生化实验心得

第一篇：生化实验心得

生化实验心得

刘欣怡

201100140057 2011级生物基地班

我很喜欢做实验，并且乐于锻炼自己的动手能力。

本学期的生化实验，虽然只从第二周上到第十五周，但是我收获了很多并且留下了深刻的印象。对于本次实验心得的撰写，我将分为以下3个部分来进行：本学期实验回顾、本学期实验总结以及对于生化实验课的支持和建议。

一、本学期实验回顾：

本学期的生化实验课上，我们一共进行了11次实验，分别是Folin-酚试剂法测定血清蛋白质含量、酵母RNA的提取、醋酸纤维薄膜电泳、紫外吸收法测定RNA含量、聚酰胺薄膜层析、纤维素酶活力的测定（三硝基水杨酸法）、还原糖和总糖含量的测定（三硝基水杨酸法）、酶最适PH的测定、费林试剂热滴定糖、肌糖原酵解作用、微量凯氏定氮法。这些实验具有代表性，是典型的生化实验。在这些实验中，涵盖了以前无机实验和有机实验的基础实验操作，还有全新的实验操作以及实验仪器。

在这学期的生化实验课上，我既复习并熟练了大一无机实验和有机实验的基本实验操作和仪器（比如移液管、滴定管、蒸馏等），又学习并掌握了许多新操作以及新仪器的使用，比如紫外分光光度计、离心机、聚酰胺薄膜、热滴定、凯氏定氮仪器等。最重要的是，我学习并掌握了一些重要的实验方法和原理，比如Folin-酚试剂法、紫外吸收法、三硝基水杨酸法、费林试剂与糖的反应、微量凯氏定氮法等。掌握了这些实验原理以及方法，有利于我们在以后中灵活运用设计实验。

总体来说，本学期生化实验教会了我测定蛋白质、糖、核酸的方法，电泳和层析分离物质、如何测定酶的相关特性、验证肌糖原酵解作用、如何提取RNA。

二、本学期实验总结

通过这学期的生化实验，我的实验技能的到了大大地提升，同时，实验中的细节、注意事项以及老师拓展的知识令我获益匪浅，也让我深深地认识到科学是非常严谨的，尤其是在做实验的时候，要全神贯注，井井有条，否则很容易出差错，而这个小小的差错很有可能就使实验前功尽弃，既耽误时间又浪费试剂。

回顾这一学期我的实验课程，每一次我都能完成实验任务。大多数都比较顺利，小组内两人也大多配合默契，但是有一些美中不足的地方。有的一些实验比较麻烦，实验步骤较为繁琐，我们在做实验时偶尔会产生不耐烦的思想，只想着抓紧结束，但是在这种时候往往更容易出差错。我有两次记忆很深，一次是在测定纤维素酶活力（三硝基水杨酸法）时，没能及时贴上空白标签，导致又重新制作空白，拜拜浪费了时间；另一次是在鉴定肌糖原酵解作用时，实验步骤较为繁琐，并且老师对黑板上的简易实验步骤进行了多个补充，其中一点是要在水浴后取出大块肉再加下一步骤的试剂，结果我们当时产生了不耐烦情绪，就直接加了试剂而没有取出大肉块。对于这两次情况，虽然对最终的实验结果没有产生什么明显的影响，但是，它实实在在体现了自己的操作并不是很严谨，需要注意和努力。

在本学期生化实验报告的撰写中，我重点注意老师强调的实验分析部分。上课认真听老师的实验讲解并认真记录有关的可能实验结果的分析。在课后撰写实验报告时对这些点重点分析和总结，有时甚至是查找相关资料然后再进行分析。通过这一些列的做法，我的实验分析能力得到了提升，我能在讨论实验结果或者实验操作时找到更好、更精确的切入点，能得出更好的结论。

同时，本学期老师将我们分为两人一组来进行实验，两人之间的磨合和合作是一种锻炼，对今后很有帮助。

三、对于生化实验课的支持和建议

我非常感谢老师在这一学期中的辛勤劳动。老师在课前为我们做好实验准备很不容易，配试剂等都很辛苦。谢谢老师您了。

我觉得咱们的额生化实验课设计的挺好的。两人一组可以分工合作，加快实验效率，同时又避免了因为同组同学人数多而有的同学无事可做的现象。老师在课上讲解实验时，有关实验步骤、实验可能结果、实验注意事项的分析、讲解和拓展令我获益匪浅，有利于培养我的实验思维并且拓宽了知识视野。

建议方面，我想和老师提的一点建议其实是有关实验器材方面的。对于老师所提到的有关节约试剂、减少材料浪费等事项我非常赞同，并且大多数时候器材和试剂都很全（这和大一的无机实验和有机实验相比条件进步了很多），只是希望咱们的一些其他实验仪器能更全面一点，举一个例子，可以使用的紫外分光光度计只有3台，有些过少，实验中要等待的时间较长，并且有的仪器还不是很准确，对于我们的实验造成了一定的困扰，希望老师能将实验室内有些问题的仪器同一修一修。

总之，我很喜欢咱们的生化实验课，并且从中学到了很多知识、实验方法和应用，锻炼了实验操作，形成了实验要耐心、细心、恒心的观念。同时还培养了团队意识和合作观念。我获益匪浅。

第二篇：生化实验

1．火

（1）酒精及其它可溶于水的液体着火时，可用水灭火

（2）汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时，应用石棉布或砂土扑灭，绝对不能用水，否则反而会扩大燃烧面积。

（3）电起火，不能用水和二氧化碳灭火器，应切断电源或用四氯化碳灭火器。2．烧伤

（1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。（2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。

氨基酸的分离鉴定纸层析法

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：

在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。

在操作过程中，手不要摸滤纸。点样直径不超过3mm。

点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。

即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。

蛋白质及氨基酸的呈色反应 双缩脲反应

紫红色

肽键 可用于蛋白质的定性或定量测定 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。茚三酮反应

除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。

与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。黄色反应

含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。

坂口反应

与精氨酸反应呈红色，精氨酸是唯一呈此反应的氨基酸，反应极为灵敏 醋酸铅反应

蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱条件下，可分解形成硫化钠。硫化钠和醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。若加入浓盐酸，就生成有臭味的硫化氢气体。

蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱条件下，可分解形成硫化钠。硫化钠和醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。若加入浓盐酸，就生成有臭味的硫化氢气体。

蛋白质的等电点测定和沉淀反应

当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液pH值称为此种蛋白质的等电点。

用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向缓冲液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点 蛋白质的沉淀反应

在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。

（1）可逆的沉淀的反应

此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。

（2）不可逆沉淀反应

此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。

蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度

考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。吸光度与蛋白质含量成正比。灵敏度高，测定快速简便，干扰物质少。

微量凯氏定氮法

有机物与浓硫酸共热，有机氮转变为无机氮（氨），氨与硫酸作用生成硫酸氨，后者与强碱作用释放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液被中和的程度，即可计算出样品的含氮量。

中和程度用滴定法来判断，分回滴法和直接法两种。

（1）回滴法：用过量的标准酸吸收氨，其剩余的酸可用标准NaOH滴定，由盐酸量减去滴定所耗NaOH的量即为被吸收的氨之量。此法采用甲基红做指示剂。

（2）直接法：用硼酸作为氨的吸收溶液，结果使溶液中[H+]降低，混合指示剂（PH4.3－5.4），黑紫色变为绿色。再用标准酸来滴定，使硼酸恢复到原来的氢离子浓度为止，指示剂出来淡紫色为终点，此时所耗的盐酸量即为氨的量。

样液：1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl液，并稀释至100ml。如有不溶物，离心取上清液备用。

醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质

本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。

方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。

由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。

电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。

经洗脱比色观察不同蛋白质的区带。

1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。

2、缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。

3、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。

4、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。

酶的特性

温度对酶活力的影响

大多数动物酶的最适温度为37－40℃，植物酶的最适温度为50－60℃。高温失活，低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH对酶活性的影响

唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。唾液淀粉酶的活化和抑制

酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。

血糖的定量测定

动物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量较恒定。用硫酸锌和氢氧化钠除去被检测血中的蛋白质制成无蛋白血滤液。当将血滤液与标准铁氰化钾溶液共热时,一部分铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，并与锌离子生成不溶性化合物。

向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸钠溶液滴定所释放的碘。即可知剩余的铁氰化钾量。血糖越多，剩余的铁氰化钾越少，所消耗的硫代硫酸钠也越少。硫代硫酸钠溶液用量与血糖的关系可以由经验确定下来的数字表查出。对照组要多一些，且要先查表再相减

脂肪酸的β－氧化

样品中丙酮的含量=(V1-V2)x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴定对照所消耗的Na2S2O3 的体积 V2—滴定样品所消耗的Na2S2O3 的体积 C—Na2S2O3 的浓度

维生素C的定量测定

2，6-二氯酚靛酚滴定法

用蓝色的碱性染料标准溶液,对含维生素 C的酸性浸出液进行氧化还原滴定,染料被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色,如无其他干扰物质存在，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原性抗坏血酸量成正比。

过氧化物酶的作用 过氧化物酶能催化过氧化氢释出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质，例如氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙（橙红色）；氧化愈创木脂中的愈创木酸成为蓝色的愈创木酸的臭氧化物。

目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：

物理性质：紫外分光光度法。

化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：荧光法。

一、凯氏定氮法： 根据蛋白质的含氮量来测定蛋白质的含量

公式:每g样品中含氮克数 × 6.25 ×100

二、比色法：利用蛋白质与不同试剂的呈色反应，测定蛋白质的含量，如双缩尿法和酚试剂法（lowry’s method）。

三、紫外分光光度法：利用蛋白质对280nm紫外光有最大的吸光度而采用

第三篇：生化实验计划

2016-2017学年第一学期生物化学教研室实验室工作计划

一、指导思想

坚持以邓小平理论和“三个代表”的重要思想及科学发展观为指导，践行社会主义核心价值观,开展教育教学改革，全力推进以高等卫生职业教育为核心的素质教育，抓好教育教学管理工作。

二、工作计划

（一）实验室日常管理计划

1、牢固树立“教学中心”意识，对实验室的仪器耗材进行精确登记备案，以便为《生物化学》实验做好后勤服务。

2、严格执行仪器使用人使用仪器必须登记的规章制度。

3、严格执行及时更新实验耗材的规章制度。

4、严格执行实验安全条例，做好实验室安全意识宣讲，做到实验室安全零事故。

5、严格执行实验室值日制度。

6、严格执行实验室卫生制度，保持实验室卫生整洁，给学生提供一个良好的实验环境。

7、严格执行学院规定及时批改实验报告。

8、切实做好实验课的示教工作。

（二）实验室师资队伍建设

1、开展政治学习和业务学习，特别是学习社会主义核心价值体系和人才培养水平评估标准，提高教师的政治品德和业务素养，组织教师开展高等卫生职业教育理念讨论，切实转变教学理念，改变教学方式，提高教学水平。

2、加强实验指导教师的管理和培养，提高实验实训的准备能力和指导水平。

3、加强实验指导教师的安全责任意识。

生物化学教研室 2016年9月

第四篇：生化实验总结

一、实验技术

1.关于糖：本学期我们学习了两种总糖样品处理方法（面粉总糖酸水解以及肌糖原无氧酵解）以及两种测定还原糖含量的方法（斐林试剂热滴定及3，5-二硝基水杨酸法）。还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。利用糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。

一种是费林试剂热滴定定糖法：在沸热条件下,用还原糖溶液滴定一定量的费林试剂时, 将费林试剂中的铜离子还原为氧化亚铜, 以亚甲基蓝为指示剂, 稍过量的还原糖立即将蓝色的氧化型亚甲基蓝还原为无色的还原型亚甲基蓝, 指示滴定终点。

另一个是3，5-二硝基水杨酸法测定还原糖：还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。

关于肌糖元酵解

2.关于蛋白质含量测定：本学期我们学习了醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白、氨基酸聚酰胺薄膜层析，以及利用溶解度差异提取血清中不同蛋白，并通过 BCA法、Folin酚法、凯氏定氮法测定蛋白质含量

3.关于酶活性学习了纤维素酶活力测定以及酶最适PH测定 4.关于稀碱法酵母核糖核酸提取以及紫外吸收法测定浓度

二、关于感悟 经过半年的生化实验的学习让我受益菲浅。在生化实验课即将结束之时，总结这学期的收获与不足。取之长、补之短，在今后的学习和工作中有所受用。

三、这半年的生化实验主要有菲林试剂热滴定定糖法、folin-酚法测蛋白、稀碱法提取酵母RNA、醋酸纤维薄膜电泳、RNA定量测定-UV吸收法、纤维素酶活力的测定、最适PH选取、肌糖元的酵解作用、N-末端氨基酸残基的测定--DNS-CL法柱层析分离色素、凯式定氮法等实验。

在这些实验中，凯式定氮法是给我印象最深的一个实验，因为这个实验使我认识了改良式凯式蒸馏仪的基本结构，同样的也让我透过这次实验掌握了凯式定氮法的操作技术。在这次实验中，我和我的同组者-韩文志犯了一些错误，而且是很不就应犯的错误，我们都忘了在做实验时要加入新的沸石，这是个很低级的错误，差点引起溶液的暴沸。透过这次错误我认识到，很多知识，即使是老师在怎样说，它也只是理论，当我们不能把它应用到实践中去时，它对我们都是毫无好处的。此刻更深的认识到了理论结合实际的观点。在这次实验中我们损坏了改良式凯式蒸馏仪，并且赔了钱，钱不是问题，重要的是操作的问题，我觉得我们在做实验时还是对仪器不是很熟悉，做实验时不认真。

还有一个是柱层析分离色素，这个实验主要是掌握吸附层析的原理和操作技术，我记得这次实验我是第二个到的实验室，当时还很有成就感，进来后就称菠菜，还有研磨，这是很累人的活，我觉得，因为想把它研磨的好些，又想

快点做实验，于是就一向磨一向磨，直到做下一步时才觉得手腕有点累。我记得在加棉花时，由于不明白就应加多厚，提取色素时还很是胆战心惊的。我觉得在这个实验中，装柱这一步是很重要的，于是我们很留意的装，直到柱面很平。直到最后，分离色素后，看到我们的色带分离的很好，很是高兴。

半年实验做下来，最“苦”的要数“菲林试剂热滴定定糖法”这个实验了。这个实验要求我们正确掌握滴定管的使用方法和热滴定的终点。由于全部滴定过程务必在沸腾状态下快速进行，而且终点不容易把握，我们滴了好几十次才确定了终点。当时我的同组者-韩文志已经被火烤的不行了。

在这半年的十几次的实验的学习中，我受益颇多。毫无疑问，它培养了我的动手潜力。每个实验我都会亲自去做，不放下每次锻炼的机会。经过这半年，我的动手潜力有了明显的提高；它让我养成了课前预习的好习惯。一向以来就没能养成课前预习的好习惯（虽然一向明白课前预习是很重要的），但经过这半年，让我不仅仅深深的懂得课前预习的重要，更领会了课前预习的好处。只有在课前进行了认真的预习，在做实验时效率才会更高，才能收获的更多、掌握的更多；它还提高了我处理数据的潜力；做实验就会有数据，有数据就要处理，数据处理的是否得当将直接影响实验成功与否。

半年实验虽然收获很多，但在这中间，我也发现了我存在的很多不足。我的动手潜力还不够强，当有些实验需要很强的动手潜力时我还不能从容应对；我的探索方式还有待改善，当应对一些复杂的实验时我还不能很快很好的完成；我的数据处理潜力还得提高，当眼前摆着一大堆复杂数据时我处理的方式及潜力还不足，不能用最佳的处理手段使实验误差减小到最小程度……总之，生化实验课让我收获颇丰，同时也让我发现了自身的不足。在实验课上学得的，我将发挥到其它中去，也将在今后的学习和工作中不断提高、完善；在此间发现的不足，我将努力改善，透过学习、实践等方式不断提高，克服那些不应成为学习、获得知识的障碍。在今后的学习、工作中有更大的收获，在不断地探索中、在无私的学习、奉献中实现自己的人身价值！

第五篇：生化实验教案

生命科学与技术学院生化实验（下）

生 物 化 学 实 验（下）

实验三 离子交换柱层析法分离氨基酸

生命科学与技术学院生化实验（下）

华中科技大学生命科学与技术学院 2012级生物化学小老师

第三组

离子交换柱层析法分离氨基酸

【实验目的】

1.学习离子交换树脂分离氨基酸的基本原理。2.掌握离子交换柱层析的基本操作。3.掌握氨基酸和茚三酮显色机理。

【实验原理】

1.离子交换层析原理

离子交换法是通过带电的溶质分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换而达到分离目的的方法。

有些高分子物质含有一些可以解离的基团，例如-SO3H，-COOH等，因此可以和溶液中的离子产生交换反应，如：

或

这类高分子物质统称为离子交换剂，离子交换剂是一类具有离子交换功能的高分子材料。功能基团由固定在骨架上的带电基团与可进行交换的能移动离子两部分组成，二者所带电荷相反，以静电作用结合。可进行交换的离子称为反离子或抗衡离子，这种反离子可与溶液中带

生命科学与技术学院生化实验（下）

同种电荷的离子进行交换反应。因离子交换反应是可逆的，在一定条件下被交换的离子也可以“解吸”，使离子交换剂又恢复到原来的离子形式，所以离子交换剂通过交换和再生可以反复使用。其中使用的最普遍的是离子交换树脂。由于一定离子交换剂对于不同离子的静电引力不同，因此在洗脱过程中，不同的离子在离子交换柱上的迁移速度也不同，最后完全分离。

选择适当的条件，可使一些溶质分子变成离子态，通过静电作用结合到离子交换剂上，而另一些物质则不能被交换，这两类物质即被分离。带同种电荷的不同离子都可以结合到同一介质上，但由于各自所带电量不同，与介质的结合牢度不同，可改变洗脱条件使它们依次先后被洗脱，从而达到分离目的。

离子交换层析是一种基于氨基酸电荷行为的层析方法。本实验采用磺酸型阳离子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸天冬氨酸（Asp，pI2.97）和碱性氨基酸赖氨酸（Lys，pI9.74）的混合液。氨基酸是两性电解质，分子上所带的净电荷取决于氨基酸的等电点和溶液的pH值。在pH5.3条件下，因为pH值低于Lys的PI值，Lys可解离成阳离子结合在树脂上；Asp可解离成阴离子，不被树脂吸附而流出层析柱。在pH12条件下，因pH值高于Lys的pI值Lys可解离成阴离子从树脂上被交换下来。这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。2.茚三酮反应机理

茚三酮反应是指在加热条件下，氨基酸或肽与茚三酮反应生成紫色（与羟脯氨酸或脯氨酸反应生成（亮黄色）化合物的反应。

该紫色化合物在570nm处有最大光吸收，所以可以利用分光光度计测量其含量。

由于该反应灵敏度高，目前已经广泛应用于氨基酸定性和定量的分析，国内的大部分教材认为其反应机理为：

生命科学与技术学院生化实验（下）

但是大量实验表明而且大部分的学者认为茚三酮显色反应生成的有色物质是混合物而不是单一组分。

茚三酮显色反应受pH，茚三酮试剂的配制方法和浓度，氨基酸种类和浓度，反应温度，反应时间，冷却时间，离子强度等都有较大影响。特别要注意的是pH对显色反应的影响特别大，且该反应在一个小时内稳定。

【实验器材和试剂】

一、实验器材

层析柱（20cm*1cm）；铁架台；恒流泵；部分收集器；分光光度计；移液枪；恒温水浴锅；试管；玻璃棒；烧杯；试管架。

二、实验试剂

①732型阳离子交换树脂（100-200目）

生命科学与技术学院生化实验（下）

②2mol/L氢氧化钠溶液，1mol/L氢氧化钠溶液； ③2mol/L盐酸溶液，0.1mol/L盐酸溶液； ④标准氨基酸溶液

天冬氨酸、赖氨酸均配制成2mg/mL的0.1mol/L盐酸溶液； ⑤洗脱液

柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲溶液（pH5.3）

取柠檬酸14.25g，氢氧化钠9.30g和浓盐酸5.25mL溶于少量水后，定容至500mL，冰箱保存

注：在柠檬酸缓冲液中加入0.1%酚溶液可防止长霉。在室温较高的夏季，配制缓冲溶液用的蒸馏水必须是新鲜蒸馏水，配前煮沸，配好后在4℃保存。0.01mol/LNaOH溶液（pH12）

取0.4gNaOH固体用适量蒸馏水溶解后，定容至1L ⑥显色剂

取0.5g茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加水定容至100mL。待测样品

混合氨基酸溶液：将2mg/mL天冬氨酸、赖氨酸溶液按1:2.5的比例混合，混合后再以1:1的比例用0.1mol/L盐酸溶液稀释。

【操作步骤】

1.树脂的处理

对于市售干树脂，先是经水充分溶胀后，经浮选得到颗粒大小合适的树脂，然后加4倍量的2mol/LHCl溶液浸泡1小时，倾去酸液，用蒸馏水洗至中性，然后用2mol/LNaOH溶液处理，做法同上。以1mol/LNaOH溶液浸泡树脂一小时转化为钠型，用蒸馏水洗至中性，最后用欲使用的柠檬酸缓冲液浸泡，过剩的树脂浸入1mol/LNaOH溶液中保存，以防细菌生长。2 装柱

取层析柱一支，垂直固定在铁架台上，(实验前需进行检漏，小老师会在实验过程中进行演示)用夹子夹紧柱底出口处橡胶管，在柱内加2~3cm高的柠檬酸缓冲液。将搅拌成悬浮状的树脂沿柱内壁缓慢倒入。待树脂在柱底部逐渐沉降时，慢慢打开柱底出口处铁夹，继续加入树脂悬浮液，直至树脂高度到层析柱高度的3/4处。

生命科学与技术学院生化实验（下）

注意：要注意装柱过程的连续性，装好的层析柱应均匀，防止产生气泡，节痕或界面，否则会对实验有较大的影响，必须重新装柱。3平衡

层析柱装好后，再缓慢沿管壁加入 适量缓冲液至树脂床面以上2~3cm处，接上横流泵，用柠檬酸缓冲液以0.5mL/min的流速进行平衡，用pH试纸测量流出液pH，直至流出液的pH与缓冲液的pH相等。

注意：调节流速前要排除恒流泵与柱间连接管内所有气泡，以免影响流速，影响实验效果。调节流速时统一将流速调节为10滴/min,平衡时间一般为15分钟。4加样

关闭恒流泵，打开层析柱上端管口，缓慢打开柱底出口，小心放出层析柱内的液体至柱内液体的凹液面恰好与树脂上液面相齐，立即关闭下端出口（注意：不要使液面下降至树脂表面以下）。用移液枪吸取氨基酸混合样品0.5ml，沿靠近树脂表面的管壁缓慢加入，注意不要冲坏树脂表面。加样后打开柱底止水夹，使液体尽可能缓慢地流下至液体凹液面恰与树脂表面相平，立即关闭止水夹。再用胶头滴管吸取0.5ml缓冲液清洗柱内壁，打开止水夹放出液体，使液体下表面与树脂表面相平，按照此法清洗2次。然后小心加入缓冲液离柱顶部1cm为止，并将层析柱与恒流泵和部分收集器相连。

注意：样品体积不要过大，样品的含量不能超过层析柱内离子交换能力，否则影响分离效果。5.洗脱

① 缓冲液洗脱：用柠檬酸缓冲液（pH5.3）以6s/滴的流速开始洗脱，用试管收集洗脱液，每管收集1ml，收集1-10号管。(② 0.01mol/L NaOH溶液（pH12）洗脱：关闭恒流泵和止水夹，将柠檬酸缓冲液更换为0.01mol/L的NaOH溶液，打开止水夹进行洗脱，同法收集11-40管。收集完毕后，关闭止水夹和恒流泵。

注意：在整个实验过程中要多注意层析柱，避免使柱内液体流干，否则实验即为失败。6.测定

分别向60管收集液中加入1.5ml柠檬酸缓冲液，混匀后再加入1ml茚三酮显色剂，混匀。沸水浴15min后取出，冷却至室温，在1h内用分光光度计在570nm下以蒸馏水为空白管进行比色，测定各管的吸光度值。

注意：比色时尽量避免将液体沾在手上或衣服上。7.树脂再生

生命科学与技术学院生化实验（下）

层析柱使用几次后，需将树脂取出用1mol/LNaOH溶液洗涤，再用蒸馏水洗至中性后可反复使用。

注意：在本次实验结束之后需将树脂倒至指定烧杯中。

【结果与分析】

以吸光度值为纵坐标，收集的管数为横坐标，绘制出洗脱曲线。以已知两种氨基酸的纯溶液样品，按上述方法和条件分别操作，将得到的洗脱曲线与混合氨基酸的洗脱曲线对照，可确定2个峰的大致位置及各峰为何种氨基酸。

【思考题】

1.对于新树脂我们做的处理是先用2mol/LHCl搅拌半小时，然后用蒸馏水洗至中性，再用2mol/LNaOH搅拌半小时，用蒸馏水洗至中性，最后用1mol/LHCl搅拌半小时，还用蒸馏水洗至中性。请分析原因。

2.所加树脂的高度为层析柱高度的3/4，请思考树脂过高或过低对实验结果有何影响，试分析原因。

3.本实验加的样品为天冬氨酸和赖氨酸，若再加一个组氨酸，请估计其峰值的位置，说明理由。