课程切片

第一篇：课程切片

课程切片

05:00管理类综合能力测试逻辑推理课程 考察能力理解、分析、综合 判断、推理、论证

并不是对于逻辑专业知识的考察，也不是对试题中可能涉及的自然科学、认为科学等方面专业知识的考察

同学们都有拿到教材了，那教材很厚，但是内容很容易，抓住概念理解透了，这部分的目标是不丢分，这是我们的一个理想状态，分为三个篇幅

基础篇有概念、判断、推理、论证

对于概念这部分，有同学问了啥是概念那? 概念就是词，就是你认识一个对象你需要了解的两个层次的含义：第一个层次：你要知道所指对象的概念的特征和内涵；第二个层次：你要知道这个对象的范围。内涵和外延这部分内涵是啥外延是啥都说清楚 二者啥关系同时加入一个生动的例子。15:00概念种类、概念之间的关系

种类包括正概念负概念、单独概念普遍概念、集合概念非集合概念

正概念负概念是相对来说的，不能死教条的去理解他，比如不好的也可能是正概念，如果让你说出他的负概念你要知道按照原命题否命题的方式，去理解，单独概念普遍概念就看是反映一个事物还是反映的两个以上的事物，这里重点讲解下集合概念和非集合概念，从定义上就能够区分这两个概念，二者区分标准就是这两个概念是否为一个不可分割的集合体，能分割就是非集合概念，不能分割就是集合概念，其实用常识就很容易理解，集合你就想象是密不可分的集体当然不能够去分割他，分割的化就是意思会发生变化，这里讲解几道习题 年轻人积极向上，这里年轻人这个概念反映的对象是集合还是非集合，我们就在年轻人前面加入每一个三个字，加入之后每一个年轻人都应该积极向上，意思并没有发生变化，那么这里年轻人的概念就是非集合概念，那如果我说人民，只有人民才是创造历史的真正动力，这里如果在人民前面加上每一个之后，人民作为整体才能够发挥创造历史的作用，但是人民前面加上每一个之后，每一个人民是能够创造历史的动力，这样的说法显然是不对的，所以我们掌握这个加入每一个这仨字的方法就能够成功的区分集合概念和非集合概念。这里我们讲过了概念相关的一些知识点，那这里重点给大家介绍一下之后我们考试中可能经常会考到的一些容易犯的逻辑错我，那我们刚说的这个内涵和外延来说，两个概念如果相等必须要内涵和外延都相等才能够两个概念是一致的，那么有这样一个例子，说某些学校缺乏体育锻炼方面的经费，学生缺乏体育锻炼，某些领导说，没有关系，学生上课做做操就行，还要什么体育锻炼，在家里做家务也是锻炼。这里犯了一个什么逻辑错误呢，我们来看同样是锻炼，体育锻炼和在家里做家务锻炼，字面意思是一样的，可是锻炼前面的限定条件不同，这就使得两种锻炼的内涵是不同的，体育锻炼内涵是通过体育运动使得身体强壮，培养同学勇敢、机智和团队合作等方面的品德和精神，而在家干活也是锻炼则是混淆了体育锻炼和在家里做家务，犯了偷换概念的错误，这里，要想判断是否出现偷换概念的逻辑错误，主要考察字面相同的两个概念在不同的语境中所反映对象的外延是否发生变化，如果你列出项下子元素二者出现不同，那么这里就是混淆了两种概念。

20:00关于概念之间的关系我们在学习的时候要配合欧拉图，学一种关系我们就按照把符合这种关系的欧拉图画出来，这样我们之后在做题的时候就可以帮助我们做题，那么概念之间的关系有同一关系、交叉关系、包含关系、矛盾关系、反对关系。首先我们来看，啥是同一关系，两个或者多个关系之间外延相同，具有同一关系的概念就叫同一概念，比如我们小时候可能妈妈爸爸可能会给起小名，上学的时候有可能被人起外号，那我们说的小名外号，这些反映的对象都是指的我们自己对吧，所以这里小名啊 外号啊就是同一概念，这里面还是，容易出现的逻辑谬误就是不当同一替代，就像我们知道鲁迅 原名周树人，有同学说老师他不浙江人吗，我们需要有点文学常识好吧，那有的人可能不知道不知道鲁迅原名周树人，知道狂人日记是鲁迅写的，那说周树人写了狂人日记可能不知道，再来举一个例子，巴金就是李尧棠，那我们都知道巴金是作家，但很少有人知道李尧棠是作家，这个时候就出现了一个什么问题呢，就是出现逻辑上的描述不一致，那怎么解释这个问题呢，所有人都知道巴金是作家，但是很少有人知道李尧棠是作家，那巴金和李尧棠是同一概念，有些人存在二者认识的差异，只知其一，那么就很好的解释了这种描述不一致的问题。

那接下来包含关系很容易理解了，比如硕士研究生，和研究生，研究生还有博士研究生，所以这里，研究生的概念外延更大一些，包含着硕士研究生，而硕士研究生包含于研究生。交叉关系，意思就是二者存在交集，我们讲的以上三种关系都是属于相容关系。接下来要讲的矛盾关系和反对关系。这两个我们不仅要讲啥事矛盾关系啥事反对关系，还会给大家对这两种概念进行区分，两个概念他们互相排斥，但他们加起来又等于一个整体，反对关系呢说的是两个概念他们是排斥的，但是加到一起呢有是属于一个整体，但是整体出来这两个概念有会存在其他的，就是说整体排除了这两个概念之后不是空集。所以总结一句话就是矛盾概念两个概念的外延和等于属概念的外延，而反对关系两个概念的外延和小于属概念的外延，这里容易出现什么样的逻辑谬误呢，就是非黑即白的错误，就是本来是反对关系但是当成矛盾关系处理。

30:00这里有一个习题需要给大家讲一下，教材翻到39页这里习题九，讲的是除非像机动车一样，你闯了红灯给你开罚单，否则对于骑行者来说禁止闯红灯这项交通法规是没意义的，为什么呢，这里说了他的论证过程，因为一项交通法规要想有意义必须要能够有效的制止他所禁止的行为，而对于骑行者来说，经常闯红灯的你不开罚单的话你这项交通法规是无意义的，那对于遵守交通法规的人来说，你又不需要，所以材料中下了结论，禁止骑自行车闯红灯是没意义的，这里面出现了什么样的逻辑漏洞呢，我们来看，这段材料有一个特殊句式，就是除非什么什么否则什么什么，那我们怎么把他换一种更好理解的说法呢，就是如果不像给机动车一样开罚单的话，那么禁止闯红灯的交通法规对于骑自行车的人来说是无意义的，分析这段材料我们揪出他所涉及的对象，有闯红灯的有机动车的，那之后论述的时候出现了经常闯红灯的，以及遵守交通法规禁止闯红灯这项要求的不闯红灯的，我们一分析，戏更多的是骑行者这一块，那我们就来分析一下，骑行者，他在交通系统中可能出现几种情况，经常闯红灯的，以及偶尔闯红灯的，还有不闯红灯的，那论证中对于经常闯红灯的他说你不开罚单是交通法规是无意义的，而遵守的你不需要，然后他下定义交通法规是无意义，他论证的缺陷在哪，就是对于可能出现偶尔闯红灯的人，没有做出判断，而交通法规禁止闯红灯的意义有可能就是针对这部分人的。35:0我们讲了矛盾关系讲了反对关系，我们来总结一下二者区别，你就记住矛盾关系非真即假，而反对关系呢有可能同真同假，也可能一真一假，那集合来说，矛盾关系是属于A集合那一定不属于B集合，而反对关系是属于A集合一定不属于B集合，而不属于A集合，就不一定属于B集合，从肯定否定上来说呢，矛盾关系肯定A就一定否定B，反对关系是肯定比否定，否定不一定。进入下一个知识点 定义

定义说的是对概念内涵进行界定的逻辑方式，包含着被定义项、定义项、定义联项。我们回忆一下学习生涯学过很多定义，有没有全部还给老师，商品的定义、自然数的定义等等，那我们对于商品是怎么进行定义的呢，商品是用来交换的劳动产品，这里商品是被定义项，劳动产品是定义项，而是这里是定义联项，这里有一个需要非常注意的地方是定义项和被定义项一定要外延相等，否则容易出现什么问题呢，就是定义过窄或是过宽的问题，比如说刚刚的商品的定义，商品是用来交换的劳动产品，这里了我如果给用来交换前面加个限定词，商品是用货币来交换的劳动产品，此时定义项的外延范围缩小了，那这个就不能称之为定义了，我们分析一下商品是用货币来交换的劳动产品，我们说在货币产生之前我们还有物物交换呢，那物物交换的话商品就不是商品了吗，所以定义项外延缩小就不能称之为定义，再给大家举个例子商品是劳动产品，这类我们把用来交换的限定词去掉了，此时是否定义成立呢，商品确实是劳动产品，但是劳动产品如果不是用来交换的话也不能称之为商品，这个就是犯了什么错误呢就是定义过宽的错误，那除了我们刚刚给大家讲的定义过宽和定义过窄的问题，还会出现同语反复和语序重复的问题，这两种情况就是，举个例子有人问你学什么的，啊 我是学区域经济学的，那给我介绍哦一下，区域经济学就是研究区域内的经济学，这里就是出现了定义项包含被定义项，那我们是不是没有说清楚概念的内涵，我有解释清楚这个区域经济学是啥吗，没有，什么样的是对这个区域经济学概念正规的解释呢，比如说范围是区域空间，通过研究比较不同区域空间经济发展差异，经济发展问题，来进行一定的区域经济发展政策的研究，那定义项包含被定义项就是犯了同语反复的毛病，下一个语序重复呢就有点像是绕口令了，问什么是战争，……

还有容易出现在这个知识点这的逻辑错误是定义中不能出现负概念，以及比喻，这个都是很容易发现，接下来我们来看几道习题

进入下一个知识点划分，划分是针对某一概念对他外延进行揭示，他所列出的项下子元素，既不能多出也不能少，什么意思呢，说让你罗列出直系亲属都包括哪些，父母子女爱人，兄弟，姐妹，这里兄弟姐妹爱人都不是直系亲属，所以不能作为直系亲属列出……

划分还有的常见的逻辑谬误是其所划分出的子项不能相容，就像人分为男人、女人、坏人、好人，那坏人好人中都有男有女，这里就是犯了子项相容的问题，同样是这个例子，还犯了标准不统一的问题，划分标准混淆，是按照性别啊 还是按照人的品质啊，最后是容易出现的问题是越级划分，所列子项一定要是同一级别，

第二篇：“板书设计”教学切片

画龙要点睛

——“板书设计”切片分析

濮阳县第二中学 王桂玲 一节课，要上得精彩，高效，必须经过教师的精心设计，如果把一节精心设计的课比作画成的一条龙，那么，板书，无疑是教学设计点睛的那一笔。那什么是板书呢？

板书是教学设计的一个重要组成部分，顾名思义，简言之，就是教师在黑板上的书写内容。我在这里，跟大家从两个方面来进行解读。从动态的角度理解，它是教师上课时在黑板上书写的文字、符号以传递教学信息、教书育人的一种言语活动方式。从静态的角度理解，它是教师在教学过程中，为帮助学生理解掌握知识，而利用黑板以凝练、简洁的文字、符号、图表等呈现的教学信息的总称。这其中，学生也是可以参与板书的，其实，我们也鼓励学生参与。

由板书的概念可以得知，板书的内容主要包括三点，一是本节课的教学内容的内在逻辑结构；再就是教学的重点和难点；另外还有教学内容的补充知识。

根据学生年龄的特点以及不同学科的特点，业内人员，通常把板书划分成六类。提纲式板书，线索式板书，词语式板书，分析综合式板书，图画式板书。思维导图式板书。

各种类型的板书都有有所侧重，要结合学生的特点和教材内容的需要进行安排，比如低学段的文科板书要尽量采取图画式的，引起孩子的兴趣，高学段的理科板书设计，尽量低要采用具有逻辑性强的板书设计。

这里，我要对思维导图式板书多做些交流。这类板书在我国是近几年比较流行的，我在教学过程中运用最多的就是这种板书，既美观又具有比较强的逻辑性，最主要的是着这一过程中，吧对知识的学习变成了学生积 极参与的做事性学习。学生根据所学内容，结合自己的想法，能够在老师的带动下绘制创造性的思维导图，对学生知识的梳理，系统化，网络化大有帮助，而且能够培养学生的发散思维。

总之，板书设计要有利于知识传授，有利于学生智力开发、能力培养，有利于学生情操陶冶，有利于活跃课堂气氛，有利于学生记忆知识。

但是，实际教学中，教师对板书设计的重视程度怎样呢，情况并不理想。通常有以下几种情况。

一部分教师，特别是刚入职的青年教师，没有认识到板书的意义和价值，对板书没有设计，讲到哪里写到哪里，讲完了，写完了，满满的一大板，横的竖的，乱七八糟，看不出条理，看不出重点。甚至于一版写不完，就唰唰唰擦掉，粉笔末四溅，再接着写。随意性很强，布局不合理，重点不突出不醒目，起不到板书应起的作用。

另一部分教师，板书是经过设计了，可是字体不美观，书写潦草，没有规范意识，忘记了自己的角色，老师的示范作用，身教的教育作用要大于言传，老师是学生模仿的对象，不理想的板书，对学生影响也不好。

最后一部分教师，可能是因为书写基本功不太理想，根本不板书。另外，现在老师上课时基本上都用到课件，干脆就制作在课件上，一展示就行了，倒是便捷。但是笔者认为，这样一来，板书教育的附加值，就会消失殆尽。

可见，课件板书设计并没有真正引起执教教师的重视。大多数老师只是在公开课的时候才会用心设计板书，我多么希望板书设计成为教师课堂教学的常态化，落实到每一节课堂教学中。这也是今天我对做客教师出色的板书设计特别关注的原因之一。

今天，杨庆春老师这节课的板书设计激发了我莫大的兴趣。板书最后形成了一部书的图形，一页是课题“背影”，另一页是对父爱的定性评价： 2 关怀备至，体贴入微，真挚深切。书脊上书写的是“父爱”。父亲就是一本书，一本厚厚的书，父爱是书的内容，这爱，是关怀备至的，是体贴入微的，是真挚深切的，二这些，都凝聚在父亲肥胖，佝偻的背影里。板书的这个创意，生动形象，直观地再现了文本的主旨，不愧为课堂的点睛之笔。这使我想起了曾在百度上看到的《秋天的怀念》的板书设计，板书整体有两个红色的心交叠组成，叠合的部分写着“爱“字，两边分别写着愧疚、怀念和坚强、无私，不言而喻，这分别是母亲和儿子的两颗心。了了几个关键词，点出了文本的主旨。由此看来，这两个板书设计有着异曲同工之妙。我又在网上搜集了大量获奖的板书设计，如下图：

.这些优秀的板书设计都具备了一些共性特点：

1.板书简洁扼要，语言凝练，只板书核心词，言简而义丰

2.板书图文结合，完备美观，给人以美的享受，能激发审美体验。3.板书有启发性。逻辑性强，留下思维的空间。

结合杨老师的课例，我建议，板书完全形成之后，教师要把板书设计的意图，用优美精炼的语言表述出来，有助于学生进一步理解教师的设计意图，进一步深刻理解文本的核心内容。给整个一节课画上一个圆满的句 号。另外，板书和学习进度要保持同步。

因此，我们可以进一步提出，优秀板书设计要遵循的基本原则与操作要求：

（一）科学性原则。板书设计，是发端于文本，源自于学者，形成于黑板的，是课堂教学中很重要的一环。板书“要反映教材特点，突出教材重点，揭示教学内容的难点和关键。

（二）美观性原则

板书设计还要合符审美的原则，图文结合，激发学生的审美意识。

（三）实用性原则

板书设计，不论是教材内容，还是技法，都要字字露旨，从实用有效着眼。

（四）生成性原则

板书设计是一个动态生成的过程，板书构思，要契合教学程序，根据课堂的生成，及时调整，展现出一幅动态的教学流程，也是文本精髓的不断生成。

总之，板书师教学设计中不可或缺的一部分，对一节课起到画龙点睛的作用，也是大型的正规的教学竞赛中重要的一部分内容，说课，微课等形式中，都对板书设计有所要求。作为任课教师一定要重视。

参考文献：百度文库 百度百科

2016-10-17 4

第三篇：组织切片技术

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 组织切片技术注意事项

程序步骤

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蜡切片：流水冲洗组织块>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蜡2h>>包埋

冰冻切片：固定后的组织>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的组织>>转入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>贴片>>干燥（37度过夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸馏水3min>>苏木精染色30s—5min>>自来水涮洗>>蒸馏水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊红染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性树胶封片

6、免疫组化（ABC法）

（1）干燥后的石蜡或冰冻切片（冰冻切片需要缓慢复温）脱蜡至水；

（2）双氧水（1%浓度左右）封闭内源性过氧化物酶；

（3）PBS洗涤3×5min；

（4）5%BSA封闭非特异性结合位点，不洗；

（5）滴加适当稀释度的一抗；4度孵育过夜或37度2h；（6）同上洗涤；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗涤；滴加ABC复合物，37度1h；（8）洗涤5遍，每次5min；

（9）配制显色液（DAB显色试剂盒），显微镜下观察显色；（10）切片浸泡于蒸馏水中终止显色；（11）苏木精复染，脱水，封片。

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注意事项

取材

1.组织越新鲜越好，最好于动物处死后10~20min完成取材，时间过久后组织自溶和腐败会影响组织形态。

2.取材组织块不宜过大，一般为5nm以下，2~3nm为宜。如果试验要求采取大块组织，最好采样前注射固定液预固定或采取灌流固定（比如取脑时需灌流固定）。

3.取材使动作轻柔，避免用力夹、捏和拉扯组织，尽可能保持组织原有形态。操作时可用镊子夹取组织的一个边角，避免主要组织损伤。

4.如果是大批量取材，取材时没有时间对组织块大小进行修正，可将组织（可稍大，但不宜过大）先放在固定液中固定，2~4h后进行修块，即用锋利的刀片（刮胡刀片）把组织切至适宜大小。注意不能用剪刀等进行钝性分离。5.如果对不同处理或不同动物的组织进行比较研究，应对所有动物在同一解剖学位置取材（比如十二指肠距胃3cm处，或空肠距胃10cm处）。

6.取材时注意组织的不同断面，可将组织的一面用刀片切平作为标示，以便包埋和切片时选取的断面正确（比如肌肉组织，应区分好横断面和纵断面）。7.一般情况下宰杀动物应放血干净，取材时除去组织周围的附属物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的组织立即固定。冰冻切片组织可先固定后冻存，也可直接冻存，直接冻存一般采取液氮中速冻，然后转入-20度保存，冻存组织应避免反复冻融，且尽快进行切片或用OCT包埋（包埋后可放置较长时间）。未包埋的组织在-20度长期保存的组织会逐渐脱水（比如肌肉），影响形态学观察。

9.理论上免疫组化的组织采取冰冻切片，一般运用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋冻存。但对于抗原表达量大且较易检测的免疫组化，可以采取石蜡切片，但固定时间不能过长，控制在1周以内，长时间固定会引起抗原表位的醛基化和抗原表位构象变化，导致免疫组化检测灵敏度降低。

固定与包埋

1.选择合适的固定液，原则是在良好固定组织并保持形态的前提下尽可能的减小对组织的影响。常用固定液为福尔马林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后两者最为常用，效果也较好。

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鲜配制，新配的固定液固定效果较好。3.固定液体积理论上应为组织体积的20倍以上。

4.一般组织理论固定时间为4~24h，即以固定液完全渗透进入组织的最短时间为宜，实际操作中可延长至数天，但一般控制在1周以内。

5.如果是冰冻切片，固定后的组织最好及时用OCT包埋，能更好的维持组织形态，包埋后的组织可于-20度保存数月。固定后的组织可用蔗糖溶液脱水，方法为直接将组织置于30%蔗糖溶液中，每天换新鲜蔗糖溶液，2-3天组织在蔗糖中沉底即可。一般来说，先固定，然后脱水，再用OCT包埋效果比较理想。6.冰冻切片可以采取后固定的方法。即采得的组织经液氮速冻后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰冻切片后用丙酮等对切片上的组织进行固定。但丙酮固定较为强烈，容易发生掉片。

7.石蜡切片时，固定后的组织包埋前一般对组织进行洗涤，通常用自来水冲洗，洗掉组织中的固定液，因为残留在组织中的固定液可能对染色产生影响。洗涤为可选步骤，我们实验室通常不洗涤，将固定后的组织直接包埋，并不影响HE染色效果。

8.二甲苯透明时间是影响包埋效果的最关键因素，需根据组织种类、组织大小、室温以及二甲苯的新旧程度综合考量，必要的时候需要设置时间梯度进行摸索。此外，组织是否脱水完全、是否浸蜡完全也直接影响包埋效果，原则上在能够完全脱水和浸蜡的前提下，组织在各溶剂中的浸泡时间越短越好。

切片

1.切片成功与否很大程度上取决于组织固定和包埋的好坏。

2.切片厚度：HE等组织学染色一般4~5微米（4微米差不多是石蜡切片的极限），如果切片困难，可适当增加切片厚度（20微米以内越厚越好切），但切片厚度的增加会使得细胞层数增多，影响观察和美观。免疫组化中石蜡切片一般切片5~10微米，冰冻切片大约8~14微米，特别是在检测表达量较少的抗原时，较厚的切片可以增加阳性物质的出现概率。

3.较好的石蜡切片呈均匀连续状，没有空洞和破损，组织完整不碎裂。4.切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。刀片应从一段开始使用，发现刀痕时逐渐移动，以最大限度使用刀片。

5.冰冻切片的主要影响因素有：切片机箱体温度（一般为-25度左右），防卷器位置（太往前切不动，太往后起不到防卷效果）。

6.对免疫组化切片而言，需对玻片进行包被（一般为使其带正电荷，组织带负

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 电荷，通过静电吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太浅起不到粘附效果，包被太深会导致免疫组化非特异性染色。

展片和贴片（捞片）：

1.烧杯中装蒸馏水，置于水浴锅中，温度一般40~45度，温度太低片子展不开，温度太高石蜡会融化。

2.冰冻切片不需要展片，直接将玻片轻靠在组织上，组织便会自动吸附到玻片上。

3.捞片时选取完全展平的片子捞起，宁缺毋滥。一张玻片上可以贴多个组织，最后选染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被过的玻片可重复使用，包被过的玻片贴片后组织很难掉下，不可重复使用。

干燥：

1.干燥可以让组织贴的更结实。石蜡切片37度干燥过夜，或者45~60度干燥数小时。冰冻切片室温晾干（夏天一般5~10min），但不可凉太干，太干也容易掉片，判定标准为组织表面没有明显的液体为宜，如果组织变白说明干燥时间过长。

2.干燥后的石蜡切片可放切片盒中室温保存，如果天气炎热可以放置4度保存；冰冻切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期内试验可以放4度保存。

染色（以HE染色为例）：

1.液体置换要彻底，特别是脱蜡和脱水步骤。

2.伊红一般用醇溶性配方，苏木精配方有很多种，如果用氧化汞方法配制使用前要过滤，因为液体表面容易聚集一层金属离子薄膜，对染色产生影响。3.新鲜配制的伊红染色时间1秒即可，存放时间长的染液可以适当增加染色时间。

4.封片时中性树胶的量要适度。根据组织的大小选择大小合适的盖玻片，盖玻片以能覆盖住组织为前提，越小越好，太大的盖玻片溶液不平整，显微镜观察时组织可能不在一个平面，需要反复调整焦距。

5.苏木精和伊红染色时，最好摸索染色时间，以寻求最合适和漂亮的颜色搭配，不同的组织染色能力有所差异，比如淋巴组织内淋巴细胞较多，细胞核比较大，染出来可能蓝色居多，肌肉组织中肌显微和细胞质比例高，染出来红色

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6.总体原则是染色宁愿偏浅不要偏深，偏深的染色难以判别细胞形态和结构。

免疫组化注意事项：

1.免疫组化一般以冰冻切片为主，但石蜡切片也可以做免疫组化。

2.冰冻切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰冻包埋）。3.免疫组化步骤繁琐，时间较长，因此用包被过的切片来防止掉片。常用的包埋剂有APES，多聚赖氨酸和明胶等。包被过程相对简单，可购公司的商品包被试剂盒，按照说明书操作。

4.石蜡切片的免疫组化有时需要抗原修复。原因：固定液会对组织的抗原性产生影响，示抗原表位发生构象变化，可以通过化学处理和热处理来还原组织的抗原性。常用的修复液为枸橼酸钠缓冲液，一般采取热修复，即把切片放置在缓冲液中然后加热至沸腾。

5.免疫组化切片厚度一般为8~12微米。6.选择合适的抗体（单抗、多抗）。

7.预实验确定合适的H2O2、封闭液和抗体作用浓度和时间。8.选用包被过的玻片，动作轻柔，防止掉片。9.设置阳性、阴性和空白对照。

10.显微镜下控制显色，放置显色过浅或过深。

11.复染时苏木精浓度可稀释，时间缩短，避免染色过深。

12.遇到问题逐项排除，寻找原因。详细的问题解决和相关技术贴可参照丁香园论坛或生物秀论坛，搜素“免疫组化”可以找到相关资料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，边加入边加热搅拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促进粉末溶解，完全溶解后HCl调PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 饱和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混匀。

染液

伊红染液：1%醇溶性伊红配方为1g伊红加入到100ml 80%酒精中，溶解。

苏木精染液：

1.哈里新（Harris）苏木紫液：甲液：苏木紫Ig，无水乙醇10ml。乙液：硫酸铝钾（或铵）20g，蒸馏水200ml，加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合，加热煮佛，沸后去火，待溶液不翻腾时即加入氧化汞0.5g（此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出）。然后染液迅速冷却，冷却后过滤，即可位应用。用时每100ml加冰醋酸4ml；

2.迈尔（Mayer）苏木紫液：将苏木柴0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。染色时间约10~20min；

3.欧立区（Ehrlich）苏木紫：将苏木紫2g溶于无水乙醇100ml中；将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml中，加入甘油100ml，将二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混匀后，盛于无色小口瓶内，暴露于日光下，使其自然成熟，约需3个月。染色时间约5~20min。此液贮存愈久，染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg，使人工成熟，配成后即可应用；

4.卡拉兹（Carrazzi）苏木紫：将苏木紫0.5g溶解于甘油100ml中，将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水350ml中溶解后将二液慢慢混合，并充分摇匀。将碘化钾0.1g放于蒸馏水50ml中，加微温溶解，然后加入苏木紫液中，充分摇匀，翌日可用。

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免疫组化

0.3%~1%双氧水：

商品化30%双氧水溶甲醇稀释到适当浓度。

1~5%BSA（羊血清、脱脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混匀。

第四篇：组织切片必看

1.组织的取材

取材时要注意及时快速固定，避免剪刀镊子损伤组织，组织要取全。全盘考虑进行病理切片的组织类型，病变可能累及的部位，组织包埋需要的剖面。2.组织的固定

在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是大体标本的保存，都必须进行及时的适当的和有效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的一系列的制作，直至切片的最后完成。

固定的作用：从组织学的角度其简单的定义是，保持细胞、组织的固有形态和结构，使之尽量保持细胞、组织的固有形态和结构，而从免疫组化技术的角度，固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，尽量减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；防止细胞的自溶，以免使抗原扩散至组织间质；以保持组织的固有形态和结构；更重要的是保持组织或细胞的抗原性，不但要使抗原不导致失活，而且不使抗原发生弥散的现象，才能在免疫组化染色时，不产生过深的背景，影响对阳性物的判断。

固定的目的

①能防止细菌的腐蚀和组织的自溶。细菌无处不存在，它们随时都可污染腐蚀未经处理的组织。固定液可以固定任何蛋白质，凡有生命的东西，都由蛋白质组成，蛋白质被固定，生命就停止，细菌也就失去了活力。另者，在日常生活中，人们常可碰到这样的问题，一块肉不经处理放了几天后就会变质，这是为什么呢？除了细菌参与外，其本身也是很重要的。因为组织离体后，供应这此组织的血液随之消失，细胞缺氧，细胞内溶酶体膜的结构受到破坏，破坏后释放出溶酶体酶，日常生活中常碰到的肉变质，就是细菌污染加组织自溶的结果。

②保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等，使细胞或组织基本上保持与生活时的物质一样。细胞的固有物质，即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖元等。这些物质，如果不将其及时固定，是很容易丧失的，尤其是溶酶体，很容易受到破坏，因此应特别小心。

③使组织硬化，便于切块。刚离体的组织，除了胃组织以外，都是柔软的组织，尤其是胃肠道的组织，如果在没有固定时就取材，效果就很差，不是取材不规整，就是厚薄不均，粘膜和肌层很容易分开，因此，要取得规整标致的材料，就必须将组织彻底固定，再行取材。

④对某些具有传染性的标本，能防止疾病的扩散。病理标本、种类繁多，成份复杂，各种病例都有，具有传染性的病种也不少，如结核、肝炎、麻风、性病等等。对于此类标本，应进行彻底的固定后，再行取材，如结核球，固定时间应在3-5天。

⑤可增强染色的作用。组织经过及时的固定，最终可见到切片有鲜艳的染色，而些时如果有一批未经及时固定的组织，将看到最终的结果是，核染色不清楚，灰淡色，由此可得结论，固定可以增强染色的作用。

固定的注意事项：

①组织固定越新鲜越好。组织一经离体，就能及时地固定，这是最好的。根据实验，如果要获得某些酶的染色，固定最好在组织离体后30秒至1分钟。对于其它达不到些要求是越快越好。原则上动物死亡后半个小时内取完并及时固定组织。

②组织固定，组织块不宜过大。凡是需要固定的组织，都不应该太大太厚，这是因为所有的固定液穿透力不够强，浸透度不够快的缘故。如果较大厚的组织，不经处理就进行固定，那么待固定液进入至中间对可能这些组织早就发生自溶了。因此，对于较大的组织，必须先进行处理，切成制片材料再行固定，这是最佳的处理方法，如遇到胃肠的器官，则应将其剪开，放平后，再行固定，若非特急病例，最好在固定后才取材，因这类组织、粘膜和肌层容易分开，没固定时，难以取得最佳制片材料，对于产酶类的器官如肝、肾、脾等，更要处理好，否则更容易出现自溶现象。

③对不同类型的组织应适当合理地选择固定液。固定剂的种类繁多，成份复杂，对组织的作用不尽相同。在我们的日常工作科研中，对于组织的固定，应有针对性的选择，方能获得满意的效果。对于肾，睾丸等泌尿系统和新生仔鼠应选择Bouin氏固定液。免疫组化可以选择多聚甲醛和中性缓冲甲醛；我病理室一般选择中性缓冲甲醛，它可以兼顾常规染色和免疫组织化学。

④组织固定，时间不宜太短，也不宜太长。固定时间应根据取材大小、性质以及类型有关，视具体情况而定；时间太短，就不能很多的固定组织，因为不管组织大小，固定液浸入组织之中，都需要有一定的时间，时间太短，就会影响组织固定的效果，对以后一系列关系的处理都有影响，切片质量难以保证，固定时间太长，也不好。组织长时间的固定，福尔马林会产生一种酸，影响核的染色。对于固定很长时间的陈列性标本制片后切片染色不鲜艳，显得非常陈旧。另外，长时间的固定往往会出现福尔马林色素，尤其是造血器官的标本，更应注意。固定时间过长，可降低抗原的活性。一般小鼠组织固定24h即可。

⑤固定液的量要充分。固定液量的足够与否决定着组织固定的成败。一般固定液和组织体积比为10：1~20：1之间。

⑥特殊病例或特殊物质应选择特殊的固定液。一般的病例标本，如没特殊的要求，都可以应用甲醛配成的各种固定液来固定。但是，如果要显示狂犬病毒的包含体时，应用上述的的固定液就不行了，必须采用丙酮来固定，显示糖元，可选择无水酒精或丙酮来固定组织。

3.常规石蜡切片制片过程

组织经系列酒精的脱水，经透明剂的作用，经熔化的石蜡的浸渍，包埋后所切成的切片称为石蜡切片。制片过程的每一步每一环节处理不好都会影响切片质量。

组织脱水：

把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。不管是正常的组织，还是有病变的组织，都含有不同程度量的水分。据测定，人体的物质组成约含水55~67%，蛋白质15~18%，脂类10~15%，无机盐3~4%及糖类1~2%[14]。如果不把这些水分脱去，石蜡切片将无法进行，因为石蜡和水不能混合在一起，所以除去组织中的水分成为制片中的关键，至今为止，国内常用的都是酒精。因它不管在什么样比例的情况下都能和水混合，所以它可以慢慢地将水从组织中置换出来。酒精脱水力强，对组织又有硬化和易脆的不良影响。在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列通常是70%、80%、90%、95%和100%，组织经过这一系列处理后，基本可达到脱水的目的。

每一步的组织脱水都需要控制好脱水时间，一般根据组织块大小和组织类型而定。短了脱水不干净，长了会使组织切片时易脆。组织的透明：

组织脱水后，要经过一个浸蜡前的中间溶剂透明过程；才能进行浸蜡。透明的目的：组织经脱水后、浸蜡前必须经过某些既能与脱水剂相混合又能溶解石蜡的中间溶剂处理。组织在中间溶剂时，组织间隙内存留的脱水剂完全为中间溶剂所取代时，组织就呈现透明状态，此时即可进行浸蜡。透明液多采用二甲苯，组织经无水乙醇脱水后转入二甲苯透明，组织的大小、厚薄不同，透明时间也不同。透明时间短了，透明不完全，导致切不了片，透明时间长了，透明过度，导致切片易粉易碎。组织浸蜡：

用于浸蜡的石蜡最好是熔点稍低（56～58℃），低温浸蜡对保存组织细胞内的抗原免疫活性，避免组织收缩和变硬变脆有帮助，以尽量清除二甲苯蜡渗透到组织中起支撑作用，切片时才能把完整的组织和蜡一起完整切下来。不同大小和厚薄的组织浸蜡时间有所不同，一般为1～3小时。浸蜡温度过高，浸蜡时间过长或不够均可导致组织收缩，变硬变脆，难以切出理想切片。组织包埋：

组织经浸蜡后即可进行包埋。包埋时，包埋石蜡的温度要比组织高（约3~5℃），否则包埋冷凝后组织与包埋石蜡分离，特别是在冷天包埋时，动作更要迅速，否则容易导致组织与石蜡融合不好，影响切片。包埋时把组织最大最平切面或所需的病灶切面向下，对皮肤、肠管和囊壁等层次清楚的组织其切面应包含有各层组织。组织包埋要选择所需要的组织切面。组织切片：

组织切片厚薄要适宜，薄的切片细胞不会重叠，易于观察。切片的厚度应为3～4μ，组织蜡块过硬，切片刀或蜡块没固定好，会出现跳刀、切片成一截厚一截薄的现象。优质的组织切片要求切片较薄，平整，无刀痕，皱褶。切片太厚或呈波浪状厚薄不匀。贴片烤片：

烤片时间短，会造成染色时切片从载玻片上脱落或脱蜡不净，染的切片会着色浅、不上色或灰染；烤片时间长，会造成对组织的损伤。染色：

染色染色的程度包括脱蜡、浸水、染色、分化、促蓝、脱水、透明等过程。切片经过脱蜡至水，HE染色后，要彻底脱水透明，才能用中性树胶封盖。如果脱水不彻底，封片后呈白色雾状，镜下观察模糊不清，且容易褪色。要求组织结构清晰，色彩鲜艳，细胞核/细胞质对比分明。

组织病理切片质量的影响因素

2009-08-19 编辑： 【打印】 【关闭】

第五篇：学习做切片

形态学方法 免疫组织化学

实验对象：冰冻切片

步骤

1、室温下复温30min，0.01MPBS清洗5min×3；

2、加入配好的0.3% Triton X100（30% Triton X100＋0.01MPBS 100ml）30min，以增加细胞的通透性，0.01MPBS清洗5min×3； 3、5%小牛血清封闭1h0.01MPBS清洗5min×3；

3、加入用血清稀释液（牛血清白蛋白 1.00g＋0.01MPBS 100ml)稀释的一抗，4℃存放24-48h；吸去抗体，0.01MPBS洗5min×3；

4、加入配好的0.3%的过氧化氢甲醇溶液（甲醇80ml＋0.01MKPBS 100ml＋30%过氧化氢）30min，以消除内源性过氧化物酶的影响，0.01MPBS清洗5min×3；

5、加入0.01MPBS稀释的的二抗，室温孵育2h。0.01MKPBS洗5min×3；

6、加入ABC复合物之类的抗体，室温孵育2h，0.01MPBS洗5min×3；蒸馏水迅速冲三次；

7、加入显色液，进行免疫组织化学显色，时间一般不超过30min，可不时在显微镜下进行观察，待细胞着色而背底颜色较淡时马上吸去显色液，用蒸馏水迅速冲三次后加入0.01MKPBS终止反应；

8、梯度酒精脱水之后，封片，拍照。

细节将消除内源性过氧化物酶这一步放在后面，能避免双氧水对目的蛋白的影响

1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻切片

（3）实验对象： 脑组织

（4）简要实验步骤

1.经心脏生理盐水灌注取脑，对半切开，4%多聚甲醛浸泡固定（4℃）2.20％、30％蔗糖/0.1M PB溶液梯度脱水、直至标本在标本瓶中沉底。3.标本在30％蔗糖/0.1 mol/L PB溶液脱水至沉底后取出，滤纸吸干表面水分。4.标本经OCT包埋剂包埋，连续冠状位切片（5）我的经验或者心得体会：

1.脑组织相对于其它器官含水量尤其丰富，冰冻切片时冷冻的速度要快，冻结的速度越慢，冰晶形成越多。

2.切片时的温度很重要，对于一般的组织切片，切头最适宜的温度在-22℃左右，但脑组织不宜太低，温度设置为：切头温度-19℃，机身温度为-21℃。

3.包埋的时候要在冰冻切片机内操作。先预冷切片的底座，然后再将标本放在底座上预冷，由于标本表面含有水分，自然就会与底座粘紧。预冷至标本表面长白霜，所需时间长短不一，1cm³大小的标本，约需5min。

4.包埋时，由下到上，尽量均匀涂抹，不要留空隙，特别是底部，螺旋状向上盘旋。标本周围包埋剂的厚度在1-2mm之间，底部3-4mm为宜。

5.OCT包埋剂不能包的太多或太少。太多，切出来的脑组织切片容易卷曲；太少，容易卷曲之外，标本底部的包埋剂过少，会导致固定不稳，标本容易与底座分离 1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻切片裱片方法（3）实验对象： 组织切片

（4）简要实验步骤

将组织切片标本贴附于载玻片上

我的经验或者心得体会： 裱片常用有两种方法：

1.漂浮法。切出来的脑标本先转移到0.01mol/L的PBS中，然后在裱到载玻片上，此法需要的时间精力太多，标本容易在裱的过程中损坏。如果切片平面太多，则无法一一辨认清楚，更难以按切片的顺序连续裱片。

2.直接裱片法。一般的同学切下组织后，直接就拿载玻片往标本上面粘，结果很多都是皱巴巴的，不平整，根本无法进行后面的实验。我的经验是先在载玻片上要裱片的部位预先涂上0.01mol/L的PBS，掀起冰冻切片机中压片的挡板，迅速将沾有PBS的区域直接去贴切下的标本。可以观察到，切片像是受到一股吸引力一样，自动贴在载玻片上并且自然展开，遇到有小皱折的地方，可以用小毛笔，蘸少许PBS溶液，涂抹在标本上，由于上下均有一层PBS液，可以自由的移动到你想要调整的切片部位和形态。调整好后，扫掉多余的PBS液，晾干切片备用。

（1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 组织切片封片

（3）实验对象： 组织切片

（4）简要实验步骤

免疫组织化学或者免疫荧光染色后的切片最后的封片

我的经验或者心得体会：

无论是经脱水透明还是直接干燥的切片，最后都需要用中性树胶或者甘油封片。在封片时，为了避免组织被颗粒污染，尽量用新的或干净的棉签棒/玻璃棒，这样可以避免将桌上的粉尘带入到中性树胶或者甘油中，并最后带入切片中。另外在封片前尽量不要摇晃封片剂产生小的气泡。封片时可以将封片剂沿着盖玻片的边缘递成一条线，然后将切片先垂直靠近载波片滴有封片剂的一边，慢慢倾斜45度左右，可发现载波片与盖波片慢慢的合在一起，最后轻轻的复位至垂直即可。

1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻切片保存（3）实验对象： 脑组织（4）简要 实验步骤

1.0.01MPBS及4%多聚甲醛经心灌注取脑，4%多聚甲醛4℃后固定过夜 2.30％蔗糖脱水两次、直至标本在标本瓶中沉底。3.OCT包埋切片

（5）我的经验或者心得体会：

1.第一次脱水时可以用30%的蔗糖，当组织沉底后，换第二次30%的蔗糖时，不要丢弃第一次的蔗糖，由于已经有组织内的水进入到蔗糖中去了，所以实际上蔗糖的浓度一定低于30%，可以将这部分糖收集起来作为下次沉糖的第一次脱水用糖，这样可以减少糖的耗费，对组织没哟任何影响。

2.为了减少冰晶的存在，在冰冻组织时，可以将经OCT包埋剂包埋好的标本放在一个小的塑料平皿中，倒入事先放置在-80度保存的2 甲基丁烷（不要蔓进组织就行），让组织速冻，可以减少冰晶，同时也可以保持直接接触底座的组织底部平整，并减少修组织时的切片浪费。3.为了避免伤害切片机用的刀片，从-80度冰箱取出的组织需要先放置在冰冻切片机中复温半小时，以避免组织及包埋剂太硬而伤害刀片。

（1）实验技术大类： 形态学

（2）具体实验技术名称： 冰冻超薄切片裱片方法（3）实验对象： 组织切片

（4）简要实验步骤

将超薄的组织冰冻切片标本贴附于载玻片上

我的经验或者心得体会：

对于没有confocal的实验室，要想做出很漂亮的荧光双标图片，可以考虑将切片切得非常薄，最薄可以达到6-8微米，当然这也对贴片技术提出了挑战。

首先组织必须固定好，固定好的组织切成薄片不会散开，而固定不好的组织薄片很快就散开。建议对这种薄片，采取漂浮法来贴片，直接裱片容易不平整。切出的标本放入0.01mol/L的PBS中（注意不要有triton x-100）。陈放的器皿直径也最好要大一些。切片进入到PBS时要尽量的轻，尽量让组织薄片漂浮在水面，切不可将组织薄片插入到水面以下，甚至还搅几下，也就是说尽量得让组织薄片显示为展开的状态而不是折叠得很厉害的状态。贴片时，小心的用一个头上是弯勾样的玻璃棒挑出组织，手要轻，再小心的让组织漂在不含triton x-100 的0.01mol/L PBS中，尽可能的保持当时在陈放器皿中的状态，如果组织直接是展开的状态是最好贴的。如果组织有部分皱褶在上，可以先将没有皱褶的部分贴在玻片上，调整玻片的方向，利用玻片在提起来时产生的水流来帮助折叠的切片顺着水流方向铺平，当然如果折叠的部分是向下的，则可以在贴片的过程中轻轻的拨动玻片产生小幅度的水流，结合细尖的毛笔来帮助向下折叠的组织与原来接触组织脱离并随着水流铺平。

形态学方法 免疫组织化学

实验对象：石蜡切片

步骤：

①石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS冲洗3次，每次5 min。②组织抗原修复，修复完自然放置至室温。

③每张切片加1滴或50 μl过氧化酶阻断剂(试剂A)，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次5 min。④除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl正常非免疫动物血清(试剂，室温下孵育10 min。

⑤每张切片加1滴或50 μl 0.1%的Triton X-100破膜，室温下孵育10 min。

⑥除去血清，每张切片加1滴或50 μl的一抗体(稀释浓度为1：100)，4℃孵育过夜。PBS冲洗3次，每次5 min。

⑦除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。

⑧除去PBS液，每张切片加1滴或50 μl链霉素抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10 min。PBS冲洗3次，每次5 min。

⑨除去PBS液，用PBST溶液漂洗切片3次，每次10 min。

⑩除去PBS液，每张切片加2滴或100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察1～3 min。⑪自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。⑫梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明。⑬中性树胶封固。⑭数码相机拍照保存。

一方面有人认为：5）我的窍门或者心得体会：以上我写的是常规的免疫组化的步骤，但其实我试过在苏木素复燃，氨水返蓝后不用再繁琐的进行梯度酒精脱水以及二甲苯透明的这些步骤，直接将玻片放在晾片板上自然晾干即可封片拍照观察，而且效果也很好，因为梯度酒精的作用就是脱水，跟你自然晾干作用一样；中性树胶里面本身就有二甲苯，因为在某种程度上可以起到透明的作用。这样一来，整个免疫组化每次就可以节省一个小时的时间了。大家可以试试看。有人提出了对上一位的看法：对这位兄弟的心得体会有点疑问，理论上来说你的窍门也不是不可行，但我觉得还是不严谨，我们做免疫组化脱水透明这些步骤加在一起也就20-30分钟，所以也不存在节省一个小时的问题。省掉脱水透明的步骤其实不利于片子的长期保存，如果仅仅是做实验留个照片的话也无所谓了，但如果是在医院的话也就不行了。晾得时间长了片子不好看，短了水分残留与二甲苯不相溶，整个片子就模糊了。中性树胶是用二甲苯溶的是没错，但每个实验室加的量是随意的，加的少的话透明不彻底，时间长了片子就不能看了。这个我是有教训的。所以个人觉得还是老老实实脱水透明吧，并不浪费时间，即使多花个几分钟那也是有好处的。呵呵，一家之言，欢迎讨论。

5）过程中需要注意的事项或技巧：

1.在进行第一步的脱蜡至水，其实最好先进行空白片的烘烤，把空白片放在58度左右的烤箱中进行烘烤，大概4~6小时，这样有两个目的：第一，可使玻片上的组织与玻片贴的更紧；第二，可以尽可能的除去玻片上的石蜡，这样就可减少后续染色过程中的非特异背景染色。

2.过程中的“用PBS冲洗3次，每次5 min”我见过有同学是用那种塑料的免疫组化盒子，然后把玻片放进架子上，用手拿着架子在免疫组化盒中进行不停得上下提拉，以达到充分漂洗的目的，这样效果会很不错，但太累人了，每一次都要不停得提拉15分钟。我的做法是，把放有玻片的架子放进免疫组化盒中后，再把免疫组化盒放在做WESTERN BLOT 的摇床上，调整适当的速度，这样放在架子上的玻片就会随着摇床的摇摆而来回摇摆，达到漂洗的目的。3.每次滴加试剂时尽可能的超出标本的边缘稍许，以防止边缘没有液体覆盖增加非特异染色；另外除去液体，继续滴加下一种液体时动作一定要快，不然也是会干片，增加非特异染色。4.抗原修复首选高压修复，效果最好。其次是微波修复。EDTA修复液效果最好，柠檬酸效果其次。

5.第四步中你可以看到，没有“PBS冲洗3次，每次5 min。”这样的说明，对了，这一步是达到用非免疫动物血清封闭非特异抗原的目的，如果你冲洗了，则整个实验就白做了，这一步切忌。6.如果抗原时表达在包膜的，则破膜与否不是太重要；但如果抗原是表达在胞浆的，则最好破膜。7.一抗孵育最好选择4度过夜，抗原抗体反应比较温和；

8.DAB染色时间把握，可以采取镜控。滴完DAB后迅速在显微镜下观察，最佳的时间点是，你要观察部位的胞浆出现了橙黄色，而其他背景还没有开始变黄。9.还是不用梯度酒精和二甲苯作用，直接晾干，封片，观察拍照。也有人认为：这位兄台说的大部分我都认同。有几点与你共同讨论

1..关于脱水透明的问题，在主题的其他贴里我表达了自己的观点，这里不累述。关于抗原修复的问题，有点不同看法。抗原修复不存在哪种方法最好，哪种方法其次的问题。每一张抗原都有不同的修复方法，有的高压修复做出来是阴性，但用胰酶消化就是阳性了。理论上即使两种抗原修复方法相同，例如都是微波修复，但作用的时间和方式可能也不一定一样。有点直接煮15分钟好，有点20分钟好，有的可能要每次煮5分钟，稍冷却再煮5分钟，重复好几次。具体的原理我也不是很明白，是实践经验的总结。关于破膜与否的问题，免疫组化切片一般就4各微米，细胞都已经被切开了，还用破膜吗？相反，如果你破膜时间和浓度掌握不好，可能还会造成染色定位不准。该膜阳性的弄成膜和浆都阳性了。如果你认为出现阴性是没破膜的话，个人感觉还是从其他方面找原因。当然，如果你做的是细胞爬片的免疫组化，那就需要破膜了。

形态学方法

载玻片处理（免疫组化用）实验对象：载玻片

（一）我们大学多个实验室用的载玻片处理方法：

1.普通的载玻片（例如： 帆船牌），将其排列在玻片架上，置于热水中，加洗衣粉，煮沸30分钟

2.倾去洗衣粉水，自来水冲洗2遍，把洗衣粉冲干净 3.超声清洗（65w，10min）4.酸缸内浸泡过夜

5.自酸缸内取出，自来水冲洗 6.超声清洗（65w，10min）7.双蒸水冲洗，烘干 8.75%酒精浸泡过夜 9.双蒸水冲洗，烘干 10.过明胶（3次）

（二）我改良的载玻片处理方法： 1.购买洁净度高的载玻片（例如：世泰）2.置架排列后，75%酒精中浸泡过夜 3.取出后，双蒸水洗涤，烘干 4.过明胶（3次）

我的窍门或心得体会：

1.经改良后的步骤简单快捷，节省大量时间。旧方法最起码要4天时间，新方法2天就完成了。当处理少量载玻片可能不觉得有多大差异，但如果你主要研究形态学的话，处理几百张载玻片的时候，就可以体验到这两种方法的差别。

2.很多人用多聚赖氨酸处理载玻片，个人觉得还是明胶可靠，很少掉片，比较过自己用多聚赖氨酸处理的载玻片或者是直接从公司购买的多聚赖氨酸处理的载玻片，都有不同程度的掉片现象，做石蜡切片的可能相对还好一些，但是冰冻切片，个人感觉明胶处理的的载玻片明显优于多聚赖氨酸处理的载玻片。并且，明胶经济实惠，非常便宜，而多聚赖氨酸很贵；过明胶可以用个大烧杯批量处理，过多聚赖氨酸的时候那可是细活。

（1）实验技术大类：分子生物学

（2）具体实验技术名称：western blot（3）实验对象：动物心肌组织/细胞蛋白（4）简要步骤：凝胶配置及蛋白样品前处理

（5）心得体会：

1．配胶: 该部分较为重要的是配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜。常出现的问题有：A.凝胶出现花纹：此时应检查原料中过硫酸铵（AP）粉末是否受潮

B.凝胶聚合时间较长：聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30min左右，AP不新鲜会导致聚合变慢：此外还需注意环境的温度也很重要，气温较低时胶是会凝得慢一些，必要时可适当增加AP以及TEMED的量，但通常不会超过1h，若超过1h甚至更长仍未聚合，应检查配制的操作有无错误。

2．处理蛋白样品：该部分蛋白样品本身很关键，若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了；除此之外loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时将样品与loading buffer混合均匀也应注意。详722926

见

：http://protein.dxy.cn/bbs/post/view?bid=65&id=15722926&sty=1&tpg=1&ppg=1&age=0#15

（1）实验技术大类： 免疫测定与诊断技术

（2）具体实验技术名称： ELISA（3）实验对象： 肿瘤病人血清标本

（4）简要步骤:① 包被：用包被缓冲液将MBP/OY-TES-1稀释至1.0µg/ml，取100µl/孔包被酶标板，4℃湿盒过夜。1×PBS-T洗板3次（室温静止30sec/次），甩去液体，用纸吸干； ② 封闭：5%脱脂奶（200µl/孔）37℃封闭30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干； ③ 上血清：加入待检稀释血清（1:400）、阳性对照和空白对照各100µl/孔，37℃湿盒孵育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干；

④ 上二抗：加入Biotin-绵羊抗人IgG单克隆抗体（1:1000），37℃湿盒温育1h，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干；

⑤ 上标记物：加入Avidin-HRP（1:1000），37℃湿盒温育30min，1×PBS-T洗板4次，甩去液体，用纸吸干；

⑥ 显色：TMB避光显色15min，加1N H2SO4终止反应； ⑦ 酶标仪OD450与OD630双波长读数。

（5）我的窍门或者心得体会：1.我没用试剂盒做（尚未有商业化试剂盒开发），所以一切数据都要自己计算，包括包被蛋白浓度，一抗浓度，二抗浓度，计算时务必不能出错，要不就会功亏一篑。

2.用任何试剂前都要把试剂混匀，因为蛋白是很容易沉淀的。3.用固定的几把移液器，这样可以尽可能的较少误差。

4.湿盒孵育前要先把湿盒放在37°进行温度平衡，这样可以减少达到平衡的时间，而且也可以避免符合试验温度的孵育时间不够。

5.等板底的水珠挥发以后再读数，要不会出现负值。

6.实验时尽量少开口说话（因为大部分做的是蛋白的测定，口水避免不了会使所测蛋白降解的啊，呵呵）