流式细胞仪在免疫学研究中的应用

第一篇：流式细胞仪在免疫学研究中的应用

流式细胞仪在免疫学研究中的应用

摘 要：随着现代激光技术、电子检测技术和电子计算机技术等的迅速发展，流式细胞仪(FCM)在免疫学、生物学、遗传学、血液学、临床检验等领域中得到了更加广泛的应用。在免疫学研究领域，FCM以快速、灵活及定量等特点被广泛地应用于基础研究和临床治疗的各个方面，尤其是与单克隆抗体技术的结合，使其在免疫分型、分选、免疫监测、免疫细胞的系统发生及特性研究等方面发挥了重要的作用，成为现代免疫学研究不可缺少的工具。该文对近年来流式细胞仪在免疫学研究中的应用进展进行了综述。

关键词：流式细胞仪；免疫学；检测

流式细胞仪(flow cytometry，FCM)是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器[1]。FCM 可对细胞大小、细胞表面抗原的表达等进行快速、灵活、定量、多参数的检测，而且，可同时用于检测细胞内的核酸定量、DNA倍体、细胞周期分析，细胞因子和黏附分子等[2]。具有分析速度快、精确度高、重复性好和费用低廉等优点。流式细胞仪介绍

1.1 流式细胞仪的工作原理

流式细胞仪主要由流动室和液流系统，激光源和光学系统，光电管和检测系统，计算机分析系统和细胞分选系统5部分组成，其中，流动室是仪器的核心部件。

将待测标本制备成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后，由气压装置送入流动室，以一定的流速经过喷嘴进入激光聚焦区，流速的选择与检测的目的有关，此时，在激光束的照射下，被荧光染色的细胞产生散射光和激发荧光，其散射光信号和荧光信号经光学系统收集，由检测系统转换成为电信号，再通过模/数转换器，转换为可被计算机识别的数字信号，各种信号经计算机采集后，用相应的应用软件进行分析处理，最后，以直方图或三维图的形式显示出来。选择不同的单克隆抗体及荧光染料，可同时测定一个细胞上的多种不同的特征参数，从而可以对细胞进行分类[3]。1.2 流式细胞仪机型介绍

近年，流式细胞仪的主要生产厂家有美国的BD(BectonDickinson)公司、贝克曼库耳(Beckman Coulter)公司和德国的Partec公司。国内使用的流式细胞仪主要由前两家生产。它们生产出一系列科研型和临床型的流式细胞仪，并研制生产了流式细胞仪所用的各种单克隆抗体和荧光试剂。

流式细胞仪可分为两大类，一类为临床分析型(又称小型机、台式机)，其特点为仪器光路调节系统固定，自动化程度高，易学易掌握，适合在临床实验室中应用。如BD公司的FACSCalibur，BeckmanCoulter公司的EPICSXL，Partec公司的Pas，Cytomation公司的MOFLO，Aber公司的Microcyte，Ortho公司Cytoron等。

另一类为科研分选型(又称综合型)，特点为功能齐全，分析灵活，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，同时可选配多种波长类型的激光器，适用于广泛的科学研究之用。如BD公司的FACSVantage，Beckman Coulter公司的EPICS ALTRA，Partec公司的PasIII及Cytomation公司的MOFLOMLS等。

随着计算机技术、电子制造技术、激光技术及荧光素合成技术的发展，流式细胞仪的制造工艺、功能、精确度等有了质的飞跃。流式细胞仪已开始向模块化发展，即它的光学系统、检测器单元和电子系统都可以按照试验要求随意更换[4]。各流式细胞仪生产厂商继续推出新产品以满足用户的不同需要。如BD公司的FACSAria(高速细胞分选仪)、分选增强型FACSVantage SETM(多色分析和高速分选流式细胞仪)、LSR II(数字化分析型流式细胞仪)，FACSCanto(双激光六色分析流式细胞仪)。BeckmanCoulter公司近年又推出了Cytomics ™FC 500系列，如FC 500MCL/MPL 采用单激光或双激光激发方式，可进行五色分析。Partec公司的顶级科研型十三色荧光流式细胞仪CYFLOW ML，临床科研型六色荧光流式细胞仪DYFLOW SL。Amnis公司的Image Stream100(激光流动成像细胞仪)，将流式多色检测技术和荧光显微图像显示技术结合在一个平台上，不仅可以通过荧光信号的强度，还可以通过细胞荧光图像对细胞内外信号定位，从而对细胞亚群进行定性和定量分析。流式细胞仪在免疫学中的应用近年来，随着生物医学等相关学科的发展和免疫学研究的深入，流式细胞仪在分子免疫学、免疫生物学和免疫遗传学，免疫血液学、免疫药理学、移植免疫学、肿瘤免疫学、抗感染免疫学、临床免疫学等免疫学领域的基础学科，以及淋巴细胞及其亚群分析、淋巴细胞免疫分型、细胞因子检测等临床研究中，也有了越来越广泛的应用。

2.1 淋巴细胞及其亚群分析

FCM在临床淋巴细胞及其亚群分析中得到广泛应用，可同时检测出一种或几种淋巴细胞细胞表面抗原，将不同的淋巴细胞亚群区分开，并计算出它们相互间的比例。通过淋巴细胞及其亚群数量的检测，可了解在不同情况下机体的免疫功能状态，辅助临床疾病的诊断，探索疾病的发病机理、病程、预后，指导临床治疗方案[5]。

由于FCM可以进行高灵敏度、高速度和多参数分析，使FCM对血液淋巴细胞亚群的检测较其他方法更精确，故其被认为是血液淋巴细胞亚群分析的标准方法[6]。

2.1.1 检测项目 在临床上，淋巴细胞及其亚群分析项目包括：B/NK/CD4/CD8/CD4：CD8；绝对计数(TruCount)；活化淋巴细胞的检测(CD69/HLADR/CD71/B27)；CD4＋ Th/i和CD8＋Ts/c的进一步区分；Naive/Memory T细胞亚群的检测；Th1/Th2亚群的检测。

用流式细胞仪诊断某种疾病时，经常需要检测多个项目，如当人类感染免疫缺陷病病毒(Human immunodeficiency virus，HIV)后，HIV主要选择地侵入人类具有重要免疫功能的T淋巴细胞亚群中的辅助性T细胞，即Th细胞(CD4＋)，使具有重要免疫功能的T细胞群被破坏，继而累及全身免疫器官，使机体免疫功能下降。检测的免疫指标表现为：T淋巴细胞总数减少(正常值的65%～81%)；T细胞亚群比值倒置，即Th/Ts<1.0(正常1.3∶12～2.1∶1)；Th细胞(CD4＋)绝对计数<200个/μL(正常值400～1 500细胞/μL)，CD8＋ T细胞在感染早期增多，后期则下降；Ts细胞增高，NK细胞减少或活力下降，B淋巴细胞群则在正常范围；CD4＋/CD8＋ 明显低于健康成人(P<0.01)。

2.1.2 检测技术的发展 随着新的荧光色素分子的不断发现，荧光标记技术的进步和流式细胞仪的多激光激发技术的进展，多色荧光分析得到迅速发展，三色、四色甚至五色或六色荧光分析对细胞亚群的识别、细胞功能评价等更为精确。近年，淋巴细胞及其亚群的分析已经发展到三色荧光以上分析，且借用MultiSET全自动获取分析软件完成。如：通过四色荧光标记，对外周血T淋巴细胞亚群可进行快速、客观、准确检测及绝对计数分析[78]。利用流式细胞仪，采用多色荧光标记的单克隆抗体，分析黏附性T 细胞表面CD3＋ CD4＋ 或CD8＋CD19－CD16－CD45RO＋CD62＋CD27＋ CD57 抗原，从而对LFA1adhesive T 细胞快速准确地测定[9]。

总之，用流式细胞仪检测淋巴细胞及其亚群的检测技术朝着多激光、多色分析方向发展。近年来，为了使样本一次检测，得到更多结果，满足临床多色分析诊断的需要，一些厂家为临床应用专门设计了六色分析流式细胞仪。

2.2 白血病免疫分型

白血病是白细胞在分化到某个阶段受阻后呈克隆性异常增殖的结果，它的发病是多阶段的，不同病因引起的白血病的发病机制不同，在治疗和预防上也不同，所以，利用白细胞分化不同阶段出现的细胞表面标志，可以对白血病进行免疫分型，对其进行导向治疗[10]。近年，白血病的MICM(形态学、免疫学和细胞遗传学，分子生物学)分型已成为现代白血病诊断的重要指标，其中应用流式细胞仪进行免疫表型的检测在分型中发挥了越来越重要的作用，现已积累了丰富的应用经验。它具有快速、客观、准确、特异性强、重复性好等优点，对白血病进行免疫分型具有极其重要的临床诊断意义[11]。

准确的免疫分型关键是区分正常细胞与白血病细胞，传统的流式细胞仪白血病免疫分型依赖于白血病细胞的FSC/SSC特性来设定原始细胞群，然后根据门内某些阳性单抗占门内细胞的百分比来确定其抗原表达情况。很显然，这种方法是不能将原始细胞与正常细胞完全分开的。

随着免疫学和遗传学及流式细胞仪检测技术的发展，由开始的主要采用间接免疫荧光标记法到直接免疫荧光标记法，从单色或双色到利用CD45抗体标记设门法进行多色免疫标记。利用造血系统细胞CD45表达量与细胞分化程度的高度相关性，可以精确地将原始/幼稚细胞与正常成熟细胞群完全分开。使免疫分型的准确性得到很大的提高，现在，已成为诊断白血病免疫分型的重要工具[12]。国际上普遍采用三色或四色分析的方法，利用CD45SSC设门法，并结合其他技术进行免疫分型。如应用流式细胞仪，采用CD45 SSC 设门法多参数，并利用抗体积分系统诊断标准，可以准确地、完整地分析白血病免疫分型[13]。采用三色流式细胞术CD45/侧散射(SSC)双参数散点图设门，并结合FAB 形态学能对急性白血病进行准确分型[14]。应用流式细胞仪四色荧光标记技术，CD45/SSC双参数散点图设门方法，能清楚地区分各种免疫细胞，可准确、客观地进行白血病免疫分型[15]。

2.3 血小板膜表面受体检测

血小板膜上有丰富的糖蛋白受体，是血小板发挥其功能的物质基础，静止期和活化期的血小板膜糖蛋白受体的种类、含量、结构和功能显著不同。应用流式细胞仪检测血小板膜上受体，主要是对血小板特异性膜糖蛋白和活化标志物进行免疫荧光标记，结合单克隆抗体和免疫荧光技术，用不同的抗血小板单克隆抗体，可以从分子水平上诊断血小板功能和数量的异常。使用流式细胞仪测定活化血小板是目前公认的快捷而灵敏的方法之一[16]，可直接、灵敏、特异地分析血小板的活化程度和功能状态。

普遍采用的技术是以全血为标本，应用流式细胞仪进行多参数分析，即全血法流式细胞术。如采用流式细胞仪三色荧光标记技术，能准确地检测冠心病患者血小板表面糖蛋白的变化[17]。采用流式细胞仪和三色免疫荧光标记的单克隆抗体，可直接检测全血样本中血小板膜表面CD41、CD61、CD62的表达水平[18]。

与常规血小板功能测定法相比，全血法流式细胞术虽然有许多优点，如直接使用全血样本，且标本用量少；简化标本的处理，避免了样本处理不当等因素导致的血小板体外激活，并可防止血小板亚群的丢失，从而更客观、更准确地反映血小板的功能[19]。但是，全血法流式细胞术也存在不足之处，如流式细胞仪价格昂贵，为了避免血小板体外活化，血样不能久置，需在45 min内处理；只能分析循环中的血小板的数量和功能，不能反映血小板代谢和最近被清除的血小板的数量。所以，还需对该方法进行更深入的研究，并使之标准化[20]。

2.4 细胞因子的检测 细胞因子(cytokine)是由免疫细胞或非免疫细胞合成和分泌的小分子多肽，在调节机体多种细胞的生长、分化和功能，调节正常与病理状态下的免疫应答过程中起着十分重要的作用。检测细胞因子对于阐明机体免疫应答机制及相关疾病的发生、发展规律和临床治疗具有重要意义。

随着研究的进展，仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。目前，越来越重视在单细胞水平上研究细胞因子的表达能力。应用流式细胞仪结合间接免疫荧光法，可在单细胞水平上客观、正确地检测细胞内多个细胞因子，并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群，进行多参数相关分析，是一种有效地在单细胞水平研究细胞因子的方法[21]。

近年主要采用的是胞内流式分析法。该方法是基于BD公司的快速免疫细胞因子系统(fast Immune cytokine system)。以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)，佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)加离子霉素(ionomycin，Ion)作刺激剂，刺激全血中淋巴细胞表达细胞因子；用雷菲德菌(Brefeldin A，BFA)与莫能霉素(monensin，MN)等药物阻断细胞因子分泌至胞外，用CD3和CD8设门，应用两种免疫荧光抗体同时标记淋巴细胞膜表面特异分子和被阻滞在胞内的细胞因子，然后用流式细胞仪进行检测和分析。

该方法具有许多优点，如完善的全血激活方法，保留体内细胞及生化微环境，能更准确反映体内状况，避免了人工假象的产生。高效荧光结合抗体，确保高度灵敏及低背景染色。高质量的膜通透剂，可以保证一致的灵敏度与低背景染色，且免除了为增加通透性所需冷冻细胞过夜的步骤。同型对照，避免了使用重组细胞因子进行繁琐的竞争性封闭。

该技术虽然已成为一项可在单细胞水平上检测细胞因子的有效方法，尤其是在确定功能不同的T细胞亚群方面具有重要的作用[22]，具有其他方法难以比拟的优点。但是，也存在一定的缺陷，如现有的激活剂可导致部分至表面分子表达的下调。因此，今后还要寻找更佳的激活剂。结语

FCM以其快速、准确、灵活、大量、多参数同时分析等优点，已成为免疫学研究领域中无可替代的重要工具。科技水平的不断发展，免疫学研究的不断深入，尤其是近年来，流式细胞仪的功能不断完善、各种功能强大的分析软件的开发、多参数分析技术的发展等，为流式细胞仪检测结果准确性的提高和分析能力的扩展提供了保障，并使仪器不断向小型化，操作自动化，简单化方向发展。可以预见，在未来免疫学领域，流式细胞仪的应用范围会进一步扩大，应用深度会进一步加强。

第二篇：模块教学在医学免疫学教学中的应用

模块教学在医学免疫学教学中的应用

模块教学的内容模块教学是将医学免疫学的全部课程根据各章节的知识特点、学习要求、临床结合度、基础性等不同划分为几个模块,各模块根据其自身内容和特点选择相应的教学方式,避免了医学免疫学课程的枯燥乏味,也保证了学生对医学免疫学基础理论的掌握和理解,同时又能兼顾临床知识的联系和科研意识的培养。这种教学内容的划分也避免了对医学免疫学教学体系的完全变革,因此能适应新形势下对医学免疫学课程教学的新要求。

1.1 基础知识模块 包括绪论、免疫器官和组织、免疫细胞、抗原、抗体、补体、MHC、免疫应答等章节。这些章节的教学内容中包括大量免疫学基本概念和基本原理,特点是基础性很强,这一模块的教学内容无论如何变革,都必须保证学生的理解和掌握。最好的方法就是保持其基础性,按照传统教学法进行教学,也可结合启发式教学,保证学生能顺利掌握基础内容。可将知识点划分为“掌握”、“熟悉”和“了解”内容,让学生知道哪些是必须掌握的,哪些是需要理解的,也可根据知识点整理针对每一章的自测试题,完成课堂教学内容后,布置学生自测,强化教学效果。教师可通过自测题的完成情况来了解学生对此模块教学内容的学习情况, 保证学生对基础理论知识的真正掌握。

1.2 前沿进展模块 包括细胞因子、分化抗原、黏附分子、免疫耐受、免疫调节、免疫诊断、免疫治疗等章节。这一模块的特点是教学内容需掌握的知识点较少,但范围较广,而且涉及免疫学研究前沿内容较多。如果仍采用传统教学形式, 难免枯燥乏味,不易理解。因此这一模块的教学可以适当与科研相结合,将免疫学前沿内容融入到教学中,相关综述文献的查找、阅读、讨论、写作尝试等方法均可以在此模块中应用。学生通过阅读文献或亲自撰写综述文献,可以近距离接触免疫前沿知识和相关内容的科研进展,顺利完成此模块教学内容的同时,可以培养学生的科研兴趣和查找阅读文献的能力。此模块可以通过学生参与的认真程度、撰写综述的符合标准程度、对所查文献的理解程度、对相关章节的了解程度等评价学生的学习效果。1.3 临床免疫学模块 包括自身免疫病、免疫缺陷病、移植免疫、肿瘤免疫等章节。此模块主要涉及免疫系统在病理状态下功能的改变以及异常免疫应答在发病机制中的作用,与临床关系非常密切,此部分也是多数学生学习和关注的重要部分,学生的学习兴趣较高。但是这些章节并不作为基础医学免疫学教学的重点,学时通常占用较少,根本无法系统学习和认识免疫与相关疾病的关系,而这些疾病往往又属于临床常见病和多发病,因此传统教学无法满足学生对临床疾病 熟悉和了解的需要。在此模块教学中应以疾病为线索,引导学生将刚刚学习过的免疫学基础知识应用于临床疾病的发病机制、诊断原理、预防和治疗原理之中。教学中可以使用 PBL教学法或病例分析教学法,通过教师提出问题或学生自己提问、自己回答的方式,系统、全面、深入、自主的掌握这一部分内容,也可以直接应用病例要求学生进行深入讨论。无论哪一种方式,都可以很好地使医学免疫学基础知识与临床常见病相结合,从而培养学生分析疾病发生机制、检测、诊断和治疗原理的能力。此部分内容可以通过学生书写报告或者上交讨论记录等形式进行考评。

1.4 知识应用模块 包括超敏反应、免疫预防等章节,此模块教学内容与现实生活、免疫相关疾病的预防密切相关,如过敏症的发生、疫苗的使用方法和原理等,特别是近年来一些流行病的爆发,其预防和治疗方法都是学生较为关心的内容。此部分的教学应选用较为灵活的教学方法,可以根据不同主讲教师的特点和能力,也可以根据不同专业的特点进行多种教学方法的联合应用。教学方法中应以讨论式教学或论坛式教学为主,也可以结合演讲、小品、录像等多种形式鼓励学生积极参与,在愉快的教学活动中学习到更多、更实用的知识。此部分可根据气氛的热烈程度、分析的深入程度、总结结论的准确程度等对学生进行评价。2 模块教学的评价模块教学法的优点是伸缩性较强,可以逐步实施。教师从传统教学模式向其他教学模式的转变需要过程,包括思维转变的过程、教学能力提高的过程、新教学法的适应过程等。模块教学应用过程中可以采取逐步增加的方式,根据不同教师能力和个性特点,有选择性的增加模块。比如年轻教师能力不够,可以在基础知识模块上增加知识应用模块,适应和驾驭后再增加临床知识模块,之后增加前沿进展模块;科研能力较强的教师可以先增加前言进展模块;对PBL和案例分析感兴趣的教师也可以先增加临床知识模块。这种方式可以更好的发掘教师的潜力和热情,避免因全面改革使用新的教学方法,导致的教师和学生不适应和抵触情绪,达不到真正想要的教学效果。

第三篇：免疫学检测技术在食品安全中的应用

免疫学检测技术在食品安全中的应用

杨明

（甘肃农业大学 动物医学院，甘肃 兰州 730070）

食品安全问题在21世纪的今天已经成为全世界关注的重大问题，对国家的经济发展和消费者的身体健康产生了重大影响。随着我国市场经济的的不断完善和发展，食品行业对外贸易与日剧增，食品的质量与安全问题已成为影响农业和食品工业产品竞争力的关键因素。同时，由于我国人民生活已由温饱型食物结构转向营业健康型食物结构，全民食品营业卫生知识得到普及。人民的饮食消费观念也由数量型转向质量型，对食品卫生质量标准的要求越练越高，这就对食品检测技术提出更高的要求。

由于食品种类丰富，食品中检测的有毒有害物质种类和组分繁多，需要检测的物质质量极低，样品中待检物的浓度常为μg、ng甚至 pg级，除此之外，许多检测物除需检测物质本身，还涉及其衍生物和降解物测定。区别同位异构体以及元素的价态等。因此食品检测要求检测方法更加准确、快速、方便，也使得其他学科的先进技术不断应用于食品检测领域中来，由于新技术的引入，食品行业开发出了许多自动化程度和精确度很高的检测仪器，这不仅缩短了分析时间，减少了人力误差，也大大提高了食品分析检测的速度、灵敏度和准确度。现代食品检测技术主要包括以下几个方面：①计算机视觉技术；②现代仪器分析技术；③食品物性的力学、声学和电学检测技术；④电子传感检测技术；⑤生物传感技术；⑥核酸探针检测技术；⑦PCR基因扩增技术；⑧免疫学检测技术。

免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分，特别是三大免疫技术——荧光免疫技术、酶免疫技术、放射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用。利用免疫学检测技术可检测细菌、病毒、真菌、各种毒素、寄生虫等，还可用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测，其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强，特别是单克隆抗体的发展，使得免疫检测方法特异性更强，结果更准确。

免疫分析是抗原与抗体的特异性、可逆性结合为基础的分析技术。1959年，Yalow和Berson 将发射性同位素示踪与免疫反应相结合建立了发射免疫测定法，从而开创了免疫分析这一崭新领域，次后又发展了许多替代或非同位素免疫免疫分析法。

1．免疫荧光技术在食品检测中的应用

免疫荧光分析（Immuno Fluorescence Assay , IFA）始创于20世纪40年代初，1942年Cons等首次报道用异硫氰酸荧光素标记抗体，检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗体，但此种荧光素标记物的性能较差，未能推广应用，20世纪50年代，Riggs等合成性能较为优良的异硫氰酸荧光素。Mashall等对荧光抗体的标记方法又进行了改进，从而使得免疫荧光技术逐渐推广应用。1．1 基本原理

抗体与荧光素结合后，并不影响其与相应的抗原发生特异性反应，事先将待测抗原固定与玻璃载玻片上，滴加荧光标记抗体，若荧光标记抗体与相应的抗原发生特异性结合反应，不能被缓冲液冲掉，载荧光显微镜下可观察到荧光，否则荧光抗体被缓冲液冲掉，在显微镜下观察不到荧光。1．2 荧光免疫测定法的分类

根据标记荧光产生的方式不同分为底物标记荧光测定法、荧光偏振免疫测定法、荧光猝灭增强免疫测定法。FIA可使用均相或非均相分析方式，均相FIA应用较多。

1．2．1 底物标记荧光测定法

底物标记荧光测定法（SLFIA）使用一种酶的底物标记待测物，底物本身无荧光，在受到相应酶的催化时能转变为荧光物，当标记底物与抗体结合产生的空间位阻阻碍了酶与标记底物间的接触，样品中的待测物通过竞争作用使游离的酶标结合物或荧光强度增加。1．2．2荧光偏振免疫测定法

使用偏振光作为激发光时，视分子的运动状态，发射的荧光可能是振动方向各向随机化的普通荧光，或是只在某一平面振动的偏振荧光（ploarized fluorescence）在反应液中，游离的标记物分子体积小，在布朗运动中转动速度快，受偏振光照射后产生的荧光偏振方向被分散，不能产生偏振光，只发射普通荧光；与抗体结合的标记物分子体积增大，布朗运动速度减慢，甚至不能转动而形成定向排列，所以受偏振光激发后能产生偏振荧光，样品中的待测物的量越大，偏振荧光的强度越高。

1．2．3 荧光淬灭免疫测定法

荧光淬灭免疫测定法（Fluoresecent Quenching Immunoassay）的原理是当荧光标记物与抗体结合后发生荧光淬灭。荧光猝灭的机制尚不清楚，荧光淬灭可能与标记物与抗体结合后导致电子振动状态的改变有关。1．2．4荧光增强免疫测定法

荧光增强免疫测定法（Fluoresecent Enhancement Immunoassay）的原理与荧光淬灭增强免疫测定法相似，不同的是标记物与抗体结合后荧光强度增强。酶免疫检测技术在食品检测中的应用

酶免疫检测技术是在20世纪60年代在荧光和组织化学的基础上发展起来的一种新技术，最初用酶代表荧光素标记抗体作为生物组织中抗原的鉴定和定位。随后发展为用于鉴定免疫扩散及免疫电泳板上的沉淀线，到1971年，Engrall等用碱性磷酸酶标记抗原或抗体，建立了酶联免疫吸附试验（ELISA），这一技术因其高度的准确性、特异性、应用范围广、检测速度快以及费用低等优点，是目前食品检测中令人瞩目的有发展前途的一种新技术。2．1 酶免疫技术的基本原理

用酶标记已知的抗原（抗体），然后与样品在一定条件下反应，如果样品中含有相应的抗体（抗原），抗原抗体结合形成复合物中所带酶分子遇到底物时，能催化底物水解、氧化或还原，产生显色反应，这样就可以定性定量测定样品中的抗体（抗原）。2．2 酶免疫技术的分类

酶免疫技术发展迅猛，种类繁多，酶免疫技术分为酶免疫组化技术和酶免疫测定技术，酶免疫测定技术又分为均相免疫测定和异相免疫测定技术，异相免疫测定技术又分为固相免疫测定技术和液相免疫测定技术。2．3 酶联免疫吸附测定技术 2．3．1 基本原理

抗体（抗原）与酶结合后，仍然能和相应的抗原（抗体）发生特异性结合，将待测样品事先包被于固相载体表面，加入酶标抗体（抗原），酶将抗体（抗原）于吸附于固相载体上相应的抗原（抗体）发生特异性结合反应，形成酶标记的免疫复合物，不能被缓冲液冲掉，当加入酶的底物时，底物发生化学反应，呈颜色变化，颜色深浅与待测抗原或抗体的量有关，可定性或定量测定抗原或抗体。ELISA常用的方法有直接法、间接法、双抗体夹心法、双夹心法和竞争法。2．3．2 ELISA技术在食品安全性检测中的应用及前景

ELISA技术把抗原抗体特异性与酶反应的敏感性相结合，使食品在未经分离的提取的情况下，即可进行定性和定量分析。近年来，该技术在食品安全检测中正逐步推广应用，用于细菌及其毒素、真菌及其毒素、病毒、寄生虫的检测。还用于蛋白质、激素、农业残留、兽药残留和抗生素及食品成分和劣质食品的检测分析。ELISA技术由于灵敏度高、特异性强、检测费用低和易于商品化，具有十分广阔的应用前景。

3．放射免疫技术在食品检测中的应用

放射免疫技术（Radio Immunoassay ,RIA）是以放射性核素为标记物的标记免疫分析法。是由Yalow和Berson于1960年创建的标记免疫分析技术。由于标记物放射性核素的检测灵敏性，本法灵敏度高，测定准确性良好，特别适应于蛋白质、激素和多肽的精确定量测定。3．1 基本原理

放射免疫分析的基本原理是标记抗原和非标记抗原对特异性抗体的竞争结合反应。在这一反应系统中，作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，抗体量一般采用能结合40％-50%的标记抗原，而受检标本中的非标记抗原是变化的，根据标本中抗原的量不同，得到不同的反应结果。当标记抗原、非标记抗原和特异性抗体三者同时在于一个反应系统时，由于标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，因此两者相互竞争特异性的抗体，由于标记抗原与特异性抗体的量是固定的，故标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。非标记抗原量增加，相应的结合较多的抗体，从而抑制了标记抗原对抗体的结合，是标记抗原抗体复合物的量相应减少，游离的标记抗原相应的增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。若将抗原抗体复合物与游离的标记抗原分开，分别测定其放射强度，就可计算出结合的标记抗原（B）与游离的标记抗原（F）的比值（B/F），这与标本中的抗原呈函数关系。用一系列不同的标准抗原进行测定，计算相应的B/F值，可得到一条剂量反应曲线，受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线是查出标本中的抗原含量。放射免疫测定 分为液相放射免疫测定和固相放射免疫测定。3．2 放射免疫技术在食品检测中的应用

RIA测定就是应用放射性物质代替ELISA中的标记酶作为抗原或抗体耦联物，在食品安全检测中最常见的同位素是3H和14C。1978年，Charm在RIA技术的基础上发展了放射免疫检测技术（RRA），放射免疫检测在快速检测方面最成功的是CharmⅡ6600/7600抗生素快速检测系统，该系统就是利用专一受体来识别结合于同一类抗生素族中的母环以便最快速同时检测同一抗生素族在样品中的残留情况。目前，CharmⅡ7600检测系统就β－内酰胺类、氯霉素类、四环素类、磺胺类、氨唑西林及碱性磷酸酶这六项检测以被FDA认可。放射免疫技术由于可以避免假阳性，适宜于阳性率较低的大量样品检测，对水产品、肉类产品、果疏产品中的农药残留量的检测中广泛应用。还可检测经食品传播的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒和寄生虫及小分子物质和大分子物质。如南京农业大学用放射免疫测定牛奶中的天花粉蛋白。

4．免疫胶体金检测技术在食品检测中的应用

免疫胶体金检测技术又叫Rosa.Tests法，是利用胶体金颗粒进行标记的一项新技术。4．1基本原理

氯金酸（HAuCl4）在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等分子被吸附到胶体金颗粒表面的过程，吸附机理可能是胶体金颗粒表面带有负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而行形成牢固结合，用已知还原法可以方便地从HAuCl4制备各种不同的粒径，不同颜色的胶体金颗粒，这种球形的颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球菌A蛋白、毒素、免疫球蛋白、糖蛋白、酶、抗生素、激素等非共价结合。

免疫胶体金检测原理是利用了金颗粒具有电子密度的特性，当这些标记物在相应配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色斑点。因而可用于定性或定量的快速检测方法中。这一方法可通过银颗粒的沉积被放大，称之为免疫金银染色。4．2 免疫胶体金技术在食品检测中的应用

该技术当前主要用于在牛奶中检测抗生素，可在十分钟内快速检测牛奶中的抗生素，利用该技术可检测的抗生素种类有六种，β－内酰胺、四环素、磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星和黄曲霉毒素，可检测的β－内酰胺药物有氨苄青霉素、阿莫西林、邻氯青霉素头孢噻呋、头孢霉素和青霉素G等。由于该技术结果直观、操作简单，在食品安全检测中有广阔的应用前景。单克隆抗体技术在食品检测中的应用

抗体主要由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因，如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可以得到由单细胞经分裂增殖而形成的细胞群，即克隆。单克隆细胞将合成一种决定簇的抗体。1975年，Kohler和 Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合，形成了杂交细胞即可产生抗体，又可无限增殖，从而创 立了单克隆抗体杂交瘤技术。这一技术为医学和生物学基础研究开创了新纪元，是免疫学领域的重大突破。5．1 基本原理

B淋巴细胞具有专一性的合成针对某一抗原决定簇的抗体，但这种B淋巴细胞不能在体外生长，而骨髓瘤细胞可在体外生长，应用细胞杂交技术使骨髓瘤细胞与免疫的淋巴细胞二者合二为一，得到杂种的骨髓瘤细胞即杂交瘤细胞，这种杂交瘤细胞即具有专一性合成某一抗体的特性，也具有瘤细胞能在体外无限增殖的特性，用这种杂交瘤细胞培养的细胞群，可制备抗一种抗原决定簇的特异性单克隆抗体，这种用杂交瘤技术制备的单克隆抗体称为第二抗体，主要抗原能引起小鼠的抗体应答，应用杂交瘤技术可获得几乎所有抗原的单克隆抗体。5．2 单克隆抗体技术在食品检测中的应用

单克隆抗体在食品检测中最大的优点是特异性强，不易出现假阳性。在食品检测中有广泛的应用前景。目前人们已制备出各种经食品传播和引起食物中毒的细菌及毒素、真菌及毒素、病毒、寄生虫、农药、激素等的单克隆抗体并建立的检测方法。

磺胺二甲嘧啶和克伦特罗（瘦肉精）这两种药物被欧美各国和我国列为兽药残留控制重点，国内研究出了用于动物性食品中磺胺二甲嘧啶检测的单克隆抗体试剂盒和克伦特罗残留检测的多克隆试剂盒。这两种试剂盒具有特异性强、仪器化程度低、样品前处理简单、检测时间短，在实际生产中应用前景广阔，填补了国内空白。

单克隆抗体检测技术可在十分钟内快速检测有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类及激素类的残留量为农产品的优质安全提供技术支持。

英国建立了自动肉制品中的沙门氏菌的单克隆抗体检测方法，人们还制出了单核增生性李特氏杆菌的单抗，用单抗ELISA检测该菌。乳中氯霉素的单克隆抗体检测技术也被建立。

食品储藏过程中会受到霉菌污染，现已从青霉、毛霉等霉菌中提取耐热性抗原制成单克隆抗体用ELISA方法可检出加热和未加热食品中的霉菌。免疫测定新技术

6．1 脂质体免疫测定法

脂质体免疫测定法（LIA）是一种较新的免疫测定技术，脂质体是由磷脂或由其他类脂分子在水相中自发形成的一种密闭的双分子单层或多层囊泡，脂质体表面还可以连接抗原或抗体分子。这种生物模拟膜在形成过程中能包裹水及其中的溶质（染料或酶），膜的稳定性可随免疫反应有规律变化。根据释放出的标记物的量进行测定，所以LIA具有很高的信号放大作用。目前LIA主要存在脂质体的稳定性和非特异性溶解问题。6．2 克隆酶给予体免疫测定法

克隆酶给予体免疫测定法（CEDIA）是一种新型均相免疫测定法。CEDIA中使用由重组DNA技术获得的半乳糖苷酶两个独立的蛋白质片段，这两个片段独立存在时无酶活性，但两个片段结合则显示催化活性。以此作为分析方法的基础。其中较小片段称为酶给予体片段（ED），另一片段称为酶受体片段（EA）。ED标记物与抗体集合后不再与EA形成酶，所以当样品中待测物增 加时则游离ED标记物增多，使反应液中酶产生增加，经底物显色测定。CEDIA是目前灵敏度较高的均相免疫测定法。6．3 发光免疫测定法

发光免疫测定法（CLIA）常用鲁米诺（Luminol）、异鲁米诺（Isoluminol）及其衍生物进行标记。这些环肼类化合物在碱性条件下可被氧化产生3-胺基苯二甲酸盐和430nm的发射光。在鲁米诺的芳氨基上进行烃链取代后产光性能增强，但若置换芳氨基则发光被破坏。另外丫叮酯也用于发光标记。CLIA操作简单、灵敏度高、测定速度快。但CLIA产光物质发光时间极短（数秒钟），测定误差较大。6．4免疫传感器技术

免疫传感器是生物传感器的一种，近年来已取得迅速发展。免疫传感器的探头主要由两部分组成；感受器：通常覆有连接有特异性抗体的可更换的传感膜；换能器：能将抗原抗体产生的信号转换为可供仪器检测的电信号。免疫传感器使用对象广泛，专一性较强，高度的自动化，微型化与集成化减少对使用者及环境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外操作。6．5 多组分免疫测定法

根据不同检测物标记方法互不相同，分析条件和检测信号互不干扰。同一反应液中同时检测不同的检测物。但这种方法必须使几种标记物的测定条件相互协调，其灵敏度和组分数受到限制。

免疫反应最大的特点是高度选择性，抗原抗体的亲和数通常为109或更高。作为一种分析手段，免疫分析技术操作简单、速度快、分析成本低，在食品安全检测中已表现出巨大的应用潜力。此外免疫分析技术能与其他技术联用，在联用方法中免疫技术即可作为高效液相色谱（HPLC）或气相色谱法（GC）等测定技术的样品进化或分离手段，也可作为其离线或在线检测方法。这些方法结合了免疫分析的选择性，灵敏性与HPLC，GC等技术的高速，高效分离和准确检测能力，使分析过程简化，分析成本下降，拓展了待测物范围。

免疫分析测定法提供的待测物组分或结构方面的信息太少，一般不具备多残留分析能力；免疫分析过程复杂，影响因素众多，且不易控制，结果易于出现假阳性，方法难以标准化；方法建立过程复杂，研究周期长，某些待测物半抗原难以合成。免疫测定法不可能取代色谱或光谱等常规分析方法，只能作为其重要补充。

参考文献

[1]现代食品检测技术.赵杰文,孙永海主编.中国轻工业出版社.北京,2005:4.[2]兽药残留分析.赵俊锁,邱月明,王超主编.上海科学技术出版社.2002:2.[3]食品安全与卫生.曹小红主编.科学出版社.2006:7.[4]兽医免疫学.杜念心主编.中国农业出版社.北京:1997.[5]分子免疫学.余传霖主编.上海医科大学出版社.复旦大学出版社.上海:2001.[6]细胞和分子免疫学.余伯泉主编.科学出版社.2001.[7]乳和乳制品检测技术.翁鸿珍主编.中国轻工业出版社.北京:2006.[8]乳品安全和乳品检测技术.庞广昌,陈庆森,刘志和,等主编.科学出版社.北京： 2005.

第四篇：免疫学技术在生猪屠宰检疫中的应用（范文模版）

免疫学技术在生猪屠宰检疫中的应用

[摘 要] 针对我国生猪屠宰检疫的现状，论述了免疫学技术在提高生猪屠宰检疫水平，保护我国生猪养殖及发展中的应用和前景。

[关键词] 免疫学技术 生猪屠宰检疫

[中图分类号] S85 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650（2014）04-0233-01

一、我国生猪屠宰检疫的现状

目前我国生猪屠宰机械化、规模化程度逐渐增高，大型生猪屠宰加工企业也纷纷建厂扩展。另一方面，动物疫病日益纷杂，许多疫病在临床表现、病理变化上都具有高度的相似性，难以区分。加强动物检验检疫，提高动物检验检疫的水平，一方面可有效防止病害生物进入我国，保障我国动物产品的养殖安全与生态环境的稳定；另一方面能控制疾病从疫区向非疫区传播，减少疾病发生，提高动物产品的质量，维护我国动物产品的国际信誉，从而促进产品出口。在此背景下，生猪屠宰检疫水平、检疫技术也必须提高以适应相应的要求。但目前在生猪屠宰检疫过程中，大部分却依赖于检疫人员“一个钩、一把刀、一双手、两只眼”来从事检疫工作，几十年来未有新的、快速的检疫方法得以应用。

二、免疫学技术与生猪屠宰检疫

免疫学是生物医学领域发展最快的学科之一，尤其是免疫学技术的长足发展，把传统免疫学推进到现代免疫学的新时代。近年来不断涌现的化学发光标记免疫、酶标记免疫、核素标记免疫、生物素和荧光素标记免疫、金标记与稀土元素标记免疫等成为全新的技术门类，极大地丰富了现代免疫技术领域，而且免疫学与分子生物学、细胞生物学等相关学科和交叉学科的融合，对免疫学技术的发展起着极大的推动作用。

三、免疫学技术在生猪屠宰检疫的应用

1.凝集反应和沉淀反应及其应用

1.1凝集反应

颗粒性抗原（完整的病原微生物或红细胞等）与相应抗体结合，在有电介质存在的条件下，经过一定时间，出现肉眼可见的凝集小块，这种反应称之为凝集反应。目前可用凝集反应检疫的疫病主要有：猪布鲁氏菌病、猪支原体肺炎、猪囊虫病、猪萎缩性鼻炎、猪乙型脑炎、猪伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、副猪嗜血杆菌等。

1.2沉淀反应

可溶性抗原（细菌培养滤液、细胞或组织的侵出液、血清蛋白等）与相应抗体在一定条件下出现沉淀物的现象，称之为沉淀反应。目前可用沉淀反应检疫的疫病主要有：猪旋毛虫病、炭疽、猪支原体肺炎、猪链球菌病等。

2.免疫标记技术及其应用

2.1酶联免疫吸附试验

一种酶联免疫技术。用于检测包被于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。目前可用酶联免疫吸附试验检疫的疫病主要有：猪囊虫病、猪瘟、猪旋毛虫病、猪乙型脑炎等。

2.2免疫组化技术

免疫组织化技术又称免疫细胞化学技术。它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。目前可用免疫组化技术检疫的疫病主要有：猪繁殖与呼吸综合征、猪瘟、猪伪狂犬病、猪圆环病毒等。

3.其他用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应

其他用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应技术主要包括免疫荧光技术、放射免疫测定技术、化学发光技术、免疫印迹技术、免疫斑点技术、等等。其中应用最为广泛的是胶体金免疫层析技术。胶体金免疫层析（GICA）技术是20世纪90年代初在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易快速的免疫学检测技术，由Beggs等最先用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）的测定。GICA是以NC膜为载体，利用微孔膜的毛细管作用，使滴加在膜条一端的液体慢慢向另一端渗移，如同层析一般。目前可用于检疫的疫病有：猪繁殖与呼吸综合征、猪链球菌2型、猪瘟、猪伪狂犬病、猪口蹄疫、猪旋毛虫等。

总之，检测动物或动物产品病原体的方法很多。有核酸水平的诊断技术（例如PCR技术），也可通过高性能的电子显微镜直接观察到病原体。但是大多数技术所需的时间较长，且对于设备有一定的要求。而免疫学检测技术的检测时间较短，且无需大型的设备和复杂的程序，因此免疫学检测作为一种传统而有效的检测技术，应被广泛应用于动物检验检疫工作中。

第五篇：流式细胞仪分析技术及应用(课件)

流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述

第二节 数据的显示与分析

第三节 流式细胞仪技术要求

一、工作原理

一、参数

一、免疫检测样品制备

二、散射光的测定

二、数据显示方式

二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色

三、荧光测量

三、设门分析技术

三、免疫胶乳颗粒的应用

四、细胞分选原理

四、流式细胞技术的质量控制

第四节 流式细胞仪技术的要求

第五节、流式细胞仪的科研应用

第六节

流式细胞术在临床检测中的主要应用  流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。/是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。/广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。

 流式细胞术发展史

1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究

1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞

1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器

1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂

目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司；BACKMAN COULTER公司

 流式细胞术的特点：最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量

主要特点 ：1.单个细胞水平分析；2.多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；3.灵敏度高；4.可分析大量细胞；5.速度快： 5000-10000个细胞/秒；6.统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况；7.分选感兴趣的细胞：血细胞、骨髓、组织培养细胞等。

第一节 概述

流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。分为三大类：(1)类为台式机（临床型）：仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)类为大型机（科研型）特点：分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适于更广泛更灵活的科学研究应用。(3)类为新型流式细胞仪：15 个参数同时分析。高速分选速度达到50,000 个/秒，并可进行遥控分选，能够满足多种科学研究的要求。流式细胞仪常检测的细胞特性 细胞组成 细胞功能

一、工作原理 大小

细胞表面/胞浆/核--特异性抗原

①采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 粒度

细胞活性

效率；②利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，DNA, RNA含量

胞内细胞因子

保证检测的灵敏度和特异性；③用计算机系统对流动的单细 蛋白质含量

激素结合位点

胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证 钙离子, PH值, 膜电位 酶活性

了检测速度与统计分析精确性。概括为三个系统结构：（1）液流系统：由样本和鞘液组成。鞘液（PBS或生理盐水）：主要作用是包裹样本流的周围，样品流在鞘液的环包下形成流体力学聚焦，包裹的细胞排列成单行，以每秒5000个-10000个细胞，每秒10米速度流动室喷出，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。鞘液在整个系统运行中流速是不变的。改变样本的进样速率开关，可提高采样分析的速度。

（2）光学系统：大多采用氩离子气体激光器。每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术 的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。激光光束在达到流动室前，先经过透镜形成光斑，这种椭圆形光斑激光能量分布属正态分布，为保证样品中细胞受到的光照强度一致。激光光束与细胞液流呈90°角方向照射，细胞产生散射光和荧光。

主要光学原件是滤光片，主要分成3 类：

1、长通滤片：（LP）：LP500滤片允许500μm 以上光通过，而500μm 以下光吸收或返回。

2、短通滤片（SP）：与长通滤片相反，如SP500 滤片允许500μm 以下光通过，500μm 以上光吸收或返回。

3、带通滤片（BP）：带通滤片可允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光的波段范围。如BP500 表示其允许通过波长范围为75μm-525μm。

（3）数据处理系统

流式细胞仪与显微镜的区别

区别

流式细胞仪

显微镜

光源

激光

自然光、灯光 对象

细胞、生物粒子

细胞、组织等 承载工具 鞘液及流动室

载玻片 检测信号 光学信号

形态及染色 放大方式 PMT、放大电路 目镜×物镜、光学放大 统计

计算机，>5000 人工，200 结果

多参数，综合分析 简单，单参数

二、散射光的测定

散射光信号不依赖任何样品的制备技术（如染色），因此称为细胞的物理参数。（波长与激光相同。）主要分为: ①前向散射光（0°散射）FSC：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。

②侧向散射光（90°散射）SSC：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内精细结构和颗粒属性，即细胞膜、胞质、核膜结构性质。

目前采用FSC（表示细胞大小）SSC（表示细胞内颗粒的复杂程度）这两个参数组合，检测FSC与SSC信号通过计算机处理，可得到FSC-SSC图，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。

三、荧光信号（FL）测量

当激光光束与细胞正交时，一般产生两种荧光信号：

①一种是细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号；

②另一种是经过特异荧光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光信号，由于 90o 方向的散射光信号较弱，容易分离出荧光信号，因此此方向上放置必要的光学元件（滤光片、双色分光镜等），可以获取荧光信号。

通过收集两种以上不同波长的荧光信号FL1、FL2进行检测和定量分析，就能了解所研究细胞参数的存在与定量，反映生物颗粒表面和内部的各种情况。

常配置的激光器波长为488nm。

633nm激光管常用染料有APC、APC-Cy

荧光信号的宽度（如FL2-W）常用来区分双联体细胞，由于DNA 样本极易聚集，当两个G1 期细胞粘连在一起时，其测量到的DNA 荧光信号（FL2-A）与G2M 期细胞相等，这样得到的测量数据G2M 期细胞比率会增高，影响测量准确性。通过设”门”（gate）方法，将双联体细胞排除。其原理是双联体细胞所得到的荧光宽度信号（FL2-W）要比单个G2M 细胞大，因此设”门”后才能得到真正的DNA 含量分布曲线和细胞周期。不过通过荧光强度的高度峰和面积峰也可做同样分析。

四、细胞分选原理（图示见上）

通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。快速精度分选纯度90%-99%，且细胞活性不受影响。

1、细胞分选时，液流在驱动力作用下断成高度均一的液滴。在喷嘴下几毫米处，液滴从液流断开。

2、从颗粒被检测到液滴断开的时间由Accudrop技术直接计算。

3、符合分选条件的颗粒一旦被检测到，包含该颗粒的液滴断开时，液滴被充电。断开后的液滴仍然带电，带电的液 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

滴通过被充电的偏转板。受到静电吸引或排斥，带电液滴将向左或右偏转。未带电的液滴不偏转而流入废液槽。检测指标：阳性百分率、绝对计数、平均荧光强度

（二）FCM 分选指标

分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。一般要求分选速度至少达5 000个／秒左右，以保证被分选细胞的生物学活性不受影响。

分选纯度：被分选出的细胞所占的百分比，分选纯度与仪器的精密度直接相关，与实验设计的选择密切相关，可达到99%。

分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。

分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二节 数据的显示与分析

常用数据显示方式：单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图、设门分析技术

目前FCM 数据存贮的方式：采用列表排队方式。目前FCM 所采用的都是多参数指标，荧光参数标记物如是4 个，采用list mode 方式可大量地节约内存和磁盘容量。当一个细胞被测4 个参数，那么获取10000 个细胞，所占容量为4×10000 个（字或双字）。同时当只检测1 个参数时（如DNA），可灵活的关闭其它3 个参数，节省3/4 的空间数据的显示通常有一维直方图、二维点图、等高线图、密度图等几种。

一、参数

FSC：反映颗粒的大小。SSC：反映颗粒的内部结构复杂程度。FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少。

二、数据显示方式

（一）单参数直方图---------由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度（FSC、SSC、FL1、FL2）四个参数的任何一个值。其单位是信道，横坐标可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标一般是细胞数。

（二）双参数直方图---------双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。常用的表达方法有二维点图,等高线图,二维密度图。在二维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，在二维图上每个点代表一个细胞，可以区分细胞性质不同的群体；X 坐标为该细胞一参数的相对含量，而Y 坐标为该细胞另一参数的含量。在双参数图形中可以将各细胞亚群区分开，同时可获得细胞相关的重要信息。

（三）二维等高图---------由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞相对或绝对数，即“等高”。曲线层次越高(越里面的线)所代表的细胞数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。

（四）三参数直方图---------在三维图中，任选FSC、SSC、FL1、FL2 中二个参数作为X 轴、Y轴，Z轴为细胞数，构成三维图。

（五）流式细胞仪的多参数分析---------多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析。

三、设门分析技术

Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。

FCM的分辨率：分辨率是衡量FCM测量精度的指标，通常用变异系数CV表示。一般要求CV<8，最好CV<3。第四节 流式细胞仪技术的要求

一、免疫检测样品制备

细胞样品制备要求：

1、单细胞悬液；

2、细胞最适密度0.5×106-1.5×106个/ml；

3、荧光染色后尽量洗净细胞外多余染料，减少荧光本底；

4、双染色时尽量选择发射光谱不接近的荧光色素，产生易区别的两种荧光颜色；

5、如果细胞分选后继续培养，细胞样品制备和上机应该无菌操作。外周血淋巴细胞样品的制备：分离单个核细胞

培养细胞的样品制备：蛋白酶消化-----机械吹打-----使贴壁细胞脱落-----洗涤-----尼龙网过滤 新鲜实体组织单细胞悬液的三种制备：

单细胞悬液的保存： 流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

机械法（金属网引起细胞破碎）

深低温保存法（一年）酶处理法（选择最适宜消化酶）

乙醇或甲醇保存法（2周）化学试剂处理法（导致细胞成活率降低）

甲醛或多聚甲醛保存法（2月）表面活性剂处理法 注意事项：

1、新鲜组织标本应及时进行处理保存；

2、根据实验目的选择最隹的固定方法；

3、酶学法要注意条件的选择和影响因素，要注意酶的溶剂，消化时间、pH 值、浓度等方面对酶消化法的影响。

4、需注意不同组织，选择相应的方法；如富于细胞的组织——淋巴肉瘤、视神经母细胞瘤、脑瘤、未分化瘤、髓样癌以及一些软组织肉瘤等，不一定采用酶学法或化学法；往往用单纯的机械法就可以获得大量高质量的单分散细胞；

5、在使用酶学方法时，要重视酶的选用，如含有大量结缔组织的肿瘤——食管癌、乳腺癌、皮肤癌等，选用胶原酶较好。

二、常用的荧光染料与标记染色 适用条件: ①有较高的量子产额和消光系数；②荧光强度与光量子产额之间的关系由下式表示：F=Q(I-eεCL)F 表示荧光强度，Q 表示光量子产额，I 表示激发光强度，￡表示消化系数，C 表示染液浓度，L 表示溶液厚度。③对488nm的激发光波长有较强的吸收；④发射光波长与激发光波长间有较大的波长差；⑤易与标记单抗结合而不影响抗体的特异性 荧光素发射荧光的基本原理：荧光素受到一定波度（激发波长）的激光激发后，其原子核外的电子由于吸收了激光的能量，由原本运动处于基础态轨道跃迁到激发态轨道上运动，然后当电子由激发态重新回到基础态时，释放出能量并发射出一定波长（发射波长）的荧光。

1、要选择正确的激光器：不同荧光素用不同的激发光波长的激发光来激发：

FITC 和PE 等的激发波长均为488nm，用产生可见光的氩离子激光器；APC 和PC5 等的激发波长在红光范围，需使用发射630nm 波长红光的氦-氖激光器。

2、各种荧光素的发射波长也十分重要，据此可以确定其检测所需光电倍增管性质； 如FITC，被激光激发后发射绿光，检测时要使用第一光电倍增管（即PMT1）；PE 则发射橙色光，需用第二光电倍增管（即PMT2）；PC5 和PerCP 等，发射的是深红色光，这时需选择第三甚至第四光电倍增管（即PMT3 或PMT4）,等等

常用的几类荧光染料

（二）免疫荧光标记

名称染料激发发射光溶解性对PH敏感特点荧光染料与细胞成分的四种结合方波长或荧光性式

结构亲和式

颜色

嵌入结合 共价键结合 异硫氰酸荧FITC488绿 易敏感易溶于水，与抗体结光素合不影响特异性52

5荧光标记抗体特异性结合 得州红Texas 568红 不易不敏感稳定，偶联后量子产免疫荧光标记方法

red额低615直标：干扰少,但需购买多种单抗

藻红蛋白PE488橙间标：步骤多,干扰多,不需标记多种575抗体

易不敏感具较多发光基团，消藻青蛋白PC488红组合标记

光系数和量子产额高

别藻青蛋白APC633红 670 能量传递复PEcy5488红易不敏感减少交叉，成本高 合染料670

三、免疫胶乳颗粒技术的应用-----液相芯片技术

是把微小的乳胶微球分别染成上百种不同的荧光色，把针对不同检测物的乳胶微球混合后再加入待标本，在悬液中与微粒进行特异性地结合，经激光照射后不同待测特产生不同颜色，并可进行定量分析。因检测速度极快，所以又有“液相芯片”之称。流式细胞仪分析技术及应用-------温医细胞生物学技术

四、流式细胞技术的质量控制

（一）单细胞悬液制备的质控

（二）免疫荧光染色的质控 适当的制备方式（不同标本来源外周血、骨髓、培养细胞等）

温度 试剂选择

pH 样品处理（蛋白质浓度、缓冲液、细胞条件、活性、自发荧光等）

染料浓度 实体组织来源标本用机械法

固定剂 温度25~37℃，pH7.0~7.2

（三）仪器操作的质控

光路与流路校正: 确保激光光路与样品流处于正交状态，减少变异（CV）。PMT（光电倍增管）校准: 保证样品检测时仪器处于最佳灵敏度工作状态。绝对计数校准: 保证计数的准确性。

（四）免疫检测的质控

同型对照：即免疫荧光标记中的阴性对照，选用相同源性的未标记单抗作为对照调整和设置电压，以保证特异性。全程质量控制：与待测标本一起标记和检测，结果达靶值，提示本次实验结果可靠。第五节、流式细胞仪的科研应用

1、细胞表型分析

2、胞内蛋白的检测

3、细胞周期和DNA倍体分析

4、流式标准小球定量

5、分选

6、细胞内钙离子测量

第六节、流式细胞术的临床应用

1、细胞周期和DNA含量分析

2、细胞凋亡的检测和分析

3、血小板及血小板活化的FCM 分析

4、造血干细胞（CD34+细胞）的检测

5、白血病和淋巴瘤免疫分型

6、网织红细胞分析

7、残余白血病检测

8、淋巴细胞亚群分析

9、肿瘤耐药基因分析

10、AIDS病检测中的应用

11、自身免疫病相关HLA抗原分析

12、移植免疫中的应用

1、DNA 含量分析检测原理：DNA 含量常和某种细胞周期相关蛋白同时检测，来分析细胞处于某一特定周期阶段。恶变肿瘤细胞一般多出现异倍体，有很多研究证明DNA 含量分析对人肿瘤的诊断预后有很高的价值。荧光染料和细胞 DNA 分子特异性结合具有一定的量效关系： ① DNA 含量多少与荧光染料的结合成正比；

② 荧光强度与DNA 分子结合荧光素多少成正比；

③ 荧光脉冲与直方图的通道值成正比。因此，FCM-DNA 定量分析1 个细胞增殖群时，可将二倍体DNA 含量分布组方图分为三部分：

即G0/

1、S、G2M ；G0/1和G2M 细胞峰的DNA 分布均为正态分布，S 期可以认为是一个加宽的正态分布。在癌组织DNA 直方图上，异倍体峰前总可以见到1 个或大或小的二倍体峰位的G0/1 细胞峰。另外，显微图象分析仪做异倍体检测时，都采用组织中淋巴细胞做对照。

在同一个肿瘤的不同区域、或原发肿瘤和继发、或转移灶、或随肿瘤病程发展、或经治疗的肿瘤灶，其DNA 倍性可能有所变化，这种倍体类型的差异，称为DNA 倍体异质性。DNA分析的临床意义

DNA分析诊断肿瘤：----DNA非整倍体细胞峰-----突出的四倍体细胞峰

DNA倍体分析：结合临床病理的形态学诊断，对一些恶性肿瘤进行早期诊断，跟踪随访和早期治疗，大大提高一些肿瘤的治愈率和生存率。尤其对一些细胞抽吸物、体液、组织液的脱落细胞的分析，意义尤为重要。增殖状态分析：反映了肿瘤的生长速度和侵袭性 FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用

DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待

形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助指标 细胞凋亡------（1）、早期细胞凋亡的流式细胞术检测：半胱氨酸蛋白酶3（caspases-3）

-------（2）晚期细胞凋亡的流式细胞术检测：DNA 含量分析法：目前检测凋亡细胞DNA 断裂的方法中，最常用、最简便的就是DNA 含量分析；DNA 直方图上显示在G0/1 峰前出现一个DNA 含量减少的亚二倍体或称亚G0/1 峰，又称凋亡细胞峰