冰冻切片技术经验总结

第一篇：冰冻切片技术经验总结

冰冻切片制作技巧

1.从锋利的刀片开始

我发现使用新的锋利的刀片时常常做出高质量的片子。我觉得在医疗场合中某些尽量省钱的做法显得有些因小失大。一般我对每位患者的标本都使用一组新的刀片，当片子的质量开始下降时，我会立刻更换刀片。某些组织如质地较硬的胶原和钙化组织会使刀片很快变钝，因此，经常更换刀片显得很有必要，有时候我在切片过程中要连续更换2-3次刀片。

2.坐着还是站着

我切片时总是坐在一张凳子上。要学会把刷子作为一种便捷的辅助工具来操作，从而精细地控制显微厚薄程度的片子。切片时俯身弯腰，颈部过伸的姿势有些不妥，要尽量处于放松和舒适的姿势以便能最大程度控制你的左手。

3.刷子

我是一位刷子的使用者。我相信要想切好片子首先学会使用刷子。刷子的作用就在于粘住片子并把片子弄到台子上。冷冻的片子会自发的卷缩并从刷子上脱离下来，因此，我使用一把有硬毛、夹取面宽的刷子。我发现来自中国的野猪毛十分坚硬，非常管用。你可以花3美元从工艺店买一把1/4英寸长的#2号扁平无色的刷子，把毛削成一个角度。由于是个有角的头端，加上握持刷子成一定的角度，这样刷子与组织接触时就会象扫帚一样的平。我不能理解为什么有人使用脆弱的骆驼毛刷子，组织片很容易从这些柔软的毛上掉下来。

4.握持刷子

左手象拿笔一样握持刷子，将第五指轻压于台面上以稳定握笔的手(或根据手和切片机尺寸的大小置于你感觉合适的地方)，这样可以保证操作者动作的灵活及可控性。我把刷子削成一个角度，大致与左手握持刷子的角度相同，这样使刷子平着接触组织的1/4。

5.摇柄的旋转

以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，且要毫不犹豫。我看到很多冰冻切片者手握着刷子在开始切片时总要停一下，缓慢的抓取组织，然后再开始转动摇柄。依我的经验看来，这种动作增加了起始切片假象的可能，会使片子的厚度不均匀，也增加了处理脂肪类组织的难度。我切片时，象前面所说的那样手握刷子，以一种连续的动作抓取组织，这个动作与刀片接触组织同时开始并贯穿于整个过程。

6.刷子的移动

组织块移向刀片时刷子也要同步地向下移动，当组织块刚好接触刀片时刷子轻轻停在其底部2mm处并迅速抽离。正是刷子的向下移动使你能连续地抓取组织，当开始的几毫米组织穿过刀片时便有自发卷曲的现象，这时，运动中的刷子立刻粘住其游离的边缘部分并水平地拖向切片者。刷子的运动路径是一个朝下的“肘”形，然后再朝向你自己，连续不断。但要注意有时候把组织压向台面时会使组织粘在台面上，可能会导致碎片，应尽量避免。当然预先将组织包埋起来可以使刷子不用接触到组织，切片也容易多了。

7.贴片

可以从切片机的台面上也可直接从组织块面粘贴组织片，我一般采用前者。片子切好后，手持玻片在片子上方，向下以一个角度粘住片子的一角，在静电作用下片子会吸附在玻片上并迅速融化。当然在周围涂一些包埋物对贴片有利，这种多余的包埋物可以保护片子的边缘免受皱缩的损坏。有时候碰到贴片困难，我会在切到最后2mm包埋物的时候停下来，让片子留在组织块上，然后倒转摇柄，使组织块退离刀片，再用刷子从边缘把组织片摊平，这样就可以从组织块面贴片了，这对卷曲的片子或者脂肪组织非常管用。

8.快速固定

我右手转动摇柄也同时拿着玻片，片子一切好，立刻粘起片子并将它浸没于固定液中。固定液需置于方便够到的地方，我一般将染色架放在染色缸的旁边，先将片子置于95%的乙醇溶液中固定，然后插于染色架上。如果组织固定延迟会出现风干的假象，我的经验是组织片还在切片机的台面时，风干效应很小，当组织片粘在有温度的玻片上时就会出现明显的风干假象，表现为核的细节丢失及胞浆液的溢出。下面几张图片是延迟15秒固定和立刻固定的相同组织的比较，差异非常明显。

9.切片的厚度

对于一般的手术病理我推荐切6um厚，这种厚度使染色更加饱满，层次清晰，病理学家通常在2x 和 4x的放大倍数下可以获得更多的信息。太薄的片子在这种放大倍数下显得苍白，容易忽略一些细节。6um的片子可以有更多的时间去避免风干假象，也会减少冰晶所造成的细胞核空洞。当然特殊情况下可能需要更厚或更薄的片子。

10.为什么会掉片

我不能确定组织片粘附到玻片的具体机制，但我相信可能与组织内的液体与玻片发生分子交联有关。下面我例出几种染色过程中组织片脱落的情况： 1）本身非常干燥或过度脱水的组织；

2）组织片的周长与面积比过大，象细条形的组织容易受染色缸内液体涡旋应力的影响而脱落，同样包括薄的纤维囊肿及不规则的坏死组织，太厚的组织也不例外； 3）返蓝用的氨水浓度太高；

4）少数情况需要使用100%的乙醇固定；

5）一张玻片贴多个片子时，片子周围的包埋物相互重叠。

组织块的准备

1.调整好组织与刀片的方向

这是冰冻切片准备中极为重要的方面，使用一些包埋物可以使这项工作变得简单，在我的工作中我总结出一些经验可供参考。

a.脂肪放在最后切。脂肪由于硬度不够，对绝大多数组织均合适的温度却切不好脂肪组织，如果一刀下去，组织中的脂肪先接触刀片，就会破碎并使整个片子损坏。如果脂肪最后接触刀片，则切片过程不受干扰。最糟糕的情况是脂肪部分先接触刀片而没有包埋物的保护，包埋物可以给片子提供一个起始的缓冲，如果没有包埋，脂肪就会切碎并把整个片子破坏。当切片过程中由于脂肪的出现而影响质量时，我要么把摇柄转回去尽量避免，要么把脂肪挖出来。

b.组织与刀片垂直或成角是关键。让我们假设组织由起始端、中间部分及末尾端三部分构成，起始端容易卷缩，或受到刷子的损害，还可能由于操作者的犹豫而引起片子的厚薄不均，这些都增加了假象的风险。末尾端在贴片时容易拉长，最好的是中间部分，最不可能出现假象，并且组织学上最干净，这是片子中最理想的部分。

非常坚实的组织容易产生横皱，切片时应包埋成角且尽可能的加温。成角包埋就像坐着船冲浪一样，如果你直线行驶，就会承受波浪线上最大的冲击，如果成角行驶，波浪线就会拉伸，所受的颠簸也会减小。跟公路上的减速脊一样的原理。

上皮和粘膜贴附的组织如皮肤，胃肠，膀胱，子宫，颈部等，应当使上皮面垂直于刀片。

2.组织块的温度

任何组织都有一个理想的切片温度，在此温度下切片，组织片以平滑均一的形式流过刀片，几乎没有卷缩。当温度、组织类型、刀片均处于理想状态时，切片十分流畅，几乎不用刷子。如果温度太低，片子容易卷曲和破碎；如果温度太高，片子就会皱成一堆。如果需要加温，只需要把大拇指置于组织块面几秒钟；如果需要降温，可以使用机子的精确低温包埋系统，简单的做法就是把过冻的冻台放在组织面上几秒钟，大多数的冰冻切片机都有一种热吸收器可以使用。

3.组织块的填涂——基本的修复

填涂可以解决组织块自身的缺陷，下面我举几个具体的例子。

扁平包埋组织的填涂 包埋扁平的组织时，只有一层薄薄的包埋物贴附在底面，而且包埋物会轻微地收缩与组织块分离，如果想以最小的休整开始切片，那么收缩的空间必须填涂上包埋物，如果不填涂，切片时组织便会与包埋物分离，从而很难获得一张完整的片子。下面这个简单的技巧可以使你获得一个整齐的组织面。

针头的移除

在工作中经常会收到布满针头的标本，有时候针头会穿过整个组织，导致刀片的损坏并使片子一分为二，下面有一种简单的解决办法。

缝线的移除

同样的方法移除组织块中的缝合线

挖凿的技术

当组织块中某些部分不需要或阻碍我们获得高质量的切片时，我们就可以将它挖除掉。最好的例子就是脂肪组织干扰切片，常见于切除的淋巴瘤用于检查是否癌转移。如果脂肪先于组织块中的其他部分接触刀片，你首先可以试着转动组织块，如果不行，就可以将它挖掉，然后用包埋物填充。

学会看片子

这里指的是片子滑过刀片时就要辨别出质量的好坏，如果到镜下才发现片子的缺陷那就无法挽救。

1.观察片子的厚薄

尽管冰冻切片机可以设置厚度，但人为辨别片子的厚度是否合适仍然很重要。片子太薄看起来象半透明的镜纸，片子太厚看起来混浊、柔性差，对我来说，5-6um的片子较合适，象一张薄的打印纸。

2.片子破裂

这种假象往往是组织块冷冻过度所致，可以通过升温来解决，含水量多的组织切片很容易破裂，必须升高到一个合适的温度使裂开程度降到最小。水肿或血液组织经常有这种问题，活检的脑组织也很明显。下面的片子来源于肾肿瘤，含水量丰富，破裂也比较明显，我觉得水性的肿瘤组织在常规温度下冷冻将会变得异常的坚硬。

我觉得组织破裂的过程同一块湿布结冰一样的道理，当你用刀去挑这块湿布时它会自然弯曲，当湿布已经结冰时刀会将冰片弄裂。下面有6张片子，上面的3张破裂很明显，底部的3张很轻微，你必须仔细看才能发现，如果在切片时你集中注意力，你能感觉到甚至听到碎裂的声音。

3.片子上的条纹

垂直于刀片的细条纹为刀片缺口所致，这往往是切到钙化组织、针头或缝线的结果。宽条纹，组织破碎或突然无法解释的切片困难往往意味着组织粘在刀片下面了，这在脂肪组织比较常见，这时刀片需要取下来清洗干净，注意清洗刀片时不要伤到自己。

4.波浪线样的横皱

这是切片机零件松动的征象，可能需要修理，切片时刀片有移动或支撑刀片的机子有移动时，往往有这种规则的条纹出现。为了获得干净整齐的片子，所有固定刀片、刀架、支撑台、支撑栓子及切片机的旋钮、螺钉、轴承都必须上紧，并且不带有垃圾残骸，支撑台或刀片下面有一点包埋物都会影响切片的质量。

脂肪组织的处理

脂肪组织无疑是冰冻切片者的绊脚石，道理很简单脂肪不会结冰，把温度降低让脂肪变硬可以切出较薄的片子，但是这个温度对同一组织中的其他成分来说显得太低而不合适切片，当脂肪破碎影响切片时这个问题就变得明显，下面是一些我的经验总结。

1.尽可能的削掉不需要的脂肪组织

当我准备切淋巴结时，我会先检查一遍，小心翼翼地除掉表面及髓内的脂肪，结内的脂肪用解剖刀刮擦掉，被膜线附近的脂肪用刀切除，这样就不需要切开整个淋巴结被膜。有人会说，我把一些组织去掉后，可能导致漏判一些阳性的淋巴结，但我的经验是好的干净的片子比含有太多脂肪的差片子更容易获得阳性的结果。当你在休整组织或切片的过程中脂肪组织意外出现时，你也可以使用前面的挖凿技术。

2.调整组织块的方向使脂肪最后接触刀片

切片时尽量避免脂肪先接触刀片，因为脂肪会脱离包埋物，在切片上留下一个洞，如果不能避免，也要在其周围加上包埋物，让包埋物先接触刀片。

3.保证刀片、台面的干净及组织块的冷冻程度

切片机的台面和刀片必须保持干净，假如你弄碎了一张片子必须即时用一块干纱布清理干净，但要防止刀片割手，如果你发现切出来的片子有条纹或者堆积成束，可能是组织粘着在刀片的下方了，必须除掉刀片上的组织，并将刀片清理干净。

组织块越冷就越容易切脂肪，只是其他非脂肪组织就变得坚硬难切，同时水性的组织会裂开，这就有必要在切片温度的最冷端和最温端取一个二者兼顾的中间值，以使脂肪和非脂肪组织都能切好。我一般将组织块冻在-24度，可以获得满意的结果，冷冻喷雾剂有用，但要注意先清掉切片机内的污秽。

4.灵活地转动摇柄而不犹豫

假如组织块是脂肪和结缔组织的混合物，那要好切于纯脂肪组织，有时候按照我前面所讲的技巧来做，片子会出乎意料的好。用运动的刷子快速粘住组织片并把它拖上台面，不要把刷子和组织片压上台面，以免粘在一起使切片完全中断。同样，好的刀片也很重要，如果你能用刷子敏捷地做出这套动作，那你肯定也能对脂肪组织切出理想的片子，脂肪在片子上会留下空的间隙，但它们之间的纤维条却保存完好。下面这块乳腺癌及其周围有数毫米覆盖着墨水的脂肪组织，假如你调整好组织块的方向使脂肪边缘垂直于刀片，肿瘤组织就切得好，脂肪切片的角度会有变动，也会留下空隙，但总有一条墨迹线指示着边缘的所在。很多时候我都用这种方法来区别肿瘤和脂肪组织。

5.试着对脂肪过多的组织切厚些

厚的片子对阅读薄片上的细节也是一种辅助，厚片可以通过各种方法获得，我先试着按一下切片机上的精细前进按钮，如果组织块保持完整，我继续尝试按一下粗前进按钮，这样会切出很厚的片子。你也可以调节机子的厚度刻度盘，或者让摇柄转两次，先向前1/4圈，再向后，再向前，采用这些技巧会切出厚度不一的片子。如果你连续均与地转动摇柄并配合使用刷子，你最后会在玻片上贴出良好的片子，后面的固定和染色还是一样的，只是时间可能要加倍或翻两番，染液中的片子轻拿轻放，不要剧烈搅动。费尽全力后最后回报给你的是一张有三维立体感染色优良的片子，而且脂肪组织也变得相当的透明清晰，你可以看到沿各个方向走行的毛细血管，我还可以幸运地识别非脂肪部分的结构，这种用墨迹标记组织边缘的方式包含于整个组织面，有助于解读脂肪边缘有缺损的薄片，粉刺癌中高度恶性的细胞核和坏死同样可以识别。在切脂肪组织的过程中，如果你连做了两三次而没做好，你可能会耗尽了一些宝贵的组织标本，可以在切那些乳腺癌组织之前用正常的脂肪练练手。

冰冻切片的局限 1.时间的限制

确实在冰冻切片室经常受到快速出结果的压力，我的经验是欲速则不达，急躁和慌乱容易出错。我们最好的办法就是树立自信，良好的态度及教育外科医生，受到加快制片的催促时应当学会从各方面抵制压力，假如你是一位专业的受过良好训练的冰冻切片家，从切片到染出一张片子只需要几分钟，如果你对组织的处理很粗糙，这个过程可能要几分钟到十分钟，碰到比较大的复杂的组织需要多重染色则需要的时间会更多，对病理学家来说，阅片需要几秒到数十秒的时间，有时候需要搜寻一些细小的线索，翻阅书籍，或向同行咨询等，所需时间会更多。考虑到外科医生的处境，我们必须动作迅速，但是当所做的结论会更改手术的进程时，我们会显得格外谨慎。我们会要求提供患者的详细资料以便得到正确的答案，即使耽误几分钟，总比重做手术或提供错误的结论所付出的代价小很多，如果连续碰到几例患者，或复杂的病例，多个标本，那我们只有寻求帮助，当然，在手术不过急的依赖冰冻切片的结果时，这些事情尽量不做。不要粗糙地准备和阅读片子，这是最可能出错的地方，同时，也要识别超出你个人能力的处境，很多需要寻求外界咨询的场合，我象一根树桩一样站在那里阅片，几分钟都无法得出结论，就象看到一只从来没有在后院出现过的老虎一样。这个时候我会不顾一切的寻找就近的帮助，并且告诉我的外科医生要耐心的等待。2.特殊染色的局限

这个问题讨论起来很难，我们只能面对，当今时代如果没有免疫过氧化物酶染色和基因突变的检测，仍然无法对淋巴瘤和肉瘤及其他类似的疾病进行分类，也许不久的将来能有快捷的方法用于冰冻切片，但是现在，确实是一个缺陷。

3.冰冻假象

这是水的特性，水在结冰时因氢键的交联而膨胀，正是这个原因，冰块才能浮在水面上。我相信组织在冰冻时候的变化与水结冰膨胀是密切相关的，在此，我会尽量解释冰冻片子和石蜡片子的差异。象处理其他病理假象一样，正确的识别这些冰冻假象有助于我们不至于误判。

冰晶的形成

含水量特别多的组织冷冻时会出现肥皂泡样的空隙，我认为当组织中的水分凝固时形成球形的冰晶，挤压纤维组织条而产生泡沫样的形状。下面的冰冻对照显示当组织片进一步处理时泡沫样的水分又重新分布于间质，而未曾冷冻的组织显示出间质的水肿。这些水分巨多的组织在切片时很难保证不裂开，应尽可能高切片的温度。

挤压假象

细胞实性的组织会受到冰泡膨胀的挤压，这在水肿组织非常明显，下面的肾细胞癌提供了一个很好的例子，中间的图片显示肾小管被透明的冰晶所挤压，右边的图片为来源于同一组织的非冷冻切片。

核性的冰晶

细胞核产生冰晶的趋势不一，根据我的观察，这似乎跟组织的类型及状态有关，我注意到在损伤的组织出现较多，从道理上讲也是如此，烧伤的组织或缺血损伤的组织由于失去了渗透压的平衡从而导致众多数量的核水肿，同时，囊状的核越多，核冰晶形成的可能性越大。我也注意到：片子切得越薄，这种冰晶越容易留下空洞，下面的例子可以很好的说明我的观点。

核染色质的改变

中间这张片子先前冷冻过，显示染色质特别明显，与左边冰冻后立刻固定的图片相比，核的密度更大，更深染，注意到冰冻片中胞浆含有较多的空泡，也是冷冻假象的一种。探讨如何合理的保养冰冻切片机

技术员除了要做好冰冻切片之外，合理的保养冰冻切片机也至关重要，合理的保养有利于工作顺利地进行，同时又能延长冰冻切片机的寿命。

1、冰冻切片机对电压稳定性要求较高-------安装稳压电源。

2、为了保证工作人员的安全及设备安全可靠运行，设备安装时应有接地。

3、应注意机箱周围通风网清理避免阻塞，不可使机器紧靠墙壁，应保证空气的自由流通。

4、冰冻切片机对环境的温度要求较高，特别是夏天所在的房间应安装空调，以减少气温过高引起的压缩机连续运转。

5、设备应专人使用和保养，严格遵守操作规程，非专业人员不准操作机器。

6、因停电或其它原因停机后再启动一定要间隔十分钟后进行。

7、有机玻璃窗开启时间不宜过长。

8、及时清理冷室内的组织碎屑，保证室内外清洁。

9、移动机器后应注意使机器着地平稳。

10、设备不可带故障使用，出现问题时及时修理。

11、冰冻量大的医院，建议购置两台冰冻切片机。

12、关机时，CT温度和OT温度下调10度，关闭OT的压缩机，然后再关机。

冰冻切片机的使用

1.切片前先安装好刀片，调整切片厚度及切片角度，确认标本组织类型，根据不同组织类型调整好最佳切片温度。

2.尽可能快地取新鲜活体标本，不经任何试剂处理，切成2.0cm×2.0cm×0.2cm大小的组织块放到组织托上，涂敷包埋剂后即放到冷台上冷冻，待包埋剂稍凝后(以组织块不流动为宜)，迅速固定到冷冻头上急冻。一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。

3.待组织块冻好后用快进键将其移近刀口，利用按钮修片，修好后即可放下防卷板切片。切片时，低温室内温度以-15℃～-20℃为宜，温度过低组织易破碎，根据各种组织的软硬度来掌握切片速度，软组织切片速度较慢，较硬的组织切片速度快。

4.调节防卷板。防卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片时，切勿上下移动。5.将切好的切片附贴在载玻片上，固定、染色、脱水、封固。冰冻切片制作完成。

第二篇：术中快速冰冻切片技术工作制度

术中快速冰冻切片技术工作制度

手术中快速冷冻切片病理诊断（以下简称“冷冻”）是将手术切下的病变组织在冷冻切片机中迅速冷冻后制成切片，进行病理诊断。一般在30分钟左右得出诊断意见，为临床手术提供参考。冷冻是一种高技术、高难度、高风险的病理项目。其主要作用：⑴确定送检标本组织是否有病变存在；⑵确定病变或肿瘤的性质；⑶确定手术切缘有否肿瘤；⑷确定送检组织有否癌浸润或转移等。但由于取材局限、标本冰晶及时间短等问题，冷冻切片质量不能达到常规石蜡切片的精确度，诊断准确率受到影响。可以出现以下情况： ⑴只能做良、恶性鉴别，为临床提供一个参考性意见；（2）诊断困难，允许发延迟报告或等待石蜡切片诊断，发出最终报告；（3）冷冻诊断与常规石蜡诊断不符时，以石蜡切片报告为准。“三甲”医院要求冷冻诊断的准确率≥96%。为减少和防止医疗差错和纠纷，有利于此项工作的规范化开展，特制定该制度。

1.“冷冻”预约规定：需做术中快速冷冻病理诊断时，各手术科室提前1～2天详细填写冷冻申请单（可用普通病理申请单代替）送病理科。要求尽可能填全各项内容，注明做冷冻的具体年、月、日、时，以便病理科做好准备；除填临床诊断外，请提出要解决的问题，如确定“病变性质”、“切缘有否浸润”、”淋巴结有否转移“等等。一般不提倡急诊“冷冻”申请。如确需急诊冷冻时，要及时与病理科主任联系，说明情况。病理科尽量创造条件，满足临床需要。2.病理科实行“冷冻查房“制度：病理各级医师在手术前1日应下病房查病人、看病历或请病人来病理科接受查体，与主管医师交换意见，全面了解有关冷冻方面的病人情况。

3.实行“手术中快速冷冻病理诊断知情同意书”（样本附后）签字制度。术前由临床医师向病人及其家属谈话，交代冷冻有关事项，征得其理解、同意并签字。最后将知情同意书放入病历中。4.单件标本的冰冻切片制片应在15分钟内完成。

5.冷冻病理报告实行三级医师检诊及双签字制度。初级医师参与取材阅片、中级医师诊断、高级医师复诊。报告由中、高级医师双签字。一般30分钟左右发报告，遇特殊情况时间可以适当延长。6.遇到冷冻病理诊断中的交界性病变及“灰色病变”难以确诊时，首先在科内讨论，如意见仍难以统一，不能勉强发报告。要及时向手术医师通报情况，可向医务处报告，协助派车去外院会诊；或允许延缓出报告，必要时待常规石蜡切片后再诊断。临床医师和/或病理医师要向患者及家属讲明情况，取得理解并记录于病历中。

7.建立冷冻报告登记及随诊制度：冷冻切片剩余组织，一律做石蜡切片对照。对与最后诊断不符的报告要组织相关医师讨论和随诊，以利提高诊断水平。

第三篇：冰冻切片中常见问题分析

冰冻切片中常见问题分析

郑则钦

庞瑾昱

陈斌

【摘要】 目的 探讨冰冻切片技术在临床病理诊断中的应用。方法 收集外科手术中冰冻诊断病例，应用快速冰冻切片法、快速冰冻染色法等对冰冻诊断病例进行分析。结论 冰冻切片技术中常见的问题及改进；影响冰冻切片质量的因素；冰冻切片在病理诊断中的作用。

【关键词】 冰冻切片； 病理诊断

冰冻切片是借助低温使组织冻结达到一定的硬度进行切片的一种方法，是手术过程中采取活体标本，进行快速的组织学诊断的方法，其便捷的优点，利于术中确诊病变性质，决定手术范围，但由于各种原因，影响冰冻切片的质量，拖延病理报告发出的时间，直接影响着病理诊断的及时性、准确性，间接影响病人的预后。

材料与方法

1.材料：收集外科手术中冰冻诊断病例

2.方法：应用快速冰冻切片法、快速冰冻染色法等

结

果 组织取材大小要适宜，约为1.5×1.5㎝,厚2㎜。2 坏死组织影响冰冻切片的完整性。3 冰冻时间根据组织的大小及性质所决定。4 冰冻温度一般设置在－18～－20℃。5 染液的酸碱度要适宜。1 组织取材对制片的影响 组织取材大小：组织块大小要适宜，冷冻切片机内切片刀移动的范围有一定的限制，超出其范围时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组织大小为1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢肿瘤及脂肪组织可稍微大些。组织块过大，切片时阻力过大，易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度，影响诊断。如需在同一标本托上放大于两块组织时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。另外，包埋时，应将组织平放在冻头的中央。组织内含过多的脂肪或坏死组织：脂肪或坏死组织较一般的组织冷冻的温度要低些，当活组织达到所需的温度时，其还比较软，从而影响切片的完整性和拖延冷冻报告发出的时间。组织块过冷：组织冷冻过度易致切片破碎或呈粉沫状，不能制作一张完整的切片。组织块冷冻不均匀：在配合使用液氮时，组织块放入液氮时不能保持水平状态且液氮量不足的情况下，可产生此现象。冻头的温度不足：冷冻切片时要求冻头的温度保持在－25℃～－30℃左右，冻头的温度达不到要求时，组织很快回软，也不能保证切片的完整。冷冻时间对制片的影响：根据组织块的大小、性质，确定冷冻时间，一般13～17s（使用液氮者），若组织较大或脂肪组织时间可适当长些，而甲状腺、脑组织和淋巴组织等冷冻的时间相对要短些。冷冻时间要严格掌握，时间过长，切片易脆碎，其处理方法是：切出完整平面后用戴乳胶手套的拇指按压回温，直到切片完整为止，反之，时间过短，则需继续冷冻，直到组织不粘刀片出现完整切片为基准。冷冻箱体工作温度对制片的影响：一般组织设定为－18～－20℃。但对一些较特殊的组织标本，温度应适当调整，如脂肪成分较多的组织以－30～－35℃为宜，纤维腺瘤，子宫等为－20℃，淋巴结，甲状腺为－18℃，切片时，表面玻璃机器盖子不要打开过大，以免箱体回温过快，影响制片。保持冻箱的温度，做到每次做完冷冻切片应关好冷冻箱的盖子。染色对制片的影响：尤以细胞核的染色最为关键，在寒冷的冬季，室温过低时，影响核的着色，可适当加温，用以增色，苏木素的酸碱度应适宜，经常观察其染液的ph值，过碱时应及时更换，盐酸酒精分化适度，时间控制到位，否则易造成核着色不佳，染色质不清晰，影响诊断的准确性。冰晶的形成对制片的影响：此原因主要取决于组织含水量的大小，尤以组织细胞水肿，淋巴结，纵隔肿瘤，卵巢肿瘤为甚，送检取材过程中接触水源，速冻过程中使用的液氮时间尚未控制好，同是造成冰晶形成的原因，其解决方法为，使用液氮时间上控制到位，保证一次冻透标本，组织送检取材时，尽量避开水源，如遇含水量高的标本时，应尽量用干纱布吸干水分后再行冷冻，避免由于冰晶形成出现诊断上的失误。操作者的动作应迅速。6 切片皱缩或卷缩：这也是影响切片质量的重要因素之一。常见的原因有：①刀锋变钝。② 防卷板粘有异物，防卷板的作用是防止切片卷缩，但若粘有异物，切片时组织会被挤压而缩在一起。③ 防卷板与刀锋的位置不平行、不协调。④ 组织块包埋不完全，缺乏支撑作用。

预防与处理的方法：① 注意检查刀具，及时更换刀口，定期磨刀。② 保持防卷板的清洁，每做一例冷冻切片，均应将刀口及防卷板拭擦干净，防止切片的污染和切片皱缩。③ 调整刀、防卷板的位置，保证两者平行，且防卷板比刀锋前0.2㎜左右。④ 包埋组织应完全，没法切片者再滴加包埋胶。7 切片脱落：冷冻切片是利用温度差（即玻片与组织切片的温度差）将切片粘贴在玻片上，然后进行固定、染色。下面几种情况下可影响切片粘贴的牢固程度，而导致切片脱落：① 组织内含过多的坏死组织。组织细胞坏死崩解后，局部的渗透压升高，吸收水分，切片一经固定，水分逸出，坏死组织失去支撑作用，染色时组织容易脱落。② 固定液浓度过低，这是最常见的原因。③ 载玻片不干净。④ 切片太厚。

预防及处理方法：避免组织内带有坏死组织，条件允许者重新取材；若没有组织可代替，切片固定时间长些，经95％乙醇双重固定后，用电吹风将切片吹干（温度不能过高，以防破坏组织结构）然后再进行染色且动作应轻柔。② 定期更换固定液。一般每周更换一次，例数较多者，适当增加次数；另外，每次做完冷冻，应及时将盛固定液的瓶盖盖好，以防固定液挥发而降低其浓度。③ 保持载玻片干净，平时应将玻片盖好，防止灰尘或其它异物的污染。若新购买的玻片较脏，洗涤过后才使用。④ 调好切片的厚度，切片厚度以5～7um较为合适（脂肪组织可稍为厚些）。组织块脱落：冷冻切片一般要求在30min内发出病理报告，以便手术医生能尽快选择手术方式。但若组织块脱落，会拖延病理报告发出的时间，而耽误病人的手术时间。常见原因有：① 冻头在冷冻机内放置时间过长，致使包埋胶还来不及渗到冻头的底部便凝固了，导致包埋胶与冻头粘连不紧，稍受外力的作用便脱落；② 冻头上的包埋胶冲洗不干净。

总之，对于冰冻切片的质量因素主要有以上几点。如果能正确对待以上几方面的问题，冰冻切片的质量方可得到保证，且能制备出一张质量优秀的切片，为明确病理诊断提供较为便利的客观条件。

第四篇：组织切片技术

组织切片技术

姓名：许莎

班级：生技1学号：12772018

组织切片技术是研究生物组织或细胞形态和结构的重要技术，对于促进细胞生物学和遗传学等研究的发展起着重要作用。最早的制片技术是徒手切片技术，以后发展了利用石蜡进行包埋和切片的制片技术，即石蜡切片技术，该技术由于成本低，操作简单，目前仍在应用，该技术被越来越多的研究工作者应用于发育学、植物细胞学、胚胎学、解剖学等研究领域。

1组织切片技术原理

1.1原理

组织切片技术是研究组织形态学最常用的一项基本技术，在制作胚胎或组织切片时，由于细胞或组织是柔软的或局部的软硬不均，这样制作厚薄均匀的切片很困难。为了能清晰地观察到组织结构及细胞形态，必须先经过一系列步骤将组织内渗入某些支持物质，使组织变硬然后利用切片机将组织切成薄片。根据所用支持剂的种类不同，主要分为石蜡切片、冰冻切片、振动切片、火棉胶切片、塑料切片、碳蜡切片等。

1.2分类

1.2.1石蜡切片

该技术是最重要、最常用的组织切片技术之一，起始于18世纪。此法是用石蜡作为包埋剂，将材料经过固定、脱水、透明后包埋在石蜡中，然后连同石蜡用切片机一同进行切片。石蜡切片的主要优点是不仅可以把材料制成薄的切片，而且还能制成连续切片，这是其他制片技术难以做到的。它的缺点是操作步骤比较复杂，而且材料在脱水、透明过程中会收缩、[1]变硬、变脆，以致不易切片。1.2.2冰冻切片

冰冻切片是利用干冰或液氮等速冻剂使组织迅速冷冻硬化，将组织在冷冻状态下直接用切片机切片的一项技术。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。由于此法不需要经过各级乙醇的脱水、二甲苯的透明和浸蜡等步骤，因而较适合子脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断冰冻切片是酶组织化学和免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。此种切片的优点是能较好的保存组织的RNA稳定性、较完好地保存细胞膜表面和细胞内多种酶活性以及抗原的免疫活性，缺点是需要较高的设备要求;切片较厚，导致组织结构显示欠佳;通常不能进行连续切片。其主要操作技术和方法与石蜡切片过程和类似。1.2.3振动切片

是用振动切片机把新鲜的组织切成厚20-100pm的切片。此类切片的优缺点类似于冰冻切片。通常在切片后进行免疫染色然后再进行电镜切片,以此来弥补结构显示不清的不足。振动切片机主要用于新鲜或经过固定的动、植物标本的制片，切片时组织标本不需冰冻或包埋。因此.样品片既避免了冰晶破坏，又能保持其活性和细胞良好形态为免疫细胞化学研究以及脊髓和脑薄片的神经生物学研究提供了良好条件。振动式切片机可以对不同的材料进行切片，在应用范围上补充了使用传统切片机的不足，是当代电镜、解剖、组胚、生理、医院化工等实验系统最理想的快速制样切片仪器。1.2.4火棉胶切片

是以火棉胶为包埋剂浸入包埋组织。优点是可以切较硬的组织，缺点是操作比较麻烦费时,切片较厚,不能连续切片。1.2.5塑料切片

用干硬度大的组织标本的包埋。由于塑料包埋组织细胞收缩程度小，切片薄，有利于组织细胞细微结构的观察，加之新型塑料包埋剂的出现和聚合方法的改进使塑料包埋技术得到了更为广泛的应用。塑料包埋使用的包埋剂是各种树脂，未聚合的树脂为勤稠的液体.通过标本组织块的没润，树脂可渗透到组织间隙中。自发或在催化剂和加速剂的作用下，发生分子回的连接形成支架，支撑组织细胞结构，聚合完成后形成固体硬块。其优点是可以切出薄至0.5-2nm的切片，适用于同时作光镜和电镜检测。缺点是处理程序繁多,抗原活性易丢失。1.2.6碳蜡切片

以碳蜡为包埋剂，优点是组织固定水洗后不需脱水透明,可以直接浸碳蜡包埋,切片方法于石蜡切片相同，缺点是夏季温度较高时切片困难。

1.3制备方法

以石蜡切片为例，介绍切片标本的制备方法。

1.取材：根据科研和教学目的选择新鲜材料，然后进行适当的切取、分割。样品块要尽量小，以便于下一步固定。

2.固定：将选取的新鲜材料立即投人到固定液中，迅速杀死细胞以保持组织及细胞的原有结构。一般固定液的最少用量为所固定材料总体积的20倍。固定液的选择视材料的性质及制片的目的而定，一般要求尽快杀死并固定细胞和组织。石蜡切片常用的固定液有FAA固定液、卡诺固定液，此外，还有多聚甲醛、戊二醛、乙醇、乙酸等。

3.洗涤：材料固定后，用洗涤剂将材料中的固定液洗掉，以便进行切片的染色或制片，常用的洗涤剂有水或乙醇。

4.脱水：因为固定和洗涤后的材料含有大量的水分，而水和透明剂、包埋剂(石蜡)不相溶，所以必须经过脱水逐步、彻底除去材料中的水分，才能进行透明和包埋。常用的脱水剂是乙醇，另外还有乙醇、正丁醇、丙酮、环氧丙烷等。脱水过程应由低浓度到高浓度逐级进行，不可太快。否则会使细胞收缩或材料损坏。

5.透明：透明是脱水与浸蜡、脱水与封藏之间的桥梁。材料经脱水后，组织内部已没有水分，但脱水剂不能与石蜡相溶，致使石蜡不能进人细胞与组织。因此，需要一种既能与脱水剂混合又能与包埋刘石蜡相混合的溶剂来处理。透明在制片中很重要。如果组织不透明，表明脱水不彻底，必须重新返工，但返工效果往往不好，常用的透明剂有二甲苯、氯仿、冬青油等。

6.浸蜡：浸蜡是将石蜡包埋剂慢慢溶于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡逐渐渗人到材料的组织细胞中，最后使透明剂被石蜡取代。进人组织细胞中的石蜡，在熔点以下很快凝固成固体，凝固后的石蜡起支撑作用，使切片后的细胞组织固定在原位。

7.包埋:将透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入包埋盒内，然后包埋盒底部接触冷水中，使其立刻降温凝固成蜡块。操作过程：包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

8.切片:已包埋好的石蜡材料，在进行切片之前需先进行修快、固着。修块：切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在干净黑纸上。切片操作时应注意随时关好停刀轧，不能对着蜡带讲话以免吹散蜡带;切片完毕，将刀取下擦净。涂上润滑油，放人盒内保存。9.粘片、展片：通过粘贴剂把合格蜡带贴在载玻片上，在贴的同时，借助水的张力使蜡带完全伸展、平贴在载玻片上，粘片和展片是在载玻片上同时完成的步骤。常用的粘贴剂有蛋白粘贴剂和明胶甘油粘贴剂两种

10.脱蜡、透明：在染色之前，需要用脱蜡剂溶去组织和细胞的石蜡，进一步清洗脱掉的石蜡，使细胞、组织透明清晰，用于脱蜡和透明的试剂是二甲苯。

11.染色：为了使植物组织和细胞各部分显像清楚，必须进行染色。运用不同的染色方法和选用不同的染色剂，使组织或细胞某一部分染上颜色，另一部分不染上颜色成为背景;或将不同部分染成不同的颜色，可使组织细胞在光学显微镜中显像清晰，便于观察。

12封片：切片染色后用胶类物质将其封固，以利于长期保存。

2切片技术的应用

2.1石蜡切片技术的应用

石蜡切片虽然是经典的方法但随着新的仪器和研究技术的不断问世，出现了与其他新的[2]技术方法相结合，从而开辟了许多新领域，增加了许多新的研究、观察内容，使组织学的观察研究从简单的形态结构深入到各种成分的定性观察，定量计测，使细胞组织的形态、功能及代谢三结合，从而达到定性可靠、定位准确及定量可测，最终阐述了生命活动的最基本规律。

2.1.1三维重建

重建技术在阐明生物体组织结构与生理功能之间的关系以及在形态学、比较解剖学、细胞化学定位等领域的研究中有着重要的意义。早在1958年，Sjostrand就论证了这种方法的[3]可行性和可靠性，是最早报道利用组织切片进行骨二维重建的学者，随后LUCZ也用同样的方法进行了尝试，但是，由于当时的切片技术和计算机技术都较落后，故效果不如人意。4]直到2000年Mason[再次用同样的方法进行了三维重建。随着计算机技术的不断发展，这项技术在国际上正在继续进行广泛深入的研究，在国内也引起了广泛的研究兴趣，例如对血

[5]管大鼠松质骨、中国虚拟人行切片后三维重建，同时也对方法进行了很多研究。特别是目前正在研究的“中国虚拟人1号”，表明我国是继美、韩之后世界上第三个用人体切片合成虚拟人的国家。2.1.2免疫组化

组织制片技术与免疫学技术结合构成免疫组织化学技术，利用抗原与抗体的特异性结合原理，检测组织切片中细胞组织的多肽及蛋白质等大分子物质的定性和定位观察研究。冰冻切片手续简便，制片过程中抗原活性丢失少，但组织细胞形态较差;石蜡切片步骤繁多。一般石蜡包埋的组织切片用于检测胞浆或核内的抗原，不宜做表面抗原染色，乙醇、丙酮等固定剂对抗原破坏较轻，但结构保存较差。2.1.3原位杂交

随着分子生物学的发展，在Southern blot, Northern blot等分子杂交技术基础上建立了原位杂交技术。原位杂交技术具有高度的准确性和敏感性，它能在细胞甚至亚细胞的水平上定位特异性核酸分子序列。因而，这一技术是目前研究分子细胞生物学、发育学等方面的重要[6][7]手段。例如，在心肌石蜡切片中检测克山病(KSD)RNA ,在乳腺癌石蜡切片中检测ER mRNA, [8][9][10] PR mRNA，在骨组织石蜡切片中检测整合素R 1-mRNA，在肝组织中检测丙型肝炎病毒RNA2.1.4原位PCR

原位PCR技术是直接在细胞或组织标本上原位扩增目的DNA或RNA片断，并在原位检测其扩增产物的技术，它兼有PCR的敏感性和原位杂交的特异性。2.1.5组织芯片

组织芯片是将成百上千的小组织整齐排列在某一载件上从而组成的微缩组织切片。该技术利用并行化处理原则、微量化检测的优点，结合分子生物学和形态学原理，具有经济、简便快捷、信息量大的特点，能够在DNA,RNA和蛋白质水平检测基因表达。2.1.6检测凋亡

检测凋亡的方法很多，形态学观察是判断细胞凋亡的基本方法。可用于体内外细胞凋亡的研究，既可用于组织切片的原位检测，也可对培养细胞通过细胞涂片或切片的检测，特别是在常规石蜡组织切片中，可对凋亡细胞进行原位检测，监测某一或某些处理因素引起体内组织细胞凋亡的动态变化。

2.1.7石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析

石蜡包理组织切片与流式细胞术结合使用来测量DNA含量及倍体分析。由于制备样品技术的原因，过去许多流式分析资料仅限于采用鲜组织标本，Hedley等1983年首先报导了FCM分析石蜡包埋组织切片制备分散细胞悬液技术来进行DNA含量的检测，从组织切片中能获得足够数量的单个细胞，且与新鲜组织分离获得的单个细胞在形态及DNA含量组方图上均极为相似，目前国内也在逐步开展这方面的研究。

2.2塑料切片技术的应用

2.2.1塑料切片技术在水稻生殖发育研究中的应用

利用塑料切片技术对水稻花粉、胚囊发育、受精和胚胎发生、胚乳发育以及突变体等进行深人研究，例如，以7022LR为包埋剂，塑料切片技术观察水稻IR36的胚胎发育过程。

参考文献：

[1] 梁化印，郭瑞峪.杜双存 等塑料切片技术介绍[1]临床与实脸病理学杂志.2004.20(5).[2] 刘能保，王西明.现代实用组织学与组织化学技术[M1湖北:湖北科学技术出版壮.[3] 王伯法，李玉松.黄高升等病理学技术 北京:人昆卫生出版社,2000

[4] 北京未来新世纪教育科学研究所主编,生物知识探讨,远方出版社,2006.01,第10页 [5] 李希平,夏寅,韩德民,等.基于虚拟中国人数据集的鼻部及颗骨解剖结构三维重建.中 国临床解剖学杂志,2004,22(4)[6] Delellis RA，etal.New teehoique singene Produetanalysis.ArehPatholLabMed 1987 [7] 任立群,赵志涛,孙波,等.石蜡包埋组织切片原位核酸杂交研究.白求恩医科大学学报, 2001 27(3)[8] 陆良勇,黄伟达,刘尚廉,等.应用RNA原位核酸杂交检测乳腺癌石蜡切片中ER rnRNA、PR1llRNA表达.中国组织化学与细胞化学杂志,2002,3,11(1):92, 97 [9] 刘少华,程刚,李声伟,等.石蜡包埋骨组织切片核酸原位杂交研究.临床口腔医学杂志, 2002,10,18(5)[10] 王春杰,胡沛臻,王文亮,等.原位杂交检测石蜡包埋组织中丙型肝炎病毒RNA.中国组 织化学与细胞化学杂志,1995,9,4(3)

第五篇：组织切片技术

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 组织切片技术注意事项

程序步骤

1、取材

2、固定（固定24h—1W）

3、包埋

石蜡切片：流水冲洗组织块>>75%酒精1h>>85%酒精1h>>95%酒精1h>>100%酒精（1）1h>>100酒精（2）1h>>二甲苯8-20min>>石蜡2h>>包埋

冰冻切片：固定后的组织>>OCT包埋>>切片或-20度保存；

液氮中的组织>>转入-20度>>OCT包埋>>切片或保存

4、切片

切片>>展片（40~50度）>>贴片>>干燥（37度过夜或者50~60度2h）

5、HE染色

干燥后的切片>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精(2)1min>>95%酒精1min>>85%酒精1min>>75%酒精1min>>蒸馏水3min>>苏木精染色30s—5min>>自来水涮洗>>蒸馏水>>75%酒精1min>>85%酒精1min>>伊红染色>>85%酒精涮洗>>95%酒精1min>>100%酒精(1)1min>>100%酒精（2）1min>>二甲苯（1）10min>>二甲苯（2）10min>>中性树胶封片

6、免疫组化（ABC法）

（1）干燥后的石蜡或冰冻切片（冰冻切片需要缓慢复温）脱蜡至水；

（2）双氧水（1%浓度左右）封闭内源性过氧化物酶；

（3）PBS洗涤3×5min；

（4）5%BSA封闭非特异性结合位点，不洗；

（5）滴加适当稀释度的一抗；4度孵育过夜或37度2h；（6）同上洗涤；滴加二抗，37度1h；

（7）同上洗涤；滴加ABC复合物，37度1h；（8）洗涤5遍，每次5min；

（9）配制显色液（DAB显色试剂盒），显微镜下观察显色；（10）切片浸泡于蒸馏水中终止显色；（11）苏木精复染，脱水，封片。

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注意事项

取材

1.组织越新鲜越好，最好于动物处死后10~20min完成取材，时间过久后组织自溶和腐败会影响组织形态。

2.取材组织块不宜过大，一般为5nm以下，2~3nm为宜。如果试验要求采取大块组织，最好采样前注射固定液预固定或采取灌流固定（比如取脑时需灌流固定）。

3.取材使动作轻柔，避免用力夹、捏和拉扯组织，尽可能保持组织原有形态。操作时可用镊子夹取组织的一个边角，避免主要组织损伤。

4.如果是大批量取材，取材时没有时间对组织块大小进行修正，可将组织（可稍大，但不宜过大）先放在固定液中固定，2~4h后进行修块，即用锋利的刀片（刮胡刀片）把组织切至适宜大小。注意不能用剪刀等进行钝性分离。5.如果对不同处理或不同动物的组织进行比较研究，应对所有动物在同一解剖学位置取材（比如十二指肠距胃3cm处，或空肠距胃10cm处）。

6.取材时注意组织的不同断面，可将组织的一面用刀片切平作为标示，以便包埋和切片时选取的断面正确（比如肌肉组织，应区分好横断面和纵断面）。7.一般情况下宰杀动物应放血干净，取材时除去组织周围的附属物，比如筋膜、脂肪等。

8.取得的组织立即固定。冰冻切片组织可先固定后冻存，也可直接冻存，直接冻存一般采取液氮中速冻，然后转入-20度保存，冻存组织应避免反复冻融，且尽快进行切片或用OCT包埋（包埋后可放置较长时间）。未包埋的组织在-20度长期保存的组织会逐渐脱水（比如肌肉），影响形态学观察。

9.理论上免疫组化的组织采取冰冻切片，一般运用4%多聚甲醛固定24~48h后用OCT包埋冻存。但对于抗原表达量大且较易检测的免疫组化，可以采取石蜡切片，但固定时间不能过长，控制在1周以内，长时间固定会引起抗原表位的醛基化和抗原表位构象变化，导致免疫组化检测灵敏度降低。

固定与包埋

1.选择合适的固定液，原则是在良好固定组织并保持形态的前提下尽可能的减小对组织的影响。常用固定液为福尔马林、4%多聚甲醛和Bouin氏液，其中后两者最为常用，效果也较好。

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 2.固定液需新鲜配制，新配的固定液固定效果较好。3.固定液体积理论上应为组织体积的20倍以上。

4.一般组织理论固定时间为4~24h，即以固定液完全渗透进入组织的最短时间为宜，实际操作中可延长至数天，但一般控制在1周以内。

5.如果是冰冻切片，固定后的组织最好及时用OCT包埋，能更好的维持组织形态，包埋后的组织可于-20度保存数月。固定后的组织可用蔗糖溶液脱水，方法为直接将组织置于30%蔗糖溶液中，每天换新鲜蔗糖溶液，2-3天组织在蔗糖中沉底即可。一般来说，先固定，然后脱水，再用OCT包埋效果比较理想。6.冰冻切片可以采取后固定的方法。即采得的组织经液氮速冻后直接放入-20度保存，OCT包埋，冰冻切片后用丙酮等对切片上的组织进行固定。但丙酮固定较为强烈，容易发生掉片。

7.石蜡切片时，固定后的组织包埋前一般对组织进行洗涤，通常用自来水冲洗，洗掉组织中的固定液，因为残留在组织中的固定液可能对染色产生影响。洗涤为可选步骤，我们实验室通常不洗涤，将固定后的组织直接包埋，并不影响HE染色效果。

8.二甲苯透明时间是影响包埋效果的最关键因素，需根据组织种类、组织大小、室温以及二甲苯的新旧程度综合考量，必要的时候需要设置时间梯度进行摸索。此外，组织是否脱水完全、是否浸蜡完全也直接影响包埋效果，原则上在能够完全脱水和浸蜡的前提下，组织在各溶剂中的浸泡时间越短越好。

切片

1.切片成功与否很大程度上取决于组织固定和包埋的好坏。

2.切片厚度：HE等组织学染色一般4~5微米（4微米差不多是石蜡切片的极限），如果切片困难，可适当增加切片厚度（20微米以内越厚越好切），但切片厚度的增加会使得细胞层数增多，影响观察和美观。免疫组化中石蜡切片一般切片5~10微米，冰冻切片大约8~14微米，特别是在检测表达量较少的抗原时，较厚的切片可以增加阳性物质的出现概率。

3.较好的石蜡切片呈均匀连续状，没有空洞和破损，组织完整不碎裂。4.切片角度和刀片新旧程度对切片效果的影响较大，切片角度视切片机型号而异；新刀片容易切出完好的切片。刀片应从一段开始使用，发现刀痕时逐渐移动，以最大限度使用刀片。

5.冰冻切片的主要影响因素有：切片机箱体温度（一般为-25度左右），防卷器位置（太往前切不动，太往后起不到防卷效果）。

6.对免疫组化切片而言，需对玻片进行包被（一般为使其带正电荷，组织带负

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 电荷，通过静电吸附增加粘附力），增加其粘附性。包被太浅起不到粘附效果，包被太深会导致免疫组化非特异性染色。

展片和贴片（捞片）：

1.烧杯中装蒸馏水，置于水浴锅中，温度一般40~45度，温度太低片子展不开，温度太高石蜡会融化。

2.冰冻切片不需要展片，直接将玻片轻靠在组织上，组织便会自动吸附到玻片上。

3.捞片时选取完全展平的片子捞起，宁缺毋滥。一张玻片上可以贴多个组织，最后选染色效果好的封片，增加成功率。

4.未包被过的玻片可重复使用，包被过的玻片贴片后组织很难掉下，不可重复使用。

干燥：

1.干燥可以让组织贴的更结实。石蜡切片37度干燥过夜，或者45~60度干燥数小时。冰冻切片室温晾干（夏天一般5~10min），但不可凉太干，太干也容易掉片，判定标准为组织表面没有明显的液体为宜，如果组织变白说明干燥时间过长。

2.干燥后的石蜡切片可放切片盒中室温保存，如果天气炎热可以放置4度保存；冰冻切片于切片盒中密封后置-20度保存，短期内试验可以放4度保存。

染色（以HE染色为例）：

1.液体置换要彻底，特别是脱蜡和脱水步骤。

2.伊红一般用醇溶性配方，苏木精配方有很多种，如果用氧化汞方法配制使用前要过滤，因为液体表面容易聚集一层金属离子薄膜，对染色产生影响。3.新鲜配制的伊红染色时间1秒即可，存放时间长的染液可以适当增加染色时间。

4.封片时中性树胶的量要适度。根据组织的大小选择大小合适的盖玻片，盖玻片以能覆盖住组织为前提，越小越好，太大的盖玻片溶液不平整，显微镜观察时组织可能不在一个平面，需要反复调整焦距。

5.苏木精和伊红染色时，最好摸索染色时间，以寻求最合适和漂亮的颜色搭配，不同的组织染色能力有所差异，比如淋巴组织内淋巴细胞较多，细胞核比较大，染出来可能蓝色居多，肌肉组织中肌显微和细胞质比例高，染出来红色

南京农大康海泓整理，Email:snai1621@126.com 居多。

6.总体原则是染色宁愿偏浅不要偏深，偏深的染色难以判别细胞形态和结构。

免疫组化注意事项：

1.免疫组化一般以冰冻切片为主，但石蜡切片也可以做免疫组化。

2.冰冻切片一般采取先固定（4%多聚甲醛），然后用OCT包埋（冰冻包埋）。3.免疫组化步骤繁琐，时间较长，因此用包被过的切片来防止掉片。常用的包埋剂有APES，多聚赖氨酸和明胶等。包被过程相对简单，可购公司的商品包被试剂盒，按照说明书操作。

4.石蜡切片的免疫组化有时需要抗原修复。原因：固定液会对组织的抗原性产生影响，示抗原表位发生构象变化，可以通过化学处理和热处理来还原组织的抗原性。常用的修复液为枸橼酸钠缓冲液，一般采取热修复，即把切片放置在缓冲液中然后加热至沸腾。

5.免疫组化切片厚度一般为8~12微米。6.选择合适的抗体（单抗、多抗）。

7.预实验确定合适的H2O2、封闭液和抗体作用浓度和时间。8.选用包被过的玻片，动作轻柔，防止掉片。9.设置阳性、阴性和空白对照。

10.显微镜下控制显色，放置显色过浅或过深。

11.复染时苏木精浓度可稀释，时间缩短，避免染色过深。

12.遇到问题逐项排除，寻找原因。详细的问题解决和相关技术贴可参照丁香园论坛或生物秀论坛，搜素“免疫组化”可以找到相关资料。

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溶液配制

固定液

4%多聚甲醛：4g多聚甲醛粉末加入100ml 0.1M PBS，边加入边加热搅拌，滴加0.2M NaOH溶液并60度水浴促进粉末溶解，完全溶解后HCl调PH至7.4，4度保存。

Bouin氏液：75ml 饱和苦味酸溶液，25ml多聚甲醛，5ml冰醋酸；使用前三者混在一起，混匀。

染液

伊红染液：1%醇溶性伊红配方为1g伊红加入到100ml 80%酒精中，溶解。

苏木精染液：

1.哈里新（Harris）苏木紫液：甲液：苏木紫Ig，无水乙醇10ml。乙液：硫酸铝钾（或铵）20g，蒸馏水200ml，加温溶解。甲、乙二液分别溶解后混合，加热煮佛，沸后去火，待溶液不翻腾时即加入氧化汞0.5g（此时有大量气泡生成，故容器宜大，以免液体溢出）。然后染液迅速冷却，冷却后过滤，即可位应用。用时每100ml加冰醋酸4ml；

2.迈尔（Mayer）苏木紫液：将苏木柴0.1g放入蒸馏水100ml中煮沸溶解，再加入硫酸铝钾5g，和碘酸钠0.02g，搅动直到全部溶解，加入水合氯醛5g和枸椽酸0.1g，加煮沸5min，冷却、过滤，放置过夜，即可应用。染色时间约10~20min；

3.欧立区（Ehrlich）苏木紫：将苏木紫2g溶于无水乙醇100ml中；将硫酸铝钾15g溶于蒸馏水100ml中，加入甘油100ml，将二液混合，最后加入冰醋酸10ml，充分混匀后，盛于无色小口瓶内，暴露于日光下，使其自然成熟，约需3个月。染色时间约5~20min。此液贮存愈久，染色力愈强。若在其中加入碘酸钠300mg，使人工成熟，配成后即可应用；

4.卡拉兹（Carrazzi）苏木紫：将苏木紫0.5g溶解于甘油100ml中，将硫酸铝钾25g溶解于蒸馏水350ml中溶解后将二液慢慢混合，并充分摇匀。将碘化钾0.1g放于蒸馏水50ml中，加微温溶解，然后加入苏木紫液中，充分摇匀，翌日可用。

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免疫组化

0.3%~1%双氧水：

商品化30%双氧水溶甲醇稀释到适当浓度。

1~5%BSA（羊血清、脱脂乳）： 0.01M PBS配制。

Triton-PBS：

100微升Triton-100加入到100ml 0.01PBS中，混匀。