实验测定方法的验证

第一篇：实验测定方法的验证

检测限是指试样中的被分析物能够被检测到的最低量，但不一定要准确定量。该验证指标的意义在于考察方法是否具备灵敏的检测能力。判断方法有非仪器分析目视法（直观法）与信噪比法

定量限系指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。定量限体现了分析方法是否具备灵敏的定量检测能力。杂质定量试验，需考察方法的定量限，以保证含量很少的杂质能够被准确测出。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定方法的定量限。判断方法有信噪比法。

线性系指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间。范围应根据剂型和分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。

故检测限、定量限、线性常用对照品试验。

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或认可的参考值接近的程度。对于制剂一般以回收率试验来进行验证。中药制剂及生物药物分析中，常采用加样回收率法（在已知含量的样品A中加入一定量的对照品B），化药制剂常采用回收率法（在空白辅料中加入原料药对照品C，还应作单独辅料的空白测定D），要求至少测定高、中、低三个浓度，每个浓度测定三次，共提供9个数据进行评价。加样回收率=（测定值M –样品中含量A）/加入标准品值B×100%

回收率＝（测定值M-空白值D）/ 加入量C×100%

回收率的RSD一般应为2%以内。

精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。精密度包括：重复性、中间精密度、重现性。

故准确度及精密度则需用供试品及对照品试验。

一、准确度(回收率)

准确度系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率(%)表示。准确度应在规定的范围内建立。

1．含量测定方法的准确度

原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定，或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。

如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定，或与另一个已建立准确度的方法比较结果。

如该法已建立了精密度、线性和专属性，准确度有时也能推算出来，不必再做。

2．杂质定量测定的准确度

可向原料药或制剂中加入已知量杂质进行测定。

假如不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。如不能测得杂质或降解产物的相对响应因子，则可用原料药的响应因子。

应明确证实单个杂质和杂质总量相当於主成分的重量比(%)，或是面积比(%)。

3．数据要求

在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，例如制备3个不同浓度的样品，各测定3次。

应报告已知加入量的回收率(%)，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。

所以加样回收率反映的是方法的准确度，是评价方法好坏的指标这一，是误差理论在药物质量标准中的具体应用。准确度=(测量值-真实值)/真实值*100%。

实际工作中，其实不存在药物的真实值的(我们所有的数据都是测量值，都是人们用一定的方法测出来的)。其他领域也一样。

於是人们找一种比较可靠的得到的值规定为真实值。这就是加样回收率的方法。

比如，为了评价阿司匹林片剂的含量测定方法，用天平称一定量(如：100mg)的对照品，加入到阿司匹林的片剂辅料中，这一定量的对照品就是真实值。用建立的方法测出来是99mg，这个方法的准确度就是99%，或加样回收率是99%，根据药品的具体情况，当这个回收率达到一定范围时(比如99%-101%)就认为方法是准确的。

在你标准曲线的范围内的高中低，一般是中间浓度一个，然后低于中间浓度20%一个，高于中间浓度20%一个

不论是拟采用什么方法，就是加样回收测定，高中低三个剂量，在你的线性范围内，每个样品测定三次，最好和试验一起，没有系统误差

第二篇：HPLC测定有关物质和含量方法验证小结

本贴的目的：讨论目前审评尺度下，药品研发过程中，分析方法的验证项目及目的，试验方法，试验要求

本帖仅仅针对于HPLC方法进行讨论

方法开发的内容不在本帖讨论范围内

1．有关物质（适用于API，制剂，也适用于起始物料，中间体）

有关物质方法验证的前提条件：

1.各杂质与主峰的混合溶液能用拟定的分析方法有效分离

2.根据混合溶液中各峰的紫外吸收波长（或单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。多波长检测（如有）则分别考察。

3.在检测波长下，选择峰高最小的，计算S/N，预估主成分浓度 4.各杂质纯度已知

5.根据合成跟踪检测，合理制定各杂质的限度 6.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明

1.1专属性： 1.1.1概念

在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定被检测物的能力。1.1.2试验方法 1.1.2.1定位试验： A.目的

对各已知杂质和主峰进行定位 B.试验方法：

a．配制一定浓度（能够显示出峰纯度，一般为0.1mg/ml）的各已知杂质溶液、拟检测浓度的主成分作为定位溶液

b．配制限度浓度各已知杂质与检测浓度的主成分的混合溶液作为分离度试验溶液 c．使用拟定分析方法分别进行定位。C.试验要求：

a．空白应不干扰各杂质的测定：如杂质附近有空白峰，二者分离度应大于1.5；杂质峰保留时间处不得为梯度峰拐点

b．定位溶液中，已知杂质与主峰的峰纯度应符合规定

c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0（至少1.5）；各已知杂质之间的分离度应大于1.5（至少1.2）； 1.1.2.2强制降解试验 A.目的

一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对有关物质分析方法用于检查降解产物的专属性进行验证。B.试验方法

对于高温、光照、强酸、强碱及强氧化剂的浓度及时间、取样方式等没有明确的规定。具体品种具体模索，初步试验了解样品对影响的因素（高温、光照、酸、碱、氧化）等条件基本稳定情况后，进一步调整破坏试验条件，只要使主药有一定量的降解，并对可能的降解途径和降解机制进行分析，保证实验的意义即可。试验一般的范围为：

强酸：0.1~5.0mol/L HCl溶液或视情况调节时间，温度，体积 强碱：0.1~5.0mol/L NaOH溶液或视情况调节时间，温度，体积

强氧化剂：30%的H2O2或视情况配制不同浓度的溶液或视情况调节时间，温度 高温：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验 光照：固体状态下稳定的主药，可以考虑溶解后以液体状态进行试验 C.试验要求

a.一般样品含量控制在85%—90%范围（归一化法），不一定要求每个条件都能降解出来。

b.在进行酸、碱、强氧化破坏试验时，每个试验最好都要做相应的空白（溶剂，空白辅料，复方制剂还包括除去某一主药的其他组分）破坏试验作为辅助。

c.主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0（至少1.5），已知杂质与相邻杂质分离度大于1.2 d.物料守恒，即未破坏主药的C/A与破坏后的C/A值相比，结果在0.9~1.1之间

e.关于破坏试验，更多内容请参阅lyslinjiu版主在帖子【讨论】2013-专属性实验（强制降解试验）2013-专属性实验（强制降解试验）-丁香园论坛

f.在此处做梯度时间（如有）延长验证试验。即将分析方法的梯度中，有机相比例最大的时长延长（建议延长时间为主峰保留时间或10~20min），考察是否降解出难以洗脱的物质在拟定方法的梯度周期内能有效检出。进一步考察分析方法的合理性

1.2定量限 1.2.1概念

样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。1.2.2验证方法 A.目的

考察杂质的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理 B.试验方法

配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。C.试验要求

定量限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/5

1.3检测限 1.3.1概念

样品中能被检测出的最低量，仅作为限度试验指标和定性鉴别的依据，没有定量意义。1.3.2验证方法 A.目的

考察杂质的最低检出量，同时评判供试品浓度的选择是否合理 B.试验方法

配制限度浓度的各已知杂质与主成分的混合溶液作为贮备液，进样，逐步稀释至S/N约为3时，得检测限。C.试验要求

检测限浓度不得高（修正，原为低）于限度浓度的1/10

1.4溶液稳定性 1.4.1目的

考察被测各溶液在特定时间周期内的稳定性 1.4.2试验方法

a.配制系统适应性溶液、供试品溶液、对照品溶液，在室温条件下，分别在各时间点进样 b.如不稳定，需考察在低温条件下的溶液稳定性

c.时间范围根据试验需要来确定。比如做回收率中需要至少连续测定9份供试品，是所有单个验证项目中最长的，选择这个时间点是可以的。也有考虑到以后需要测定更多的样品，选择更长的时间范围。1.4.3试验要求

a.系统适应性溶液，各峰之间分离度应符合要求。b.对照品溶液峰面积RSD应小于2.0% c.供试品溶液，杂质个数和杂质量应一致，峰面积RSD应小于5.0%；不得检出新增杂质 d.如不稳定，需临用现配或低温保存

1.5仪器精密度 1.5.1概念

同一溶液，连续进样6次，其tR和峰面积的精密度，考察仪器的进样精密度 1.5.2试验方法

配制限度浓度的各杂质和主成分的混合溶液，连续进样6次 1.5.3试验要求 a.tR的RSD小于2.0% b.各峰面积RSD小于2.0%

1.6线性与校正因子 1.6.1概念

在设计的范围内，被测物浓度与峰面积的线性关系 1.6.2试验方法

配制各杂质和主成分的混合溶液，逐步稀释，浓度范围从定量限至限度浓度的120%以上，至少配制5份以上溶液。由2人分别进行。1.6..3试验要求

a.线性关系系数r大于0.990 b.Y轴截距应在100％响应值的25％以内 c.响应因子的相对标准差应不大于10% d.2人测得斜率之比在0.98~1.02之间

e.计算出来的校正因子应进行修约，在0.9~1.1范围内的，修约为1.0进行计算；0.2~5.0范围内的，按校正因子计算；0.2~5.0范围外的，按外标法计算。

1.7精密度 1.7.1概念

同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。1.7.2重复性 1.7.2.1试验方法

由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。1.7.2.2试验要求

a.检出杂质个数，杂质相对保留时间，各杂质百分含量均应一致 b.单个杂质的百分含量的极差应在其含量±10%以内 c.杂质总量的RSD应小于5.0% 1.7.3中间精密度 1.7.3.1试验方法 同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定杂质百分含量。1.7.3.2试验要求 a.同1.7.2.2-a和b b.单个杂质和杂质总量的RSD应小于10.0%

1.8回收率 1.8.1概念

用拟定分析方法所测得结果与真实值接近的程度。1.8.2试验方法

a.配制各杂质的混合贮备液

b.称取供试品适量，精密加入混合杂质贮备液适量，配制成溶液，使供试品浓度为测定浓度，杂质浓度分别为限度浓度的50%，100%，150%。各浓度均平行配制3份 c.配制混合杂质对照品溶液和自身对照溶液 1.8.3试验要求

a.各浓度下的回收率应在90%~110%之间 b.回收率（N=9）的RSD应小于10.0% c.用加校正因子的自身对照法计算结果应与杂质外标法计算结果一致

1.9耐用性 1.9.1概念

在拟定的分析方法有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为所建立的分析方法用于常规检测提供依据

1.9.2试验方法

a.分析方法中可变动的因素有：流动相组成比例，水相pH，柱温，色谱柱（同一品牌不同批次，不同品牌的常用色谱柱），流速，检测波长

b.配制系统适应性溶液，供试品溶液，对照品溶液进行测定 1.9.3试验要求

a.系统适应性溶液应符合规定；如不符合规定，则需更严格控制所变化的因素，直至找到一个合适的范围；如指定色谱柱，严格控制pH等等

b.检测杂质个数，杂质的相对保留时间应与精密度结果一致 c.测得杂质量应与精密度结果一致

2．含量测定（适用于API，制剂，也适用于单个杂质控制）含量测定方法验证的前提条件：

1.空白（溶剂和辅料）和各杂质不干扰主峰的测定

2.根据主成分的紫外吸收波长（复方需分别单独测定各组分紫外吸收），选择合适的检测波长。多波长检测（如有）则分别考察。

3.在检测波长下，计算S/N，预估主成分浓度 4.供试品溶解方法和提取方法得到合理证明

2.1专属性： 2.1.1概念

在其他成分（如其他杂质，辅料，溶剂）可能存在的情况下，拟定的分析方法能正确测定主成分的能力。2.1.2试验方法 2.1.2.1定位试验： A.目的同1.1.2.1-A B.试验方法同1.1.2.1-B C.试验要求：

a．空白应和各杂质不得干扰主成分的测定，主峰保留时间处不得为梯度峰拐点（如有）b．定位溶液中，主峰的峰纯度应符合规定

c．分离度试验溶液中，主峰与相邻杂质的分离度应大于2.0 2.1.2.2强制降解试验 A.目的

一是通过考察药品在一系列剧烈条件下的稳定性，了解该药品内在的稳定特性及其降解途径与降解产物。其二，这些试验也能在一定程度上对含量测定分析方法用于检查主成分的专属性进行验证。B.试验方法 同1.1.2.2-B C.试验要求

a.主峰纯度符合规定，与相邻杂质分离度大于2.0 其他同1.1.2.2-C

2.2定量限 2.2.1概念

样品中能被定量测定的最低量，有定量意义。2.3.2验证方法 A.目的

考察主成分的能被定量的最低量，同时评判供试品浓度的选择是否合理 B.试验方法

配制检测浓度的主成分溶液，进样，逐步稀释至S/N约为10时，得定量限。C.试验要求

定量限浓度不得高（修正，原为低）于检测浓度的1/10

2.3溶液稳定性

试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0% 如溶出检测方法同含量，建议考察一个溶出曲线周期内的溶液稳定性 其他同1.4项下 2.4仪器精密度

试验要求为主成分峰面积RSD小于2.0% 其他同1.5项下

2.5线性与校正因子 2.5.1概念

在设计的范围内，被测物浓度与峰面积的线性关系 2.5.2试验方法

配制主成分贮备液，逐步稀释，浓度范围从检测浓度80%至120%，至少配制5份以上溶液。由2人分别进行。2.5.3试验要求 同1.6.3

2.6精密度 2.6.1概念

同一个均匀供试品，经多次取样测定结果之间的接近程度。2.6.2重复性 2.6.2.1试验方法

由同一试验人员，取同一均匀供试品，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量。2.6.2.2试验要求

6份供试品含量结果RSD应小于2.0% 2.6.3中间精密度 2.6.3.1试验方法

同一实验室，由不同试验人员在不同时间使用不同设备，平行配制6份供试品溶液，测定主成分百分含量。2.6.3.2试验要求

a.6份供试品含量结果RSD应小于2.0% b.12份供试品含量结果RSD应小于2.0%

2.7回收率 2.7.1概念

用拟定分析方法所测得结果与真实值接近的程度。2.7.2试验方法

a.API在精密度，线性和专属性推算出来的情况下可豁免验证

b.制剂：称取空白辅料适量（相当于100%检测浓度的主药），精密加入对照品（或已知含量的主药）适量，配制成溶液，使供试品浓度分别为测定浓度80%，100%，120%。各浓度均平行配制3份 c.配制对照品溶液 2.7.3试验要求

a.各浓度下的回收率应在99%~101%之间 b.回收率（N=9）的RSD应小于2.0%

2.8耐用性 2.8.1概念

2.8.2试验方法：同1.9.1 2.8.3试验要求：同1.9.2 测得结果应与精密度结果一致 其他同1.9.3

第三篇：含量测定分析方法验证的可接受标准简介

含量测定分析方法验证的可接受标准简介

摘要：本文介绍了在对含量测定所用的分析方法进行方法学验证时，各项指标的可接受标准，以利于判断该分析方法的可行性。

关键词：含量测定 分析方法验证 可接收标准

为规范对各种分析方法的验证要求，我国已于2005年颁布了分析方法验证的指导原则。该指导原则对需要验证的分析方法及验证的具体指标做了比较详细的阐述。但是文中未涉及各具体指标在验证时的可接受标准，国际上已颁布的指导原则中也未发现相关的要求。

1．准确度

该指标主要是通过回收率来反映。验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。

可接受的标准为：各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。

2．线性

线性一般通过线性回归方程的形式来表示。具体的验证方法为：

在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。

可接受的标准为：回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。

3．精密度

1）重复性

配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。

2）中间精密度

配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。

4．专属性

可接受的标准为：空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。

5．检测限

主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。

6．定量限

主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。

7．耐用性

分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。可接受的标准为：主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。

8、系统适应性

配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。

第四篇：方法验证原理和实验操作数据结果

1.专属性

是指在其他成分可能存在的情况下，采用的方法能准确测定出被测物的特性，能反映分析方法在有共存物时对供试物准确而专属的测定能力;是方法用于复杂样品分析时相互干扰程度的度量。比如：

（气相色谱法测定杆菌肽原料药中的正丁醇含量）在本测试方法条件下将一个空白稀释液（甲醇）进样进行测试。所得图谱应当基线平整，不存在有影响正丁醇峰积分的干扰。证明稀释液（甲醇）不影响本方法对正丁醇的测试。

3.指某一分析方法在给定的可靠程度内可以从样品中检测待测物质的最小浓度或最小量。所谓检测是指定性检测，即断定样品中确定存在有浓度高于空白的待定物质。信噪比法：把低浓度的试样测出的信号与空白样品尽心比较，计算出较能被可靠检测出的最低浓度或量。

基线噪声看的是高度，而你的积分的是峰面积，之间无法换算。工作站里有个积分方式，你给转换成峰高，就可以顺利算出检出限了，对应浓度从而算出S/N=3的浓度。

4.是指样品中被测物（正丁醇）能被定量测定的最低量，其测定结果应具有一定的准确度和精密度。

5.线性and范围（略）

线性(linear)，指量与量之间按比例、成直线的关系

线性以六个不同浓度的对照品溶液: 1）LOQ 浓度，2）4mg/100ml(～40%);3）6mg/100mL（～60%）;4）8mg/100mL（～80%）, 5）10mg/100mL（～100%）和6）12 mg/100mL（～120%），以及一个空白溶液，按方法进行GC测试。以浓度（x）和峰面积（y）进行线性回归。

6.在样品中加入高中低三个水平的标准，进行测定，计算回收率。

一般的回收率公式是=（加标后测定的浓度-样品本底的浓度）/加入的标准的浓度*100% 比如：任意选取一个批号的杆菌肽原料样品。以加标量的方法准确加标配制正丁醇含量约为0.08mg/ml, 0.1mg/ml及0.12mg/ml 及LOQ浓度等四个不同浓度的样品溶液。每个浓度重复配制三次。该浓度相当于正丁醇限度（5000ppm）的80%, 100% 及120%。按照本测试分析方法中的仪器条件及方法描述进行测试，并计算结果，扣除原批号杆菌肽原料样品中原来已含的正丁醇，计算回收率，回收率应当在100%+ 10.0范围内。

将计算结果 填入下表。

7.重复性（方法精密度）相同条件下，同一分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。制备100%浓度水平供试品（含正丁醇约为3000至5000ppm的杆菌肽原料药。按照本测试分析方法描述的步骤进行正丁醇含量测定，重复配制样品六次并测试。计算正丁醇含量）6

份，进行测定。相对偏差RSD%必须不大于10.0%，结果用偏差和相对偏差衡量。中间精密度验证中，要求不同的分析人员采用相同的分析方法、在不同的时间、使用不同的仪器进行测试，以确认方法的适用性。

同一实验室不同时间不同分析人员不同设备（色谱柱）测定结果之间的精密度。８.耐用性

对照品（杂质正丁醇）溶液、样品溶液的稳定性，将对照品溶液及样品溶液分别置于室温及冰箱(约4゜C)内保存若干天后检测(建议收集0，1，2，3，4，5 天的冰箱数据及0，8，16，24小时的室温数据)。将检测结果与原始测试结果比对。计算峰面积的%RSD。%RSD应不大于10.0%。

【完】

第五篇：实验分析用测试方法验证报告

方法验证报告

方法名称：

验证单位：

通讯地址：报告编写人：

报告日期：原始测试数据

1.1实验室基本情况

表1-1参加验证的人员情况登记表

表1-2使用仪器情况登记表

表1-3使用试剂及溶剂登记表

1.2方法检出限、测定下限测试数据

表1-4 方法检出限、测定下限测试数据表

验证单位：测试日期：

1.3方法精密度测试数据

表1-5精密度测试数据

验证单位：测试日期：

1.4方法准确度测试数据

表1-6有证标准物质/标准样品测试数据

验证单位：测试日期：

表1-7实际样品加标测试数据

验证单位：测试日期：

1.5其他需要说明的问题

（1）测试中的异常或意外情况。

（2）对方法适用性、分析步骤、干扰消除等方面的意见和建议。