mL，工作浓度100ug/mL 溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。TE缓冲液（pH=8.0）：10mmol/LTris-Hcl/1mmol/LEDTA 2mg/mLRNase A溶解于10mmol/LTris-Hcl(pH7.5)、15mmol/LNacl 3mol/LNaAc(pH5.2 苯酚/氯仿/异戊醇（PCI）、冰冷无水乙醇、冰冷70%乙醇 碱裂解法小量提取质粒DNA步骤如下：

（a）挑单菌落接种于含相应抗生素的LB培养基中，37℃摇菌过夜。（b）每管取1ml菌液然后12,000 g离心30 秒，集菌。（c）加200 l溶液I，用振荡器剧烈振荡悬浮菌体。（d）加300 l新配制的溶液II，温和颠倒混匀5次以上。

（e）溶液澄清后立即加入300 l预冷的溶液III，混匀后冰上放置5分钟。（f）4℃、12000 g离心10（或5）分钟。

（g）取上清，加入等体积的氯仿，颠倒混匀后，4℃、12000 g离心10 分钟沉淀蛋白。

（h）吸取上清，加等体积异丙醇，混匀。室温放置10分钟。

（i）12000 g离心10 分钟，弃上清，再用75%(v/v)乙醇洗涤沉淀，12000 g离心5分钟。

(k)沉淀在37 ℃干燥后后溶于适量水或TE（50ul），（-20°C）保存备用。质粒DNA的检测:取5ul的质粒与2ul的6×上样缓冲液混合后，在0.7%凝胶上电泳检测。

溶液I：50 mmol.L-1Tris-HCl，pH7.5，10 mmol.L-1 EDTA，pH8.0，高压灭菌后室温保存。溶液I的作用：

１、任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此可用适当浓度和适当pH值的Tris-HCl溶液。

２、大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生长。在溶液I中加入高达10 mM的EDTA，无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉。

溶液II：0.2 M/LNaOH，1% SDS（以2M NaOH和10% SDS母液现用现配）用新鲜的0.4 N的NaOH和2％的SDS等体积混合后使用的。要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH，无非是为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性。其实破细胞的主要是碱，而不是SDS，所以才叫碱法抽提。事实上NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。

既然是NaOH溶解的细胞，那为什么要加SDS呢？那是为下一步操作做的铺垫。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，千万不要这时候去接电话，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合不然基因组DNA也会断裂。基因组DNA的断裂会带来麻烦，溶液III：1.32 M KAc（pH4.8），(3mol/L NaAc)高压灭菌后室温保存。加入溶液III后出现大量沉淀，这与SDS的加入有关系。这其实是十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此发生了沉淀。如此看来，溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。大家知道SDS专门喜欢和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，让人高兴的是大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组DNA太长了，长长的DNA自然容易被PDS给共沉淀了，尽管SDS并不与DNA分子结合。

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带。其实这三条带以电泳速度的快慢排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。

实验

二、DNA片段（PCR或者酶切）的体外连接感受态细胞的制备重组质粒的转化阳性克隆的筛选（抗性筛选、蓝白斑筛选）

大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）

此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。1.取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉 淀尽量干燥；

2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl 溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，剧烈振荡；

3.加入200µl 新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管 口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液 II接触，不要涡旋，置于冰浴中；

4.加入150µl预冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5 ml冰乙酸，28.5mlH2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠 的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟； 5.在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；

6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转 速离心5分钟；

7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；

8.加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将 开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～ 10分钟），用适量的ddH2O溶解；

9.用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟； 10.电泳鉴定。

乙醇沉淀DNA 1.加入1/10体积的乙酸钠（3mol⁄L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其 最终浓度为0.3mol⁄L；

2.加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟； 3.12,000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；

4.加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸 去管壁上所有的液滴；

5.于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干； 6.加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。

酶切

1.酶切前确定待切样品的浓度, 并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。2.在离心管中加入如下成分： 10×Buffer 1μl 待切样品xμl 酶 0.5-1μl 加水补足10μl 3.混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。

4.将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间 适当延长。

5.用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶 切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。）

连接

1.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。2.在离心管中加入如下成分： 10×连接Buffer1μl 待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）连接酶0.5-1μl 加水补足10μl 3.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。

4.将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求 而定，一般为22℃1-3hr或16℃连接过夜）。

连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。

感受态细胞的制备

1.挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18℃剧烈震荡，直到A600 达到0.6。

3.将培养物转移到50ml离心管中，4℃4,000rpm/min 离心10min。同时在冰浴 上配置TB溶液。

4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养液被吸干。

5.取1ml刚配的TB溶液打散菌体沉淀，再加入15mlTB（1/3体积的起始培养 液），冰浴10-15min，4℃4,000rpm/min 离心10min。

6.弃上清，沉淀重悬于4mlTB（1/12.5体积的起始培养液），冰浴10min。

7.加入280μl DMSO，缓缓滴入并轻轻摇晃，使其充分混合均匀，冰浴10min。8.将菌液分装于EP管中，-80℃或液氮冻存。

9.取两管感受态细胞分别加入1μl无菌ddH2O（阴性对照）和1μl纯质粒（阳性对照）进行转化（见后），以检测感受态的质量。阴性对照平板上应该无菌落 生长，阳性对照平板上菌落数目的多少显示感受态效率的高低。

注：上述溶液均需高压蒸汽灭菌处理 0.1MK-Pipes(pH=6.7)的配制：

称取3.02gPipes粉末溶于80mlddH2O中，此时粉末不能完全溶解，用10N KOH或KOH固体调节PH值，只有当PH接近6.7时粉末才能完全溶解，此时 当小心少量地加入KOH直至达到所需PH值。

转化

1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。

2.加入1μl纯质粒或连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，立即放入冰浴中2min。4.加入0.9mlSOC，于37℃恒温摇床上200rpm×1hr温育。

5.将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体打散，均匀涂布于含适当

抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃倒置培养过夜。

i.注：新倒的平板可于37℃培养箱中预先放置数小时至过夜干燥。ii.当转化的是TA克隆连接产物时可在菌液中加入8μl 1MIPTG 和40μl 20mg/mlX-gal以进行蓝白斑筛选。

重组子的筛选和鉴定

重组子可通过酶切进行鉴定，也可以利用扩增引物通过PCR进行鉴定，阳 性重组子能切出所需要的片段或得到相应片段的PCR产物。

1.用牙签挑取平板上的菌落接种于2ml含适当抗生素的LB培养基中，37℃摇 床培养过夜。

2.次日取菌液0.2-0.5ml，13,000rpm×3min离心，弃上清，加入20μl ddH2O和 20μl 酚/氯仿，震荡混匀，13,000rpm×5min离心。

3.取上清进行琼脂糖电泳，加入载体质粒DNA作为阴性对照，根据质粒大小 初步筛选重组子，重组子的泳动速度应该慢于载体质粒。4.用碱法小量制备可能是重组子的质粒DNA。

5.选取适当的酶，对重组子进行酶切分析，酶切体积均为10μl体系。酶切样品 进行琼脂糖电泳鉴定是否有所需片段。

6.酶切分析正确的重组子分成两份，一份进行测序反应，另外一份保种。7.若用PCR法鉴定，则在第2步时每个样本取0.5-1.0μl 菌液为模板进行PCR 反应，每管反应体系最低可少至10μl，PCR产物电泳，能得到所需条带的样 本进一步提取质粒酶切鉴定或送样品测序。

第二篇：基因工程实验小结

基因工程实验小结

基因工程实验同以前的实验有所不同，它有很明显的特点。首先是微量操作，所有的实验药品和试剂都是在1.5ml和0.5ml的离心管中进行，转移、加样都是使用移液器进行操作。其次是反应条件要求比较严格。冰浴是实验的关键操作步骤，对于DNA等具有生物活性的物质均需冰浴低温保证其不失活；实验中所用试剂均需较高的纯度，实验中的痕量污染、空气污染等都会影响实验结果，尤其是PCR反应，它对DNA浓度和纯度均有严格的要求。另外，此次的实验是综合实验，每个基础实验联系在一起才有意义，每个实验的结果好坏直接影响下一个实验的结果。而且有些实验的结果并不能直接观察，需要在下一个实验中体现证实。实验所用部分仪器也是以前从未接触过的，如电泳仪，PCR扩增仪，高速冷冻离心机，恒温摇床等。

此次实验主要完成的实验有：大肠杆菌DNA提取，PCR扩增，质粒的连接，感受态细胞制备与转化和α-互补筛选细菌克隆。其中前一个实验的结果均为下一个实验的材料，前两个实验通过琼脂糖凝胶电泳鉴定产物，后三个实验通过特定平板培养的菌落形态鉴定实验结果。由于实验起初对各种仪器和操作不熟悉，导致DNA的SDS法分离纯化结果不佳，PCR产物凝胶成像不是很清楚，经过进一步的分析和操作熟悉，后面的实验结果均良好。由于影响实验结果的因素很多，所以实验中必须每一步都应仔细认真完成。

通过此次实验，完成了基因工程中的基本操作，使我们在学习完《基因工程》理论知识后对抽象的概念、仪器、步骤等有了具体的认识，加深了记忆和理解。

第三篇：基因工程

宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

基因工程

摘要：基因工程是20世纪70年代在分子遗传学、细胞生物学基础上发展起来的，是一种可以按照人们的意愿设计、改造和组建生物品种的新技术。包括它通过基因操作，将目的基因活DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状。

关键词：生物技术；基因工程

一、基因工程的诞生：

从20世纪40年代开始，受分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学取得巨大进步，为基因工程的诞生奠定了基础。现在人们公认的诞生日期是1973年，其中现代分子生物学领域上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性作用。

理论上的三大发现包括：第一，20世纪40年代，Avery 在美国的一次学术会上报道了肺炎球菌的转化，证明了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA分子的双螺旋结构以及半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题；第三，20世纪50年代末的“中心法则”，60年代由Monod 和 Jacob 提出的操纵分子学说，并成功的由一批科学家破译了遗传密码从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

以上问题的解决使得人们自主改造生物遗传性状从理论上成为现实。

技术上的三大发明：第一，1967年发现的DNA连接酶，以及1979年发现的具有更高活性的T4 DNA连接酶。在1970年Smith和 Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化的限制性核酸内切酶HindⅡ和1972年发现的EcoRⅠ核酸内切酶。后来发现的大量的限制性核酸内切酶。第二，一些病毒、质粒和噬菌体等载体技术的发现使把目的基因的导入更加容易。第三，DNA分子序列分析及琼脂糖凝胶电泳、Southern杂交技术的发展使得基因工程的诞生越来越近。1973年，斯坦福大学将抗四环素质粒和抗新霉素的质粒用限制性内切酶切割并连接成重组质粒导入到大肠杆菌中是基因工程诞生的标志。

二、基因工程有几个重要特征：（1）、打破了物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）、通过已知功能基因的遗传转化，进行物种的定向改良；（3）、创造出自然界中本来不存在的物种。

三、基因工程技术流程包括：（1）、目的基因克隆，即从特定生物基因组和cDNA中分离提纯和扩大繁殖目的基因；（2）、选择合适的载体，并对载体DNA进行克隆；（3）、将目的基因与载体宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：

连接；（4）、将重组DNA导入到大肠杆菌或酵母菌体内培养；（5）、利用载体上的标记基因进行筛选，获得转目的基因的细胞或植株。

四、基因工程的应用：

（1）基因工程应用于农业生产方面：农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。

（2）基因工程应用于医药方面：目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和核苷酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。

（3）基因工程应用于环保方面：基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中的2/3烃类降解完，而天然菌株需要1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而大大地提高降解效率。

五、基因工程的安全性问题：

自基因工程诞生以来，基因工程的安全性问题就受到人们极大的关注，关于重组DNA潜在的危险性问题的争论，在基因工程还处于酝酿阶段的时候就已经开始。争论的焦点是担心基因工程宁波大学科学技术学院考核答题纸

（2011--2012学年第 学期）

课号：:EK5G04A00

课程名称：现代生物技术概论

阅卷教师：

班级：10级生物工程

学号：104177306

姓名：郭兆峰

成绩：的杂种生物会从实验室溢出，在自然界造成难以抑制的灾难，有害的杂种菌或病毒与化学物质不同，它们会在自然界不断繁殖，造成的危害更大。

在1975年2月，美国国立卫生研究院（NIH）在加利福尼亚州的Asilomar 会议中心内，160名来自美国和16个国家的专家学者对重组DNA的危害辩论，虽然与会代表分歧挺大，但最后也达成了一些重要的共识，在1976年6月23日美国NIH制定并公布了《重组DNA研究准则》。为了避免可能造成的危害，除了规定禁止若干类型的重组DNA实验外，还制定了许多具体的规定条文。

六、基因工程的前景展望：基因工程技术是继工业革命、信息革命之后 对人类社会产生深远影响的一场革命。它在基因制药、基因诊断、基因治疗、基因芯片和基因克隆等技术方面取得的革命性成果，将极大地改变人类生命和生活面貌。

参考文献：

1、基因工程/楼士林，杨盛昌，龙敏南等主编.—北京：科学出版社，2002

2、基因工程技术/钟卫鸿主编.—北京：化学工业出版社，2007.6

3、基因工程/何水林主编.—北京：科学出版社，2008

4、基因工程原理与技术/刘志国主编.—2版.—北京：化学工业出版社，2010,12

5、基因工程：原理、方法与应用/徐煜泉等编著.—北京：北京大学出版社，2008.12

第四篇：基因工程

《基因工程论文》

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

学

院：生命科学学院 班

级：生物技术12-2 学

号：7011208209 姓

名：陈 昆 任课教师：张锐

嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建

摘要﹕从以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长的解烃菌———地芽孢杆菌MD-2细胞中获得了1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA。将基因sladA克隆到质粒pSTE33上,构建了重组质粒pSTalk。通过电转化将pSTalk转化入嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3内,构建了基因工程菌SL-21。SL-21兼具嗜热和解烃的功能,在70℃条件下,14d后对原油的降解率达75.08%。研究结果表明,可以通过体外重组的方式向嗜热菌中引入烃降解基因,从而构建嗜热解烃基因工程菌。关键词:微生物采油;烃类降解菌;嗜热解烃基因;质粒;基因工程菌

微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要机理之一。研究结果表明,在解烃菌作用下原油的族组分发生变化,轻质组分增加,粘度下降,改善了原油的流动性;同时,解烃菌还可以将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质。迄今为止,从自然界筛选的高效解烃菌绝大多数为嗜温微生物,最适合生长温度一般为20-45℃,很难适应油藏的高温环境。笔者从1株解烃菌细胞中分离出1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段将此基因转化到另外1株最适合生长温度为70℃的嗜热菌体内,构建了嗜热解烃基因工程菌SL-21。该基因工程菌既具有高效的解烃功能,又能适应油藏高温环境,在微生物采油中具有良好的应用前景。1.1 实验材料

实验材料包括限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒、PCR片断回收试剂盒;大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α;pGEM-T easy载体;质粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。LB培养基按文献配制。无机盐培养基组成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO40.001g;MgSO4 0.03g;蒸馏水100mL;pH值为7.2。嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3,分离自胜利油区孤岛油田中一区馆3区块采出液,最适合生长温度为70℃;地芽孢杆菌MD-2,以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长,分离自胜利油区原油污染土壤。1.2 实验方法

DNA的操作 基因组DNA小量提取,利用聚合酶链式反应(PCR)对DNA扩增、PCR产物的回收、酶切与连接,质粒DNA提取和基因序列测定等均按文献[13-14]方法进行。菌株培养 所涉及到的菌株培养均在温度为70℃,转速为180r/min的条件下进行振荡培养。基因工程菌的构建和筛选方法 ZJ-3感受态细胞的制备按文献[13-14]方法进行。用构建的重组质粒pSTalk在最佳条件下电转化ZJ-3感受态细 胞构建基因工程菌。在含有50μg/mL Kan的LB琼脂平板上挑选10个阳性克隆接种到5mL LB培养基中,培养过夜,获得种子液。将该种子液接种到200mL以液蜡为惟一碳源的无机盐培养基中,培养5d后用CCl4抽提剩余的液蜡,用红外测油仪测定烃的剩余量,根据菌株降解液蜡的速率筛选出目的基因工程菌。基因工程菌的诱导表达及SDS-PAGE检测挑取阳性克隆接种于含100μg/mL Amp的10mL的LB液体培养基中,180r/min下振荡培养至光密度值达到0.6(检测光波波长为600nm),加诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,振荡培养8h,收集表达菌体,加SDS上样缓冲液,于100℃水浴10min后上样,用12%的SDS-PAGE电泳检测。基因工程菌降油能力测试 将基因工程菌接入20mL LB培养基中,培养12h,以5 000r/min的速度离心5min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体1次,加20mL无菌生理盐水悬浮,作为菌株利用烷

烃生长的种子液。取菌悬液按1%接种量接入200mL无机盐培养基中,加入2%孤岛油田中一区馆3区块原油或2%的液体石蜡作为惟一碳源培养,取样稀释涂布计数。原油降解实验 在无机盐培养基中添加2%的原油,按1%接种量接入基因工程菌,培养14d。用正己烷萃取降解后的原油,用气相色谱仪测定原油饱和烃组分的降解情况。原油降解率为菌株降解前、后原油量的差值与菌株降解前原油量的比值。2 实验结果与分析

2.1 MD-2基因组DNA的检测

对MD-2基因组进行提取和纯化。提取后的染色体DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,相对分子质量不小于23kb,说明提取的DNA完好。在检测光波波长为260280nm条件下分别测出DNA的光密度,其比值为1.95,换算出DNA的质量浓度为1 400g/mL,表明DNA纯度较好,无蛋白、RNA、酚和多糖物质的干扰。2.2 烷烃单加氧酶基因的克隆与序列分析依据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)中的烷烃单加氧酶基因开放阅读框两端保守序列,设计了一对兼并引物以MD-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,将约1.3kb的PCR产物回收后连接到pGEM-T easy载体上,转入E.coliDH5α,挑取阳性克隆质粒进行测序。测序结果经Genbank检索,表明该DNA序列是个新的烷烃单加氧酶基因,命名为sladA。2.3 基因工程菌的构建及筛选

通过PCR扩增sladA后,将PCR产物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分离纯化出1 329bp的片断,与经EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33质粒连接,构建成含sladA的重组质pSTalk。经电泳鉴定表明(图1),重组质粒构建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的诱导表达

由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE图谱可见(图2),在烷烃单加氧酶基因sladA对应蛋白大小的地方扫描到高信号强度,表明sladA基因在SL-21中得以表达。2.5 基因工程菌SL-21碳源生长

基因工程菌SL-21在以原油和液体石蜡为惟一碳源的无机盐培养基中培养,在70℃和180r/min条件下,经过3d的延滞期后进入对数期,菌体数增加。17d后,菌体数为接菌初期的5倍,表明SL-21能够利用原油或液体石蜡作为惟一碳源生长。2.6 对原油的降解作用

由原油饱和烃组分的降解情况可看出(图3),基因工程菌对原油有很明显的降解效果,几乎将饱和烃降解完全。经对气相色谱各峰面积对比,计算出各峰面积的含

量和饱和烃组分降解率(表2)。基因工程菌SL-21对原油的降解率为75.08%。

实验结果表明,烃类降解菌地芽孢杆菌MD-2细胞提取的烷烃单加氧酶基因sladA可以在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中表达。但不同的基因工程菌株中烷烃单加氧酶基因sladA表达的效率不同,需要通过菌株对原油的降解评价进一步筛选。获得的对原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高温条件下生长,并且对原油降解效果明显。因此以体外重组方式向嗜热菌中引入烃类降解基因构建嗜热解烃基因工程菌在技术上是可行的。3 结论

以地芽孢杆菌MD-2为目标菌株,克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因sladA,并在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中正确表达了基因sladA,构建了基因工程菌SL-21。基因工程菌SL-21在70℃条件下,能以原油或液体石蜡为惟一碳源生长。14d对原油的降解率为75.08%,对原油饱和烃组分均有明显的降解效果。该基因工程菌既可以用于微生物驱油技术,又可以用于高温油田污水的生物处理。利用基因工程的方法可以获得既能耐受极端环境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌种选育的重要方向。参考文献: [1] 周金葵,王大威,廖明清,等.一株石油烃降解菌的筛选及性能研究[J].大庆石油地质与开发,2007,26(6):119-123.[2] 汪卫东,汪竹,耿雪丽,等.美国微生物采油技术现场应用效果分析[J].油气地质与采收率,2002,9(6):75-76.[3] 袁长忠,宋永亭,段传慧.微生物采油用营养物质在石英砂上的静态和动态吸附规律[J].油气地质与采收率,2009,16(4):74-76.[4] 修建龙,董汉平,俞理,等.微生物提高采收率数值模拟研究现状[J].油气地质与采收率,2009,16(4):86-89.[5] 路璐,向廷生,黑花丽.本源微生物降解原油的饱和烃色谱分析[J].油气地

质与采收率,2008,15(1):77-79.[6] 宋智勇,张君,马继业,等.微生物菌液的界面特性[J].油气地质与采收率,2008,15(3):73-75.[7] 蒋焱,曹功泽,赵凤敏,等.聚合物驱后微生物提高采收率的可行性分析[J].油气地质与采收率,2008,15(5):63-65,68.[8] 陈爱华,方新湘,吕秀荣,等.克拉玛依油田内源微生物驱油机理探索[J].油气地质与采收率,2008,15(5):75-77.[9] 宋绍富,刘菊荣,张忠智.微生物采油替代营养源的研究[J].油气地质与采收率,2007,14(2):96-98.[10]李希明.微生物驱替盲端类剩余油的微观实验[J].油气地质与采收率,2008,15(3):91-92.[11]沈萍.微生物学[M].北京:高等教育出版社,2000:143.[12]唐赟,冯露,刘沐之,等.嗜热解烃菌NG80-2的鉴定及其特[J].南开大学学报,2006,39(2):46-50,70.[13] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.分子克隆实验指南[M].金冬雁,译.北京:科学出版社,1992.[14]卢圣栋.现代分子生物学实验技术[M].2版.北京:高等教育出版社,1993.4

第五篇：基因工程

基因工程技术的程序与应用

【摘要】基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，它将给人类社会带来一场深刻的变革，我们有必要了解基因工程的概念、原理、技术程序，以及基因工程在农业、工业、医药等方面的应用和进展情况。

【关键词】基因工程技术程序应用进展

基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，在分子水平上对基因进行复杂的操作，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。它克服了远缘杂交的不亲和障碍。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

一 基因工程的技术程序

基因工程的基本原理是在体外将不同来源的DNA进行剪切和重组，形成镶嵌DNA分子，然后将之导入宿主细胞，使其扩增表达，从而使宿主细胞获得新的遗传特性，形成新的基因产物。它有3个基本的步骤：①从合适材料分离或制备目的基因或DNA片段。②目的基因或DNA片段与载体连接作成重组DNA分子。③重组DNA分子引入宿主细胞，在其中扩增和表达。不同种类生物的生物学特性不同，其基因工程在操作上和具体技术上必然有所差异，但技术核心都是DNA的重组，即利用一系列的DNA限制性内切酶、连接酶等分子手术工具，在某种生物DNA链上切下某个目标基因或特殊的DNA片段，然后根据设计要求，将其接合到受体生物DNA链上。

一个完整的用于生产生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有：①外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。②适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组。③外源基因的导入。④外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选。⑤外源基因表达产物的生理功能的检定。⑥转基因新品系的选育和建立以及转基因新品系的效益分析。⑦生态与进化安全保障机制的建立。⑧消费安全评价。

（一）外源目标基因的分离、克隆及功能结构分析

获合乎人类某种需要的取目的基因是实施基因工程的第一步，也是开展一项基因工程的前提和全部工作的核心。目前人们已经能够通过多种途径和方法来获取目标基因，其中主要有两条途径：一条是从供体细胞的DNA中直接分离基因；另一条是人工合成基因。

直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。鸟枪法的具体做法是：用限制酶将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞提供的DNA（即外源DNA）的所有片段分别在各个受体细胞中大量复制（在遗传学中叫做扩增），1

从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。如许多抗虫抗病毒的基因都可以用上述方法获得。用鸟枪法获得目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。又由于真核细胞的基因含有不表达的DNA片段，一般使用人工合成的方法。

目前人工合成基因的方法主要有两条。一条途径是以目的基因转录成的信使RNA为模版，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需要的基因。另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对的原则，推测出它的基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。如人的血红蛋白基因胰岛素基因等就可以通过人工合成基因的方法获得。

（二）构建能在受体生物细胞中表达的重组目标基因

要使一个外源目标基因能整合到受体细胞的基因组中并能在整合后在受体基因组的调控下有效地转录和翻译，就必须事先对目标基因的功能结构用DNA重组技术进行适当的修饰，也就是将目标基因与一种特别的DNA分子重组，这种特别的DNA分子称为基因载体，目前所用的载体主要有以下几类：质粒、λ噬菌体、柯斯质粒、病毒载体、YAC载体等，各类载体具有独特的生物学特性，可用于不同的目标基因。

（三）外源重组目标基因的导入

将重组的外源目标基因转入到宿主细胞中的过程称为基因导入或基因转移。接受外源基因的细胞称为受体细胞。由于受体生物学特征的不同以及基因工程目的不同，外源基因导入的方法也不同，有的是用载体导入，有的是直接用物理的方法导入。目前使用的有转化、转染、电穿孔导入法、基因枪射入法、显微注射法、脂质体介导法等，向细菌等微生物中导入外源目标基因常用质粒转化和噬菌体转染方法；向植物细胞中导入外源基因常用基因枪注入法和Ti质粒导入法；能由原生质体再生出植株的植物细胞还可以用电穿孔导入法及脂质体融合法；动物的受精卵一般通过人工显微镜注射法导入外源基因；动物的体细胞可用电穿孔法和病毒转染法导入外源基因，但对用于生产目的的基因工程常常避免用病毒转染法。

（四）转基因细胞或个体的鉴别和筛选

在对宿主的细胞进行了外源目标基因导入处理以后，有些细胞可能并没有外源基因的进入，另有一些细胞可能在外源基因进入后因各种原因而不能使外源基因表达，因此必须对被进行了基因转移处理的细胞或个体进行鉴别，以筛选出导入外源目标基因的转基因细胞或个体。鉴别和筛选转基因生物一般在两个层面上进行：一是检测目标基因是否表达，二是检测目标基因是否整合到了宿主的染色体上和能否稳定传代。表达检测的方法主要有转录产物的印迹杂交法、免疫印迹检测法、免疫组织化学检测法等。整合检测可通过DNA分子杂交来确定。

（五）转基因品系的效益分析。

一个生产性能优越的转基因品系，首要的条件是目标基因的表达产物必须有正常的生理功能，另一个必要标志是其目标基因必须有适度的高效表达特性和可持续生产能力。

（六）生态与进化安全保障

由于转基因生物与其他生物一样具有可遗传、易扩散及自主的特性，而且人类对生命、生态系统、生物的演化实际上还知之甚少，对不同物种间基因的人工组合，外源基因对受体生物进化的可能影响，转基因生物对生态系统的长期影响

等都无法进行评估，因此如果人们不事先采取控制措施，转基因生物一旦进入到自然环境中就可能打破生态平衡，破坏生态环境和自然种质资源。对转基因生物的控制措施有物理的方法和生物的方法：物理的方法就是通过各种严格的管理措施和物理屏障尽量使转基因生物不能从实验室逃逸进入到自然环境里去；生物的方法一般就是造成转基因生物与非转基因生物之间的生殖隔离，如利用三倍体不育的特性将用于生产的转基因动物或植物变成三倍体等。

（七）消费安全评价

消费安全评价一般要考虑以下一些主要的方面：①导入外源目标基因本身编码的产物是否安全。②外源目标基因是否稳定。③使用的载体是否安全。④使用的报道基因（就是能产生很容易观察的性状的基因）是否会产生有害物质。⑤外源基因导入后是否会诱导受体生物产生新的有害遗传性状或不利于健康的成分。为了保护人类的健康，许多国家都已通过立法或其他形式对转基因产品进行消费安全评价和严格的管理，对进口转基因食品严格限制。

二 基因工程的应用

基因工程在医药业中的应用。许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。如基因工程胰岛素、干扰素、人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。

基因诊断与基因治疗。遗传病是长期困扰人类的一类不治之症，迄今已发现的有3000多种。其根源于遗传基因存在缺陷，主要特征是可随生育而传代。基因治疗是把正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的，这是治疗遗传病的最有效的手段。基本方法是：基因置换、基因修复、基因增补和基因失活等。如运用基因工程设计制造的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。通过基因工程给患有遗传病的人体内导入正常基因可“一次性”解除病人的疾苦。

基因工程在农牧业、食品工业上的应用。运用基因工程技术，不但可以培养优质、高产、抗性好的农作物及畜、禽新品种，还可以培养出具有特殊用途的动、植物。如转基因鱼（生长快、耐不良环境、肉质好），转基因牛（乳汁中含有人生长激素），转黄瓜抗青枯病基因的甜椒，转鱼抗寒基因的番茄，转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯，不会引起过敏的转基因大豆，抗虫棉等。

基因工程在环境保护工业方面的应用。基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。利用基因工程培育的指示生物能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。如有一种超级细菌，能快速分解石油，可用于清除被石油污染的海域。这种超级菌是美国科学家用基因工程方法，把降解不同石油化合物的基因移植到一个菌株内而产生的。

总之，基因工程的发展将会给人类社会带来巨大的变化。

三 基因工程的进展状况

基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，而且也已经取得了许多重要的应用成果，但我们也应该看到，基因工程技术不是一项已经成熟的技术，仍然还很粗糙和原始，在许多方面尚需完善和改进。

1．基因工程在技术上存在一定的不确定性和盲目性。目前的基因工程在技术上有很多的不确定性。这种不确定性表现在两个方面，一是技术方面的不稳定性，二是由于对不同生物的生理特性的了解不很深入，如我们将鱼类抗冻蛋白基因转移到不抗寒的罗非鱼等热带鱼中，虽然抗冻蛋白基因得到表达，但并没有使受体鱼产生预期的抗寒效果。目前我们所进行的基因工程基本上只能对简单的、单基因控制的性状进行设计和改造，操作对象只限于一些比较简单的单因子基因。但生物绝大部分的重要性状是由多个基因共同控制的，对这些多基因控制的性状，现有的基因工程技术几乎仍然是束手无策。我们对活的生物体中基因表达调控的机制知之甚少，有关的知识仅限于对启动子和增强子有所了解，对生物体整体的调节复杂性的认识还刚刚开始。

2．在安全性方面存在着不确定性。对社会大众来说，最主要和最关心的是基因工程的安全性问题，基因工程的安全性问题包括两个方面：一是基因工程产品的消费安全问题，二是转基因生物的生态安全问题。目前用转基因技术生产出来的食品因其成分的某些改变是否会对人类的健康产生不良的影响，这需要实验和时间来验证。有着某种生存优势的转基因生物如果进入到自然生态系统，就有可能排挤自然种群，降低生态系统里物种的多样性，打破生态平衡。

所以我们在大力发展转基因技术的同时，必须高度重视对转基因动物、植物及微生物品种的生物控制和控制技术的研究。在转基因品种的安全性没有进行全面的评估和没有可靠的生物控制措施之前，应严格禁止其进行生产和进入开放的自然生态系统，只有其生态安全性达到了传统育种方法培育的新品种时，或无生殖能力的转基因动物和植物才能允许进入自然界进行生产，也只有这样才是有益于人类和社会进步的。

参考文献：

[1]罗琛主编，生物工程与生命，北京，高等教育出版社，2000；

[2]颜青山主编，洞悉生命的真谛，西安，陕西科学技术出版社，2003，11；

[3]刘祖洞编著，遗传学，北京，高等教育出版社，1991；

[4]王镜岩等主编，生物化学，北京，高等教育出版社；

[5]程玉忠;植物基因工程进展[J];遗传;1991年04期；

[6]刘金元;植物基因转移及其应用前景[J];生物技术;1994年06期；

[7]吴乃虎,黄美娟;植物基因工程的克隆载体[J];中国生物工程杂志;1987年02期；

[8]孟建华;农业基因工程研究进展报道[J];中国生物工程杂志;1989年01期；

[9]侯云德.动物病毒载体与基因治疗的现状和前景(续)[J].中国生物工程杂志, 1994,14(3)；

[10]李璇.植物抗性基因工程研究进展[J].中国生物工程杂志, 1991,11(2)；

[11]李以莞.基因工程抗体研究进展[J].中国生物工程杂志, 1991,11(4)；

[12]陈红梅,李昆志,陈丽梅.植物来源抗虫基因的研究进展[J].中国生物工程

杂志, 2008；

[13]陈章良, 潘乃穟.植物基因工程的现状、前景及问题[J].中国生物工程杂志, 1989,9(3)；

[14]TheodoreFriedmann, 杨靖.人类基因疗法的进展[J].中国生物工程杂志, 1990,10(3)；

[15]金由辛.真核生物tRNA基因的表达[J].中国生物工程杂志, 1994,14(1)；

[16]何晨阳, 王金生.植物防卫反应基因的类型、表达、调控和应用[J].中国生物工程杂志, 1994,14(4)；

[17]吴明.转基因作物研究、开发和市场预测[J].中国生物工程杂志, 1991,11(1)；

[18]戴秀玉.生物技术的由来[J].中国生物工程杂志, 1991,11(1)；

[19]门大鹏.质粒[J].中国生物工程杂志, 1993,13(3)；

[20]赵贵英;张树庸;;生命科学与生物技术研究进展2009[J];中国医药生物技术;2010年01期；

[21]北京大学 王岳;转基因:立法规范与人文反思[N];社会科学报；

[22]毛黎;科技创造未来美食[N];中国食品报；