流式细胞仪分析技术及应用(课件)

第一篇：流式细胞仪分析技术及应用(课件)

流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述

第二节 数据的显示与分析

第三节 流式细胞仪技术要求

一、工作原理

一、参数

一、免疫检测样品制备

二、散射光的测定

二、数据显示方式

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

三、荧光测量

三、设门分析技术

三、免疫胶乳颗粒的应用

四、细胞分选原理

四、流式细胞技术的质量控制

第四节 流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节

流式细胞术在临床检测中的主要应用  流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

 流式细胞术发展史

1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器

1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司

 流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点 ：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；5.速度快： 5000-10000个细胞/秒；6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节 概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。分为三大类：(1)类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能

一、工作原理 大小

细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 粒度

细胞活性

效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，DNA, RNA含量

胞内细胞因子

保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细 蛋白质含量

激素结合位点

胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

了检测速度与统计分析精确性。概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术 的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：

1、长通滤片：（LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通滤片（SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片（BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

（3）数据处理系统

流式细胞仪与显微镜的区别

区别

流式细胞仪

显微镜

光源

激光

自然光、灯光 对象

细胞、生物粒子

细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室

载玻片 检测信号 光学信号

形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计

计算机，>5000 人工，200 结果

多参数，综合分析 简单，单参数

二、散射光的测定

散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为: ①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

②侧向散射光（90°散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。

目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

三、荧光信号（FL）测量

当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：

①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；

②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。

通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。

常配置的激光器波长为488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

四、细胞分选原理（图示见上）

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。

1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。

2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。

3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度

（二）FCM 分选指标

分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。

分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。

分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节 数据的显示与分析

常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术

目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

一、参数

FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。

二、数据显示方式

（一）单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

（二）双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。

（三）二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

（四）三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。

（五）流式细胞仪的多参数分析---------多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术

Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节 流式细胞仪技术的要求

一、免疫检测样品制备

细胞样品制备要求：

1、单细胞悬液；

2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml；

3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；

4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；

5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：

单细胞悬液的保存： 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

机械法（金属网引起细胞破碎）

深低温保存法（一年）酶处理法（选择最适宜消化酶）

乙醇或甲醇保存法（2周）化学试剂处理法（导致细胞成活率降低）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性剂处理法 注意事项：

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存；

2、根据实验目的选择最隹的固定方法；

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。

二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL)F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。

1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：

FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。

2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质； 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等

常用的几类荧光染料

（二）免疫荧光标记

名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式

结构亲和式

颜色

嵌入结合 共价键结合 异硫氰酸荧FITC488绿 易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52

5荧光标记抗体特异性结合 得州红Texas 568红 不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法

red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗

藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体

易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记

光系数和量子产额高

别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高 合染料670

三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术

是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

四、流式细胞技术的质量控制

（一）单细胞悬液制备的质控

（二）免疫荧光染色的质控 适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）

温度 试剂选择

pH 样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）

染料浓度 实体组织来源标本用机械法

固定剂 温度25~37℃，pH7.0~7.2

（三）仪器操作的质控

光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。

（四）免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用

1、细胞表型分析

2、胞内蛋白的检测

3、细胞周期和DNA倍体分析

4、流式标准小球定量

5、分选

6、细胞内钙离子测量

第六节、流式细胞术的临床应用

1、细胞周期和DNA含量分析

2、细胞凋亡的检测和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、网织红细胞分析

7、残余白血病检测

8、淋巴细胞亚群分析

9、肿瘤耐药基因分析

10、AIDS病检测中的应用

11、自身免疫病相关HLA抗原分析

12、移植免疫中的应用

1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比；

② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比；

③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：

即G0/

1、S、G2M ；G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。

在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。DNA分析的临床意义

DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰

DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用

DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待

形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡------（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）

-------（2）晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰

第二篇：流式细胞仪在免疫学研究中的应用

流式细胞仪在免疫学研究中的应用

摘 要：随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术等的迅速发展，流式细胞仪(FCM)在免疫学、生物学、遗传学、血液学、临床检验等领域中得到了更加广泛的应用。在免疫学研究领域，FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面，尤其是与单克隆抗体技术的结合，使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用，成为现代免疫学研究不可缺少的工具。该文对近年来流式细胞仪在免疫学研究中的应用进展进行了综述。

关键词：流式细胞仪；免疫学；检测

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器[1]。FCM 可对细胞大小、细胞表面抗原的表达等进行快速、灵活、定量、多参数的检测，而且，可同时用于检测细胞内的核酸定量、DNA倍体、细胞周期分析，细胞因子和黏附分子等[2]。具有分析速度快、精确度高、重复性好和费用低廉等优点。流式细胞仪介绍

1.1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪主要由流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机分析系统和细胞分选系统5部分组成，其中，流动室是仪器的核心部件。

将待测标本制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，由气压装置送入流动室，以一定的流速经过喷嘴进入激光聚焦区，流速的选择与检测的目的有关，此时，在激光束的照射下，被荧光染色的细胞产生散射光和激发荧光，其散射光信号和荧光信号经光学系统收集，由检测系统转换成为电信号，再通过模/数转换器，转换为可被计算机识别的数字信号，各种信号经计算机采集后，用相应的应用软件进行分析处理，最后，以直方图或三维图的形式显示出来。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征参数，从而可以对细胞进行分类[3]。1.2 流式细胞仪机型介绍

近年，流式细胞仪的主要生产厂家有美国的BD(BectonDickinson)公司、贝克曼库耳(Beckman Coulter)公司和德国的Partec公司。国内使用的流式细胞仪主要由前两家生产。它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪，并研制生产了流式细胞仪所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。

流式细胞仪可分为两大类，一类为临床分析型(又称小型机、台式机)，其特点为仪器光路调节系统固定，自动化程度高，易学易掌握，适合在临床实验室中应用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的MOFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。

另一类为科研分选型(又称综合型)，特点为功能齐全，分析灵活，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于广泛的科学研究之用。如BD公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cytomation公司的MOFLOMLS等。

随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的发展，流式细胞仪的制造工艺、功能、精确度等有了质的飞跃。流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照试验要求随意更换[4]。各流式细胞仪生产厂商继续推出新产品以满足用户的不同需要。如BD公司的FACSAria(高速细胞分选仪)、分选增强型FACSVantage SETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSR II(数字化分析型流式细胞仪)，FACSCanto(双激光六色分析流式细胞仪)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomics ™FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用单激光或双激光激发方式，可进行五色分析。Partec公司的顶级科研型十三色荧光流式细胞仪CYFLOW ML，临床科研型六色荧光流式细胞仪DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流动成像细胞仪)，将流式多色检测技术和荧光显微图像显示技术结合在一个平台上，不仅可以通过荧光信号的强度，还可以通过细胞荧光图像对细胞内外信号定位，从而对细胞亚群进行定性和定量分析。流式细胞仪在免疫学中的应用近年来，随着生物医学等相关学科的发展和免疫学研究的深入，流式细胞仪在分子免疫学、免疫生物学和免疫遗传学，免疫血液学、免疫药理学、移植免疫学、肿瘤免疫学、抗感染免疫学、临床免疫学等免疫学领域的基础学科，以及淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、细胞因子检测等临床研究中，也有了越来越广泛的应用。

2.1 淋巴细胞及其亚群分析

FCM在临床淋巴细胞及其亚群分析中得到广泛应用，可同时检测出一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开，并计算出它们相互间的比例。通过淋巴细胞及其亚群数量的检测，可了解在不同情况下机体的免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病的发病机理、病程、预后，指导临床治疗方案[5]。

由于FCM可以进行高灵敏度、高速度和多参数分析，使FCM对血液淋巴细胞亚群的检测较其他方法更精确，故其被认为是血液淋巴细胞亚群分析的标准方法[6]。

2.1.1 检测项目 在临床上，淋巴细胞及其亚群分析项目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；绝对计数(TruCount)；活化淋巴细胞的检测(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4＋ Th/i和CD8＋Ts/c的进一步区分；Naive/Memory T细胞亚群的检测；Th1/Th2亚群的检测。

用流式细胞仪诊断某种疾病时，经常需要检测多个项目，如当人类感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的辅助性T细胞，即Th细胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T细胞群被破坏，继而累及全身免疫器官，使机体免疫功能下降。检测的免疫指标表现为：T淋巴细胞总数减少(正常值的65%～81%)；T细胞亚群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th细胞(CD4＋)绝对计数<200个/μL(正常值400～1 500细胞/μL)，CD8＋ T细胞在感染早期增多，后期则下降；Ts细胞增高，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则在正常范围；CD4＋/CD8＋ 明显低于健康成人(P<0.01)。

2.1.2 检测技术的发展 随着新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。近年，淋巴细胞及其亚群的分析已经发展到三色荧光以上分析，且借用MultiSET全自动获取分析软件完成。如：通过四色荧光标记，对外周血T淋巴细胞亚群可进行快速、客观、准确检测及绝对计数分析[78]。利用流式细胞仪，采用多色荧光标记的单克隆抗体，分析黏附性T 细胞表面CD3＋ CD4＋ 或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋ CD57 抗原，从而对LFA1adhesive T 细胞快速准确地测定[9]。

总之，用流式细胞仪检测淋巴细胞及其亚群的检测技术朝着多激光、多色分析方向发展。近年来，为了使样本一次检测，得到更多结果，满足临床多色分析诊断的需要，一些厂家为临床应用专门设计了六色分析流式细胞仪。

2.2 白血病免疫分型

白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病的发病机制不同，在治疗和预防上也不同，所以，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志，可以对白血病进行免疫分型，对其进行导向治疗[10]。近年，白血病的MICM(形态学、免疫学和细胞遗传学，分子生物学)分型已成为现代白血病诊断的重要指标，其中应用流式细胞仪进行免疫表型的检测在分型中发挥了越来越重要的作用，现已积累了丰富的应用经验。它具有快速、客观、准确、特异性强、重复性好等优点，对白血病进行免疫分型具有极其重要的临床诊断意义[11]。

准确的免疫分型关键是区分正常细胞与白血病细胞，传统的流式细胞仪白血病免疫分型依赖于白血病细胞的FSC/SSC特性来设定原始细胞群，然后根据门内某些阳性单抗占门内细胞的百分比来确定其抗原表达情况。很显然，这种方法是不能将原始细胞与正常细胞完全分开的。

随着免疫学和遗传学及流式细胞仪检测技术的发展，由开始的主要采用间接免疫荧光标记法到直接免疫荧光标记法，从单色或双色到利用CD45抗体标记设门法进行多色免疫标记。利用造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高度相关性，可以精确地将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群完全分开。使免疫分型的准确性得到很大的提高，现在，已成为诊断白血病免疫分型的重要工具[12]。国际上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45SSC设门法，并结合其他技术进行免疫分型。如应用流式细胞仪，采用CD45 SSC 设门法多参数，并利用抗体积分系统诊断标准，可以准确地、完整地分析白血病免疫分型[13]。采用三色流式细胞术CD45/侧散射(SSC)双参数散点图设门，并结合FAB 形态学能对急性白血病进行准确分型[14]。应用流式细胞仪四色荧光标记技术，CD45/SSC双参数散点图设门方法，能清楚地区分各种免疫细胞，可准确、客观地进行白血病免疫分型[15]。

2.3 血小板膜表面受体检测

血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期的血小板膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同。应用流式细胞仪检测血小板膜上受体，主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，结合单克隆抗体和免疫荧光技术，用不同的抗血小板单克隆抗体，可以从分子水平上诊断血小板功能和数量的异常。使用流式细胞仪测定活化血小板是目前公认的快捷而灵敏的方法之一[16]，可直接、灵敏、特异地分析血小板的活化程度和功能状态。

普遍采用的技术是以全血为标本，应用流式细胞仪进行多参数分析，即全血法流式细胞术。如采用流式细胞仪三色荧光标记技术，能准确地检测冠心病患者血小板表面糖蛋白的变化[17]。采用流式细胞仪和三色免疫荧光标记的单克隆抗体，可直接检测全血样本中血小板膜表面CD41、CD61、CD62的表达水平[18]。

与常规血小板功能测定法相比，全血法流式细胞术虽然有许多优点，如直接使用全血样本，且标本用量少；简化标本的处理，避免了样本处理不当等因素导致的血小板体外激活，并可防止血小板亚群的丢失，从而更客观、更准确地反映血小板的功能[19]。但是，全血法流式细胞术也存在不足之处，如流式细胞仪价格昂贵，为了避免血小板体外活化，血样不能久置，需在45 min内处理；只能分析循环中的血小板的数量和功能，不能反映血小板代谢和最近被清除的血小板的数量。所以，还需对该方法进行更深入的研究，并使之标准化[20]。

2.4 细胞因子的检测 细胞因子(cytokine)是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽，在调节机体多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答过程中起着十分重要的作用。检测细胞因子对于阐明机体免疫应答机制及相关疾病的发生、发展规律和临床治疗具有重要意义。

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。目前，越来越重视在单细胞水平上研究细胞因子的表达能力。应用流式细胞仪结合间接免疫荧光法，可在单细胞水平上客观、正确地检测细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群，进行多参数相关分析，是一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法[21]。

近年主要采用的是胞内流式分析法。该方法是基于BD公司的快速免疫细胞因子系统(fast Immune cytokine system)。以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)，佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)加离子霉素(ionomycin，Ion)作刺激剂，刺激全血中淋巴细胞表达细胞因子；用雷菲德菌(Brefeldin A，BFA)与莫能霉素(monensin，MN)等药物阻断细胞因子分泌至胞外，用CD3和CD8设门，应用两种免疫荧光抗体同时标记淋巴细胞膜表面特异分子和被阻滞在胞内的细胞因子，然后用流式细胞仪进行检测和分析。

该方法具有许多优点，如完善的全血激活方法，保留体内细胞及生化微环境，能更准确反映体内状况，避免了人工假象的产生。高效荧光结合抗体，确保高度灵敏及低背景染色。高质量的膜通透剂，可以保证一致的灵敏度与低背景染色，且免除了为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。同型对照，避免了使用重组细胞因子进行繁琐的竞争性封闭。

该技术虽然已成为一项可在单细胞水平上检测细胞因子的有效方法，尤其是在确定功能不同的T细胞亚群方面具有重要的作用[22]，具有其他方法难以比拟的优点。但是，也存在一定的缺陷，如现有的激活剂可导致部分至表面分子表达的下调。因此，今后还要寻找更佳的激活剂。结语

FCM以其快速、准确、灵活、大量、多参数同时分析等优点，已成为免疫学研究领域中无可替代的重要工具。科技水平的不断发展，免疫学研究的不断深入，尤其是近年来，流式细胞仪的功能不断完善、各种功能强大的分析软件的开发、多参数分析技术的发展等，为流式细胞仪检测结果准确性的提高和分析能力的扩展提供了保障，并使仪器不断向小型化，操作自动化，简单化方向发展。可以预见，在未来免疫学领域，流式细胞仪的应用范围会进一步扩大，应用深度会进一步加强。

第三篇：防火墙的技术及应用课件资料

防火墙的技术及应用

随着计算机网络和现代技术的飞速发展，人们已经生活在信息时代。计算机技术和网络技术深入到社会的各个领域，因特网把“地球村”的居民紧密地连在了一起。近年来因特网的飞速发展，给人们的生活带来了全新地感受，人类社会各种活动对信息网络地依赖程度已经越来越大。在互联网上防火墙是一种非常有效的网络安全模型，通过它可以隔离风险区域与安全区域的连接，同时不会妨碍人们对风险区域的访问。因此，防火墙的作用就是防止不希望的、未授权的通信进出被保护的网络。在互联网的众多站点中，非常多的网站都是由某种形式的防火墙加以保护，这是对黑客防范最严密，安全性较强切较有效的一种方式。这不免使的一些不法之徒恶意利用有效的网络工具进行恶意攻击。网络环境日益复杂，安全问题接受的挑战越来越大越来越多的时候，对防火墙技术需要有全面的认识。因此了解其所处的现状以及优势和缺点，未来的展望就显得格外重要。本文将详细介绍与防火墙的有关的技术。

本文简要介绍了防火墙在网络信息安全中的重要作用,描述了防火墙的原理及分类,分析了构建防火墙时对防火墙的选择与设置,说明了防火墙的主要规则设置方法。然后从实际出发，描述防火墙技术的应用现状。最后提出了面对网络安全问题以及构建安全网络环境应用防火墙所面临的挑战，其中论述了防火墙在网络安全中起的重要作用以及应用需求,最后对该技术的未来发展进行展望，以期促进防火墙技术发展，实现安全网络环境的构建。

1、防火墙简介 1.1防火墙的基本概念

防火墙是一个位于内部网络与 Internet 之间的网络安全系统，是按照一定的安全策略建立起来的硬件和(或)软件的有机组成体，以防止黑客的攻击，保护内部网络的安全运行。防火墙可以被安全在一个单独的路由器中，用来过滤不想要的信息包，也可以被安装在路由器和主机中，发挥更大的网络安全保护作用。防火墙被广泛用来让用户在一个安全屏障后接入互联网，还被用来把一家企业的公共网络服务器和企业内部网络隔开。另外，防火墙还可以被用来保护企业内部网络某一个部分的安全。例如，一个研究或者会计子网可能很容易受到来自企业内部虚拟主机网络里面的窥探。

它是一个由软件和硬件设备组合而成、在内部网和外部网之间、专用网与公共网之间的界面上构造的保护屏障。它实际上是一种隔离技术。它是一种计算机硬件和软件的结合，使Internet与Intranet之间建立起一个安全网关，从而保护内部网免受非法用户的侵入，防火墙可以是硬件类型的，所有数据都首先通过硬件芯片监测;也可以是软件类型，软件在电脑上运行并监控。其实硬件型也就是芯片里固化了的软件，但是它不占用计算机CPU处理时问，功能作用非常强大，处理速度很快，对于个人用户来说软件型，更加方便实在。1.2 防火墙的发展（1）第一代防火墙

第一代防火墙技术几乎与路由器同时出现，采用了包过滤（Packet filter）技术。（2）第二、三代防火墙

1989年，贝尔实验室的Dave Presotto和Howard Trickey推出了第二代防火墙，即电路层防火墙，同时提出了第三代防火墙——应用层防火墙（代理防火墙）的初步结构。（3）第四代防火墙

1992年，USC信息科学院的BobBraden开发出了基于动态包过滤（Dynamic packet filter）技术的第四代防火墙，后来演变为目前所说的状态监视（Stateful inspection）技术。

（4）第五代防火墙

1998年，NAI公司推出了一种自适应代理（Adaptive proxy）技术，并在其产品Gauntlet Firewall for NT中得以实现，给代理类型的防火墙赋予了全新的意义，可以称之为第五代防火墙。

1.3防火墙的基本构成

防火墙的基本构成包括：安全策略、高层认证、包过滤、应用网关。其中安全策略又分为扩展性策略、服务/访问策略、防火墙设计策略、信息策略、以及拔入与拔出策略。服务/访问策略是建立防火墙中最重要的组成部分，其余3部分在实现和执行策略中是必要的。保护网站防火墙的有效性，取决于使用防火墙的实现类型，以及使用正确的程序和服务/访问策略。

它是一项信息安全的防护系统，依照特定的规则，允许或是限制传输的数据通过。防火墙是在两个网络通讯时执行的一种访问控制尺度，它能允许你“同意”的人和数据进入你的网络，同时将你“不同意”的人和数据拒之门外，最大限度地阻止网络中的黑客来访问你的网络。换句话说，如果不通过防火墙，公司内部的人就无法访问Internet，Internet上的人也无法和公司内部的人进行通信。它是目前一种最重要的网络防护设备。从专业角度讲，防火墙是位于两个或两个以上的网络间，实施网络之间访问控制的一组组件集合。对于普通用户来说，所谓“防火墙”，指的就是一种被放置在自己的计算机与外界网络之间的防御系统，它对从网络发往计算机的所有数据都进行判断处理，并决定能否把这些数据交给计算机，一旦发现有害数据，防火墙就会拦截下来，实现对计算机的保护功能。2、使用防火墙的必要性

如果没有防火墙，粗略的下个结论，就是：整个网络的安全将倚仗该网络中所有系统的安全性的平均值。遗憾的是这并不是一个正确的结论，真实的情况比这更糟：整个网络的安全性将被网络中最脆弱的部分所严格制约。即非常有名的木桶理论也可以应用到网络安全中来。没有人可以保证网络中每个节点每个服务都永远运行在最佳状态。网络越庞大，把网络中所有主机维护至同样高的安全水平就越复杂，将会耗费大量的人力和时间。整体的安全响应速度将不可忍受，最终导致网络安全框架的崩溃。2.1为什么要使用防火墙

很多人都会有这个问题，也有人提出，如果把每个单独的系统配置好，其实也能经受住攻击。遗憾的是很多系统在缺省情况下都是脆弱的。最显著的例子就是Windows系统，我们不得不承认在Windows 2003以前的时代，Windows默认开放了太多不必要的服务和端口，共享信息没有合理配置与审核。如果管理员通过安全部署，包括删除多余的服务和组件，严格执行NTFS权限分配，控制系统映射和共享资源的访问，以及帐户的加固和审核，补丁的修补等。做好了这些，我们也可以非常自信的说，Windows足够安全。也可以抵挡住网络上肆无忌惮的攻击。但是致命的一点是，该服务器系统无法在安全性，可用性和功能上进行权衡和妥协。对于此问题我们的回答是：“防火墙只专注做一件事，在已授权和未授权通信之间做出决断。” 2.2设置防火墙的目的

设置防火墙的目的是防火墙是在网络之间执行控制策略的系统，它包括硬件和软件，目的是保护内部网络资源不被外部非授权用户使用、防止内部网络受到外部非法用户的攻击。防火墙的主要功能检查所有从外部网络进入内部网络的数据包；检查所有从内部网络流出到外部网络的数据包；执行安全策略，限值所有不符合安全策略要求的数据包通过具有防攻击能力，以保证自身的安全性。它是一种过滤器，按照防火墙事先设计的规则对内网和外网之间的通信数据包进行筛选和过滤，只允许授权的的数据通过不符合童心规则的数据包将被丢弃，以此来限制网络内部和外部的相互访问，达到保护内网的目的。

防火墙成为了与不可信任网络进行联络的唯一纽带，我们通过部署防火墙，就可以通过关注防火墙的安全来保护其内部的网络安全。并且所有的通信流量都通过防火墙进行审记和保存，对于网络安全犯罪的调查取证提供了依据。总之，防火墙减轻了网络和系统被用于非法和恶意目的的风险。简单来说，通常应用防火墙的目的有以下几方面：限制他人进入内部网络、过滤掉不安全的服务和非法用户、防止入侵者接近你的防御设施、限定人们访问特殊站点、为监视局域网安全提供方便。

3、防火墙的主要类型 3.1 包过滤防火墙

数据包过滤是指在网络层对数据包进行分析、选择和过滤。选择的数据是系统内设置的访问控制表，又叫规则表，规则表制定允许哪些类型的数据包可以流入或流出内部网络。通过检查数据流中每一个IP数据包的源地址、目的地址、所用端口号、协议状态等因素或它们的组合来确定是否允许该数据包通过。包过滤防火墙一般可以直接集成在路由器上，在进行路由选择的同时完成数据包的选择与过滤，也可以由一台单独的计算机来完成数据包的过滤。

数据包过滤防火墙的优点是速度快、逻辑简单、成本低、易于安装和使用，网络性能和通明度好，广泛地用于Cisco和Sonic System等公司的路由器上。缺点是配置困难，容易出现漏洞，而且为特定服务开放的端口存在着潜在的危险。

例如：“天网个人防火墙”就属于包过滤类型防火墙，根据系统预先设定的过滤规则以及用户自己设置的过滤规则来对网络数据的流动情况进行分析、监控和管理，有效地提高了计算机的抗攻击能力。3.2 应用代理防火墙

应用代理防火墙能够将所有跨越防火墙的网络通信链路分为两段，使得网络内部的客户不直接与外部的服务器通信。防火墙内外计算机系统间应用层的连接由两个代理服务器之间的连接来实现。有点是外部计算机的网络链路只能到达代理服务器，从而起到隔离防火墙内外计算机系统的作用；缺点是执行速度慢，操作系统容易遭到攻击。

代理服务在实际应用中比较普遍，如学校校园网的代理服务器一端接入Internet,另一端介入内部网，在代理服务器上安装一个实现代理服务的软件，如WinGate Pro、Microsoft Proxy Server等，就能起到防火墙的作用。3.3 状态检测防火墙

状态检测防火墙又叫动态包过滤防火墙。状态检测防火墙在网络层由一个检查引擎截获数据包并抽取出与应用状态有关的信息。一次作为数据来决定该数据包是接受还是拒绝。检查引擎维护一个动态的状态信息表并对后续的数据包进行检查，一旦发现任何连接的参数有意外变化，该连接就被终止。状态检测防火墙克服了包过滤防火墙和应用代理防火墙的局限性，能够根据协议、端口及IP数据包的源地址、目的地址的具体情况来决定数据包是否可以通过。

在实际使用中，一般综合采用以上几种技术，使防火墙产品能够满足对安全性、高效性、适应性和易管性的要求，再集成防毒软件的功能来提高系统的防毒能力和抗攻击能力，例如，瑞星企业级防火墙RFW-100就是一个功能强大、安全性高的混合型防火墙，它集网络层状态包过滤、应用层专用代理、敏感信息的加密传输和详尽灵活的日志审计等都肿安全技术于一身，可根据用户的不同需求，提供强大的访问控制、信息过滤、代理服务和流量统计等功能。

4、各防火墙体系结构的优缺点 4.1双重宿主主机体系结构

提供来自于多个网络相连的主机的服务（但是路由关闭），它围绕双重宿主主计算机构筑。该计算机至少有两个网络接口，位于因特网与内部网之间，并被连接到因特网和内部网。两个网络都可以与双重宿主主机通信，但相互之间不行，它们之间的IP通信被完全禁止。双重宿主主机仅能通过代理或用户直接登录到双重宿主主机来提供服务。4.2被屏蔽主机体系结构

使用1个单独的路由器提供来自仅仅与内部网络相连的主机的服务。屏蔽路由器位于因特网与内部网之间，提供数据包过滤功能。堡垒主机是1个高度安全的计算机系统，通常因为它暴露于因特网之下，作为联结内部网络用户的桥梁，易受到侵袭损害。这里它位于内部网上，数据包过滤规则设置它为因特网上唯一能连接到内部网络上的主机系统。它也可以开放一些连接（由站点安全策略决定）到外部世界。在屏蔽路由器中，数据包过滤配置可以按下列之一执行：①允许其他内部主机，为了某些服务而开放到因特网上的主机连接（允许那些经由数据包过滤的服务）。②不允许来自内部主机的所有连接（强迫这些主机经由堡垒主机使用代理服务）。这种体系结构通过数据包过滤来提供安全，而保卫路由器比保卫主机较易实现，因为它提供了非常有限的服务组，所以这种体系结构提供了比双重宿主主机体系结构更好的安全性和可用性。弊端是，若是侵袭者设法入侵堡垒主机，则在堡垒主机与其他内部主机之间无任何保护网络安全的东西存在；路由器同样可能出现单点失效，若被损害，则整个网络对侵袭者开放。4.3被屏蔽子网体系结构

考虑到堡垒主机是内部网上最易被侵袭的机器（因为它可被因特网上用户访问），我们添加额外的安全层到被屏蔽主机体系结构中，将堡垒主机放在额外的安全层，构成了这种体系结构。这种在被保护的网络和外部网之间增加的网络，为系统提供了安全的附加层，称之为周边网。这种体系结构有两个屏蔽路由器，每一个都连接到周边网。1个位于周边网与内部网之间，称为内部路由器，另一个位于周边网与外部网之间，称之为外部路由器。堡垒主机位于周边网上。侵袭者若想侵袭内部网络，必须通过两个路由器，即使他侵入了堡垒主机，仍无法进入内部网。因此这种结构没有损害内部网络的单一易受侵袭点。

5、防火墙的未来发展趋势

尽管罗列了这么多防火墙技术的局限性，但防火墙在网络安全中所扮演的重要角色是不可撼动的。未来的防火墙发展朝高速、多功能化、更安全的方向发展。

实现高速防火墙，可以应用ASIC硬件加速技术、FPGA和网络处理器等方法。其中以采用网络处理器最好，因为网络处理器采用微码编程，可以根据需要随时升级，甚至可以支持IPv6；并且网络处理器中集成了很多硬件协处理单元，通过算法也比较容易实现高速。防火墙将会集成更多的网络安全功能，入侵检测、防病毒、防御拒绝服务攻击等安全技术都可以模块形式安装到防火墙的机箱内。既节省宝贵的机柜空间，又能为企业节约一部分安全支出，更主要的是可以实现网络安全设备之间的联动。防火墙将会更加的行业化。

任何一种防火墙只是为内部网络提供安全保障，但网络安全不能完全依赖于防火墙，还需要加强内部的安全管理，完善安全管理制度，提高用户的安全意识，从而形成全方位的安全防御体系。

第四篇：数控车工技术应用分析

数控车工技术应用分析

【摘要】本文对数控车工技术的关健技术，应用优势和不足进行了阐述，并探究了数控车工技术在数控机床中的具体应用，对于推动数控车工技术的发展，对于实现其有效应用具有积极的意义。

【关键词】数控车工技术；关键技术；优势不足；数控机床

在现代工业生产中，数控车工技术是不可或缺的关键技术手段之一，数控车工技术集自动化、数字化、柔性化合和敏捷化为一体，应用优势明显，采用这种技术能够保障生产加工产品零件有效实现，即使是复杂的零件也能够实现有效的加工处理。

一、数控车工技术概述

数控车工技术指的是借助于数字化控制系统在数控机床上完成零件整体加工的技术手段，数控车工技术能够有效地完善大量加工难度较大的零件加工，能够保障零件加工的精确度和准确性。数控车工技术主要分为数控机床加工工艺和数控编程技术两种类型。

二、数控车工的关键技术

数控车工的关键技术包括三种，第一，自适应控制技术，这种技术能够实现自动化设备检测，能够根据设备情况自动调整相关系统参数，从而有效改善数控系统的运行状态。第二，专家技术。这种技术是采用数字化手段将专家经验与车床切削加工的一般规律和特殊情况输入到相关数据系统中，构建完善的加工工艺参数系统，智能化专家系统，为数控系统开展工作提供相关参数。专家技术能够有效提升数控机械设备的编程效率和质量，能够有效提升加工工作效率。第三，故障自诊断技术。这种技术能够为数控机械设备的维修工作提供相关信息指导。故障自诊断技术主要包括维护决策信息集成系统和智能诊断系统，这种技术能够实现对相关设备进行故障检测，故障诊断，安全保障等多种应用。

三、数控车工的技术应用优势及不足

数控车工技术应用优势是明显的，第一，这种技术用的效率很高。借助于数控车工技术开展工作，能够实现数字化的加工控制，能够有效提升零件互换的速度，并能够实现对复杂曲面零件的快速加工处理，能够显著提升加工工作的效率和质量。第二，这种技术应用的劳动强度小。借助于数控车工技术开展零件加工工作，在整个过程中都是通过数控自动系统开展工作的。这项工作的自动化控制水平高，作为操作人员不需要做强度大的工作，只需要密切监视数控设备的运行状况，适时做好相关参数的调整，就能有效完成加工任务，工作强度小是数控车工技术的重要应用优势。第三，这种技术应用的适应能力强。数控车工技术主要是通过数控加工系统进行操作，完成加工任务的。在整个过程中，数控加工系统都能实现自动化操作，并能能够根据需要调整系统的部分参数，从而有效改善机械设备的运行状态，这种技术应用的适应能力是非常强的。第四，这种技术应用的准确度很高。数控车工技术通过数控系统开展工作，能够根据需要优化传动设备装置，这样，可以有效减少加工过程中的人为误差问题，能够有效提升系统设备加工工作的准确度。

数控车工技术有诸多应用优势，这种技术能够有效提升加工工作的任务量，能够有效提升生产加工工作的质量和效率。但借助于这种手段进行零件加工，企业在购置设备中，需要拖人大量的资金，这对于一些小型企业而言是难以承受的。另外，借助于数控车工技术加工形状较为复杂的零件时，需要做大量的手工编程工作，这项工作对操作人员及维修人员的编程能力水平要求很高。但目前，相关高素养的技术人员较为缺乏，这就制约了数控车工技术的有效应用。

四、数控车工技术在数控机床中的应用

（一）数控机床

数控机床是建立在数控系统的基础上的，是以数控车工技术应用为本的，发展到今天，其数控系统控制功能已经相当强大。数控机床已经可以借助于数控系统开展多种工作，能够实现多种功能，其中主要功能是切削和特种加工。数控机床在发展中，能够实现与多种现代化技术的的不断融合，其功能正在不断拓展，目前，已经能够满足多样化，复杂化加工工作的需要，并能够实现对相关零件短周期，高精度的生产加工。

（二）数控机床的选择

在加工工作中，进行数控机床的优化选择是提升加工工作质量和效率的保障。在选择数控机床的时候，企业要能够基于加工工作的需要选择简易型、超精密性的数控机床，有条件的企业也可以选择全功能型的机床。企业要能够根据加工工作的精度要求进行机床的合理化选择。一般而言，简易型的数控机床能够满足简单车工和铣工的操作要求，简易型机床的分别率能够达到0.01mm，而超精密型机床的分别率更高，能够满足更为精密加工工作的需要。在具体的选择中，企业要根据自己工作的需要进行数控机床的合理购置。

（三）数控机床的结构

数控机床是有程序介质、数控系统、伺服驱动、机床主体四部分组织的。程序介质在运行过程中，首先会接收到工作指令，然后根据指令记录加工要求，并能够将相关要求信息自动传送到数控装置信息系统中，根据相关指令要求开展加工控制。数控系统是机床的核心组织，数控系统接收到由程序介质传到的相关指令要求后，会通过相关软件对相关信息进行进一步处理，然后把相关信息发送出去。伺服驱动，这个系统主要是接受数控系统的相关信息，然后根据相关信息进行系统驱动，设置相应的加工速度和加工方向。机床主体主要是机床的构造，机床是有滚珠丝杠构成的，这种构造结构简单，性能良好，能够满足不同加工工作的需要。

总之，数控车工技术的技术含量高，在工业生产中发挥着重要的价值，数控车工技术目前在我国制作业中已经得到了广泛的应用，这种应用有效的提升力我国制作业的生产效率和水平，提升了行业竞争力。我国要大力发展数控车工技术，作为政府要加大技术研发和创新的支持力度，以不断提升我国制作业的技术水平。作为相关企业，也要能够认识到数控车工技术应用的重要作用，要能够积极借助于这种技术实现生产创新，工作创新，能够借助于数控车工技术不断推动企业向更高端发展。目前，数控车工技术在应用发展中还存一些不足和问题，我们要重视这些问题，能够加大人力物力方面的投入，积极进行技术创新，真正推动数控车工技术向高速、高精、高效化化方向发展，以有效的技术创新，促进我国经济的快速发展。

参考文献：

[1]于娟.数控车工技术的应用实践探析[J].企业技术开发，2016（17）

[2]杨永利.分析数控车工技术的应用实践探析[J].黑龙江科技信息，2015（33）

第五篇：教育技术课件

太原师范学院《现代教育技术》课程

信息技术环境下新型学与教

太原师范学院外语系0905班成职萍2009051508 摘要：随着我国新课程改革进行的不断深入和信息技术的飞速发展，对信息技术环境下新型学与教方式的研究越来越受到教育工作者的重视。特别是近年来，国家不断加大对教育信息化的投入，农村远程教育工程的实施极大地改善了欠发达地区和贫困地区的信息化教学环境。在这样的背景下，教育信息化的研究与应用应该发生以下几方面的转变：从基础设施和资源建设向信息技术的课堂教学应用的转变；从应用信息技术辅助教学向使用信息技术支持学生学习的转变；从局部的教育信息化向整体的教育信息化的转变；从关注一般应用模式向考察具体学科教学模式和策略的转变。这些转变给广大教育工作者提出了新的研究课题。

中国教育学会中小学信息技术教育专业委员会“十一五”规划课题的推出，无疑为我们做好这一工作提供了更加广阔的空间。信息技术环境下新型学与教方式的应用与实践研究将会从根本上改变我市的信息技术环境下的课堂教学，为我国的基础教育改革注入更新鲜的活力。

关键词：现代教育技术 新型环境 国家教育 信息化 1．国家级现代教育技术实验校充分发挥示范作用

“九五”期间，中共中央国务院召开了第三次全国教育工作会议，做出了深化教育改革、全面推进素质教育的决定，对如何应用教育技术培养创新人才，形成了广泛的共识。教育技术系统广泛开展了“应用教育技术，促进素质教育”的科研活动，取得了较为丰硕的成果。同时，教育部启动了全国现代教育技术实验学校工程，批准了962所中小学校为全国现代教育技术实验学校。这些学校现在已经是我国教育技术发展的示范性学校，在开设信息技术必修课和实现“校校通”方面具有领先优势，完全具备了应用现代教育技术研究探索学与教的方法，培养创新人才、推进素质教育的环境和条件。按照国家对现代教育技术实验校的要求，“九五”期间，我国的国家级教育技术实验校参与了全国教育科学规划教育部重点课题《中国基础教育现代化工程实施策略研究》。“九五”课题的开展，推动了国家级教育技术实验校的建设，取得了丰硕的成果，奠定了开展课题研究的基础。

2．现代远程教育基础设施建设工作基本完成

我国实施了农村中小学现代远程教育工程以来，为全国所有所农村中小学配备了农村远程教育三种模式的设备，实现了卫星收视教学、下载资源教学、网络环境下的自主学习等系统到校。现代远程教育工程的实施为扩大教育规模，改革教育教学方法，构建终身教育与学习体系奠定了坚实的基础。现代远程教育属于教育技术的研究范畴，也充分体现了信息技术在教育领域的高级应用形式。“十五”期间，我国探索研究了现代远程教育对农村教育、优秀教育资源对中小学学与教过程的影响。

太原师范学院《现代教育技术》课程

3．国家教育城域网初步建成

“十五”期间，我国初步建成了教育城域网。到2006年末，光沈阳全市铺设光纤2000公里，接入学校和教育单位605所，今年年底，农村中心校以上单位将全部接入教育网。同时，我国充分重视教育资源建设，教育网成为了教育系统的门户网站，目前已拥有教育教学资源3000G。独立的教育网络与农村远程教育平台相呼应，实现了天网与地网的协调与统一，为我国信息技术环境下新型学与教方式的应用与研究奠定了良好的软硬件基础。但是，从目前开展的对教学模式的探索上看，我国对基于信息技术环境的“学与教”的研究还处于初级阶段，还有很多问题需要去研究和探索。特别是如何有效利用农村远程教育资源，使学习者学会利用网络资源进行学习、学会在虚拟情境下进行探究学习、学会利用通讯工具进行协商学习、学会利用数字化工具进行创造学习等等。因此，开展现代信息技术环境下“学与教”的理论与实践研究有着十分重要的意义。

基于以上原因，我国有待于深入开展信息技术环境下新型学与教方式的应用与实践研究，为我国的基础教育的改革与发展做出新的贡献。

同时，我国有着明确的研究目标。

1．通过本课题的研究与实践，探索信息化时代如何改革传统教育思想和模式，总结利用网络和资源进行学习的方法和经验；促进城市发达地区新型学与教方式的应用；促进农村欠发达地区或贫困地区新型学与教方式的应用；促进新型学与教方式在学科教学中的运用；

2．通过本课题的研究与实践，促进基于农村现代远程教育三种模式应用的资源研制与开发，建设新一代网络教育教学资源；

3．通过本课题的研究与实践，研究并探索现代远程教育为欠发达地区及贫困地区的学校提供学与教服务的途径与方法；研究新型教学和学与教方式的应用条件和推广机制，提出政策建议。

研究内容也是该研究中不可或缺的重要部分。

（一）本课题设计的指导思想

在辩证唯物主义思想指导下，应用现代教育教学理论，应用现代教育技术研究学与教过程优化的理论与实践，实现素质教育的人才培养目标。实现发达地区、欠发达地区及贫困地区新型学与教方式的相互促进与融合，全面推进我市基础教育的均衡发展。

（二）本课题研究的主要内容

1．新型学与教方式应用条件和适应性的研究：通过实践和行动研究，总结新型学与教方式的应用条件，针对不同地区不同层次的中小学校，研究新型学与教方式的适应性，总结其推广方式和策略。

2．新型学与教方式在学科教学中运用的研究：利用课题研究成果，在实验学校学科教学中开展行动研究，探讨不同学科的不同应用方法和策略，形成有推广意义的实践模式。

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（三）本课题下的专项研究子课题方向

A．网络环境下的新型学与教方式的应用与实践研究

B.卫星收视播放环境下的新型学与教方式的应用与实践研究 C．光盘播放环境下的新型学与教方式的应用与实践研究 D．非网络多媒体环境下的新型学与教方式的应用与实践研究 E．信息技术环境下新型学与教方式在语文教学中运用的研究 F．信息技术环境下新型学与教方式在数学教学中运用的研究 G．信息技术环境下新型学与教方式在英语教学中运用的研究

H．信息技术环境下新型学与教方式对普通学校教育教学过程的影响的研究 I．网络环境下教学资源的开发与应用研究

J.其它（各实验校可在以上研究方向中选择申报，也可根据本校实际情况自行选择研究方向申报）

本课题按照总课题研究方案的要求，在总课题组的指导下进行。本子课题的研究主要以实验法和行动研究法为主。

实验法要求各实验校要有明确的实验目的，要进行实验设计（要有实验研究假设），要对实验过程进行控制，要收集有关信息和数据，要对实验资料进行统计分析，总结提炼、形成实验结果、验证假设。

行动研究法要求各实验校要注意五个环节（指：计划、行动、考察、反馈与调整）和螺旋式上升的规律。

各实验校在课题研究中采用何种研究方法，以何方法为主、以何方法为辅，要结合学校实际和所选课题的具体情况而定。

课题创新之处是改研究的核心与关键

教育信息化已经从注重硬件环境建设，转向注重教学资源开发及教学应用。我国应抓住教育网初步建成的有利契机，积极探索信息技术环境下学与教方式的变革。“十五”期间，我国针对城市中小学进行了信息技术和学科教学整合的初步探索。本课题拟在“十五”期间课题研究的基础上，进行如下突破：结合我国开展农村中小学现代远程教育的契机，深入农村中小学教育教学第一线，充分利用农远的设备及资源，设计、实践和总结三种信息技术环境下学与教方式变革的方法和经验，构建和提出新型学与教方式的有效模式和应用策略。从而形成符合我国不同地区中小学生实际的、可以被实践检验，并能被学校直接应用和借鉴的基于信息技术环境下的新型学与教的模式与方法。进一步推动我市的教育教学模式改革由城市向农村拓展。

我国对实验学校有严格的要求

参加本课题研究的学校应具备以下条件：

1．全国现代教育技术实验学校和部分具备了参加本课题研究条件、学校科研氛围浓厚并且在“十五”教育技术研究中取得突出成绩的学校；

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2．我国的农村现代远程教育项目校和部分郊县的具备参加本课题研究条件、学校科研氛围浓厚的学校。

2．成立实验学校子课题组

实验学校子课题组属于三级课题组。

参加本课题研究的实验学校可以申请并承担子课题，子课题负责人一般由实验学校校长担任。

子课题的申报必须依据本课题的研究方向和研究内容，必须与学校的实际和需要相结合。

3．课题申报程序

实验学校按照本研究方案，结合学校实际，提出课题申请，报送到区里； 市级课题组根据各区情况，提出具体审批意见，并将审批结果报总课题组审定； 参加子课题研究的实验学校必须经总课题组和市级课题组根据需要和条件选择审定。

本课题之子课题研究所需经费，主要由各子课题组及实验学校自筹解决； 市级课题组负责解决重点培训、研讨、交流及重要的科研成果的总结与推广活动所需经费；

各级课题组负责自行解决参加国家总课题组的学习培训及成果交流所需要的经费。预期成果的研究：

1．树立在信息技术环境下新型学与教研究中有突出贡献的学校典型，提供示范、交流服务；

2．出版、发表关于信息技术环境下新型学与教方式的科研论文； 3．总结、推广成功应用信息技术环境下新型学与教方式的教学案例； 4．研制、开发适合农村远程教育三种模式的教学资源； 5．研制、开发适合网络环境下的教学资源；

6．为总课题组提供有关的研究成果、经验材料、实验数据等，为“信息技术环境下新型学与教方式的应用与实践研究”做出贡献。

参考文献：[1]何克抗，信息技术与课程深层次整合的理论与方法 [J].中国大学教学，2005(5).[2]朱长华.关于探究性实验教学的探究 [J].安徽教育学院学报，2003(11).4