7单克隆抗体制备教案

第一篇：7单克隆抗体制备教案

单克隆抗体的制备

一、教学目标

知识目标：

1、单克隆抗体的概念

2、单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。

3、单克隆抗体的应用，和普通抗体相比的优点。能力目标：

1、学会从复杂的制备过程中找出简单的流程图

2、注意前后知识点的对比学习。情感态度价值观：从生物导弹的应用了解单克隆抗体目前在抗癌方面的贡献，并努力掌握更多的相关知识。

二、教学的重点难点：

单克隆抗体的制备过程，以及过程中涉及的具体筛选过程。

三、教学课时：1课时

四、教学过程：

【一】锚式问题：从“生物导弹”一个新颖而又陌生的画面入手。引发学生的探究热情。具体结合材料和图片来介绍生物导弹。资料：“生物导弹”是免疫导向药物的形象称呼，它由单克隆抗体与药物或放射性同位素配合而成，因带有单克隆抗体而能自动导向，在生物体内与特定目标细胞或组织结合，并由其携带的药物产生治疗作用。问题：生物导弹中的关键成分是什么？什么是单克隆抗体？ 【二】自主探究（4分钟，学生看课本完成）

1、长期人们怎样获得抗体？这样的抗体有什么缺点？

（给动物反复注射抗原，然后在动物的血清中提取抗体。抗体产量低、纯度低、特异性差）

2、B淋巴细胞在分泌抗体时有什么特点？B淋巴细胞实际指的是什么细胞？（一个或是一种B淋巴细胞只能分泌一种抗体；效应B细胞或是浆细胞）

分析：这两个问题比较简单，而且在课本中能直接找到答案，学生迅速阅读课本就能完成。【三】继续探究（10分钟，学生看课本，查阅资料，讨论合作完成）

1、写出单克隆抗体制备的过程简图（略，见课件）

2、怎么获得免疫小鼠，目的是什么？

（给小鼠注射特定的抗原，使小鼠发生特定的体液免疫，产生相应的B淋巴细胞）

3、为何选择B淋巴细胞和骨髓瘤细胞？

（B淋巴细胞能产生特定的抗体，单不能无限增殖；骨髓瘤细胞能无限增殖）

4、过程中大致需要几次筛选？怎么筛选？目的是什么？（主要是2次。第一次为了筛选出杂交瘤细胞；第二次筛选出能大量产生特定抗体的杂交瘤细胞。）

5、最终获得单克隆抗体的办法有几种？分别是？

（两种。体内在小鼠的腹水中提取；体外在细胞的培养液中提取）

6、单克隆抗体制备过程涉及的技术及其原理有哪些？

（细胞融合：原理是细胞膜具有流动性；动物细胞培养原理：细胞增殖）

分析：上述的6个问题涉及的内容是本节课的重点和难点，也是考点，需要和学生一起系统化的梳理，并强调重点内容作好笔记。【四】继续探究总结

1、单克隆抗体的“单”和“克隆”分别指的是什么？

（单：单个能产生大量抗体的杂交瘤细胞；克隆：无性繁殖即有丝分裂）

2、单克隆抗体的应用主要有哪些？

（主要集中在医学方面，诊断疾病，治疗疾病等）

3、单克隆抗体的主要优点有哪些？

（特异性强、灵敏度高、纯度大、可大量制备）【五】运用质疑

1、科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是(A)A．经过免疫的B淋巴细胞 B．不经过免疫的T淋巴细胞 C．经过免疫的T淋巴细胞 D．不经过免疫的B淋巴细胞

2、将小鼠骨髓瘤细胞与一种B淋巴细胞融合，可使融合的细胞经培养产生单克隆抗体，下列说法中不正确的是(C)A．动物细胞融合和动物细胞培养技术是单克隆抗体技术的基础 B．实验中杂交瘤细胞从培养基中吸收葡萄糖的方式是主动运输

C．B淋巴细胞与骨髓瘤细胞直接放入培养液中就能融合为杂交瘤细胞

D．按照培养基的用途分类，实验中筛选杂交瘤细胞的培养基是选择培养基

6、单克隆抗体是指（C）

A．单个骨髓瘤细胞增殖产生的抗体

B．单个B淋巴细胞增殖产生的抗体 C．单个杂交瘤细胞增殖产生的抗体

D．单个抗体通过克隆化，产生大量抗体 【六】课外延伸

单克隆抗体是来自谁？如果直接给人注射，会有什么反应？请同学想办法来解决！！

第二篇：单克隆抗体的制备论文 (自动保存的)

摘 要

单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要工具,在基因和蛋白质的结构和功能研究方面有着不可或缺的作用。近年来,随着分子生物学技术的发展,出现了嵌合单克隆抗体和由转基因小鼠、噬菌体展示技术、核糖体展示技术及共价展示技术所产生的单克隆抗体。这些技术将有效解决单克隆抗体的鼠源性等问题。本文主要讲述制备单抗的实验过程，并对实验结果及其影响因素进行分析。

关键词：抗体，单克隆，肿瘤，细胞融合，淋巴细胞

Abstract

The monoclonal antibody technology is the modern life sciences research important tool, has the indispensable function in the gene and the protein structure and the function research aspect.In recent years, along with the molecular biology technology's development, presented the embedment monoclonal antibody and by the transgene mouse, the bacteriophage demonstrated that the technology, the ribosome demonstrated the technology and the covalence demonstrated the technology produces monoclonal antibody.These technologies effective addressing monoclonal antibody questions and so on mouse source.This article mainly prepares Shan Kang the new technology to the above several kinds to make a summary and analysis of factors.Keywords:antibodi,monoclonal, neoplasms,cell fusion,lymphocyte

目录

1.前言....................................................................................................................4

1.1国外现代生物技术产业发展的现状............................................................4 1.2我国现代生物技术医药产业发展的现状.....................................................4 2.文献综述.............................................................................................................5

2.1单克隆抗体的概念.....................................................................................5 2.2单克隆抗体的主要特点..............................................................................5 2.3单克隆抗体的应用..................................................................................6 3实验方法.............................................................................................................9

3.1材料和方法：..........................................................................................9

3.1.1材料..............................................................................................9 3.1.2.方法............................................................................................10

4.结果与讨论.......................................................................................................11

4.1细胞融合结果的差别..............................................................................11 4.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用...................................................12

4.3加入巨噬细胞的用量和时间..................................................................13 4.4不同源的巨噬细胞.................................................................................14 4.5细胞加入的量.........................................................................................15 4.6骨髓瘤细胞株的比较..............................................................................16 4.7融合剂的比较.........................................................................................17 4.8细胞融合温度的比较..............................................................................18 4.9各种营养液的比较.................................................................................19 4.10细胞换液的方案...................................................................................20 4.11微量培养...............................................................................................20 4.12无血清培养液.......................................................................................21 5.结论..................................................................................................................22 6.参考文献..........................................................................................................24 7.致谢..................................................................................................................2

1.前言

现代生物技术制药工业始于1971年，现已创造出35个重要治疗药物，全球大约有2500多家公司，主要产品有重组蛋白质药品、重组疫苗和诊断、治疗用的单克隆机体三大类。我国自80年代在采用现代生物技术改造传统生物技术制药产业方面已取得初步成果。但我国生物技术诊断试剂、酶工程、动植物细胞工程医药产品、现代生物技术支撑技术、后处理技术和制剂技术等方面与国外还存在差距。

1.1国外现代生物技术产业发展的现状

自1971年Cetus公司成立至今，现代生物技术制药工业已走完了二十五年的路程，创造出35个重要的治疗药物，目前已在治疗癌症、多发性硬化症、贫血、发育不良，糖尿病、肝炎、心力衰竭、血友病、囊性纤维变性和一些罕见的遗传性疾病中取得良好效果。在医药工业中，传统生物技术（包括近代生物技术）已为人类提供了许多重要药品，在保障人类生命健康和推动社会进步中发挥了巨大作用；现代生物技术以其特有的高新技术又为人类提供了传统生物技术难以获得的极微量的珍贵药品。由于这一系列现代生物技术新型药物的出现，使过去无法治疗的疑难疾病得到了治疗。同时，应用现代生物技术DNA重组，细胞融合以及细胞大规模培养等现代生物技术发展和提高传统生物技术的生产水平，为抗生素、氨基酸、维生素以及基体激素等药品的生产，构建了高产新菌株，创造新工艺，提高生产能力，降低生产成本，促进生产发展。

1.2我国现代生物技术医药产业发展的现状

现代生物技术医药产业化进程：我国自80年代开始进行现代生物技术药品的研究和开发，虽然起步较晚，基础较差，但一开始就受到党和国家的高度重视，并列为“863”计划和国家重点攻关项目的主要内容，经过十多年的努力，特别是近五年来，现代生物技术医药产业有了突破性的进展，到1998年7月底我国已有十四种现代生物技术药品和疫苗投入生产，据初步统计，1997年的工业总产值约20亿（包括采用现代生物技术改造传统生物技术后新增加的产值在内）。目前我国己有近200多个现代生物技术制药企业，其中约30家生产企业已具有不同规模的生产能力，陆续投入生产。因此，可以说我国现代生物技术制药产业化已经开始。

本文主要介绍了单克隆抗体的制备过程及应用。

2.文献综述

2.1单克隆抗体的概念

抗体是由B淋巴细胞分化形成的浆细胞合成、分泌的。每一个B淋巴细胞在成熟的过程中通过随机重排只产生识别一个抗原的抗原受体基因。动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，重排后具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞，大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆抗体。

2.2单克隆抗体的主要特点

1)由于来于单克隆细胞，所分泌的抗体分子在结构上高度均一，甚至在氨基酸序列及空间构型上均相同；

2）由于抗体识别的是抗体分子上单一抗原位区，且所有抗体分子均相同，由此，单克隆抗体具有高度特异性；

3）产生该抗体的为一无性细胞系，且可长期传代并保存，为此可持续稳定的生产同一性质的抗体。2.3单克隆抗体的应用

作为亲合层析的配体:单克隆抗体能与其相应的抗原特异性结合，因而能够从复杂系统中识别出单个成分。只要得到针对某一成分的单克隆抗体，利用它作为配体，固定在层析柱上，通过亲合层析，即可从复杂的混和物中分离、纯化这一特定成分。如用抗人绒毛膜促性腺激素(hCG)亲合层析柱，就可从孕妇尿中提取到纯的hCG。与其它提取方法(沉淀法、高效疏水色谱法等)相比，具有简便、快速、经济、产品活性高等优点。

作为生物治疗的导向武器:脂质体是由既亲水又亲油的两亲磷脂组成的连续双分子层微囊，内含水相空间，可包裹水溶性物质。包有细胞毒剂的脂质体膜上偶联抗体，可定向攻击靶细胞，称为免疫脂质体。这种“导向治疗”，在动物试验与体外试验中已获得满意效果。如热敏免疫脂质体，由抗人乳癌细胞抗体经疏水长链脂肪酸修饰，抗体带上长的疏水碳链，部分插入脂质体的脂双层膜中，抗体Fab段仍暴露在膜表面，因而保持了抗体活性。热敏免疫脂质体可特异识别靶细胞(人乳癌细胞)，并通过相变温度引起脂质体破裂，从而定向释放药物。另外，可将化疗药物、细菌毒素、植物毒素或放射性同位素等细胞毒剂与抗肿瘤抗原的单克隆抗体直接交联，利用其导向作用，使细胞毒剂定位于肿瘤细胞把它直接杀伤。这不仅提高了抗体的疗效，也可降低细胞毒剂对正常细胞的毒性反应。如应用抗T细胞单抗和柔红霉素结合物，在体外对非T淋巴细胞就无杀伤作用。但是，要把这种方法应用于临床，目前还存在不少技术难关，包括人体对鼠源单抗的排异问题等。

作为免疫抑制剂:抗人T淋巴细胞单抗(McAb)作为一种新型免疫抑制剂，已广泛应用于临床治疗自身免疫疾病和抗器官移植的排斥反应。其作用机理有赖于McAb的种类及其免疫学特性。注射抗小鼠Thy-1抗原的单抗，可以抑制小鼠同种皮肤移植的排斥反应。此外，对用于同种骨髓移植的供体骨髓，在体外经抗T细胞单抗加补体处理，能减轻移植物抗宿主病的发生。作为研究工作中的探针:单克隆抗体只与抗原分子上某一个表位(即抗原决定簇)相结合，利用这一特性就可把它作为研究工作中的探针。此时，可以从分子、细胞和器官的不同水平上，研究抗原物质的结构与功能的关系，进而并可从理论上阐明其机理。如用荧光物质标记单抗作为探针，能方便地确定与其结合的相应生物大分子(蛋白质、核酸、酶等)在细胞中的位置和分布。

增强抗原的免疫原性:抗体对抗原免疫原性的增强作用由来已久，60年代就已发现幼猪对破伤风类毒素难以产生抗体，注射相应特异性抗体IgG，就能有效地提高对委内瑞拉马脑炎病毒的免疫应答。1984年以来，Celis等发现，抗乙肝病毒(HBs)IgG可增强HBs抗原对特异性人T细胞克隆的刺激增殖，并可诱生干扰素。在小鼠中发现，当低剂量的HBs抗原不产生免疫反应时，加入抗HBs抗体组成的复合物，则可有效地诱生免疫反应。根据这一作用，现已研制出乙肝的抗原—抗体复合物型治疗性疫苗。

作为医学检验试剂:单克隆抗体作为医学检验试剂，更能充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，大大提高了抗原—抗体反应的特异性，减少了和其它物质发生交叉反应的可能性，使试验结果可信度更大。单抗的均一性和生物活性的单一性，使抗原—抗体区应结果便于控制，利于标准化和规范化。目前已有许多检验试剂盒用单抗制成，其主要用途如下：

(1)诊断各类病原体

这是单抗应用最多的领域，已有大量诊断试剂商品供选择。如用于诊断乙肝病毒、丙肝病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、EB病毒和各种微生物、寄生虫感染的试剂等。单抗所具有的灵敏度高、特异性好的特点，使其在鉴别菌种的型及亚型、病毒变异株，以及寄生虫不同生活周期的抗原性等方面更具独特优势。

(2)肿瘤特异性抗原和肿瘤相关抗原的检测

用于肿瘤的诊断、分型及定位。尽管目前尚未制备出肿瘤特异性抗原的单抗，但对肿瘤相关抗原(如甲胎蛋白、肿瘤碱性蛋白和癌胚抗原)的单抗早就用于临床检验。随着淋巴细胞杂交瘤技术的应用，许多抗人肿瘤标记物的杂交瘤细胞株已经建立，这为肿瘤的早期诊断及其阐明肿瘤的发生、发展，了解肿瘤细胞的生物学活性及其定量研究奠定了基础。用抗肿瘤单抗检查病理标本，可协助确定转移肿瘤的原发部位。以放射性核素标记单抗可用于体内诊断，再结合X-线断层扫描技术，可对肿瘤的大小及其转移灶作出定量诊断。

(3)检测淋巴细胞表面标志

用于区分细胞亚群和细胞的分化阶段。例如检测CD系列标志，有利于了解细胞的分化和T细胞亚群的数量和质量变化，这对多种疾病诊断具有参考意义。细胞表面抗原的检测，将对白血病患者的疾病分期、治疗效果、预后判断等方面有指导作用。组织相容性抗原检测是移植免疫学的重要内容，应用单抗对其进行位点检测可得到更可信的结果。

(4)机体微量成分的测定

应用单抗结合其它技术，可对机体的多种微量成分进行测定。如放射免疫分析，即是利用了同位素的灵敏性和抗原-抗体反应的特异性而建立起来的方法，它可以测至10-9～10-12g，使原来难以测定的激素能够进行定量分析。除了激素，还可检测诸多酶类、维生素、药物和其它生化物质。这对受检者健康状态判断、疾病检出、指导诊断和临床治疗均具有实际意义。3实验方法

3.1材料和方法：

3.1.1材料

a．盐溶液：将NaCl8克，KClO4克，Na2HPO4·2H2O1.77克，NaH2P04·H 692O0．克，葡萄糖2克，酚红0.001克，溶于1000ml双蒸水中，pH7.2。高压115℃，15分钟，保存于室温。

标准培养液；RPMI1640，DMEM或者Iscove„s培养液，加入10％灭活血清(马血清、小牛血清或胎牛血清)，贮存于4℃。在使用前加入2％100×谷酰胺，1％100×丙酮酸钠，1％100 ×抗菌素(青霉素和链霉素各10000单位／m1)，0.05％0.1M硫乙二醇。所有培养液均需于两天内用完。

选择性培养液：即所谓HAT培养液，100× HAT培养液，100×H：Hypoxanthine次黄嘌呤为10mM，必须在45℃溶解完全。100×A：Aminopterine氨基喋呤为0.04mM．必须在45℃溶解于稀释NaOH溶液中，然后再用HCI中和。

I00×T；Thymidime胸腺嘧啶，1.6mM，在室温中溶解。然后各溶液分别除菌过滤，分装5m1一支，-20℃保存。HAT和HT的营养液都必须在应用前配制，方法把100×贮存液按1％加入营养液即成。

细胞冻存液：为9份营养浓加入l份DMSO二甲基亚砜，混匀。此时细胞株必须生长良好[1]。b、骨髓瘤细胞株

BALB／c小鼠骨髓瘤细胞株，经过克隆纯化P3×63Ag8(简称×63)和其衍生株SP—2／0，SP—2／0不产生球蛋白，此两株细胞均为本研究所Dr、G、Kohler所培育，这些细胞株都适应于各种标准培养液以及2.5cm2和7.5cm2的塑料培养瓶，分别装入4ml或12ml营养液，通入气体为10％CO 2、7％O2和83％N2，37℃恒温培养。3.1.2.方法

a、小鼠免疫

成年BALB／c小鼠各种性别均可，用流感病毒1000个血凝单位腹腔注射，作为首次免疫。7一12周后，再给200血凝单位病毒腹腔注射，作为加强免疫。

在加强免疫后4—5天，即可进行细胞融合，处死小鼠、无菌取脾，把脾细胞轻轻压入10m1的盐溶液中，然后把细胞悬浮液转入15ml离心管中，毛细管吹打，然后至室温中10分钟，让其自然下沉，吸出大约9ml上清液，不要搅动底下的沉淀块，然后用TURK溶液作白细胞计数。

b、腹腔内巨噬细胞的采取

把成年BALB／c小鼠处死，剥开腹部皮肤，用4—5ml的标准培养液或0.34M(＝11.6％)的蔗糖溶液注入腹腔，用18号针头从耻骨联合处，直接插入，把针头朝向肝右叶上方，然后轻轻按摩腹部，再行吸出腹腔液体。每鼠可得1.5—3×105的巨噬细胞(m￠)，这些细胞可收集于塑料管中，用任何一种标准培养液洗细胞，并于30分钟内用完。c、大孔培养

24孔培养板，每孔可容2m1培养液，培养于37℃，含7%CO2/DA大气恒温箱中。湿度为85—95％。

换营养液时，分别以无菌巴氏吸管联接于吸引装置上，吸出大约lml的血营养液，然后用一个小口的25m1吸管，分别加入预热的新鲜营养液。

如果细胞长得很密，可以用2ml吸管吸出培养液，转种于小瓶中，一般1.5ml细胞悬浮液可接种25㎝2的小瓶，当小瓶中细胞长至单层时，即可转种至75cm2的瓶中。以后即可按转种骨髓瘤细胞的方法，维持杂交瘤细胞。d、微量培养法

平底的微量培养板每孔可容纳0.25mI的培养液，细胞培养条件与24孔培养板相同。当细胞长待很密时，第一步可转入24孔培养板的二个孔中，加入1m1培养液，然后按24孔培养板处理。

4.结果与讨论

通过体内单克隆抗体培养的到以下结果，下面是对细胞融合的实验结果进行的分析，并对实验数据进行讨论。

4.1细胞融合结果的差别

用5×107的BALB／c小鼠脾细胞与5×106骨髓瘤细胞进行融合，方法按Kohler和Milstein（1975，1976)的方法，每批细胞融合物分装到24个培养孔，培养28天，记录活细胞每孔多余104者为阳性，结果如表1所示。

表1 各次细胞融合结果的差别

实验

脾号

阳性

孔

数3／24

0／

20／

223／ 22

2／

8／

24／ 2

824／24 3

0／24＋0／24

0／24＋0

／

18／24＋2

／

1／24＋0

／

2表1中融合的结果波动很大，结果理想时，所有的培养孔可以都是阳性，而不理想时则为0，而唯一确实可靠的结论是：只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。这些培养孔看起来十分清亮，在最初培养的第一周内，很少细胞碎片，而且这些巨噬细胞一直可存活到实验的结束。但巨噬细胞的存在并不是唯一的因素，在实验4、7、8和11中应用了每个培养孔加入1×104的巨噬细胞，获得理想结果，而相同地在实验3，12中也应用1×104巨噬细胞，结果却不理想。

4.2巨噬细胞在培养杂交瘤细胞株的作用

接下去一个实验，除了在实验的当天给每个培养孔加入2×104的巨噬细胞外，其他方面都按Kohler和Milstein的方案进行，结果见表2 细胞融合物的准备，接种和判定都按表1方法进行、本实验按表2所列于实验当天加入巨噬细胞。

表2 巨噬细胞对杂交细胞的作用

实验

脾号

阳性孔数

不加巨噬细胞

加巨噬细胞 2

2／24

24／24

8／23

21／24

24／24

24／24

24／24

24／24 4

0／24＋0／24

23／24

0／24＋0／24

24／24 11

18／24＋21／24

22／24 12

1／24＋0／24

24／24

由表2可得，巨噬细胞的效果十分明显，表现在相同的脾脏9和10，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。再如脾5，脾

6、脾12未加巨噬细胞时只有极少数杂交细胞克隆生长，而加入后几乎是90—100％都产生了杂交细胞的克隆。另外，在这个实验中，虽然脾12的细胞融合物在对照组中已加过了104巨噬细胞(参阅表1)但其效果并不理想，而当第二次加入另一个小鼠的巨噬细胞时，获得理想结果，说明前面的巨噬细胞是无效果的，为了避免遇上无效的巨噬细胞影响结果，应该合并3—4只小鼠的腹腔洗出的巨噬细胞，作为喂养细胞。

4.3加入巨噬细胞的用量和时间

可以将投入实验的脾细胞的量减少10倍，其他方法则按照K6hler和M11stein(1975，1976)的方法进行。不同剂量的巨噬细胞和不同时期加入的实验结果见表3。

表3 影响巨噬细胞的有关因素

加入日期

每孔加入巨噬细胞量

阳性孔数

0

33×103

43×104

5-0

0

0

0

0

0

1

0 21

0

1Ca

4

0

0

0

0

2合计

0

--

表3说明按照Kohler和Milstein(1975、1976)的方法，取一只BALB／c小鼠脾细胞5×106和骨留瘤细胞5×108进行融合。融合当天称为“0”天，每天收集小鼠腹腔巨噬细胞，并按各需要量加入培养孔，培养28天后，计算24个培养孔中，活细胞多于104的阳性孔[2]。

4.4不同源的巨噬细胞

巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长，结果如表4

表4 用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞的比较

动物来源

每个培养孔加入巨噬细胞数

总阳性数

3×103

3×10

4105

小鼠BALB/c

52117

小鼠C57BL/6

小鼠C3H

0

321

小鼠Outbred(杂种)7

大鼠Rat

121

豚鼠Guinea pig

0

巨噬细胞来自各种动物如表4所列，每种动物各取了3只进行脸皮灌洗，合并其巨噬细胞在细胞融合前一天接种于各培养孔，第25天时计数24个培养孔的阳性数、(活细胞多于104者为阳性。)．

另外，还试验了已经建株的巨噬细胞系和在实验室中长期传代的巨噬细胞株，这些细胞都来自BALB／c小鼠。

4.5细胞加入的量

脾细胞参加细胞融合的用量，通过脾细胞限量试验可以得到结果，结果见表5。

表5 限量脾细胞杂交试验

实验

参加融合的脾细胞数

2×106

4×106

374 14

由表5可知4×106的脾细胞结果较好，细胞融合数较多。取BALB／c小鼠牌细胞，分别用下表所列的脾细胞量与5×106x 63骨朗瘤细胞融合，接种于24孔培养板中，细胞融合的前一天，每孔接种2×104腹腔巨噬细胞。培养24天后，每孔活细胞数多于104者为阳性孔。4.6骨髓瘤细胞株的比较

细胞融合时脾细胞和骨髓瘤细胞数如表6所列，接种于24孔塑料板，每孔并含2×104巨噬细胞，第28天记录活细胞数大于104者为阳性。

表6 骨髓瘤细胞株的比较

骨髓瘤细胞

参加融合的脾细胞数

总阳性孔

数

3×106

X63

3×106

107

3×107

237 Sp2/0

3×108

0

0107

0

43×107

表6说明，选择合适的骨髓瘤细胞株，产生克隆的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。用骨髓瘤细胞x 63作为细胞融合的亲代细胞，后来产生的存活的杂交细胞抹，实际上都带有亲代骨髓细胞瘤细胞基因密码，因而各杂交细胞株产生的抗体（针对免疫原的)，都是球蛋白分子的混合物，上面带有一个片段，就是所需要的链的结合物。4.7融合剂的比较

在细胞杂交时用同一种骨髓瘤细胞和同一种小鼠脾细胞，但PEG作用后的杂交细胞存活数比经仙台病毒作用的存活数要少，所以我们选用不同厂牌和分子量的PEG作细胞融合试验，表上所列数据，为培养23天后，计数24孔培养孔中的阳性孔，结果如表7所示。

表7 PEG聚乙二醇比较表

产品来源

细胞融合方法

总阳性孔

Ⅰ

Ⅱ

Ⅲ

BDH200

0

0 Merck200

0

Serva200

0

0

0

0 Baker1000

0 BDH1000

0

Koch-Light1000 5

3数 Merch1000 GK 12

3Serva1000

1Merck20000

由表7说明，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应。但分子量太大阳性数也会有所下降，因为它们过份地粘稠，甚至加热至45℃时，也会粘在管壁上，但当高压时加入等量的盐水则较为稳定。4.8细胞融合温度的比较

脾细胞和骨髓瘤细胞在应用前都泡在水浴中，洗细胞时也都用低温离心机(2℃)。偶尔有一次制备细胞时没有进行冷处理，而洗脾细胞时离心沉淀也在室温进行，得到较多的杂交细胞株，这样重复试验，室温比常规的4℃和0℃往往结果好，见表8。

表8 温度对细胞融合的影响

实验

0-4℃

20℃

5×106

5×10 6

1/24

8/24

4/24

21/24 2

5/24

27/48

15/48

46/48 3

3/24

15/24

5/24

22/24 4

4/24

14/24

6/24

24/24 总阳性孔数

113

脾细胞数如表8所列，分别与5×106FO细胞融合，融合温度有0℃一4℃和20℃，在培养2l天时，活细胞数多于104为阳性。4.9各种营养液的比较

各种营养液与血清的比较分成几个实验进行，列于表9。

表9 各种营养液的比较

参加细胞

DMEM＋10%血清

RPMI＋10%血清

Iscove`s＋10%血清骨髓瘤细胞 脾细胞 马

牛

胎牛

马

牛

胎牛

马

牛

胎

牛

X63（5×10 6）10 6

0

5×10 6

5×10 6

5×10 6 20

15 17

20

脾细胞(三只小鼠脾细胞混合物)和骨髓瘤细胞的用量如表9所列，接种于24孔培养板，每孔并含有3×104的巨噬细胞，第23天确定阳性培养孔数，本实验包括三个内容：脾细胞的用量，RPMI培养液和I scove` s培养瓶三种血清的比较。由表9可知：DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。x 63的融合物在培养液中若用10％马血清虽然可以，但并不是常常都很理想。为了避免以后需要克隆限制杂交细胞的数量，我们常规应用Iscove` s培养液，也选用RPMI1840，因为它的缓冲能力较强，不完全依赖于合适的气体环境。Sp2/0(2×107)10 6

0

0

0

0

0

FO(5×10 6)10 6

4.10细胞换液的方案

表10 不同细胞换液方案比较

实验

换液方案

下列各天出现的阳性孔数

总阳性

6 8 10 12 14 16 20 24 28 Ⅰ

0

0

Ⅱ

0

07

Ⅲ

1数

Ⅰ

0

0

04

Ⅱ

0

410

1Ⅲ10 14 15

1516 17

表10试验了在细胞融合后，直接加入HAT选择培养波，让其直接暴露于高浓度的氨基喋呤中，比较结果，把细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。

4.11微量培养

表11 在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养

细胞融合物

培养板 FO细胞

脾细胞

标准板

微量5×10 6

2×10

板

6×10 6

15×10 6

10 7

2×10 6

6×10 6

15×10

2×10 7

2×10 6

6×10

15×10

表11可知，微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔，最高可达106，细胞融合混合物为6×106。脾细胞和107FO骨髓瘤细胞，接种整个微量培养板可希望获得12—16个杂交瘤细胞抹。

高度免疫的BALB／c小鼠脾细胞和FO骨髓瘤细胞融合，用50％PEG 4000作为促进剂，细胞数皆列于下表，分别接种于24孔培养板(每孔含有2×104巨噬细胞于2mIHAT)和微量培养板(即96孔板，每孔含有3×103巨噬细胞于0.25HAT培养液中。)于第21天计算阳性数[3]。

4.12无血清培养液

检测杂交瘤细胞株的产物常规是应用其细胞培养瓶其中含有血清，也有胎牛血清。对检测工作来说并不希望有这些东西，因为往往会干扰测定，或者对某些测定带来较高的基础值，也会造成单克隆产品分离和纯化的困难、我们试用了标记氨基酸或无血清培养液以取得在这种条件下的单克隆抗体。

用MEM作基础，加入标记物可获得理想的结果，可以从商业购得缺乏亮氨酸的MEM，原液的配制：无亮氨酸的MEM 45ml，加入[14C]亮氨酸5m1[14C]leucinc(250uCi)、lml10％葡萄糖和0.5m120％牛血清蛋白，4℃备用，在使用前临时配制应用液，即10ml原油十0.2m1100×谷酰胺十0.10m1100×丙酮酸钠十0.2m1100×V itra—mines十 0.1m1100×抗菌素和0.01ml 0.1M硫乙二醇，接种106活细胞于此培养液中，37℃，过夜，此时最好应用玻璃管并加塞[4]。

在实验中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛(GuiL—bert and lscove，1976Iscove和M elches，1978)，其中含有转移素transferrin和血清蛋白为唯一的蛋白成份，虽然配制这种培养液比较麻烦，但能支持杂交细胞抹继续生长和分泌抗体、每天能产生纯抗体10-20mg。

5.结论

通过小鼠免疫培养，腹腔内巨噬细胞的采取，微量培养，大孔培养，可得到一定量的杂交瘤细胞，同时分析了实验的一些影响因素，结果如下。

（1）.各次细胞融合结果的差别，只有在巨噬细胞活跃的培养孔中，才能得到抗体阳性的杂交瘤细胞克隆。

（2）.巨噬细胞对杂交细胞的作用，不加巨噬细胞，没有杂交单克隆细胞，加入巨噬细胞，结果大大增加。

（3）.加入巨噬细胞的用量和时间，投入实验的脾细胞的量减少10倍，培养28天后，活细胞多于104的阳性孔。（4）.用不同动物巨噬细胞作为喂养细胞，巨噬细胞来源于何种品系的动物并不重要，来自不同种动物的腹腔洗液，或者杂交动物的小鼠、甚至大鼠或豚鼠的巨噬细胞都可促使杂交瘤细胞生长

（5）.限量脾细胞杂交试验可知脾细胞加入量为4×106时，结果较好，细胞融合数较多。

（6）.骨髓瘤细胞株的比较中，选择合适的骨髓瘤细胞株（x63），产生单克隆抗体的几率较高，但不是都产生同一种抗体的。

（7）.融合剂 PEG聚乙二醇的比较中，所有低分子的PEG结果都差，其中有些是明显有毒性反应，但分子量太大阳性数也会有所下降。

（8）.细胞融合温度的比较中，室温比常规的4℃和0℃往往结果较理想。

（9）.各种营养液的比较，DMEM、RPMI、Iscove` s三种营养液都可得到较多的杂交细胞株，而对Iscove` s营养液比其他培养液要更好些。

（10）.不同细胞换液方案比较中，细胞融合物直接接种于HAT培养液中为优。

（11）.在微量培养板上作杂交瘤细胞株选择培养，可知微量孔培养的杂交细胞数常多于常规培养孔。

（12）.在无血清培养液中，所有的杂交瘤细胞克隆只在Iscovs`s完全培养液中才能生长旺盛。

6.参考文献

[1]齐香君，现代生物制药工艺学[M]，化学工业出版社，2003.9 [2]甄永苏等，抗体工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [3]李元等，现代工程药物[M]，化学工业出版社，2002.5 [4]张和君，单克隆抗体细胞免疫反应技术[M]，云南科技出版社，1985.2 7.致谢

本课题在选题及研究过程中得到杜老师的悉心指导。在杜老师的精心指导下，为我们开拓研究思路，顺利完成论文。杜老师一丝不苟的作风，严谨求实的态度，踏踏实实的精神，不仅授我以文，而且教我做人，给以我们终生受益无穷之道。对杜老师的感激之情是无法用言语表达的。

第三篇：单克隆抗体药物综述

单克隆抗体药物综述

摘 要: 通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备单克隆抗体药物 ,已经成为生物制药领域的一个重要方面 ,由于单克隆抗体药物专一性强、疗效显著 ,因此成为近年来研究的热点药物之一。此文就单抗药物的分类、应用进行了综述 ,并对其应用前景及存在的不足作了概述。

关键词:单克隆抗体 抗体药物 靶向 联用

自 1975 年Koeh ler 和M ilstein 首先报道利用小鼠杂交瘤细胞制备单克隆抗体以来, 经过近30 年的发展, 单抗技术在生命科学研究及医学实践方面作出了杰出的贡献, 已经成为了现代生物技术产业的支柱之一。

然而, 尽管单抗推动了生物诊断技术的革命, 但是在将单抗应用于人体疾病的治疗方面, 却在长时间内迟迟没有进展。早期的临床试验结果都不尽人意, 这是因为鼠源单抗应用于人体有许多限制].现今上市的单抗药物, 治疗的领域主要集中在肿瘤、自身免疫疾病、器官移植排斥及病毒感染等领域。由于单抗具有明确的作用位点, 与靶位点亲和力高, 而且通过改造的抗体其免疫原性大大减弱, 这些因素使得单抗在临床治疗中具有特异性强、见效快、副作用较低等优点, 因而单抗治疗有着广阔的前景。目前, FDA 批准上市的 17 个单抗药物中即有 8 个是用于治疗淋巴细胞肿瘤、乳腺癌及结直肠癌等, 而在开发阶段的单抗也有一半以上是与治疗各种癌症相关。可以预见, 在未来几年来将有更多的治疗性单抗药物上市, 其市场份额将进一步扩大。

目前, 单抗类药物的市场销售逐年提升的年均增长幅度在20%以上, 表现强劲。用于治疗非霍奇金淋巴瘤的单抗药物R ituxan 已成为世界第一的抗肿瘤药物, 2003 年销售为 14.89亿美元, 2002 年为 11.63 亿美元, 在 2002 年全球最畅销前 50位商标名处方药中排名 43 位。用于治疗关节炎的单抗药物Rem icade, 2002 年销售额为 12.97 亿美元, 当年全球药物销售排名第 37 位。2000 年世界单抗药物的销售额为 22.05 亿美元, 据F ro st&Sullivan 预测, 到 2003 年销售额将达到 47 亿美元。

下面就单克隆抗体药物的研究进展作一综述。

1单克隆抗体药物的分类

单抗药物一般分为:治疗疾病(尤其是肿瘤)的单抗药剂、抗肿瘤单抗偶联物、治疗其他疾病的单抗。单抗药剂针对的靶点通常为细胞表面的疾病相关抗原或特定的受体。如:最早被美国 FDA批准用于治疗肿瘤的单抗药物利妥昔单抗;抗肿瘤单抗偶联物 ,或称免疫偶联物(Immunoconjugate), 由单抗与有治疗作用的物质(如:放射性核素、毒素和药物等)两部分构成 ,其中包括放射免疫偶联物、免疫毒素、化学免疫偶联物 ,此外还有酶结合单抗偶联物、光敏剂结合单抗偶联物等。

2作为肿瘤治疗药剂的单克隆抗体药物

表1概括了近年来美国 FDA 批准上市的 5 个治疗肿瘤的单克隆抗体药物的基本情况 ,下面具体加以介绍。

2.1利妥昔单抗 在自身免疫性疾病形成过程中 ,B 细胞起重要作用。CD20是前B细胞向成熟淋巴细胞分化过程中表达的表面抗原 ,参与调节B细胞的生长和分化。利妥昔单抗(美罗华)是一种针对 CD20抗原的人鼠嵌合型单克隆抗体 ,是第一个被FDA批准用于临床治疗的单抗。进入人体后可与 CD20 特异性结合导致 B 细胞溶解 ,从而抑制 B 细胞增殖 ,诱导成熟 B细胞凋亡 ,但不影响原始B细胞。它能通过介导抗体依赖的细胞毒性(ADCC)、补体依赖的细胞毒性(CDC)作用和抗体与CD20分子结合引起的直接效应 ,包括抑制细胞生长 ,改变细胞周期以及凋亡等方式杀死淋巴瘤细胞[1 ]。

由于利妥昔单抗药物可以提高肿瘤细胞对化疗的敏感性 ,所以利妥昔单抗药物的优势就在于与其他治疗药物及治疗方式配合使用。临床研究表明美罗华单药或联合化疗治疗肿瘤具有良好的疗效和安全性 ,但还是存在一定的毒副作用。夏忠军等[2 ]进行的临床研究:34例确诊惰性淋巴瘤的患者接受含利妥昔的方案化疗 ,结果总有效率为 92.3 % ,完全缓解率为60.0 %。主要不良反应为骨髓抑制 ,其它不良反应包括恶心呕吐、轻度脱发和肝功能受损等。张晓艳等[3 ]对 4例 CD20阳性非霍奇金淋巴瘤(NHL)病人进行了5次利妥昔单抗联合自体外周血干细胞移植(APBSCT)的治疗研究 ,结果显示所有病人均对利妥昔单抗耐受良好 ,植入后在 8～11 d内达造血重建 ,表明利妥昔单抗联合APBSCT治疗 CD20阳性NHL 是一种耐受及效果良好的方法。

2.2曲妥珠单抗

曲妥珠单抗为一种针对 HER22/ neu的重组人源化 IgG单克隆抗体 ,能特异性识别 Her22调控的细胞表面蛋白 HER22 ,使其通过内吞噬作用离开胞膜进入核体内 ,抑制其介导的信号转导 ,从而起到治疗肿瘤的作用。美国 FDA 于 1999 年批准其上市 ,2002年在我国上市。大量临床资料证实曲妥珠单用于乳腺癌的有效率为21 % ,而且它与化疗联合应用明显提高了生存时间[4 ]。据报道 ,欧洲曲妥珠单抗辅助治疗试验研究了曲妥珠单抗对 HER22 阳性伴有或不伴有淋巴结阳性的乳腺癌患者的疗效 ,其中 1 组给予 1 年的曲妥珠单抗治疗 ,另1组作为对照。曲妥珠单抗治疗 1 年组与对照组相比 ,复发风险减少了46 % ,两组的整体生存率无明显区别 ,说明曲妥珠单抗用于治疗辅助化疗后的 HER22阳性乳腺癌患者 ,明显延长了患者的无病生存期[5 ]。我国也对曲妥珠进行了临床研究 ,沈坤炜等[6 ]对 42 例 Ⅱ～ ⅢA期浸润性乳腺癌患者紫杉醇联合曲妥珠单抗治疗 24 周 ,结果单用新辅助化疗组完全缓解率为 26.3 % ,在新辅助化疗联用曲妥珠单抗组为65.2 % ,可见 ,对于 HER22 过表达的乳腺癌化疗联用曲妥珠单抗能显著提高完全缓解率。

2.3阿伦珠单抗 阿伦珠单抗是人源化、非结合型单抗 ,作用靶点为正常与异常B淋巴细胞的 CD52 抗原 ,CD52 广泛分布于正常的 B淋巴细胞、T淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞和B 淋巴细胞及T淋巴细胞瘤细胞表面 ,在慢性淋巴细胞白血病细胞表面尤为丰富。它与带 CD52 的靶细胞结合后 ,通过宿主效应子的补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和细胞凋亡等机制导致细胞死亡。阿伦珠单抗作为一种作用机制独特的单克隆抗体 ,对源于B和 T细胞的各种恶性肿瘤具有很好的治疗作用。

英国科学家应用阿伦珠单抗和利妥昔单抗治疗复发性淋巴瘤患者 ,结果总反应率为 52 % ,其中完全缓解 8 % ,表明联合使用阿伦珠单抗和利妥昔单抗是安全可行的。在其它 T细胞恶性肿瘤的治疗中:对 22 例 Ⅲ～ Ⅳ期皮肤 T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿病和 Sezary综合征)患者静脉输注阿伦珠 12周 ,结果显示阿伦珠具有非常好的疗效 ,总有效率达 55 %。其中 ,红皮病患者总有效率达 69 % ,片状斑或皮肤肿瘤患者达40 %[7 ]。阿伦珠单抗联合其他药物、化疗等治疗肿瘤具有显著的效果。但临床研究表明 ,其还存在一些常见并发症 ,如低血压、寒颤、发热、恶心、呕吐、气短、支气管痉挛、皮疹、疲乏、呼吸困难、头痛、腹泻、感染等。2.4西妥昔单抗

西妥昔单抗为 IgG 1 单克隆抗体 ,是表皮生长因子受体拮抗剂 ,可与表达于正常细胞和多种肿瘤细胞表面的表皮生长因子受体(EGFR)特异性结合 ,并竞争性阻断 EGF和其他配体 ,如α 2转化生长因子(TGF 2 α)的结合。它通过增加细胞周期抑制因子 p27kip 使得细胞周期停留在 G 1 期;增加 Bax表达和减少 bcl22表达 ,诱导癌细胞的凋亡;它还可减少基质金属蛋白酶和血管内皮生长因子(VEGF)的产生。相关实验表明 ,西妥昔单抗可抑制过度表达 EGFR的肿瘤细胞的增殖 ,但是对缺乏 EGFR表达的肿瘤细胞则没有抗肿瘤效果 ,还发现西妥昔与化疗联用要优于单独化疗[8 ]。

在对西妥昔单抗联合化疗的研究中 ,BOAD 试验最为著名。576例晚期结直肠癌(ACRC)患者中 82 %的 EGFR 过表达。治疗采取两个方案 ,第1组用西妥昔单抗联合伊立替康治疗;第2组单独用西妥昔单抗单药治疗。西妥昔单抗联合伊立替康与单用西妥昔单抗相比 ,联用疗效优于单一使用 ,有效率分别为23 %和11 % ,疾病控制率为 56 %和 32 % ,疾病进展中位时间为4.1和1.5个月 ,中位生存时间为8.6和6.9个月 ,而且西妥昔单抗并没有增加化疗的副作用。以上临床实验显示:西妥昔单抗能够克服 ACRC患者对伊立替康的耐药性 ,生存质量明显提高[9 ]。西妥昔单抗的毒副作用包括:痤疮样皮疹、虚弱、腹痛、恶心、呕吐、白细胞减少和过敏反应等。其中痤疮样皮疹是最常见的不良反应 ,皮疹主要分布在脸部和躯干上部 ,这可能是由于西妥昔单抗干扰了 EGF的表皮生理作用所致[10 ]。

2.5贝伐单抗

贝伐单抗是抗VEGF的人源化单抗 ,主要通过中和VEGF来阻断其与内皮细胞上的受体结合 ,使得肿瘤细胞不能得到养分和氧 ,起到治疗肿瘤的作用。Presta 等[11 ]将鼠抗人VEGF单克隆抗体(muMAB VEGF)A.4.6.1 的互补决定区与人 IgG 1的恒定区框架嵌合 ,并对相应氨基酸残基加以修饰 ,最终形成了人鼠嵌合型 VEGF单抗 ,仍然有 7 %的氨基酸来源于鼠抗体。实验表明 ,贝伐单抗用于治疗肿瘤安全有效。郑航等[12 ]探究贝伐单抗联合伊立替康治疗转移性结肠癌的疗效 ,90例患者中给予贝伐单抗联合伊立替康治疗的一组有效率为43.3 % ,血清肿瘤标志物的浓度治疗前后有显著变化。这说明贝伐联合伊立替康治疗转移性结肠癌具有更高的疾病控制率。2005 年美国临床肿瘤学会年会上报道了贝伐单抗的最新研究结果 ,采用贝伐单抗联合伊立替康和顺铂一线治疗转移性胃癌或者胃食管连接部腺癌的患者 ,治疗的不良反应除了原有伊立替康和顺铂引起的肾髓抑制、胃肠道反应等 ,还有贝伐单抗造成的不良反应包括栓塞性疾病、胃穿孔等。

3抗肿瘤单抗偶联物

3.1放射免疫偶联物

放射免疫治疗(RIT)是以单克隆抗体为载体 ,以放射性核素为弹头 ,通过抗体特异性结合肿瘤细胞相关抗原 ,将产生高能射线的放射性核素靶向到肿瘤细胞 ,实现对肿瘤的近距离内照射治疗。RIT利用携带放射性核素的单克隆抗体特异地结合到病灶部位 ,减少了对正常组织的损伤。90Y— ibri2tumomab是第1个被 FDA批准应用于临床的放射免疫制剂 ,主要用于复发的淋巴瘤患者或对单独应用利妥昔单抗疗效不佳的患者。

3.2免疫毒素

免疫毒素是用化学方法或基因工程方法将肿瘤选择性单抗与经修饰的多肽毒素共价连接而成的肿瘤治疗药物。免疫毒素可与肿瘤细胞表面受体或与细胞表面的靶抗原相结合后内化 ,继而在胞内抑制细胞蛋白质合成 ,导致肿瘤细胞死亡。毒素有很多种 ,如植物毒素、细菌毒素、动物毒素 , 其中引用最广泛的是植物毒素中的白喉毒素。美国 FDA已经批准了白喉毒素与白细胞介素 2 重组的免疫毒素 ONTAK(DAB3892I L2),用于治疗人皮肤 T细胞淋巴瘤[13214 ]。

3.3化学免疫偶联物 单抗是药物良好的靶向性载体 ,通过药物分子上特殊的功能基团如:羟基、巯基、氨基等 ,将治疗药物与单抗相连接而组成化学免疫偶联物 ,避免了药物对其他正常组织的毒害作用,选择性地发挥治疗作用。常与单抗进行偶联的药物有阿霉素、柔红霉素、平阳霉素、博安霉素、丝裂霉素、新制癌菌素、氨甲喋呤等。

4单克隆抗体在其他疾病中的应用 单克隆抗体药物不只在肿瘤的治疗中取得了很好疗效 ,在其他疾病的治疗中也取得了一些疗效 ,例如:奥马珠单抗(omalizumab)通过与游离 IgE结合而显著降低游离 IgE的水平,阻断 IgE与肥大细胞、嗜碱粒细胞结合 ,防止炎症介质的释放。可显著改善哮喘病人的症状、肺功能及生活质量 ,减少哮喘恶化的发作次数 ,减少糖皮质激素的用量 ,使用安全 ,具有很好的耐受性[15 ]。Mab03.2C1C2 在体外能抑制白念珠菌芽管的形成 ,从而抑制白念珠菌对上皮细胞、内皮细胞的粘附 ,降低白念珠菌的侵袭力。利妥昔单抗对类风湿和系统性红斑狼疮也有很好的治疗作用。英夫利昔单抗对类风湿性关节炎患者疼痛、晨僵、关节肿胀等临床症状减轻程度就可达60 %。另有研究显示 ,输注英夫利昔单抗可快速、显著缓解顽固性银屑病、关节炎病人的关节和皮损症状[16 ]。英利昔单抗对克罗恩病、溃疡性结肠炎、酒精性肝病等消化系统疾病都有较好疗效 ,且在推荐的治疗范围内安全性良好[17 ]。

参考文献 [1 ] 冯洁.介绍几种抗肿瘤的靶向新药[J ].中国药师,2006 ,9(2):1762178.[2 ] 夏忠军.含美罗华方案治疗B细胞性惰性淋巴瘤34例报告[J ].癌症,2006 ,25(4):4902494.[3 ] 张晓艳.利妥昔单抗联合自体外周血干细胞移植治疗非霍奇金淋巴瘤[J ].中国新药与临床杂志,2006 ,7(19):5412544.[4 ] 吴凤霞.Herceptin—一种治疗乳腺癌的新药[J ].中国生化药物杂志,1999 ,20(1):47.[5 ] 董嵩,朱建权,吴一龙.美国临床肿瘤学报告[J ].循证医学,2006 ,6(2):67273.[6 ] 沈坤炜.紫杉醇序贯表阿霉素新辅助化疗联合曲妥珠单抗显著提高病理完全缓解率[J ].循证医学,2006 ,4(6):84286.[7 ] 崔银珠,胡江宁.慢性淋巴细胞白血病治行新药 alemtuzumab[J ].世界临床药物,2004 ,25(5):2922296.[8 ]

Baselga J.The EGFR as a target for anticancer therapy 2 focus on cetux2imab[J ].Eur J Cancer 2001 ,37(4):16222.[9 ]

Nygren P ,S orbye H O ,Sterlund P ,et al.Targeted drugs in metastaticcolorectal cancer with special emphasis on guidelines for the use of be2vacizumab and cetuximab : an Acta Oncologica expert report [J ].ActaOncol ,2005 ,44(3):2032217.[10 ] Busam KJ ,Capodieci P ,Motzer R ,et al.Cutaneous side2effects in can2cer patients treated with the anti epidermal growth factor receptor anti2body C225[J ].Br J Dermatol ,2001 ,144(6):116921176.[11 ] Presta L G,Chen H ,C onnor S J ,et al.Humanization of an anti2vascularendothelial growth factor monoclonal antibody for the therapy of s olid tu2mors and other dis orders[J ].Cancer Res ,1997 ,57(20):459324599.[12 ] 郑航,陈锦章,廖吐军,等.贝伐单抗联合伊立替康治疗转移性结直肠癌的近期疗效观察[J ].南方医科大学学报,2006 ,2652269.[13 ] 冯仁田,何维.白细胞介素218 的研究进展[J ].中国生化药物杂志,1999 ,20(2):1012103.[14 ] 裴瑾,杨成君,杨翰仪,等.白细胞介素 2 脂质体的制备及其抗肿瘤作用的研究[J ].中国生化药物杂志,1997 ,18(4):1662169.[15 ] 赵云峰,吴学玲,罗永艾.奥马珠单抗对支气管哮喘的治疗作用[J ].中国新药与临床杂志,2005 ,24(1):68272.[16 ] 林金盈.生物制剂在风湿病治疗中的应用[J ].广西医学,2006 ,28(1):528.[17 ] 陈垦.英利昔单抗在消化系统疾病中的应用状况及前景[J ].中国医院用药评价与分析,2006 ,6(3):1512153.

第四篇：单克隆抗体药物概述

单克隆抗体药物概述

高熹

（2015级 交流学院 生物技术 168615140001）

摘要：单克隆抗体药物作为一种具有独特优势的生物靶向药物，具有特异性高、靶向性强和毒副作用低的特点，在治疗方面效果显著。伴随着抗体技术的不断发展以及新型抗体的不断出现，单克隆抗体药物已成为制药业发展最快的领域之一，目前正在研究的生物技术药物中有四分之一都是单克隆抗体药物，期间又涌现出了各种单抗衍生物，包括抗体药物偶联物、小分子抗体、双特异性抗体等。本文就单克隆抗体药物的分类、制备、应用和发展等进行综述。关键词：单克隆抗体药物；抗体技术；单抗衍生物

1975年分子生物学家G.J.F.克勒和C.米尔斯坦在自然杂交技术的基础上，创建立杂交瘤技术，他们把可在体外培养和大量增殖的小鼠骨髓瘤细胞与经抗原免疫后的纯系小鼠B细胞融合，成为杂交细胞系，既具有瘤细胞易于在体外无限增殖的特性，又具有抗体形成细胞的合成和分泌特异性抗体的特点。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。杂交瘤技术为规模化生产特异性高、结构和性质均一稳定的单克隆抗体提空了有力的保障。单克隆抗体药物的发展和现状

1986年，FDA批准了第一个鼠源单克隆抗体药物Muromonab-CD3上市，用于预防肾移植时急性器官排斥。单克隆抗体药物的发展因人抗鼠抗体反应在1988年到1993年间陷入低谷。之后随着重组DNA技术的发展，各种抗体人缘化技术迅速发展，单克隆抗体药物经历了人鼠嵌合单抗、人源化单抗阶段。随后出现的噬菌体展示文库技术和转基因小鼠技术，使全人源单抗的产生成为可能。过去的30年抗体工程的研究主要集中于减弱鼠源抗体的免疫原性和提高产生抗体的能力，如今全人源抗体已成为治疗性单抗的主流，2002年第一个全人源抗体阿达木单抗上市。且随着微生物和哺乳动物细胞等外源蛋白表达系统的技术进步和表达水平的提高，使治疗性单克隆抗体在临床和商业上都取得了巨大的成功。尽管如此，单克隆抗体药物的发展仍然存在许多挑战。迄今为止，大多数FDA 批准上市的单抗药物都是未经修饰的全长抗体，这是相对分子质量在150×103左右的大蛋白分子，这些抗体药物在临床应用取得巨大成功的同时，本身的局限性也得到越来越多的关注[1]。现如今，单抗药物经历了市场和时间的考验，已经成为生物医药的最重要组成部分，在疾病治疗上具有广阔的应用前景，成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。治疗性单抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶点决定，上市和在研的单抗药物有些靶向相同的靶点，有些有自己独特的作用靶点，新的作用靶点也在不断地出现。随着研究深入、技术进步，单抗药物呈现出旺盛的发展势头[2]。

随着已上市品种的销售额不断增长以及新适应症的批准和新品种的上市，单克隆抗体药物市场容量迅速攀升。1997-2007年是全球单抗产业增长的爆发期，十年间CAGR高达58.6%。2008年-2015年，全球单抗产业增速放缓明显，CAGR降至14.8%，但仍要显著高于全球医药行业约5%的增速水平。1997年全球单抗药物销售额仅3.7亿美元，2015年全球单抗药物的销售额已超过980亿美元。1992-2015 年间，国外共批准上市了61个原研抗体药，其中后有6个退市。在现有上市的55个产品（49个单抗产品，6个具有抗体功能的受体-Fc融合蛋白）中，51个是由美国或欧盟首先批准上市的，数量占比高达 92.7%，生产企业方面：罗氏、诺华等10家欧美企业共开发和生产了全球70%以上的抗体药物，欧美国家在全球抗体产业中居于绝对主导地位。2015年全球最畅销药物TOP 10中有5个单抗，分别是阿达木单抗、英夫利昔单抗、利妥昔单抗、贝伐珠单抗和曲妥珠单抗，它们占据了单抗药物的半壁江山，销售额约为426.6亿美元，约占2015年全球单克隆抗体药物总销售额的44%。根据预测，2016-2020 年，全球单抗产业仍将以9.84%的RAGR快速发展（同期全球药品市场CAGR约为 5%），2020年市场规模有望突破1300亿美元。

相比处于上升期的国外单抗产业，我国单抗产业仍处于初创期，单抗药物仍以仿制为主，单抗药物无论产品种类和销售规模都远低于欧美发达国家，并且进口单抗药物占据了主要市场。2015年中国单抗药物市场容量约为70多亿元人民币，约80%的市场被外资制药企业占据。在单抗药物领域，国内制药企业面临市场快速增长和进口替代的双重机遇。单克隆抗体研究已被列入863计划和国家重点攻关项目。十三五期间，生物产业将是国家重点支持的战略性新兴产业。单抗药物的研究、开发和市场应用必将吸引一大批制药企业的参与和布局。目前全国有100多家企业在做单抗，除了中信国健、百泰生物、海正药业等一些老牌企业之外，近几年还涌现出了很多新兴企业，包括丽珠单抗、信达生物等。在2016三生制药集团媒体开放日活动上，三生制药集团董事长娄竞博士表示三生制药集团的3万升生产线建成后将成为中国规模最大的单克隆抗体生产线，也是从细胞系、培养基、原液到制剂（多种剂型和规格）的全球最完整生产线之一。单克隆抗体药物分类

根据来源的不同.单克隆抗体大体可分为4类,即鼠源化单克隆抗体、人鼠嵌

[3]合体单克隆抗体、人源化单克隆抗体、全人源化单克隆抗体，这也是单克隆抗体发展的四个重要的阶段。2.1 鼠源化单克隆抗体

人用鼠源单抗的生产方法一般分为体内法和体外法2种。2.1.1 体内法

体内法即腹水法。尽管腹水中抗体浓度比较高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必须达到SPF级,繁殖、饲养BALB/c小鼠及生产腹水、纯化抗体的厂房必须符合GMP要求,WHO及我国对体内法生产的人用鼠源单克隆抗体的质检项目繁多,要求严格,因此限制了体内法在人用鼠源单抗生产领域的应用。2.1.2体外法

体外法(杂交瘤细胞体外培养法)的产品纯度高,可以避免鼠类病毒的污染,简化质检项目,操作具有可控制性,适用于大规模工业生产,因此是人用鼠源单抗生产方式的主要发展方向[4]。体外法的制备流程也基本相同，即从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠获取脾细胞，选育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤细胞，待细胞融合后，对单个细胞进行克隆，体外培养出能分泌单抗的克隆细胞。

但鼠源单抗在临床应用方面存在着很大的弊端，主要是鼠源单抗与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用（ADCC）较弱，而且它与补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体分子质量较大,在人血循环中的半衰期短，在体内穿透血管的能力较差;它发挥ADCC作用的时间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易引起宿主过敏反应[5]，产生人抗鼠抗体(HAMAs)，将其清除出体外，因此限制了它的应用。2.2 人鼠嵌合单克隆抗体

抗体分子由两个相同的轻链和两个相同的重链组成，具有典型的功能区结构，其与抗原的结合完全取决于氨基端的可变区。恒定区与抗体抗原结合无关，并且恒定区是抗体分子免疫原性的主要部位，因此可通过用人的恒定区取代鼠单抗的恒定区进行人源化，消除其大部分异源性，并能保留亲本鼠单抗结合抗原的特异性和亲和力，这种方法得益于DNA重组技术的发展。1984年首次应用上述方法重组制备了抗半抗原磷酸胆碱的全分子人鼠嵌合抗体[6]。

嵌合抗体可将同一个可变区与不同类别的恒定区链接在一起，比较在相同特异性情况下不同类别的功能。其制备过程主要包括了可变区的克隆，表达载体的构建及嵌合抗体的表达。可变区基因的克隆在早期主要从杂交瘤细胞的基因组文库中克隆出来带有完整上游转录调控序列的轻重链可变基因DNA片段，组装到含有人恒定区的表达载体中。PCR方法的建立和发展为抗体可变区基因的克隆提供了简便有效的方法。接着将控制小鼠抗体重链和轻链中可变区的基因片段与人抗体重链及轻链的不变区的基因片段在体外链接形成重组基因，然后导入真核细胞的某种表达质粒中，再将这种含有重组基因的表达载体转化哺乳动物骨髓瘤细胞，筛选能分泌完整抗体的转化子。但嵌合抗体仍保留着30%左右的鼠源序列，并且其常达不到预期的效果。

嵌合抗体目前主要有3种应用形式：嵌合免疫球蛋白G、嵌合Fab和嵌合,F（ab’）2。嵌合免疫球蛋白G因含有人抗体的Fc段，能介导补体及细胞对靶抗原的杀伤和吞噬作用，但因鼠源性成分较多，免疫原性大且组织穿透力差[7]；嵌合 Fab 和嵌合F（ab’）2抗体分子小、穿透力强，可充当小分子载体用于放射免疫显像及放射免疫治疗。2.3 人源化单克隆抗体

由于鼠源抗体的可变区仍残留一定的免疫原性人缘化单克隆抗体又较嵌合抗体有所改进。由于鼠源性抗体可变区中的骨架区仍残留一定的免疫原性，为了最大限度地减少鼠源成分，用人骨架区替代鼠骨架区可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了CDR是鼠源以外，其余全部是人源结构。这一类型的抗体被称为CDR移植抗体或改型抗体，包括完全CDR移植抗体、部分CDR移植抗体和特异决定区（SDR）移植抗体[8]。2.3.1 完全CDR移植抗体

完全CDR移植抗体由于鼠源性抗体VR中的骨架区仍残留一定的免疫原性，为最大限度的减少鼠源成分，用人FR替代鼠FR可形成更为完全的人源化抗体，即在此抗体中除了３个CDR是鼠源以外，其余全部是人源结构，这一类型的抗体称为CDR移植抗体或改型抗体。应用这一策略，将鼠源McAb的CDR区完全移植，得到了抗磷脂酰肌醇（蛋白）聚糖嵌合抗体。但随后多项研究发现，简单的CDR移植往往明显降低抗原－抗体反应的亲和力，甚至丧失与抗原结合的能力。其原因在于FR不仅作为骨架对CDR起到支持作用，FR中的某些非CDR区补充调控残基还为CDR的回折构象提供必要的支持，其形状和侧链大小协同决定CDR的基本结构，影响CDR与抗原结合的特异性和亲和力[9-10]。2.3.2 部分CDR移植抗体

在简单CDR移植的基础上又相继发展了部分CDR移植技术。研究发现轻链的 CDR1、CDR2和重链的CDR3对保证抗体与抗原特异性结合至关重要，其余三个CDR的作用则较低[11]。因此只将抗体结合抗原必须的CDR移植到人抗体的FR骨架上即能获得对人免疫原性更小的嵌合抗体，这类抗体称为部分CDR移植抗体。2.3.3 特异决定区移植抗体

正如并非所有的CDR在抗原抗体反应中具有同样的重要作用，X射线晶体衍射实验提示具体到一个CDR中,不是所有的蛋白分子都参与抗原的特异性识别。执行抗原识别的CDR中的一些特定区域称为SDR。由此又产生了SDR移植抗体。该抗体是将McAb中与抗原结合密切相关的SDR等少数残基移植到人抗体的相关部位，从而进一步提高抗体的人源化水平。根据目前的研究，抗体轻链的SDR多位于27d、34、50、55、89、96位残基，而重链的SDR多位于31、35b、50、58、95、101位残基[12]。基于上述两种策略，部分CDR移植、SDR移植的构建方法主要有：（1）模板替换，使用与鼠对应部分有较大同源性的人FR替换鼠FR；（2）表面重塑，对鼠 CDR和FR表面残基进行镶饰或重塑，使其具有类似于人抗体CDR的轮廓或人FR的形式；（3）补偿变换，对起关键作用的残基进行改变以补偿完全的CDR移植；（4）定位保留，人源化McAb以人FR保守序列为模板，但保留了鼠源McAb VR中参与抗原结合的氨基酸残基，包括CDR和FR中的一些关键残基。

2.4 全人源单克隆抗体

由于免疫原性的存在，人们一直在努力制备全人源化的单克隆抗体，目前主要有抗体库技术和人源性抗体转基因小鼠技术两种。2.4.1 抗体库技术

抗体库技术的主导思想是将某种动物的所有抗体可变区基因克隆在质粒或噬菌体中表达，利用不同的抗原筛选出携带特异抗体基因的克隆，从而获得相应的特异性抗体。抗体库技术不仅可以模拟动物免疫系统产生抗体的过程，还具有许多独特的优点，令杂交瘤技术难以相比。抗体库技术无需免疫，从理论上讲，106-108的库容就可能包容所有的抗体。利用抗原即可直接从非免疫动物抗体库中筛选出特异性抗体，•并能筛选到针对该物种自身抗原的抗体。从人的抗体库中可以得到完全是人源的McAb，•克服了难以用杂交瘤技术获得人源McAb的障碍。此外，由于细菌细胞增殖快，培养成本低廉，利于大量制备高纯度抗体。抗体库技术主要包括了噬菌体抗体库和核糖体展示技术。

噬菌体抗体库技术：从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因;PCR 扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体,形成组合文库;将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因Ⅲ(g3)或基因Ⅷ(g8)的先导系列的紧靠下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gpⅢ或gpⅧ的N端。用固相化抗原经“亲和结合—洗脱—扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。

核糖体展示技术：将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如去掉3′末端终止密码子，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA 的3′末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如：固定在ELISA 微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA 板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA 进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，最终可使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。2.4.2 人源性抗体转基因小鼠技术

适宜基因工程改造的小鼠成为亲和力成熟全人源抗体产生的强劲引擎，其体内免疫系统自然选择与成熟机制促使产生的抗体具备成为药物的天然优势，包括高效与特异性、低免疫原性与可工艺性等。产生的系列抗体包括针对全新靶点的全新作用机制的抗体药物，也包括针对经典靶点的升级抗体药物[13]。构建转基因小鼠，目的是用人的抗体基因转入小鼠相应基因，产生分泌人抗体的转基因小鼠。在转基因小鼠的基础上，产生分泌抗体的转基因小鼠。在目前FDA批准上市的全人源单抗中，技术来源除了噬菌体抗体库技术外，有三种转基因小鼠平台技术，即HuMAb-Mouse、XcnoMouse和VelocImmuneTM。

HuMAb-Mouse：HUMab转基因小鼠整合入人抗体基因450kb(200kbIgH；230kb Igk，约占人类IgGκ的50％)，免疫该小鼠可以产生0.1-5nmol／L的抗体。虽然该小鼠转入的人抗体基因组还是比较小，但仍获得巨大成功。

XcnoMouse:XenoMouse转基因小鼠也是目前最为成功、应用最广的转基因小鼠之一。该转基因小鼠整合入大部分人抗体VH和Vκ基因，大小分别为1020kb和800kb。重链包含34个V区基因、所有的重链D区和J区，以及Cγ

2、Cμ和Cδ基因，共66个功能基因；轻链包含18个V区基因、所有的5个J区和Cκ基因，共32个功能基因。该转基因小鼠XMG2-KL可以产生全人IgM和IgG2，亲和力可以达0.1～1nmol／L。

VelocImmuneTM：不同于以往的转基因小鼠抗体筛选平台，VelocImmuneTM产生人可变区与鼠恒定区组成的反向嵌合抗体。小鼠Ig H恒定区通过B细胞胞质区的信号转导区域(如Igα与Igβ)传递天然的免疫信号，并通过与其他类型免疫细胞上的Fc受体的结合促使小鼠产生强大的免疫反应，并提供半衰期长且亲和力高的抗体。该类转基因小鼠免疫后产生的抗体可变区编码序列通过基因克隆技术与人源恒定区编码序列进行构建，反向嵌合抗体即可转变为适宜药用的全人源抗体。

另外转基因小鼠技术还有TC MouseTM、KM MouseTM和Five-feature mouse，但它们都还未经过市场的检验。单克隆抗体衍生物

为了更好地发挥抗体药物的治疗效果，人们构建各种形式的工程抗体来改善它们的特性和效能。例如，制备抗体和药物的偶联物，增加对靶细胞的杀伤；改变抗体分子大小，构建小分子抗体，使之有较好的肿瘤/血液比；制备双特异性抗体，同时结合两个不同的抗原表位；增加抗体的亲和力；改进抗体ADCC或CDC效应；改变抗体的药代动力学，使半衰期延长。3.1 抗体药物偶联物

抗体药物偶联物(ADC)是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中[14]。单抗和小分子本身都是药物，都可以单独用来治疗疾病，ADC的设计思路是利用两者的长处来弥补可能的不足或者缺陷。单抗具有很高的专一性，但是通常药效不强，往

往需要与小分子药物治疗并用；小分子药物活性强，缺点是专一性较差，从而可能存在毒性，受副作用和剂量的影响较大；有些小分子药物，特别是肽类药物在血液中的半衰期过短，通过和单抗结合，可以改善这方面的缺陷。ADC 将两者结合，在到达目标细胞时将小分子药物释放出来，这不仅能灵敏地区分出健康和疾病组织，限制与非目标细胞的作用，降低毒性，还能够明显改善药代动力学和向目标组织的传递[15]。

构建抗体偶联物主要有三个步骤：选择合适的抗体、选择合适的药物和选择合适的链接方式。这样构建的抗体偶联物需要具有以下的特性：（1）稳定性，链接需要在血液循环中保持稳定，避免过早发生裂解，造成对健康组织器官损伤；（2）分特异性免疫反应，即药物结合到单抗不能破坏单抗本身的特异结合能力；（3）内化和药物的释放，一般ADC都是通过单抗与目标细胞结合后再内化，将小分子药物在细胞内释放，因此需要控制药物的数量，以发挥最大的效果；（4）药物作用，释放出的药物需要在很低的浓度（皮摩尔级）发挥效果，因此需考虑药物的活性。3.2 小分子抗体

小分子抗体具有分子量小、穿透性强、抗原性低、可在原核系统表达及易于基因工程操作等优点。常见的单价小分子抗体有Fab段、ScFv段、FV段、二硫键稳定的Fv段、单域抗体和超变区等；多价小分子有双链抗体、三链抗体和微型抗体等；特殊类型的小分子抗体有双特异抗体和催化抗体等[16]。当前，常用于生产小分子抗体片段的表达系统通常有大肠杆菌（E．coli）表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统四种[17]。小分子抗体的优势在于不需要糖基化修饰，可以在原核细胞中表达，操作方便。因此这四种表达系统的成本是依次增加的，但翻译后的加工精确性和准确度却是依次递减的。3.2.1 Fab抗体

Fab抗体由一条完整的轻链和重链Fd段通过一个链间二硫键连接组成一个异二聚体，大小为完整抗体的三分之一，但其仍保持了亲本抗体的fv段结构和与抗原结合的特异性与活性的能力。并且分子结构比较稳定具有穿透力强、免疫原性低，可与多种药物及放射性同位素偶联，可与多种毒素和酶结合，用作药物的导向治疗载体和显影等特点。3.2.2 单链抗体

在DNA水平上用一段 适当的寡聚核苷酸作为连接肽（linker）将VH和VL连在一起，使之表达成为一条单一肽链，即为单链抗体（ScFv）。单链抗体大小仅为全抗体的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原结合部位的最小片段,但有时构建的ScFv其亲和力明显低于亲本抗体，并常有聚集的倾向。3.2.3 单域抗体

由抗体轻、重链可变区基因（VH、VL）间通过一段连接肽基因拼接后表达形成的重组蛋白，大小为全抗体的六分之一，抗原性低，是具有完整抗原结合部位的最小片段。其分子量更小，具有一定的可溶性和稳定性特点，相较于其它的抗体分子，单域抗体更容易进入细胞。3.2.4 双特异性抗体

双特异性抗体是含有2种特异性抗原结合位点的人工抗体，一个位点可与靶细胞表面抗原结合，另一个位点则可与载荷物如毒素、酶、细胞因子、放射毒素等耦合，能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁，激发具有导向性的免疫反应，其靶向性的特点可以减少载荷物的毒副作用。单克隆抗体的应用

随着单克隆抗体的完善与推广，单克隆抗体在农业、食品、治疗疾病等方面的应用越来越广泛，并取得了良好的效果。4.1 农业和食品 由于单克隆抗体的高特异性和高灵敏性，单克隆抗体农业和食品的应用主要集中在了检测方面。在食品中对动物性食品中β兴奋剂、抗生素和激素等的检测，植物性食品中农药残留物的检测，还可以检测储存食品中的微生物含量。在农业中，单克隆抗体可以对牲畜的细菌、病毒和寄生虫的患病情况进行筛选。在植物中，除了对病虫害的诊断应用以外，单克隆抗体还在药用植物活性成分定性定量分析、成分分离、培植育种中得到了广泛的应用。4.2 医学

单克隆抗体主要应用在医学方面，不仅为基础医学提供了有价值的载体，更在临床医学得到了广泛的应用，如治疗肿瘤、移植排斥、自身免疫病、心血管疾病、病毒感染等。4.2.1 治疗肿瘤

近20年来，抗肿瘤抗体药物已成为治疗癌症的重要方法，是治疗癌症最成功的的策略之一。据PharmaprojectsV5数据库统计，目前上市与临床在研的约500种抗体药物中，约有50%用于肿瘤治疗，临床在研的抗肿瘤抗体药物共约20多种，针对70多个靶点[18]。目前，销量排名前五的抗体类药物，其中有三个都是用于治疗肿瘤，其中贝伐珠单抗用于治疗转移性癌症，曲妥珠单抗通过附着在Her2上来阻止人体表皮生长因子在Her2上的附着，从而阻断癌细胞的生长，利妥昔适用于复发或耐药的滤泡性中央型淋巴瘤的治疗。截止2015年底，FDA共批准了21个抗肿瘤类药物，2016年新批准了用于膀胱癌靶向治疗的Tecentriq和治疗软组织肉瘤的Lartruvo。近年来，利用单克隆抗体靶向治疗肿瘤已经成为全球靶向治疗药物的主流，免疫检验点靶向抗体药物的研发更是极大地推动肿瘤免疫治疗，是目前肿瘤治疗的最热点所在[19]。同时抗体治疗联合其他治疗策略也成为了必然的发展趋势，联用型治疗适用性更广，临床效果更持久，不良反应更少，病灶去除更彻底，有效防止肿瘤的复发，显著提高了存活率。4.2.2 器官移植

移植排斥是器官移植失败的重要因素之一，而单克隆抗体可以有效地改善移植排斥反应，其应用也在不断增长，目前的研究和应用主要集中于清除不同种类的白细胞分化抗原（CD），例如采用抗CD154单克隆抗体阻断免疫细胞活化信号传导途径,主要应用于胰腺、心脏、皮肤等多个器官的移植，证明抗CD154单抗能有效地抑制移植排斥反应，延长移植物的存活时间[20]。4.2.3 自身免疫病

自身免疫性疾病的治疗通常采用的糖皮质激素、免疫抑制剂等,虽然有一定疗效,但长期使用都会产生严重的不良反应,而且都只能减缓病情的发展,并不能根治疾病[21]。而单克隆抗体可以有效地改善和治疗自身免疫病，主要有以下的三种作用机制。（1）封闭细胞因子和生长因子的单克隆抗体药物，其中最成功的便是TNF抑制剂，包括伊纳西普、英孚利昔、阿达木、赛妥珠和戈利木，适用于类风湿关节炎、青少年关节炎、牛皮癣、结肠炎、脊柱炎和银屑病等；（2）受体阻滞和受体调节的单克隆抗体药物，即单抗结合受体，阻断配体和受体相互作用，下调细胞表面目标受体的表达，这些抗体包括治疗类风湿关节炎的IL-6受体抗体tocilizumab,重组非糖基化的人IL-1受体拮抗剂阿那白滞素(anakin-ra)等；（3）耗竭异常免疫细胞及介导细胞信号的单克隆抗体药物，通过结合细胞表面抗原,如CD20,CD22、CD80和CD52,通过FcγR介导的ADCC作用和CDC作用杀伤异常的淋巴细胞，有治疗1型糖尿病的otelixizumab、治疗多发性硬化症的阿伦和治疗慢性淋巴细胞白血病ofatumumab等一系列单抗药物。4.2.4 抗感染

细菌和病毒等病原体感染机体的机制复杂,由于单克隆抗体只能识别单一抗原表位,限制了抗体药物的抗感染效果。抗感染领域的抗体药物发展缓慢，目前仅有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠单抗以及抗炭疽杆菌的瑞西巴库单抗两个品种上市[22]。目前抗感染的单克隆抗体的研究热点集中于埃博拉病毒抗体、抗呼吸道合胞病毒抗体、抗炭疽杆菌抗体等，2014年西非大规模埃博拉病毒疫情爆发后，实验性抗体药物ZMapp第一个被用于临床治疗，中国研制的抗体药物MIL77也成功用于治疗，抗体药物再次显示了在抗感染领域的应用前景。单克隆抗体药物可能存在的问题

单克隆抗体导致的不良发应主要有皮肤及附件损害、全身反应、心血管损害等，具体表现为皮疹、瘙痒、寒战、发热、心慌、心跳加快等，严重可导致急性呼吸衰竭、多器官功能衰竭、严重出血、脑梗死、过敏性休克等。单克隆抗体可能的不良反应也许与以下3个机理之一有关:所用mAb的异源性,特别是当给予mAb而无相关的免疫抑制剂时；生理功能的抑制以及mAb的特异性；mAb与靶点结合后炎症细胞或介导物的活性[23]。从发生人群来看，患者的年龄集中在儿童和老人，这可能是由于儿童的器官/系统发育不完善，使得个体对药物的吸收、分布、代谢相对缓慢，药物在体内滞留的时间较长；而老人往往患有心血管疾病、高血压、糖尿病等，这些可能都会引起不良反应的发生。因此，临床中使用单克隆抗体药物是应注意：（1）重视患者人群，注意防范儿童或老年患者不良反应的发生。（2）注意首次用药，初次静脉滴注单克隆抗体时，应控制滴速。（3）询问患者药物过敏史和既往病史。（4）使用前建议预防使用抗过敏药物。（5）对具有肝炎病史的患者，注意对肝功能和病毒的检测，避免肝病复发。（6）按照说明书使用单克隆抗体药物，避免超说明书用药。（7）单克隆抗体制剂应保存在2-8℃的环境中，避免冻结。（8）输注药液的过程中，加强巡视，严密观察药物引起的不良反应，及时给予相应的处理，保证患者的用药安全[24]。展望

单克隆抗体药物这些特征使它成为了生物医药领域一颗耀眼的明珠。过去的30年中，随着研究的不断突破，单克隆抗体从鼠源发展到人缘，提高了单克隆抗体的药效和安全性。虽然单抗药物还存在一些尚未解决的问题，最突出的问题是如何降低单抗的免疫原性，单抗的异源性所引起的抗体反应，不但降低了单抗的效价，而且会给患者带来严重的后果。但是我们可以相信随着研究的不断深入；生产工艺的不断成熟；检测技术不断的完善，现有的问题会逐一地解决，并且必将出现更高靶向性和药效更强的单克隆抗体药物，单克隆抗体药物将在治愈疾病中显示出它独特的效果，为患者带来更大的希望。

未来伴随着生物技术制药的发展，单克隆抗体将在其中占有更重要的地位，并逐渐成为生物医药领域发展的主要方向。目前单克隆抗体药物快速扩大的市场已经成为制药业争夺的焦点，为制药公司提供了发展的契机。我国企业虽然进入该领域较晚，但在仿制单克隆抗体药物的规模化、产业化的基础上，积极探索、开发和创新，相信很快会在国际市场上占有一席之地。

参考文献

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第五篇：氢氧化铁的制备小教案

小教案

姓名：农瑞娇 学号：201010900006 姓名：梁艳荣 学号：201010900019

二氧化硫小教案

教学过程

【提出问题】SO2是一种大气污染物，它是形成硫酸型酸雨的“罪魁祸首”，那么现在就让我们一起来探究SO2的实验室制备方法和其化学性质。【板书】二氧化硫的制备与性质研究

【演示实验】在玻璃皿中放盖住小药匙底部的少量亚硫酸钠，将玻璃皿放在烧杯中。将分别滴加、品红溶液、高锰酸钾溶液、硫化钠溶液的三张滤纸贴在漏斗内壁，将漏斗倒扣在烧杯中，使玻璃皿在漏斗内部。在漏斗的颈部上连接吸有几滴浓硫酸的胶头滴管。沿着烧杯避倒入适量的氢氧化钠溶液，使液面漫过漏斗边沿，但低于玻璃皿上沿。滴加浓硫酸，观察漏斗壁上滤纸颜色的变化。【实验现象板书】

（1）滴有 KMnO4 溶液的滤纸 褪色。

（2）滴有品红溶液的滤纸褪色，加热滤纸，后颜色重新变红。（3）滴有 Na2S 溶液的滤纸变为黄色。【整理联系】

（1）滴有 KMnO4 溶液的滤纸

褪色，说明 SO2具有还原性，易被 KMnO4 所氧化。

（2）品红溶液褪色，说明 SO2 具有漂白性；加热已褪色的滤纸后滤纸变红，说明SO2 的漂白性不稳定。

（3）滴有 Na2S 溶液的滤纸变为黄色，说明SO2 具有氧化性，易将-2价硫氧化为0价。【结论板书】

二氧化硫的实验室制法：H2SO4(浓)+Na2SO3=Na2SO4+SO2↑+H2O SO2具有还原性、氧化性、酸性、漂白性，且漂白性不稳定。

二氧化氮的装备及其性质教案

1.教学目标

（1）了解二氧化氮的物理性质（2）掌握二氧化氮化学性质

（3）通过观察思考等过程训练科学的学习方法 2.教学重点

实验原理和二氧化氮的化学性质 3.课前准备

所用实验用品：50mL注射器，小烧杯三个（分别盛水，氢氧化钠溶液，一个空的），大烧杯一个，大橡胶塞一个，表面皿一个，蓝色石蕊试纸

所用药品：铜片，浓硝酸，氢氧化钠溶液，水 4.实验演示过程

[提出问题]我们已经学过二氧化氮的物理性质和一些化学性质以及它的制备原理，那在实验中我们如何来检验它的一些化学性质呢，由于二氧化氮是有毒气体，在实验中希望制备尽量少的气体，又能完成性质的检验，那我们用什么样的实验来实现我们的目的呢，下面就让我们来看有关二氧化氮的制备和性质检验的微型实验。

[介绍媒体]我们这个实验用的仪器很简单，和一氧化氮的制备与性质检验相似，用注射器做为反应装置，另外用到橡胶塞作为密封装置。[实验探究] 实验原理： Cu﹢4HNO3（浓）﹦ Cu(NO3)2﹢2NO2↑+ H2O

相应装置（或实验装置）

仪器药品

注射器，小烧杯三个（分别盛水，氢氧化钠溶液，一个空的），大烧杯一个，大橡胶塞一个，表面皿一个，蓝色石蕊试纸

铜片，浓硝酸，氢氧化钠溶液，水

实验步骤

（1）在注射器中放入两片铜片（约0.5克），将注射器推到底部（2）将输液管插入浓硝酸中，吸入0.5ml后，将注射器插到橡胶塞上（3）待反应停止后，看见红棕色气体，压注射器活塞，引导学生观察气体颜色变淡还是变浓还是不变，取一张蓝色石蕊试纸湿润放在干净的表面皿上，拔出注射器，让蓝色溶液流到大烧杯中，将试纸靠近针头，试纸变红色

（4）吸入6ml水在注射器中，看见红棕色气体变无色，让水流出，吸入空气，引导学生观察那一瞬间出现红棕色，（因为注射器中有水，二氧化氮溶于水所以红棕色很快消失）实验结束，将气体推到氢氧化钠溶液中。5.板书设计

二氧化氮的制备及其性质检验

实验原理：Cu﹢4HNO3（浓）﹦ Cu(NO3)2﹢2NO2↑+ H2O 化学性质

现象：压活塞，气体颜色变浅 性质：2NO2

N2O4 蓝色石蕊试纸变红 性质：NO2为酸性气体

吸入水后红棕色气体变成 无色溶液和无色气体

氧化性，3 NO2﹢H2O﹦ NO ﹢2HNO3