单克隆抗体生产的杂交瘤技术

第一篇：单克隆抗体生产的杂交瘤技术

Hybridoma Technology for the Generation of Monoclonal Antibodies(mAbs)单克隆抗体生成的杂交瘤技术 Abstract 1 Introduction 2 Materials

2.1 Preparation of splenocytes 2.1 脾细胞制备 spleens from immunized mice 免疫小鼠的脾脏 RPMI-1640 medium(Serum-free cell freezing medium)无血清细胞冻存培养基 无血清细胞冻存培养基 3 Petri dishes 有盖培养皿 Sterile surgical instruments,including microdissecting scissors and forceps,for collecting animal samples 用于收集动物样品的无菌手术器械，包括显微解剖剪和钳子，5 sterile microscope glass slide with frosted ends 磨砂的的无菌显微玻片 6 15-ml conical tubes 15-ml 锥形瓶

2.2 Preparation of myeloma cells as the fusion partner 作为融合头（融合标签）的骨髓瘤细胞的制备 2.3 cell fusion 细胞融合

2.4 hybridoma screening by FACS 2.5 hybridoma screening by ELISA 通过ELISA进行杂交瘤筛选 2.6 hybridoma screening by IHC 2.7 hybridoma subcloning 2.8 hybridoma cryopreservation 低温保存杂交瘤细胞 2.9 antibody isotyping 抗体同型

2.10 thawing and growth of hybridoma cells 杂交瘤细胞的融化和生长methods 3.1 preparation of splenocytes from the immunized mouse 来自免疫鼠的脾细胞的制备 3.2 preparation of myeloma cells 骨髓瘤细胞的制备 3.3 cell fusion 细胞融合

3.4 hybridoma screening using flow cytometry 通过流式细胞仪进行杂交瘤筛选 3.5 hybridoma screening by ELISA 通过ELISA进行杂交瘤筛选 3.6 hybridoma screening by IHC 通过免疫组化进行杂交瘤筛选 3.7 hybridoma subcloning 杂交瘤亚克隆

3.8 hybridoma cryopreservation 杂交瘤低温保存 3.9 antibody isotyping 抗体同型

3.10 Thawing and growth of hybridoma cells 杂交瘤细胞的融化和生长 4 小记 参考文献

第二篇：单克隆抗体技术个人总结

单克隆抗体技术个人总结

制备单克隆抗体

1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成的杂交细胞既可产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。

制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产，要经过几个月的一系列实验步骤，下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。

一、细胞融合前准备

(一)免疫方案

选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功，获得高质量的McAb至关重要。一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫，免疫方案应根据抗原的特性不同而定。

1.颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果。下面以细胞性抗原为例的免疫方案:

初次免疫1×10７／0.5ml ip(腹腔内注射)

↓ 2～3周后

第二次免疫1×10７／0.5ml ip

↓ 3周后

加强免疫(融合前三天)1×10７／0.5ml ip或iv(静脉内注射)↓

取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱，一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂。要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态。商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。

初次免疫Ag

～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射

│(一般0.8～1ml 0.2ml／点)

↓3周后

第二次免疫 剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip

│(ip剂量不宜超过0.5ml)

↓3周后

第三次免疫 剂量同上，不加佐剂，ip

│(5～7天后采血测其效价，检测免疫效果)

↓2～3周后

加强免疫，剂量50～500μg

宜，ip或iv

↓3天后

取脾融合目前，用于可溶性抗原(特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性，另一方面可降低抗原的使用量。②改变抗原注入的途径，基础免疫可直接采用脾内注射。③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的 1

免疫应答水平，促进免疫细胞对抗原反应性。

(二)饲养细胞

在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞，如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞(较为常用)、小鼠脾脏细胞或小鼠胸腺细胞，也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞，使用比较方便，照射后可放入液氮罐长期保存，随用随复苏。

小鼠腹腔巨噬细胞的制备

小鼠采用与免疫小鼠相同的品系，常用BaLb／c小鼠6～10周龄

↓

拉颈处死 浸泡于75％酒精，消毒3～5分钟

↓

用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜

↓

用无菌注射器注入6～8ml培养液

↓

反复冲洗，吸出冲洗液

↓

放入10ml离心管，1200转／分离心5～6分钟

↓

用20％小牛血清(NCS)或胎牛血清(FCS)的培养液混悬，调整细胞数1× 0５／ml

↓

加入96孔板，100μl／孔

↓

放入37℃ CO2孵箱培养

一般饲养细胞在融合前一天制备，一只小鼠可获得5～8×106腹腔巨噬细胞，若用小鼠胸腺细胞作为饲养细胞时，细胞浓度为5×106／ml，小鼠脾细胞为1×106／ml，小鼠的成纤维细胞(3T3)1×105／ml，均为100μl／孔。

(三)骨髓瘤细胞

骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内产生大量 McAb

常用骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2／0、X63 Ag8.653等。

骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10～20％，细胞的最大密度不得超10６／ml，一般扩大培养以1∶10稀释传代，每3～5天传代一次。细胞的倍增时间为16～20小时，上述三株骨髓瘤细胞系均为悬浮或轻微贴壁生长，只用弯头滴管轻轻吹打即可悬起细胞。

一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HAT的敏感性，每3～6月应用8～AG(8氮杂鸟嘌呤)筛选一次，以防止细胞的突变。

保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95％，也是决定细胞融合的关键。

(四)免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋巴母细胞棗浆母细胞。一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，由于此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。

脾细胞悬液的制备：在无菌条件下取出脾脏，用不完全的培养液洗一次，置平皿中不锈钢筛网上，用注射器针芯研磨成细胞悬液后计数。一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积的２倍，细胞数为２×10８左右。

二、细胞融合，选择杂交瘤

(一)细胞融合流程

(1)取对数生长的骨髓瘤细胞SP2／0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全培养液混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。

(2)同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。

(3)将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml

料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。

(4)弃上清，用滴管吸净残留液体，以免影响PEG的浓度。

(5)轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略加松动。

(6)在室温下融合:

① 30秒内加入预热的1ml45％PEG(Merek,分子量4000)含5％DMSO，边加边搅拌。② 作用90秒钟，若冬天室温较低时可延长至120秒钟。

③ 加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔２分钟分别加入

1ml，2ml，3ml，4ml，5ml和10ml。

(7)离心，800rpm，6分钟。

(8)弃上清，先用6ml左右20％小牛血清RPMI1640轻轻混悬，切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开。

(9)根据所用96孔培养板的数量，补加完全培养液，10ml一块96孔板。

(10)将融合后细胞悬液加入含有饲养细胞的96孔板，100μl／孔，37℃、5％CO2孵箱培养。

一般一块96孔板含有1×

107脾细胞。

(二)HAT选择杂交瘤

应用HAT 选择培养液筛选杂交瘤细胞的原理已在研究生专题讲座第六专题中已经提到，这里主要介绍加HAT选择培养的时间和浓度。

一般在融合24小时后，加HAT选择培养液。HT和HAT均有商品化试剂50×贮存，用时1ml加入50ml20％小牛血清完全培养液中。

因为在培养板内已加入饲养细胞、融合后的细胞，200μl／孔。所以在加选择培养液时应加3倍量的HAT。我们认为，融合后最初补加的量可用全量的2／3进行选择，可得到满意的筛选结果。

50×HAT

H: 5×10-3M

A: 2×10-5M

T: 8×10-4M

一般选择HAT选择培养液维持培养两周后，改用HT培养液，再维持培养两周，改用一般培养液。

三、抗体的检测

筛选杂交瘤细胞通过选择性培养而获得杂交细胞系中，仅少数能分泌针对免疫原的特异性抗体。一般在杂交瘤细胞布满孔底1／10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。

检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快

速、简便、特异、敏感的方法为原则。

常用的方法有:

1.ELISA用于可溶性抗原(蛋白质)、细胞和病毒等McAb的检测。

2.RIA用于可溶性抗原、细胞McAb的检测。

FACS(荧光激活细胞分类仪)用于检查细胞表面抗原的McAb检测。

4.IFA用于细胞和病毒McAb的检测。

上述方法均为一般实验室的常规方法，故在此不介绍具体的实验过程。

可靠的筛选方法必须在融合前建立，避免由于方法不当贻误整个筛选时机。

四、杂交瘤的克隆化和冻存

克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。犚r为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。

(一)克隆化方案

用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释和软琼脂平板法。

1.有限稀释法的程序

① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备)

② 阳性孔细胞的计数，并调细胞数在1～5×10３／ml

③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液，即20个细胞／ml，100μl／孔加

A、B、C三排为每孔2个细胞。余下2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10个／ml，100μl／孔加D、E、F三排，为每孔1个细胞。余下2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液，细胞数5个／ml，100μl／孔，加G、H

排，为每孔0.5个细胞。

④ 培养4～5天后，在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆，补加完全培养液200μl／孔。

⑤ 第8～9天时，肉眼可见细胞克隆，及时进行抗体检测。

注:初次克隆化的杂交瘤细胞需要在完全培养液中加HT。

2.软琼脂法

① 软琼脂的配制

含20％FCS(小牛血清)的2倍浓缩的RPMI1640

1％琼脂水溶液：高压灭菌，42℃预热。

0.5％琼脂：由

份1％琼脂加1份含20％小牛血清的2倍浓缩的RPMI1640配制而成。置42℃保温。

② 用上述0.5％琼脂液(含有饲养细胞)15ml倾注于直径为9cm的平皿中，在室温中待凝固后作为基底层备用。

③ 按100／ml，500／ml或5000／ml等浓度配制需克隆的细胞悬液。

④ 1ml 0.5％琼脂液(42℃预热)在室温中分别与1ml不同浓度的细胞悬液相混合。⑤ 混匀后立即倾注于琼脂基底层上，在室温中10分钟，使其凝固，孵育于 37℃，5％CO2孵箱中。

⑥ 4～5天后即可见针尖大小白色克隆，7～10天后，直接移种至含饲养细胞的24孔

板中进行培养。

⑦ 检测抗体，扩大培养，必要时再克隆化。

(二)杂交瘤细胞的冻存

及时冻存原始孔的杂交瘤细胞、每次克隆化得到的亚克隆细胞是十分重要的。因为在没有建立一个稳定分泌抗体的细胞系的时候，细胞的培养过程中随时可能发生细胞的污染、分泌抗体能力的丧失等等。如果没有原始细胞的冻存，则因为上述的意外而全功尽弃。

杂交瘤细胞的冻存方法同其他细胞系的冻存方法一样，原则上细胞应在每支安瓿含1×106以上，但对原始孔的杂交瘤细胞可以因培养环境不同而改变，在24孔培养板中培养，当长满孔底时，一孔就可以冻一支安瓿。

细胞冻存液:

50％小牛血清

40％不完全培养液

10％ DMSO(二甲亚砜)

冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降到0℃，再降温时一般按每分钟降温2～3℃，待降至-70℃可放入液氮中。或细胞管降至0℃ 后放-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。也可以用细胞冻存装置进行冻存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

五、单克隆抗体的大量生产

大量生产单克隆抗体的方法主要有两种：

1.体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从上清中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液含量为10～60μg／ml，如果大量生产，费用较高。

2.体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。

① 实体瘤法 对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107／ml接种于小鼠背部皮下，每处注射

.2 ml, 共2～4点。待肿瘤达到一定大小后(一般10～20天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mg／ml。但采血量有限。

② 腹水的制备 常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石腊于BaLb／c鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获1～10ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。腹水中单克隆抗体含量可达5-20mg/ml，这是目前最常用的方法，还可将腹水中细胞冻存起来，复苏后转种小鼠腹腔则产生腹水快、量多。

六、单克隆抗体的鉴定

对制备的McAb进行系统的鉴定是十分必要的。应对其做如下方面的鉴定:

.抗体特异性的鉴定：除用免疫原(抗原)进行抗体的检测外，还应用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如①制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体。② 制备抗重组的细胞因子的单克隆抗体，应首先考虑是否与表达菌株的蛋白有交叉反应，其次是与其它细胞因子间有无交叉。

2.McAb的Ig类与亚类的鉴定：一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时，已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定McAb的亚类。在作双扩试验时，如加入适量的PEG(3％)，将有利于沉

淀线的形成。

3.McAb中和活性的鉴定：用动物的或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。

4.McAb识别抗原表位的鉴定：用竞争结合试验、测相加指数的方法，测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb

识别的表位是否相同。

5.McAb亲和力的鉴定：用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力。

七、影响因素、失败原因分析

由于制备McAb的实验周期长，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。

其主要失败原因和影响因素有:

1.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。这是杂交瘤工作中最辣手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其它添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采取生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB／c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，犖^菌取出分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。

2.融合后杂交瘤不生长：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素①PEG有毒性或作用时间过长。②牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。③骨髓瘤细胞污染了支原体。④HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。

3.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体

① 融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。

② 有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。

③ 对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。Goding91982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。

三要:

要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。

要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。

要定期进行再克隆。

三不要:

不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。

不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。

不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。

.杂交瘤细胞难以克隆化

可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。

第三篇：单克隆抗体药物综述

单克隆抗体药物综述

摘 要: 通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物 ,已经成为生物制药领域的一个重要方面 ,由于单克隆抗体药物专一性强、疗效显著 ,因此成为近年来研究的热点药物之一。此文就单抗药物的分类、应用进行了综述 ,并对其应用前景及存在的不足作了概述。

关键词:单克隆抗体 抗体药物 靶向 联用

自 1975 年Koeh ler 和M ilstein 首先报道利用小鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体以来, 经过近30 年的发展, 单抗技术在生命科学研究及医学实践方面作出了杰出的贡献, 已经成为了现代生物技术产业的支柱之一。

然而, 尽管单抗推动了生物诊断技术的革命, 但是在将单抗应用于人体疾病的治疗方面, 却在长时间内迟迟没有进展。早期的临床试验结果都不尽人意, 这是因为鼠源单抗应用于人体有许多限制].现今上市的单抗药物, 治疗的领域主要集中在肿瘤、自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等领域。由于单抗具有明确的作用位点, 与靶位点亲和力高, 而且通过改造的抗体其免疫原性大大减弱, 这些因素使得单抗在临床治疗中具有特异性强、见效快、副作用较低等优点, 因而单抗治疗有着广阔的前景。目前, FDA 批准上市的 17 个单抗药物中即有 8 个是用于治疗淋巴细胞肿瘤、乳腺癌及结直肠癌等, 而在开发阶段的单抗也有一半以上是与治疗各种癌症相关。可以预见, 在未来几年来将有更多的治疗性单抗药物上市, 其市场份额将进一步扩大。

目前, 单抗类药物的市场销售逐年提升的年均增长幅度在20%以上, 表现强劲。用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单抗药物R ituxan 已成为世界第一的抗肿瘤药物, 2003 年销售为 14.89亿美元, 2002 年为 11.63 亿美元, 在 2002 年全球最畅销前 50位商标名处方药中排名 43 位。用于治疗关节炎的单抗药物Rem icade, 2002 年销售额为 12.97 亿美元, 当年全球药物销售排名第 37 位。2000 年世界单抗药物的销售额为 22.05 亿美元, 据F ro st&Sullivan 预测, 到 2003 年销售额将达到 47 亿美元。

下面就单克隆抗体药物的研究进展作一综述。

1单克隆抗体药物的分类

单抗药物一般分为:治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如:最早被美国 FDA批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗;抗肿瘤单抗偶联物 ,或称免疫偶联物(Immunoconjugate), 由单抗与有治疗作用的物质(如:放射性核素、毒素和药物等)两部分构成 ,其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物 ,此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等。

2作为肿瘤治疗药剂的单克隆抗体药物

表1概括了近年来美国 FDA 批准上市的 5 个治疗肿瘤的单克隆抗体药物的基本情况 ,下面具体加以介绍。

2.1利妥昔单抗 在自身免疫性疾病形成过程中 ,B 细胞起重要作用。CD20是前B细胞向成熟淋巴细胞分化过程中表达的表面抗原 ,参与调节B细胞的生长和分化。利妥昔单抗(美罗华)是一种针对 CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体 ,是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后可与 CD20 特异性结合导致 B 细胞溶解 ,从而抑制 B 细胞增殖 ,诱导成熟 B细胞凋亡 ,但不影响原始B细胞。它能通过介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、补体依赖的细胞毒性(CDC)作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应 ,包括抑制细胞生长 ,改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞[1 ]。

由于利妥昔单抗药物可以提高肿瘤细胞对化疗的敏感性 ,所以利妥昔单抗药物的优势就在于与其他治疗药物及治疗方式配合使用。临床研究表明美罗华单药或联合化疗治疗肿瘤具有良好的疗效和安全性 ,但还是存在一定的毒副作用。夏忠军等[2 ]进行的临床研究:34例确诊惰性淋巴瘤的患者接受含利妥昔的方案化疗 ,结果总有效率为 92.3 % ,完全缓解率为60.0 %。主要不良反应为骨髓抑制 ,其它不良反应包括恶心呕吐、轻度脱发和肝功能受损等。张晓艳等[3 ]对 4例 CD20阳性非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人进行了5次利妥昔单抗联合自体外周血干细胞移植(APBSCT)的治疗研究 ,结果显示所有病人均对利妥昔单抗耐受良好 ,植入后在 8～11 d内达造血重建 ,表明利妥昔单抗联合APBSCT治疗 CD20阳性NHL 是一种耐受及效果良好的方法。

2.2曲妥珠单抗

曲妥珠单抗为一种针对 HER22/ neu的重组人源化 IgG单克隆抗体 ,能特异性识别 Her22调控的细胞表面蛋白 HER22 ,使其通过内吞噬作用离开胞膜进入核体内 ,抑制其介导的信号转导 ,从而起到治疗肿瘤的作用。美国 FDA 于 1999 年批准其上市 ,2002年在我国上市。大量临床资料证实曲妥珠单用于乳腺癌的有效率为21 % ,而且它与化疗联合应用明显提高了生存时间[4 ]。据报道 ,欧洲曲妥珠单抗辅助治疗试验研究了曲妥珠单抗对 HER22 阳性伴有或不伴有淋巴结阳性的乳腺癌患者的疗效 ,其中 1 组给予 1 年的曲妥珠单抗治疗 ,另1组作为对照。曲妥珠单抗治疗 1 年组与对照组相比 ,复发风险减少了46 % ,两组的整体生存率无明显区别 ,说明曲妥珠单抗用于治疗辅助化疗后的 HER22阳性乳腺癌患者 ,明显延长了患者的无病生存期[5 ]。我国也对曲妥珠进行了临床研究 ,沈坤炜等[6 ]对 42 例 Ⅱ～ ⅢA期浸润性乳腺癌患者紫杉醇联合曲妥珠单抗治疗 24 周 ,结果单用新辅助化疗组完全缓解率为 26.3 % ,在新辅助化疗联用曲妥珠单抗组为65.2 % ,可见 ,对于 HER22 过表达的乳腺癌化疗联用曲妥珠单抗能显著提高完全缓解率。

2.3阿伦珠单抗 阿伦珠单抗是人源化、非结合型单抗 ,作用靶点为正常与异常B淋巴细胞的 CD52 抗原 ,CD52 广泛分布于正常的 B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和B 淋巴细胞及T淋巴细胞瘤细胞表面 ,在慢性淋巴细胞白血病细胞表面尤为丰富。它与带 CD52 的靶细胞结合后 ,通过宿主效应子的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和细胞凋亡等机制导致细胞死亡。阿伦珠单抗作为一种作用机制独特的单克隆抗体 ,对源于B和 T细胞的各种恶性肿瘤具有很好的治疗作用。

英国科学家应用阿伦珠单抗和利妥昔单抗治疗复发性淋巴瘤患者 ,结果总反应率为 52 % ,其中完全缓解 8 % ,表明联合使用阿伦珠单抗和利妥昔单抗是安全可行的。在其它 T细胞恶性肿瘤的治疗中:对 22 例 Ⅲ～ Ⅳ期皮肤 T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿病和 Sezary综合征)患者静脉输注阿伦珠 12周 ,结果显示阿伦珠具有非常好的疗效 ,总有效率达 55 %。其中 ,红皮病患者总有效率达 69 % ,片状斑或皮肤肿瘤患者达40 %[7 ]。阿伦珠单抗联合其他药物、化疗等治疗肿瘤具有显著的效果。但临床研究表明 ,其还存在一些常见并发症 ,如低血压、寒颤、发热、恶心、呕吐、气短、支气管痉挛、皮疹、疲乏、呼吸困难、头痛、腹泻、感染等。2.4西妥昔单抗

西妥昔单抗为 IgG 1 单克隆抗体 ,是表皮生长因子受体拮抗剂 ,可与表达于正常细胞和多种肿瘤细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合 ,并竞争性阻断 EGF和其他配体 ,如α 2转化生长因子(TGF 2 α)的结合。它通过增加细胞周期抑制因子 p27kip 使得细胞周期停留在 G 1 期;增加 Bax表达和减少 bcl22表达 ,诱导癌细胞的凋亡;它还可减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子(VEGF)的产生。相关实验表明 ,西妥昔单抗可抑制过度表达 EGFR的肿瘤细胞的增殖 ,但是对缺乏 EGFR表达的肿瘤细胞则没有抗肿瘤效果 ,还发现西妥昔与化疗联用要优于单独化疗[8 ]。

在对西妥昔单抗联合化疗的研究中 ,BOAD 试验最为著名。576例晚期结直肠癌(ACRC)患者中 82 %的 EGFR 过表达。治疗采取两个方案 ,第1组用西妥昔单抗联合伊立替康治疗;第2组单独用西妥昔单抗单药治疗。西妥昔单抗联合伊立替康与单用西妥昔单抗相比 ,联用疗效优于单一使用 ,有效率分别为23 %和11 % ,疾病控制率为 56 %和 32 % ,疾病进展中位时间为4.1和1.5个月 ,中位生存时间为8.6和6.9个月 ,而且西妥昔单抗并没有增加化疗的副作用。以上临床实验显示:西妥昔单抗能够克服 ACRC患者对伊立替康的耐药性 ,生存质量明显提高[9 ]。西妥昔单抗的毒副作用包括:痤疮样皮疹、虚弱、腹痛、恶心、呕吐、白细胞减少和过敏反应等。其中痤疮样皮疹是最常见的不良反应 ,皮疹主要分布在脸部和躯干上部 ,这可能是由于西妥昔单抗干扰了 EGF的表皮生理作用所致[10 ]。

2.5贝伐单抗

贝伐单抗是抗VEGF的人源化单抗 ,主要通过中和VEGF来阻断其与内皮细胞上的受体结合 ,使得肿瘤细胞不能得到养分和氧 ,起到治疗肿瘤的作用。Presta 等[11 ]将鼠抗人VEGF单克隆抗体(muMAB VEGF)A.4.6.1 的互补决定区与人 IgG 1的恒定区框架嵌合 ,并对相应氨基酸残基加以修饰 ,最终形成了人鼠嵌合型 VEGF单抗 ,仍然有 7 %的氨基酸来源于鼠抗体。实验表明 ,贝伐单抗用于治疗肿瘤安全有效。郑航等[12 ]探究贝伐单抗联合伊立替康治疗转移性结肠癌的疗效 ,90例患者中给予贝伐单抗联合伊立替康治疗的一组有效率为43.3 % ,血清肿瘤标志物的浓度治疗前后有显著变化。这说明贝伐联合伊立替康治疗转移性结肠癌具有更高的疾病控制率。2005 年美国临床肿瘤学会年会上报道了贝伐单抗的最新研究结果 ,采用贝伐单抗联合伊立替康和顺铂一线治疗转移性胃癌或者胃食管连接部腺癌的患者 ,治疗的不良反应除了原有伊立替康和顺铂引起的肾髓抑制、胃肠道反应等 ,还有贝伐单抗造成的不良反应包括栓塞性疾病、胃穿孔等。

3抗肿瘤单抗偶联物

3.1放射免疫偶联物

放射免疫治疗(RIT)是以单克隆抗体为载体 ,以放射性核素为弹头 ,通过抗体特异性结合肿瘤细胞相关抗原 ,将产生高能射线的放射性核素靶向到肿瘤细胞 ,实现对肿瘤的近距离内照射治疗。RIT利用携带放射性核素的单克隆抗体特异地结合到病灶部位 ,减少了对正常组织的损伤。90Y— ibri2tumomab是第1个被 FDA批准应用于临床的放射免疫制剂 ,主要用于复发的淋巴瘤患者或对单独应用利妥昔单抗疗效不佳的患者。

3.2免疫毒素

免疫毒素是用化学方法或基因工程方法将肿瘤选择性单抗与经修饰的多肽毒素共价连接而成的肿瘤治疗药物。免疫毒素可与肿瘤细胞表面受体或与细胞表面的靶抗原相结合后内化 ,继而在胞内抑制细胞蛋白质合成 ,导致肿瘤细胞死亡。毒素有很多种 ,如植物毒素、细菌毒素、动物毒素 , 其中引用最广泛的是植物毒素中的白喉毒素。美国 FDA已经批准了白喉毒素与白细胞介素 2 重组的免疫毒素 ONTAK(DAB3892I L2),用于治疗人皮肤 T细胞淋巴瘤[13214 ]。

3.3化学免疫偶联物 单抗是药物良好的靶向性载体 ,通过药物分子上特殊的功能基团如:羟基、巯基、氨基等 ,将治疗药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物 ,避免了药物对其他正常组织的毒害作用,选择性地发挥治疗作用。常与单抗进行偶联的药物有阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。

4单克隆抗体在其他疾病中的应用 单克隆抗体药物不只在肿瘤的治疗中取得了很好疗效 ,在其他疾病的治疗中也取得了一些疗效 ,例如:奥马珠单抗(omalizumab)通过与游离 IgE结合而显著降低游离 IgE的水平,阻断 IgE与肥大细胞、嗜碱粒细胞结合 ,防止炎症介质的释放。可显著改善哮喘病人的症状、肺功能及生活质量 ,减少哮喘恶化的发作次数 ,减少糖皮质激素的用量 ,使用安全 ,具有很好的耐受性[15 ]。Mab03.2C1C2 在体外能抑制白念珠菌芽管的形成 ,从而抑制白念珠菌对上皮细胞、内皮细胞的粘附 ,降低白念珠菌的侵袭力。利妥昔单抗对类风湿和系统性红斑狼疮也有很好的治疗作用。英夫利昔单抗对类风湿性关节炎患者疼痛、晨僵、关节肿胀等临床症状减轻程度就可达60 %。另有研究显示 ,输注英夫利昔单抗可快速、显著缓解顽固性银屑病、关节炎病人的关节和皮损症状[16 ]。英利昔单抗对克罗恩病、溃疡性结肠炎、酒精性肝病等消化系统疾病都有较好疗效 ,且在推荐的治疗范围内安全性良好[17 ]。

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第四篇：美成功用鸡生产全功能人单克隆抗体

美成功用鸡生产全功能人单克隆抗体

美国奥利基因（Origen）治疗公司今天宣布，他们首次用鸡蛋生产出全功能人单克隆抗体。这种抗体仅在鸡输卵管中表达，并以每枚鸡蛋产出1至3毫克的抗体沉淀在蛋白里，同用传统细胞培养方法产生的治疗用抗体相比，用这种新方法生产的抗体，有比传统方法生产抗体大10至100倍的杀灭癌细胞能力。

为了培育生产抗体的鸡，研究人员首先在鸡胚胎干细胞中插入为抗体编码的基因，然后该干细胞被导入鸡胚胎内。在发育阶段，胚胎干细胞对正在成长的鸡起着极大的作用。所产生的混种鸡下的蛋包含毫克数量的抗体，将这些抗体同蛋白的蛋白质分离，即产生被提纯的单克隆抗体。

奥利基因公司副总裁埃特乔斯说：“用这种方法生产出的抗体与用细胞培养法生产的抗体有极类似的物理和生物学特性。此外，鸡体内产生的抗体没有糖残余物———岩藻糖，因此具有增强杀灭癌细胞的活力。目前，美政府已批准25种以上的单克隆抗体用于临床治疗。我们预期对抗癌单克隆抗体会有更多需求，用现有的细胞培育法不仅远远不能满足需求，也不利于降低成本，采用以鸡为基础的生产技术，将会实现工业化大量生产治疗用抗体。”

该公司总裁罗伯特•凯说：“我们相信，同植物系统或其它转基因动物生产单克隆抗体系统相比，用鸡生产单克隆抗体是最有效的方法。用鸡蛋生产抗体所需鉴别时间可短至8个月，而用山羊或牛来生产单克隆抗体的鉴别时间则需18个月至3年。此外，鸡蛋是无菌和稳定的，对分离和提纯感兴趣的蛋白质来说，它提供了良好的起始材料。

这项研究得到了美国家卫生研究院的资助，研究成果发表在9月期《自然生物技术》杂志上，并在9月期《自然医学》上发表对这一新技术的评论。

第五篇：单克隆抗体药物概述

单克隆抗体药物概述

高熹

（2015级 交流学院 生物技术 168615140001）

摘要：单克隆抗体药物作为一种具有独特优势的生物靶向药物，具有特异性高、靶向性强和毒副作用低的特点，在治疗方面效果显著。伴随着抗体技术的不断发展以及新型抗体的不断出现，单克隆抗体药物已成为制药业发展最快的领域之一，目前正在研究的生物技术药物中有四分之一都是单克隆抗体药物，期间又涌现出了各种单抗衍生物，包括抗体药物偶联物、小分子抗体、双特异性抗体等。本文就单克隆抗体药物的分类、制备、应用和发展等进行综述。关键词：单克隆抗体药物；抗体技术；单抗衍生物

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。杂交瘤技术为规模化生产特异性高、结构和性质均一稳定的单克隆抗体提空了有力的保障。单克隆抗体药物的发展和现状

1986年，FDA批准了第一个鼠源单克隆抗体药物Muromonab-CD3上市，用于预防肾移植时急性器官排斥。单克隆抗体药物的发展因人抗鼠抗体反应在1988年到1993年间陷入低谷。之后随着重组DNA技术的发展，各种抗体人缘化技术迅速发展，单克隆抗体药物经历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段。随后出现的噬菌体展示文库技术和转基因小鼠技术，使全人源单抗的产生成为可能。过去的30年抗体工程的研究主要集中于减弱鼠源抗体的免疫原性和提高产生抗体的能力，如今全人源抗体已成为治疗性单抗的主流，2002年第一个全人源抗体阿达木单抗上市。且随着微生物和哺乳动物细胞等外源蛋白表达系统的技术进步和表达水平的提高，使治疗性单克隆抗体在临床和商业上都取得了巨大的成功。尽管如此，单克隆抗体药物的发展仍然存在许多挑战。迄今为止，大多数FDA 批准上市的单抗药物都是未经修饰的全长抗体，这是相对分子质量在150×103左右的大蛋白分子，这些抗体药物在临床应用取得巨大成功的同时，本身的局限性也得到越来越多的关注[1]。现如今，单抗药物经历了市场和时间的考验，已经成为生物医药的最重要组成部分，在疾病治疗上具有广阔的应用前景，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。治疗性单抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶点决定，上市和在研的单抗药物有些靶向相同的靶点，有些有自己独特的作用靶点，新的作用靶点也在不断地出现。随着研究深入、技术进步，单抗药物呈现出旺盛的发展势头[2]。

随着已上市品种的销售额不断增长以及新适应症的批准和新品种的上市，单克隆抗体药物市场容量迅速攀升。1997-2007年是全球单抗产业增长的爆发期，十年间CAGR高达58.6%。2008年-2015年，全球单抗产业增速放缓明显，CAGR降至14.8%，但仍要显著高于全球医药行业约5%的增速水平。1997年全球单抗药物销售额仅3.7亿美元，2015年全球单抗药物的销售额已超过980亿美元。1992-2015 年间，国外共批准上市了61个原研抗体药，其中后有6个退市。在现有上市的55个产品（49个单抗产品，6个具有抗体功能的受体-Fc融合蛋白）中，51个是由美国或欧盟首先批准上市的，数量占比高达 92.7%，生产企业方面：罗氏、诺华等10家欧美企业共开发和生产了全球70%以上的抗体药物，欧美国家在全球抗体产业中居于绝对主导地位。2015年全球最畅销药物TOP 10中有5个单抗，分别是阿达木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗，它们占据了单抗药物的半壁江山，销售额约为426.6亿美元，约占2015年全球单克隆抗体药物总销售额的44%。根据预测，2016-2020 年，全球单抗产业仍将以9.84%的RAGR快速发展（同期全球药品市场CAGR约为 5%），2020年市场规模有望突破1300亿美元。

相比处于上升期的国外单抗产业，我国单抗产业仍处于初创期，单抗药物仍以仿制为主，单抗药物无论产品种类和销售规模都远低于欧美发达国家，并且进口单抗药物占据了主要市场。2015年中国单抗药物市场容量约为70多亿元人民币，约80%的市场被外资制药企业占据。在单抗药物领域，国内制药企业面临市场快速增长和进口替代的双重机遇。单克隆抗体研究已被列入863计划和国家重点攻关项目。十三五期间，生物产业将是国家重点支持的战略性新兴产业。单抗药物的研究、开发和市场应用必将吸引一大批制药企业的参与和布局。目前全国有100多家企业在做单抗，除了中信国健、百泰生物、海正药业等一些老牌企业之外，近几年还涌现出了很多新兴企业，包括丽珠单抗、信达生物等。在2016三生制药集团媒体开放日活动上，三生制药集团董事长娄竞博士表示三生制药集团的3万升生产线建成后将成为中国规模最大的单克隆抗体生产线，也是从细胞系、培养基、原液到制剂（多种剂型和规格）的全球最完整生产线之一。单克隆抗体药物分类

根据来源的不同.单克隆抗体大体可分为4类,即鼠源化单克隆抗体、人鼠嵌

[3]合体单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人源化单克隆抗体，这也是单克隆抗体发展的四个重要的阶段。2.1 鼠源化单克隆抗体

人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。2.1.1 体内法

体内法即腹水法。尽管腹水中抗体浓度比较高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必须达到SPF级,繁殖、饲养BALB/c小鼠及生产腹水、纯化抗体的厂房必须符合GMP要求,WHO及我国对体内法生产的人用鼠源单克隆抗体的质检项目繁多,要求严格,因此限制了体内法在人用鼠源单抗生产领域的应用。2.1.2体外法

体外法(杂交瘤细胞体外培养法)的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,因此是人用鼠源单抗生产方式的主要发展方向[4]。体外法的制备流程也基本相同，即从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞，待细胞融合后，对单个细胞进行克隆，体外培养出能分泌单抗的克隆细胞。

但鼠源单抗在临床应用方面存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）较弱，而且它与补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体分子质量较大,在人血循环中的半衰期短，在体内穿透血管的能力较差;它发挥ADCC作用的时间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易引起宿主过敏反应[5]，产生人抗鼠抗体(HAMAs)，将其清除出体外，因此限制了它的应用。2.2 人鼠嵌合单克隆抗体

抗体分子由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，具有典型的功能区结构，其与抗原的结合完全取决于氨基端的可变区。恒定区与抗体抗原结合无关，并且恒定区是抗体分子免疫原性的主要部位，因此可通过用人的恒定区取代鼠单抗的恒定区进行人源化，消除其大部分异源性，并能保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力，这种方法得益于DNA重组技术的发展。1984年首次应用上述方法重组制备了抗半抗原磷酸胆碱的全分子人鼠嵌合抗体[6]。

嵌合抗体可将同一个可变区与不同类别的恒定区链接在一起，比较在相同特异性情况下不同类别的功能。其制备过程主要包括了可变区的克隆，表达载体的构建及嵌合抗体的表达。可变区基因的克隆在早期主要从杂交瘤细胞的基因组文库中克隆出来带有完整上游转录调控序列的轻重链可变基因DNA片段，组装到含有人恒定区的表达载体中。PCR方法的建立和发展为抗体可变区基因的克隆提供了简便有效的方法。接着将控制小鼠抗体重链和轻链中可变区的基因片段与人抗体重链及轻链的不变区的基因片段在体外链接形成重组基因，然后导入真核细胞的某种表达质粒中，再将这种含有重组基因的表达载体转化哺乳动物骨髓瘤细胞，筛选能分泌完整抗体的转化子。但嵌合抗体仍保留着30%左右的鼠源序列，并且其常达不到预期的效果。

嵌合抗体目前主要有3种应用形式：嵌合免疫球蛋白G、嵌合Fab和嵌合,F（ab’）2。嵌合免疫球蛋白G因含有人抗体的Fc段，能介导补体及细胞对靶抗原的杀伤和吞噬作用，但因鼠源性成分较多，免疫原性大且组织穿透力差[7]；嵌合 Fab 和嵌合F（ab’）2抗体分子小、穿透力强，可充当小分子载体用于放射免疫显像及放射免疫治疗。2.3 人源化单克隆抗体

由于鼠源抗体的可变区仍残留一定的免疫原性人缘化单克隆抗体又较嵌合抗体有所改进。由于鼠源性抗体可变区中的骨架区仍残留一定的免疫原性，为了最大限度地减少鼠源成分，用人骨架区替代鼠骨架区可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了CDR是鼠源以外，其余全部是人源结构。这一类型的抗体被称为CDR移植抗体或改型抗体，包括完全CDR移植抗体、部分CDR移植抗体和特异决定区（SDR）移植抗体[8]。2.3.1 完全CDR移植抗体

完全CDR移植抗体由于鼠源性抗体VR中的骨架区仍残留一定的免疫原性，为最大限度的减少鼠源成分，用人FR替代鼠FR可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了３个CDR是鼠源以外，其余全部是人源结构，这一类型的抗体称为CDR移植抗体或改型抗体。应用这一策略，将鼠源McAb的CDR区完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗体。但随后多项研究发现，简单的CDR移植往往明显降低抗原－抗体反应的亲和力，甚至丧失与抗原结合的能力。其原因在于FR不仅作为骨架对CDR起到支持作用，FR中的某些非CDR区补充调控残基还为CDR的回折构象提供必要的支持，其形状和侧链大小协同决定CDR的基本结构，影响CDR与抗原结合的特异性和亲和力[9-10]。2.3.2 部分CDR移植抗体

在简单CDR移植的基础上又相继发展了部分CDR移植技术。研究发现轻链的 CDR1、CDR2和重链的CDR3对保证抗体与抗原特异性结合至关重要，其余三个CDR的作用则较低[11]。因此只将抗体结合抗原必须的CDR移植到人抗体的FR骨架上即能获得对人免疫原性更小的嵌合抗体，这类抗体称为部分CDR移植抗体。2.3.3 特异决定区移植抗体

正如并非所有的CDR在抗原抗体反应中具有同样的重要作用，X射线晶体衍射实验提示具体到一个CDR中,不是所有的蛋白分子都参与抗原的特异性识别。执行抗原识别的CDR中的一些特定区域称为SDR。由此又产生了SDR移植抗体。该抗体是将McAb中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基移植到人抗体的相关部位，从而进一步提高抗体的人源化水平。根据目前的研究，抗体轻链的SDR多位于27d、34、50、55、89、96位残基，而重链的SDR多位于31、35b、50、58、95、101位残基[12]。基于上述两种策略，部分CDR移植、SDR移植的构建方法主要有：（1）模板替换，使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR；（2）表面重塑，对鼠 CDR和FR表面残基进行镶饰或重塑，使其具有类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的形式；（3）补偿变换，对起关键作用的残基进行改变以补偿完全的CDR移植；（4）定位保留，人源化McAb以人FR保守序列为模板，但保留了鼠源McAb VR中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR和FR中的一些关键残基。

2.4 全人源单克隆抗体

由于免疫原性的存在，人们一直在努力制备全人源化的单克隆抗体，目前主要有抗体库技术和人源性抗体转基因小鼠技术两种。2.4.1 抗体库技术

抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免疫，从理论上讲，106-108的库容就可能包容所有的抗体。利用抗原即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，•并能筛选到针对该物种自身抗原的抗体。从人的抗体库中可以得到完全是人源的McAb，•克服了难以用杂交瘤技术获得人源McAb的障碍。此外，由于细菌细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体。抗体库技术主要包括了噬菌体抗体库和核糖体展示技术。

噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因;PCR 扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体,形成组合文库;将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先导系列的紧靠下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。

核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如去掉3′末端终止密码子，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA 的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA 进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。2.4.2 人源性抗体转基因小鼠技术

适宜基因工程改造的小鼠成为亲和力成熟全人源抗体产生的强劲引擎，其体内免疫系统自然选择与成熟机制促使产生的抗体具备成为药物的天然优势，包括高效与特异性、低免疫原性与可工艺性等。产生的系列抗体包括针对全新靶点的全新作用机制的抗体药物，也包括针对经典靶点的升级抗体药物[13]。构建转基因小鼠，目的是用人的抗体基因转入小鼠相应基因，产生分泌人抗体的转基因小鼠。在转基因小鼠的基础上，产生分泌抗体的转基因小鼠。在目前FDA批准上市的全人源单抗中，技术来源除了噬菌体抗体库技术外，有三种转基因小鼠平台技术，即HuMAb-Mouse、XcnoMouse和VelocImmuneTM。

HuMAb-Mouse：HUMab转基因小鼠整合入人抗体基因450kb(200kbIgH；230kb Igk，约占人类IgGκ的50％)，免疫该小鼠可以产生0.1-5nmol／L的抗体。虽然该小鼠转入的人抗体基因组还是比较小，但仍获得巨大成功。

XcnoMouse:XenoMouse转基因小鼠也是目前最为成功、应用最广的转基因小鼠之一。该转基因小鼠整合入大部分人抗体VH和Vκ基因，大小分别为1020kb和800kb。重链包含34个V区基因、所有的重链D区和J区，以及Cγ

2、Cμ和Cδ基因，共66个功能基因；轻链包含18个V区基因、所有的5个J区和Cκ基因，共32个功能基因。该转基因小鼠XMG2-KL可以产生全人IgM和IgG2，亲和力可以达0.1～1nmol／L。

VelocImmuneTM：不同于以往的转基因小鼠抗体筛选平台，VelocImmuneTM产生人可变区与鼠恒定区组成的反向嵌合抗体。小鼠Ig H恒定区通过B细胞胞质区的信号转导区域(如Igα与Igβ)传递天然的免疫信号，并通过与其他类型免疫细胞上的Fc受体的结合促使小鼠产生强大的免疫反应，并提供半衰期长且亲和力高的抗体。该类转基因小鼠免疫后产生的抗体可变区编码序列通过基因克隆技术与人源恒定区编码序列进行构建，反向嵌合抗体即可转变为适宜药用的全人源抗体。

另外转基因小鼠技术还有TC MouseTM、KM MouseTM和Five-feature mouse，但它们都还未经过市场的检验。单克隆抗体衍生物

为了更好地发挥抗体药物的治疗效果，人们构建各种形式的工程抗体来改善它们的特性和效能。例如，制备抗体和药物的偶联物，增加对靶细胞的杀伤；改变抗体分子大小，构建小分子抗体，使之有较好的肿瘤/血液比；制备双特异性抗体，同时结合两个不同的抗原表位；增加抗体的亲和力；改进抗体ADCC或CDC效应；改变抗体的药代动力学，使半衰期延长。3.1 抗体药物偶联物

抗体药物偶联物(ADC)是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中[14]。单抗和小分子本身都是药物，都可以单独用来治疗疾病，ADC的设计思路是利用两者的长处来弥补可能的不足或者缺陷。单抗具有很高的专一性，但是通常药效不强，往

往需要与小分子药物治疗并用；小分子药物活性强，缺点是专一性较差，从而可能存在毒性，受副作用和剂量的影响较大；有些小分子药物，特别是肽类药物在血液中的半衰期过短，通过和单抗结合，可以改善这方面的缺陷。ADC 将两者结合，在到达目标细胞时将小分子药物释放出来，这不仅能灵敏地区分出健康和疾病组织，限制与非目标细胞的作用，降低毒性，还能够明显改善药代动力学和向目标组织的传递[15]。

构建抗体偶联物主要有三个步骤：选择合适的抗体、选择合适的药物和选择合适的链接方式。这样构建的抗体偶联物需要具有以下的特性：（1）稳定性，链接需要在血液循环中保持稳定，避免过早发生裂解，造成对健康组织器官损伤；（2）分特异性免疫反应，即药物结合到单抗不能破坏单抗本身的特异结合能力；（3）内化和药物的释放，一般ADC都是通过单抗与目标细胞结合后再内化，将小分子药物在细胞内释放，因此需要控制药物的数量，以发挥最大的效果；（4）药物作用，释放出的药物需要在很低的浓度（皮摩尔级）发挥效果，因此需考虑药物的活性。3.2 小分子抗体

小分子抗体具有分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统表达及易于基因工程操作等优点。常见的单价小分子抗体有Fab段、ScFv段、FV段、二硫键稳定的Fv段、单域抗体和超变区等；多价小分子有双链抗体、三链抗体和微型抗体等；特殊类型的小分子抗体有双特异抗体和催化抗体等[16]。当前，常用于生产小分子抗体片段的表达系统通常有大肠杆菌（E．coli）表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统四种[17]。小分子抗体的优势在于不需要糖基化修饰，可以在原核细胞中表达，操作方便。因此这四种表达系统的成本是依次增加的，但翻译后的加工精确性和准确度却是依次递减的。3.2.1 Fab抗体

Fab抗体由一条完整的轻链和重链Fd段通过一个链间二硫键连接组成一个异二聚体，大小为完整抗体的三分之一，但其仍保持了亲本抗体的fv段结构和与抗原结合的特异性与活性的能力。并且分子结构比较稳定具有穿透力强、免疫原性低，可与多种药物及放射性同位素偶联，可与多种毒素和酶结合，用作药物的导向治疗载体和显影等特点。3.2.2 单链抗体

在DNA水平上用一段 适当的寡聚核苷酸作为连接肽（linker）将VH和VL连在一起，使之表达成为一条单一肽链，即为单链抗体（ScFv）。单链抗体大小仅为全抗体的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原结合部位的最小片段,但有时构建的ScFv其亲和力明显低于亲本抗体，并常有聚集的倾向。3.2.3 单域抗体

由抗体轻、重链可变区基因（VH、VL）间通过一段连接肽基因拼接后表达形成的重组蛋白，大小为全抗体的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原结合部位的最小片段。其分子量更小，具有一定的可溶性和稳定性特点，相较于其它的抗体分子，单域抗体更容易进入细胞。3.2.4 双特异性抗体

双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，一个位点可与靶细胞表面抗原结合，另一个位点则可与载荷物如毒素、酶、细胞因子、放射毒素等耦合，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，其靶向性的特点可以减少载荷物的毒副作用。单克隆抗体的应用

随着单克隆抗体的完善与推广，单克隆抗体在农业、食品、治疗疾病等方面的应用越来越广泛，并取得了良好的效果。4.1 农业和食品 由于单克隆抗体的高特异性和高灵敏性，单克隆抗体农业和食品的应用主要集中在了检测方面。在食品中对动物性食品中β兴奋剂、抗生素和激素等的检测，植物性食品中农药残留物的检测，还可以检测储存食品中的微生物含量。在农业中，单克隆抗体可以对牲畜的细菌、病毒和寄生虫的患病情况进行筛选。在植物中，除了对病虫害的诊断应用以外，单克隆抗体还在药用植物活性成分定性定量分析、成分分离、培植育种中得到了广泛的应用。4.2 医学

单克隆抗体主要应用在医学方面，不仅为基础医学提供了有价值的载体，更在临床医学得到了广泛的应用，如治疗肿瘤、移植排斥、自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等。4.2.1 治疗肿瘤

近20年来，抗肿瘤抗体药物已成为治疗癌症的重要方法，是治疗癌症最成功的的策略之一。据PharmaprojectsV5数据库统计，目前上市与临床在研的约500种抗体药物中，约有50%用于肿瘤治疗，临床在研的抗肿瘤抗体药物共约20多种，针对70多个靶点[18]。目前，销量排名前五的抗体类药物，其中有三个都是用于治疗肿瘤，其中贝伐珠单抗用于治疗转移性癌症，曲妥珠单抗通过附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长，利妥昔适用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤的治疗。截止2015年底，FDA共批准了21个抗肿瘤类药物，2016年新批准了用于膀胱癌靶向治疗的Tecentriq和治疗软组织肉瘤的Lartruvo。近年来，利用单克隆抗体靶向治疗肿瘤已经成为全球靶向治疗药物的主流，免疫检验点靶向抗体药物的研发更是极大地推动肿瘤免疫治疗，是目前肿瘤治疗的最热点所在[19]。同时抗体治疗联合其他治疗策略也成为了必然的发展趋势，联用型治疗适用性更广，临床效果更持久，不良反应更少，病灶去除更彻底，有效防止肿瘤的复发，显著提高了存活率。4.2.2 器官移植

移植排斥是器官移植失败的重要因素之一，而单克隆抗体可以有效地改善移植排斥反应，其应用也在不断增长，目前的研究和应用主要集中于清除不同种类的白细胞分化抗原（CD），例如采用抗CD154单克隆抗体阻断免疫细胞活化信号传导途径,主要应用于胰腺、心脏、皮肤等多个器官的移植，证明抗CD154单抗能有效地抑制移植排斥反应，延长移植物的存活时间[20]。4.2.3 自身免疫病

自身免疫性疾病的治疗通常采用的糖皮质激素、免疫抑制剂等,虽然有一定疗效,但长期使用都会产生严重的不良反应,而且都只能减缓病情的发展,并不能根治疾病[21]。而单克隆抗体可以有效地改善和治疗自身免疫病，主要有以下的三种作用机制。（1）封闭细胞因子和生长因子的单克隆抗体药物，其中最成功的便是TNF抑制剂，包括伊纳西普、英孚利昔、阿达木、赛妥珠和戈利木，适用于类风湿关节炎、青少年关节炎、牛皮癣、结肠炎、脊柱炎和银屑病等；（2）受体阻滞和受体调节的单克隆抗体药物，即单抗结合受体，阻断配体和受体相互作用，下调细胞表面目标受体的表达，这些抗体包括治疗类风湿关节炎的IL-6受体抗体tocilizumab,重组非糖基化的人IL-1受体拮抗剂阿那白滞素(anakin-ra)等；（3）耗竭异常免疫细胞及介导细胞信号的单克隆抗体药物，通过结合细胞表面抗原,如CD20,CD22、CD80和CD52,通过FcγR介导的ADCC作用和CDC作用杀伤异常的淋巴细胞，有治疗1型糖尿病的otelixizumab、治疗多发性硬化症的阿伦和治疗慢性淋巴细胞白血病ofatumumab等一系列单抗药物。4.2.4 抗感染

细菌和病毒等病原体感染机体的机制复杂,由于单克隆抗体只能识别单一抗原表位,限制了抗体药物的抗感染效果。抗感染领域的抗体药物发展缓慢，目前仅有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠单抗以及抗炭疽杆菌的瑞西巴库单抗两个品种上市[22]。目前抗感染的单克隆抗体的研究热点集中于埃博拉病毒抗体、抗呼吸道合胞病毒抗体、抗炭疽杆菌抗体等，2014年西非大规模埃博拉病毒疫情爆发后，实验性抗体药物ZMapp第一个被用于临床治疗，中国研制的抗体药物MIL77也成功用于治疗，抗体药物再次显示了在抗感染领域的应用前景。单克隆抗体药物可能存在的问题

单克隆抗体导致的不良发应主要有皮肤及附件损害、全身反应、心血管损害等，具体表现为皮疹、瘙痒、寒战、发热、心慌、心跳加快等，严重可导致急性呼吸衰竭、多器官功能衰竭、严重出血、脑梗死、过敏性休克等。单克隆抗体可能的不良反应也许与以下3个机理之一有关:所用mAb的异源性,特别是当给予mAb而无相关的免疫抑制剂时；生理功能的抑制以及mAb的特异性；mAb与靶点结合后炎症细胞或介导物的活性[23]。从发生人群来看，患者的年龄集中在儿童和老人，这可能是由于儿童的器官/系统发育不完善，使得个体对药物的吸收、分布、代谢相对缓慢，药物在体内滞留的时间较长；而老人往往患有心血管疾病、高血压、糖尿病等，这些可能都会引起不良反应的发生。因此，临床中使用单克隆抗体药物是应注意：（1）重视患者人群，注意防范儿童或老年患者不良反应的发生。（2）注意首次用药，初次静脉滴注单克隆抗体时，应控制滴速。（3）询问患者药物过敏史和既往病史。（4）使用前建议预防使用抗过敏药物。（5）对具有肝炎病史的患者，注意对肝功能和病毒的检测，避免肝病复发。（6）按照说明书使用单克隆抗体药物，避免超说明书用药。（7）单克隆抗体制剂应保存在2-8℃的环境中，避免冻结。（8）输注药液的过程中，加强巡视，严密观察药物引起的不良反应，及时给予相应的处理，保证患者的用药安全[24]。展望

单克隆抗体药物这些特征使它成为了生物医药领域一颗耀眼的明珠。过去的30年中，随着研究的不断突破，单克隆抗体从鼠源发展到人缘，提高了单克隆抗体的药效和安全性。虽然单抗药物还存在一些尚未解决的问题，最突出的问题是如何降低单抗的免疫原性，单抗的异源性所引起的抗体反应，不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来严重的后果。但是我们可以相信随着研究的不断深入；生产工艺的不断成熟；检测技术不断的完善，现有的问题会逐一地解决，并且必将出现更高靶向性和药效更强的单克隆抗体药物，单克隆抗体药物将在治愈疾病中显示出它独特的效果，为患者带来更大的希望。

未来伴随着生物技术制药的发展，单克隆抗体将在其中占有更重要的地位，并逐渐成为生物医药领域发展的主要方向。目前单克隆抗体药物快速扩大的市场已经成为制药业争夺的焦点，为制药公司提供了发展的契机。我国企业虽然进入该领域较晚，但在仿制单克隆抗体药物的规模化、产业化的基础上，积极探索、开发和创新，相信很快会在国际市场上占有一席之地。

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