细胞工程总结

第一篇：细胞工程总结

广州大学生命科学学院

08生工2班

黄永平

0820020044

细胞工程考点总结

名词解释：

细胞工程：是指以细胞为对象，应用生命科学理论，借助工程学原理与技术，有目的 地利用或改造生物遗传特性，以获得特定的细胞、组织产品或新型物种的一门综合性 科学技术。

细胞周期：通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细 胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。

细胞全能性：细胞具有该个体全部遗传的可能性，在一定条件下如受精卵一样，有发育成完整个体的固有潜在能力。两层含义：细胞无论是体细胞还是生殖细胞，均具有该物种全部的遗传信息；每个细胞均具有发育成完整个体的潜在能力。

细胞分化：指细胞在形态、结构和功能上发生差异的过程，包括时间上和空间上的分化。实质是基因的差异表达。

细胞脱分化：又称去分化，是指分化的细胞失去特有的结构和功能变成具有未分化细胞特性的过程，即分化细胞在适当的条件下转变为胚性状态而重新获得分裂能力的过程。可采用人工诱导技术诱导体细胞脱分化。

细胞再分化：指在离体条件下，无序生长的脱分化细胞在适当的条件下重新进入有序生长和分化状态的过程。事实上是基因选择性表达与修饰的人工调控的过程。

植物组织培养：是将植物器官，组织，细胞和原生质体等外植体在离体无菌条件下培养在人工培养基上，在适当的条件下诱发长成完整植株的一种技术。

植物激素：是植物自然状态下产生的对生长发育有显著作用的微量有机物，包括生长素家族、细胞分裂素家族、赤霉素、乙烯和脱落酸。

愈伤组织：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。植物组培中，指脱分化后的细胞经过细胞分裂，产生无组织结构，无明显极性的松散的细胞团。

体细胞胚：又叫胚状体，是指离体条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。其发生途径是指体细胞在离体培养的过程中经历了胚胎发育过程，起源于非合子细胞。发生实质是细胞再分化。

人工种子：含义为将植物离体培养产生的体细胞胚或芽包埋在含有营养成分和保护功能的人工胚乳和人工种皮中，在适宜条件下发芽出苗的颗粒体，即人工种子。

细胞核移植：是一种利用显微镜操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟细胞内的技术。用该方法所得到的动物为核质杂种。

胚胎分割：是指借助显微操作仪切割早期胚胎成多等份，再移植给受体，从而制造同卵多仔后代的技术，是一种广义上的动物克隆技术。

性别控制：是通过人工操作手段繁殖所需要性别后代的一门技术，其方法主要包括受精前控制、胚胎移植前控制。

试管动物：又叫体外受精动物，是指将供体的精子与卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。

试管婴儿：指将卵子与精子在体外受精，培养发育成早期胚胎再植回母体子宫内发育出生的婴儿也就是采用体外受精联合胚胎移植技术培育的婴儿。

细胞重组：是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，在体外进行重新装配成为具有生物活性的细胞的一种技术。

细胞拆和：把细胞质与细胞核分离开来，然后把不同来源的细胞质和细胞核相互结合，形成核质杂交细胞。

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0820020044 细胞融合：又叫体细胞杂交，是指将不同来源的原生质体融合并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。

体细胞杂交：是指将不同来源的体细胞融合并使之分化再生、形成新品种的技术。胚胎嵌合：又称胚胎融合，是将两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的部分或全部细胞混合在一起，使之发育成一个胚胎，然后移植到受体内继续发育成嵌合体后代的技术。雌核发育：或孤雌生殖，精核进入卵细胞后未与卵核融合而退化，卵核未经受精而单独发育成单倍体。远缘杂交中有时会出现此种现象。

植物细胞培养：在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。

细胞株：通过克隆化培养从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异性标记的细胞群。

细胞系：是由原代培养经传代培养纯化，获得的能在体外生存的细胞群体，第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。

单克隆抗体：是指经过免疫哺乳类动物单一的B淋巴细胞，要以分泌单一性抗体，这种抗体具有特异性和同质性。

干细胞：同时具有自我更新以及产生分化细胞的增殖性细胞。

组织工程：是利用生命科学、医学、工程学的原理与技术，利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。

细胞凋亡：也叫程序性细胞死亡，是机体维持环境稳定、有基因控制的细胞自主的有序性死亡。与细胞增殖、分化一样，都是正常的生理现象。这种细胞行为在数量控制和形态塑造中具有的意义。P27 染色体工程：按设计有计划削减、添加和代换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。

胚胎移植：又称受精卵移植，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。

胚胎工程：是按照一定的设计，有计划地消减、添加或替换同种或异种染色体从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。

简答题或问答题：

1．细胞工程的应用：

细胞工程的应用领域非常广泛，主要包括：优质植物快速培育与繁殖；动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种；利用动植物细胞培养生产活性产物、药物；新型动植物品种的培育；供医学器官修复或移植的组织工程；转基因动植物的生物反应器工程；珍稀动植物资源的保存与保护；在遗传学、发育学等领域的理论研究；在能源、环境保护等领域的应用。

2．为一农业生物技术企业设计一用于花卉快速繁殖组培工厂？画简图，并说明各室要求。

实验室一般由准备室、无菌间、操作间、培养室、分析室等几部分组成，其首要要求是工作环境和条件必须保证无微生物污染，环境清洁，各室的要求如下；

准备室；一般要与其他室分割开来，需放置药品柜、器械柜、灭菌锅、过滤除菌器、天平，加热设备等；要求宽敞明亮，通风条件好。

无菌间：进行无菌操作。要求封闭性好，无尘、干燥清洁，大小要合适，没有死角，能较长

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0820020044 时间保持无菌保持清洁，应防止空气对流，墙面和地面要求光滑，密封、安装滑门，定期用甲醛和高锰酸钾产生的蒸汽消毒，使用前开紫外光灯20min，更衣换鞋。严格的应包括更衣间、缓冲间和操作间3部分，缓冲间处于两者间 操作间：

培养室：对离体材料进行控制培养，能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，应保持干燥和清洁，一般设置在室内较少走动的内侧，需放置摇床、二氧化碳培养箱、生化培养箱光照培养箱、人工气候箱培养架等； 分析室：

3．分析比较细胞培养不同操作方式的优缺点。

分批式培养方式的优点有操作简单，培养周期短，能直观反映细胞生长代谢过程，生产规模放大比较容易，其缺点有不能控制底物浓度、细胞容易老化、生长周期短、效率低等；流加式培养的优点有可合理充足补充营养、减少产物反馈抑制、排除有害代谢物积累对细胞的损伤及细胞不易老化，另外还能避免一次性投料过多，改善培养液流体性质，延长指数生长期，其缺点是操作较麻烦，受生物反应器容积的限制等；半连续式培养能使细胞持续指数生长，可多次收获并且操作简便，生产效率高，其缺点是菌种易老化；连续式培养可使细胞在恒定状态下生长，细胞生长速率可基本保持不变，持续指数增长，但其缺点是收获细胞浓度不高、细胞分裂快、易变异、易污染等；灌流式培养可维持较高的细胞密度，使细胞处于较稳定的营养环境中，有害代谢废物积累低，反应速率易控制，培养周期长，目标产品回收率高，其缺点是仪器设备要求较高，操作较复杂等。

4．植物快速繁殖的技术路线：(P81)1）采集材料：①受精卵/②发育中的分生组织细胞（分生组织/根尖/嫩茎/幼叶/花等）/③雌雄配子及单倍体细胞；2）消毒材料：①自来水洗净然后用无菌纱布吸干水分，切成小块/②无菌环境中用70%酒精浸泡30~60秒/③材料移入漂白粉饱和液或0.01%升汞（HgCl2）水中消毒10min/④无菌水冲洗三四次；3）制备外植体：无菌环境下，用无菌刀剥去材料的鳞片、嫩枝的外皮或种皮胚乳（叶片不需），切成0.2~0.5cm厚的小片，操作中不可用手触碰；4）接种和培养：①接种：无菌环境下将切好的外植体立即接种在培养基上，每瓶4~10个②封口：接种后瓶、管用无菌药棉或盖封口，培养皿用无菌胶带封口③温度：培养基大多应保持在25℃左右，但要因花卉种类及材料部位不同而区别对待④增殖：在新梢等形成后需要继代培养；5）根的诱导：继代培养形成的不定芽和侧芽一般没有根，必须转到生根培养基上进行生根培养，一个月后即可获得健壮根系；6）组培苗的练苗移植：试管苗进入自然环境前必须进行炼苗，一般先将培养容器打开在室内自然光照3天，然后取出小苗，自来水洗净根须，栽入消毒过的基质，移植前适当遮阴，加强水分管理，保持较高的湿度，但基质不宜过湿，以防烂苗。

5．请分析植物激素在组织培养中的作用？

（答题要点：（1）、每种植物生长调节剂各自的作用。（2）、相对浓度）

植物激素：是植物自然状态下产生的、对生长发育有显著作用的微量有机物。

植物激素包括：生长素家族、细胞分裂家族、赤霉素、乙烯和生长抑制素。其中前三者是正向激素，后两者为负向激素。

生长素 植物体内的生长素是由色氨酸通过一系列中间产物形成的，主要途径是通过吲哚乙

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0820020044 酸。作用：在植物组织培养中，生长素主要用于诱导愈伤组织形成、诱导根的分化、促进细胞分裂、伸长生长。

Eg：吲哚乙酸：促进生长点细胞的分裂和非生长点细胞的伸长，诱导根原基的发生和根系的生成，促进雌花的分化和果实的成熟。

Eg：萘乙酸为代表的人工合成生长调节剂是一种生长素合成前体。

细胞分裂素 大多是嘌呤族衍生物，细胞生理素的生理作用主要是引起细胞分裂，诱导芽的形成和促进芽的生长。

赤霉素：广泛存在于植物体内，能促进细胞生长，与生长素一起可诱导细胞分化。经常使用的人工合成分裂素：6-苄氨基嘌呤（BA）、6-呋喃氨基嘌呤（又称激动素，KT）天然细胞分裂素:玉米素

分裂素和生长素通常一起使用，来促使细胞分裂、生长，一般在培养基中生长素与细胞分裂素的比值高时可诱导外植体生根，比值低时，可诱导外植体出芽，而比值适中时，愈伤组织增殖。

6、植物组织培养中出现的问题：

⑴玻璃化问题，即出现一些半透明状的畸形试管植物，该现象由于能引起植物的组织结构和生理功能异常，因此分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗，已成组织培养的一大问题；玻璃化现象主要是适应性的生理问题，其主要的防治措施有；适当提高光照强度，适当降低培养基中NH4﹢浓度，注意通气，注意细胞分裂素和生长素的配合以及激素和K+之间的配合使用，及适当进行低温处理等；⑵褐变问题，也是一种植物组织培养中常见的现象，已成为植物组织培养发展的一大障碍，防止或缓解褐变的方法有：选择适宜的外植体（生长旺盛时期的材料）；选择适宜的培养条件（酸性环境）；细胞筛选和材料的预处理，主要是剔除是褐变的细胞，减少材料醌类物质的产生等；使用抑制剂和吸附剂；⑶微生物污染问题；⑷其他问题，如研究水平，难培养植物，品种退化问题等。

7．什么是植物胚胎培养？植物胚胎培养有怎样的意义？

植物胚胎培养是指将植物的胚及具胚器官（如子房、胚珠、胚乳）在离体条件下培养，使之发育形成幼苗的过程。其意义有：克服杂种胚的败育，获得稀有杂种；获得单倍体和多倍体；打破种子休眠，促进胚萌发；快速繁殖良种，缩短育种周期；克服种子生活力低下和自然不育性，提高种子发芽率；提高后代抗性，改良品质；用于种子活力快速测定、种质资源的搜集和保存等。

8．植物脱毒的原理、方法：

答案

一、主要有物理、化学和生物三种方法；物理方法有高温处理和低温处理两种方法，高温处理又称热疗法，原理是有些病毒对热不稳定，植物基本不受伤害，得该方法只对部分病毒有效且高温处理容易使植物材料受热枯死，造成损失；低温处理又称冷疗法，原理是降低温度能使病毒活力下降，但该法用时长。化学方法是利用化学药品（嘌呤、嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等）处理患病植物以抑制植物体内病毒的复制，但该法一些化学物质不能使病毒失活，且对植物有毒害；生物方法，其原理是病毒不会侵染植物的每一部位，因此选择不带病毒的外植体来再生植株就可以达到去病毒的目的；有茎尖培养，通常取0.2~0.5mm茎尖，该法周期短、效率高但培养基及剥离技术要求较高；微体嫁接法，适用于茎尖培养脱毒生根困难、不能形成完整植株的植物；另外，还有愈伤组织诱导脱毒、珠心胚培养法和花药培养脱毒。答案

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0820020044 1物理方法：a.高温处理.去除病毒的原理是一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40度）即钝化失火，繁殖力下降，失去侵染能力，而植物基本不受伤害。包括温汤处理（50度热水中处理数分钟至几小时）

热风处理（35-40度处理几十分钟至数月）

a.低温处理

原理：降低温度能使病毒代谢能力下降，活力下降。

2.化学方法：原理:利用嘌呤和嘧啶类似物、氨基酸、抗生素等化学药品处理患病植物可以抑制植物体内病毒的复制。3.生物方法 原理：病毒并不会浸染植物的每一个部位，因此选择不带病毒的外植株来再生植株就可以达到祛病毒的目的。

a.茎尖培养

最有效的植物脱毒方法，具有周期短、效率高的特点。原理：因为茎尖区无维管束，病毒难以进入。

b.微体嫁接法 原理：将极小的茎尖嫁接到不带病毒的种子实生苗砧木上得到无毒苗。c.愈伤组织诱导脱毒

原理：由无病毒细胞的产生的愈伤组织可以获得无病毒苗。

d.珠心胚培养法：原理：通过珠心胚培养可以获得无毒的再生植株，同时又保存了母株的遗传特性。

e.花药培养脱毒

原理：花药培养可产生无病毒植株。

9．脱毒植物的鉴定：

直接检测法（观察症状）

指示植物法，指采用对某种病毒反应敏感、症状明显的植物来检测病毒，指示植物一旦

1摩擦接种（与金刚砂混合）感染病毒就会在叶片或全株上表现出特有的病斑，具体方法有○和○2嫁接法；○3电镜法，用电子显微镜观察样品材料有无病毒存在，并可同时鉴定病毒颗粒大小、形状和结构；○4抗血清检测法，病毒携带抗原，注射进动物体内会在血清中产生抗体得到抗血清，不同病毒产生的抗血清具有高度的特异性和专一性；○5分子检测技术，利用已知病毒的核苷酸序列设计引物，采用PCR技术体外扩增病毒的DNA片段，或者通过探针杂交等分子技术检测。

10．什么是试管动物？试管动物培育一般经过哪几个步骤？其繁殖技术的关键问题有哪些？

试管动物，也称体外受精动物，是指将供体的精子和卵子在体外受精，体外培养胚胎发育到一定阶段，通过胚胎移植移入受体完成发育出生的动物。其培育步骤一般经过以下五个步骤：⑴精子采集与体外获能，卵子采集与成熟培养；⑵体外受精；⑶重组胚激活与体外培养；⑷胚胎移植；⑸体内发育、出生。关键问题有：①精子的采集、获能和卵子的采集与成熟培养；②体外受精问题；③胚胎体外培养中的发育阻滞问题；④胚胎移植成活率低的问题；

11．胚胎细胞克隆动物与体细胞克隆动物各有什么优势？

胚胎细胞克隆动物的优势有：⑴受体、供体均是胚胎细胞，胚胎细胞分化程度较低，成功率较高；⑵核供体取自同一胚胎，因而可能一次性繁殖性状相同或高度相似的动物。

体细胞克隆动物的优势有；⑴体细胞数量丰富，易于获得；⑵被获取核供体的动物不受性别限制，年龄不要求在能产生胚胎的年限。

12．胚胎工程动物培育的关键技术环节有哪些？如何控制成功率？

关键技术环节有：体外受精、人工受精、核移植和胚胎移植四个环节；要控制成功率，首先要对各个环节技术熟悉了解及掌握，即深化理论知识；另外在各个环节总结成功的经验，第5页，共9页 广州大学生命科学学院

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0820020044 如在胚胎移植上，应选择与供体发情周期同步的、生殖道正常、无疾病、繁殖史良好的雌性动物为受体接受胚胎移植；最后，还应加强术后护理等，这样将可提高成功率，总之，要控制成功率，应对各个环节的相关技术、应注意的问题进行精细控制，这样才能控制成功率。

13．植物细胞融合的过程：

首先取材（生长旺盛、生命力强的组织）并制备原生质体，即去除细胞壁，去除的方法有机械去除法和生物酶解法，然后纯化原生质体，纯化的方法有离心法（原生质体沉于离心管底部）、漂浮法和离心和漂浮结合法；接着是诱导细胞融合，诱导的方法分为生物法、化学法和物理法；生物法是利用病毒诱导细胞融合（病毒能与宿主细胞膜直接融合，打破两个细胞膜的隔阂引发细胞质的交流）该法需在适当pH下，有足够量的Ca2+存在；化学法是指采用化学诱导剂促使细胞融合的方法，常用的诱导剂有：NaNO3、高pH的高浓度Ca2+、聚乙二醇（PEG）等；物理法，常采用的方法是电融合诱导法，是利用电场来诱导细胞彼此连接成串，再施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促进细胞融合的技术。

14．怎样获得植物的单倍体、三倍体和四倍体？

植物四倍体获得的方法：因秋水仙素能特异性地与细胞中的微管蛋白分子结合从而使纺锤丝合成受阻，最终形成染色体加倍的核，故可用秋水仙素来获得四倍体，其具体方法是根据不同植物对秋水仙素的敏感性不同调整秋水仙素浓度，其有效含量一般在0.01%~0.4%，以0.2%左右最为常用，然后，以适宜浓度处理分裂能力强的细胞，处理方法包括浸染法、涂抹法等，浸染法是先将种子浸种催芽，待胚根露白时把种子浸在秋水仙素溶液内24h，浓度高时处理时间可相应短些，且对于幼嫩而分裂迅速的组织也可短些，且处理时温度应在18~25℃之间；另外还可用细胞松弛素B来处理。单倍体的获得方法是：花药和花粉培养，具体方法是先花药制备与培养：取特定时期（单核期）未开放的花蕾，低温处理（放在4℃冰箱预处理）3~5天，然后用70%乙醇擦拭花蕾表面，在无菌条件下剥取花粉，接种于适当的培养基中，于25℃光照条件下培养，然后通过分离、过筛、清洗获得花粉外植体，最后经过植株再生发育成单倍体植株。获得植物三倍体的方法是，用以上获得四倍体的方法得到四倍体后，再以二倍体作父本，与四倍体母本植株杂交便可获得。

15．鱼的三倍体的获得方法：（如何用细胞工程的方法获得动物的三倍体？）

（1）温度休克法获得。温度休克法包括冷休克法（0~5℃）和热休克法（30℃）两种其关键是能否成功地阻止细胞分裂或卵子第二极体的释放。一般来说冷水性鱼类应用热休克法好，温水性鱼类用冷休克法效果较好。（2）水静压法，指采用较高的水静压（如65kg/gm2）可抑制卵子第二极体的释放或细胞分裂，产生多倍体，处理时间较短，一般在3~5min。（3）体细胞杂交，即通过四倍体个体与二倍体个体杂交而获得。

如何利用细胞工程方法获得鱼类或者是贝类的三倍体，四倍体。

生物学:主要通过杂交尤其种间杂交获得异源多倍体

物理学:温度休克法、水静压法和高盐高碱法等

温度休克法原理阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出

水静压法原理

抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体

化学:化学物质可用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生3n或4n，如细胞松弛素B。细胞松弛素Ｂ原理能抑制肌动蛋白聚合微丝，从而抑制细胞质分裂。

三倍体---原理，四倍体---原理？

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0820020044 如何鉴定得到了三倍体/四倍体？

16．什么是植物细胞培养？其特点有哪些？

植物细胞培养是在离体条件下，将分离的植物细胞通过继代培养增殖，获得大量细胞群体的一种技术。其特点有：①D10-200um,较微生物大30-100倍，②以一定细胞数的非匀相细胞团形式存在，很少单一细胞悬浮生长；③具纤维素细胞壁和大液泡，很容易被剪切力损伤；④生长速度慢,操作周期长,分批培养需2-3周,半连续/连续培养则2-3个月；⑤培养基成分丰富/复杂，适合微生物生长，防止污染更困难；⑥一般需光照光合, O2 和 CO2的含量与传递对细胞培养影响较大等特点。

17．什么是植物细胞固定化培养，它有什么优点？

植物细胞固定化培养是将游离的细胞包埋在惰性支持物内部或贴附在它的表面多糖或多聚化合物置备成的网状支持物中、培养液呈流动状态进行无菌培养的技术。其方法有：吸附、交联、共价结合和包埋等。其优点有：①细胞包埋后所受剪切力损伤减小，维持了细胞稳定性，适于植物细胞传统生物反应器的大规模培养；②细胞密度较高时不会改变培养液流体性质，利于传质；③次级代谢产物在细胞停长后才大量合成，固定化可将细胞生长与产物合成2个阶段分开；④细胞生长较缓慢，利于次生代谢产物积累；⑤增加细胞之间接触，促进了细胞间信息传递，利于代谢产物合成；⑥固定化细胞可反复使用，可利于连续培养和收获产物，降低成本等优点。

18．什么是次级代谢产物，如何提高植物次级代谢产物？

次级代谢产物上通过次级代谢合成的产物，大多是分子结构比较复杂的小分子化合物，如抗生素、激素、生物碱、毒素等。提高次级代谢产物产量需要考虑的因素有；细胞株、培养工艺、培养技术及培养设备等，具体是选育优良的细胞株，培养时保证培养基和培养条件符合细胞生长和代谢的需要，通过添加次级代谢产物的前体物质进行调控，还可以通过添加表面活性剂增加细胞膜的通透性等。

限制植物细胞培养大规模生产有价值次级代谢产物的影响因素

1.生物因素

（1）细胞株（2）细胞凋亡（3）细胞团（4）生物合成机制 2.化学因素

（1）营养盐（2）前体（3）诱导子（4）反馈抑制 3.物理因素

主要包括：光照、温度、通气、搅拌、pH值等。（1）光照（2）温度（3）pH 4.工程技术问题

（1）培养液的流变特性、（2）气体传递（3）搅拌与剪切力（4）泡沫与器壁表面粘附性

19．毛状根培养生产次级代谢产物：

毛状根又名发状根，是植株或组织、器官受到发根农杆菌感染后而形成的类似头发一样的根组织。利用毛状根培养可以克服天然根培养存在的难培养等问题与不足。将发根农根杆菌含有的Ri质粒中的T-DNA片段整合到植物细胞的DNA上诱导出毛状根；常用的毛状根诱导的方法有外植体接种法（共同培养2~3d）、茎秆接种法（植株的茎尖、叶片切去，划出伤口，将发根农杆菌接种在伤口处培养）和原生质体—农杆菌共培养法（培养3~5d）。毛状根培养的优点有；生长快，易培养；毛状根分化程度高，产生次级代谢产物能力强；通过

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0820020044 T-DNA改造，易于采用基因工程途径提高次级代谢产物产量等。

20．微藻特点与分类：

微藻分为原核藻类和真核藻类，现国内外已可以大量培养的微藻分别属于蓝藻门、绿藻门、金藻门和红藻门。微藻的特点有：①利用太阳能和CO2通过光合作用生产有机物，生长速度快，效率高，耗能低；②微藻提取有效成分需要复杂的前处理；③种类多，许多微藻可产生有生物活性的化合物；④可能利用贫瘠土地、盐碱地等极端环境；⑤微藻培养简单，容易产业化等。

21．动物细胞体外培养的特点有哪些？需要哪些条件？

培养特点有：①动物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感；②动物细胞生长缓慢，易受污染；③正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去；④动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面才能生长等。动物细胞体外培养需要的条件有：①培养基，应包括细胞各种代谢所需的各种成分；②需平衡盐溶液、培养基pH调整液、细胞消化液和抗生素液等；③生长条件，包括温度、pH、渗透压、气体等；④培养工具，如GO2培养箱、相差显微镜、培养皿、培养瓶等。

22．动物细胞大规模培养的方法有哪些？各自主要是为了解决什么问题？

动物细胞大规模培养的方法及其为了解决的问题是：⑴转瓶（管）培养系统，为了解决从小量培养到大规模培养的过度问题；⑵微载体培养，为摆脱传统的培养瓶（管）培养限制，实现三维立体贴附培养；⑶中空纤维生物反应器培养，为改善传统培养方法的气体、营养物质及水分等物质的通透性使水分子、营养物质和气体可以透过，细胞也能在上面贴附生长；⑷大规模培养方式，常采用的是流加式培养和灌流式培养的操作方式，该法是为使细胞持续生长到较高的密度，目标产品达到较高水平。

23．动物细胞原代培养及技术要点：

接种组织块直接长出单层细胞或将组织分散成单外细胞再进行培养，在首次传代前的培养称为原代培养。原代培养的优点有：在一定程度上能反映体内的形态学特征，原代细胞是很好的实验材料，原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。

原代培养取材时需要注意的几个问题是：①选择性取材，应选分化程度低、容易培养的组织，如胚胎、新生组织等；②取材要注意使用新鲜材料和保鲜，取材后一般6h内分离细胞；③取材应该严格无菌；④防止细胞机械损伤；⑤避免组织干燥等。动物细胞原代培养有组织块原代培养和细胞原代培养。

24．与常规细胞工程技术相比，转基因技术在生物遗传改造方面有什么特点？

转基因技术是通过人工方式将外源基因整合到生物体基因组内，并使该转基因生物能稳定地将此基因遗传给后代的技术。其与常规细胞工程技术相比，在生物遗传改造方面的特点有：可实现不同种类生物之间的基因重组，可使人类根据自己的意愿定向地改造生物的遗传特性，创造新的生命类型等。

25．乳腺生物反应器：

乳腺生物反应器是将外源基因置于乳腺特异性调节序列之下，使之在乳腺中表达，然后通过回收乳汁获得有重要价值的生物活性蛋白的技术。其在生产药用蛋白上具有巨大的优势，主要表现在：①生产出的药用蛋白与天然蛋白质的活性一致；②动物乳腺不仅能大量持续地表达蛋白质，可维持所表达蛋白质的稳定性，而且可通过诱导系统调控表达；③成本低，第8页，共9页 广州大学生命科学学院

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0820020044 安全性可靠；④药物分离纯化工艺简便等。

26．干细胞有什么特征？如何获得？

特性：具有自我维持与自我更新的能力，具有多方向分化的潜能，即可发育成各种胚胎组织的细胞，或可分化为本系统各谱系的细胞，干细胞分裂能力可维持相当长时间，有的可保存终生，既有生理性的更新能力，也具有对损伤与疾病导致的反应与修复能力。形态特征：通常呈圆形或椭圆形，体积小，核质比例大，具有较高的端粒酶活性，因此具有较强的增殖能力。增殖缓慢，质稳性。

获得的方法：可从早期胚胎内生细胞团或原始生殖细胞也可从自发或诱发的畸胎细胞中分离得到，也可通过核移植方法获得（？）。伦理方面的问题？？

27．目前，胚胎干细胞研究存在的问题：

有：⑴来源限制；⑵体外培养困难；⑶安全性不高；⑷伦理道德问题等。

28．什么叫组织工程，其基本要素有哪些？组织工程有什么作用？

组织工程是利用生命科学、医学、工程学的原理与技术，利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。其基本要素包括：种子细胞、支架材料、细胞因子三个。其作用主要表现在临床应用上，如用组织工程技术生产一些骨、肌腱、血管，人工肝等器官为医疗提供原料等。

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第二篇：细胞工程总结

★绪论：

细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特征，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体有关理论和技术方法的学科。★第一章：

细胞全能性：一个生活细胞所具有得产生完整生物个体的潜在能力。（作为植物组织或器官的基本单位细胞，在离题培养条件下，实现分裂和分化并能发育成胚胎和完整植株的能力）

细胞分化：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。

脱分化：培养条件下使一个已分化的细胞回复到原始无分化状态或分生细胞状态的过程。

再分化：当细胞脱分化以后，无序生长的细胞及其愈伤组织要重新进入有序生长才能再生为个体的过程。

按细胞分裂能力植物细胞可分为3类：第一类始终保持分裂能力：茎尖、根尖及形成层细胞。第二类分化终端细胞，永远失去分裂能力：筛管、导管、气孔保卫细胞等特化细胞。第三类暂不分裂细胞（G0细胞）在受到外界刺激后可重新启动分裂：表皮细胞及各种薄壁细胞。离体培养中器官发生的方式：先芽后根、先根后芽、愈伤组织的不同部位形成芽和根，在通过维管组织的联系形成完整植株。

器官分化过程：第一阶段外植体经过诱导形成愈伤组织。第二阶段是“生长中心”（即分生组织，愈伤组织中形成器官的部位）形成。第三阶段器官原基及器官形成（生长中心部位形成不同的器官原基，进而分化出相应的组织和器官）。

体细胞胚：离题培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。

体细胞胚形成的途径：1直接途径就是从外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚，如：直接从子叶基部的表皮细胞或切口处产生体细胞胚。

2、间接途径是在固体培养中外植体先形成愈伤组织，再分化发育产生体细胞胚；悬浮培养中先产生胚性细胞团再形成体细胞胚。与器官发生形成个体的途径相比，体细胞胚发育再生植株的特点：一是体细胞胚具有双极性，二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统联系较少，即出现生殖隔离现象。

体细胞胚的特点：

1、起源于非合子细胞

2、双极性细胞能同时允许根芽发生

3、存在生殖隔离

4、经历类似合子胚发育的各种胚共四个发育阶段

5、遗传稳定变异相对较小

6、由性细胞发育而来 ★第二章;

离体培养条件下遗传变异的特点：普遍性、局限性、嵌合性、生理适应性。

影响体细胞遗传与变异的因素：1供体植物（原有的倍性水平在培养细胞多倍化过程中起着重要作用）2培养基及培养方式（培养方式、激素以及其他附加成分均会诱导体细胞变异的发生）3继代培养的次数（继代时间越长继代次数愈多细胞变异的概率就越高）。★第三章：

实验室的组成：基本实验室，辅助实验室，实验室布局。其中基本实验室分为准备室（进行一切与实验有关的准备工作）接种室（进行材料的离体无菌操作）培养室（对离体材料进行控制条件下的培养）。辅助实验室又分细胞学实验室和生化分析实验室。

基本设备配置：常规设备（天平、冰箱、酸度计、离心机、加热器、纯水器、分装设备）、灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒装置、紫外灯）、无菌操作设备（净化工作台、接种箱）、培养设备（培养架、培养箱、摇床、生物反应器）、其他设备。灭菌技术：培养基灭菌（高压蒸汽灭菌或过滤灭菌）玻璃器皿灭菌（湿热和干热灭菌）金属用具灭菌（使用前干热灭菌使用中浸泡在70%的酒精中，再以火焰将酒精烧去，冷却）操作环境灭菌（气体熏蒸或紫外线照射）

培养基成分：无机盐类、有机化合物、生长调节物质、水、其他附加成分。

外植体：指用于离体培养的活的植物组织，器官等材料。

外植体的来源有三种：生长在自然环境下的植物、有目的地培养在温室控制条件下的生长的植物、无菌环境下已经经过离体培养的植物。培养基组成：

1、无机盐类：大量元素、微量元素；

2、有机化合物：糖类、维生素、肌醇、腺嘌呤、氨基酸、其他复合成分；

3、生长调节物质：生长素类、细胞分裂素类、赤霉素类；

4、水；

5、其他附加成分：琼脂、活性炭。

外植体灭菌选择：

1、种子灭菌；

2、芽，叶片，茎等组织材料灭菌；

3、未成熟胚，子房，及花药灭菌。注意：灭菌后的材料应立即接种培养，否则会造成二次污染。★第四章：

快速繁殖：利用细胞的再生特性，在组织培养条件下加速繁殖材料的个体生产提高繁殖系数

植物脱毒和快繁的意义：1能够有效保持优良品种特性2生产无病毒种苗，防止品种退化3快速繁殖新品种，加速优良品种推广4节约耕地，提高农产品商品产出率5便于运输

离体繁殖：在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。

立体繁殖的一般技术环节：1无菌培养物的建立2培养物的增殖3器官分化4植株的形成和移栽

培养基的增殖方式：芽增殖，不定芽增殖，胚状体的增殖，愈伤组织增殖。

增值方式的选择：首先选择茎芽增殖，其次是不定芽，除非万不得已不宜选择愈伤组织增值方式。

花药培养：把发育到一定阶段的花药接种到人工培养基上，使其发育和分化成为植株的过程。

花粉培养：从花粉中分离出花粉粒使之成为分散的或游离的状态，通过培养使花粉粒脱分化进而发育成完整植株的过程。共同点：利用花粉染色体、单倍体性培养发育

不同点：1.花粉培养可以避免花药壁花丝和药隔等体细胞组织的干扰能更好地调节控制雄核发育的各种因子；2.花粉数量大具有单细胞单倍性和较高同步性等特点，可以从较少的花药获得大量的花粉植物，3.花粉培养还能为研究细胞分化条件胚胎发生和形态发生机理提供较为理想的实验系统，4花药培养的成功为深入展开原生质体的培养遗传操作和发育分子生物学的研究提供了有用的材料和良好的技术基础。

单培体培养的特点;1体细胞染色体数目减半；生长发育弱，体型小，各种器官明显减小；2各种器官明显减少；3雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。

单培应用潜力:1迅速获得纯和性材料，缩短育种年限2获得育种中间材料3与诱变育种结合可提高诱变率4作为遗传工程受体更有效5与体细胞融合6用作基础研究的各个领域。

胚培养的意义:1克服杂交育种中杂种胚的早期夭折2克服珠心胚的干扰，提高育种效率3理论研究的意义，胚培养可用于探讨植物器官发生过程的许多问题，研究胚发育中胚乳的作用和进行胚胎切割实验等。胚培养类型:成熟胚培养和幼胚培养。

幼胚培养的生长发育方式：1胚胎发育2早熟萌发3愈伤组织 胚乳发育类型：核型 细胞型 沼生目型 ★第五章

植物细胞培养：在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其增殖的技术。

细胞悬浮培养：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。

用于建立细胞悬浮培养的愈伤组织要求：有较好的松散型，使之在悬浮培养的起始阶段易打散；还必须必备较强的增殖和再生能力。满足细胞悬浮培养体系的三条件：1悬浮培养物分散性良好，细胞团较小一般在30到50个细胞以下；2均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色；3细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2到3天甚至更短时间可增加一倍。

悬浮细胞培养的同步化:同一悬浮培养体系中的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。

同步化方法：分选法，饥额法，抑制剂法，低温处理法。

单细胞培养方式:微室培养，看护培养，平板培养，其他单细胞培养技术。

生物反应器类型：搅拌式，气动式，固定化细胞。悬浮细胞的生长动态（S曲线）：延迟期、指数生长期、直线生长期、减缓期、静止期。当细胞生长进入减缓期时，就要及时继代。★第六章

原生质体：除去细胞壁后的裸露的球形细胞。

原生质体的特点：虽然没有了细胞壁，但仍能进行植物细胞的各种基本生命活动，如蛋白质和核酸的合成、光合作用、呼吸作用以及通过质膜的物质交换等。

原生质体纯化方法：

1、沉降法；优点是搜集方法方便，操作简单，原生质体丢失少。但这种方法在漂洗过程中易造成原生质的损害且纯度不够好，常存在少量脱壁不完全的细胞和破碎的原生质体。

2、飘浮法；优点是可收集较纯净的原生质，还可避免在离心纯化过程中因震荡撞击或挤压引起的原生质损伤或破裂，所用试剂简单，成本低，从而造成原生质体的获得率较低。缺点是原生质在数量上损失较多。

3、梯度离心法：优点：获得原生质体更为纯净。原生质活力测定原理：

方法:荧光素双醋酸酯染色法（FDA），酚藏花红染色法，荧光增白剂染色法(CFW)，伊凡蓝染色法。

原生质的应用：1原生质由于脱去了细胞壁并且在离体培养条件下能够实现细胞的全能性而且再生植株，可以作为一个良好的试验系统而用于细胞壁的形成与功能，质膜的结构与功能，细胞骨架细胞分化与脱分化等基础理论问题的研究。2原生质体容易摄取外缘DNA、染色体、细菌、细胞器和质粒等，从而为高等植物细胞水平和分子水平的遗传操作提供理想的实验体系。3原生质体还可应用于体细胞杂交，无性系变异及突变体的筛选，细胞器的分离等研究。4原生质体可以作为植物生理学，分子生物学，遗传学，病毒学，育种学，体细胞遗传学和实验生物学等学科的理论和应用研究提供重要的实验体系。5作为遗传转化的受体。★第七章

植物体细胞杂交:又称原生质体融合将植物不同属种甚至科间的原生质体通过人工方法诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。

融合方法：

1、PGE诱导融合方法，优点是融合成本低，不需特殊设备；融合子产生的异核率较高，融合过程不受物种限制。缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害作用。

2、电融合法：优点是不存在对细胞的毒害问题，融合效率高，融合技术操作简便。缺点是仪器昂贵，给融合技术的实际应用带来一定的限制。★第八章

人工种子的概念：任何一种人工种皮包被或裸露的具有形成完整植株能力的繁殖体。人工种子的分类：（根据包被的需要程度分）

1、裸露或休眠的繁殖体。

2、被人工种皮包被的繁殖体。

3、水凝胶包埋在包被的人工种皮的繁殖体。（根据繁殖体的类型分）1体细胞人工种子2非体细胞人工种子 人工种子的特点：一 重要的经济作物、粮食作物以及多年生经济林木的人工种子报道日益增多。二 是以微器官为繁殖体的报道呈增加趋势，其中包括微芽、微枝、原球茎、小鳞茎和小块茎等。人工种子组成的三个部分：繁殖体、人工胚乳和人工种皮。★第九章

玻璃化:是指液体转化为非晶体的固化过程。

玻璃化法：是将生物材料经极高密度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。玻璃化的途径：1 大幅度提高冷却速率 2 增加溶液浓度 影响超低温保存效果的因素：植物的基因型 抗冻性及器官、组织和细胞的年龄及生理状态。

冰冻保护剂的特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的类型：渗透型冰冻保护剂、非渗透型冰冻保护剂。第十章

植物基因转化受体系统：用于转化的外植体通过组织培养途径及其它非组织培养途径，能高效、稳定的再生无性系，并能接受外源基因的整合，对用于转化选择的抗生素敏感的再生系统。植物基因转化受体系统的类型：1 经过愈伤组织的受体系统 2 不经过愈伤组织的受体系统 3 原生质体在生系统 4 细胞系及其体细胞胚受体系统 5 生殖细胞受体系统。★论述题：

植物细胞工程的应用：

1、在植物育种上的应用：将常规植物育种技术与植物组织培养技术相结合，可以获得常规技术难以获得或无法获得的种质材料。（快速获得特殊倍性材料、克服远源杂交不亲和、克服杂种胚早期夭折、导入外援基因、突变体筛选、种质资源保存）

2、种苗脱病毒与快速繁殖：利用茎尖培养脱毒，在组织培养条件下或在具有良好的病毒传播隔离条件下进行无病毒种苗的快速繁殖；利用组织培养技术，亦使许多传统上繁殖系数很低的有性繁殖植物得以快速繁殖，大大提高了经济效益。

3、细胞培养生产有用次生产物：植物几乎能生产人类所需要的一切天然有机化合物，如：蛋白质、脂肪、糖类、天然药物、香料、生物碱及其它活性物质。4在植物生物学和发育生物学研究中的应用：植物不同组织、细胞培养获得再生个体，及其在此过程中所形成的调控技术本身，进一步揭示里植物细胞全能性学说的本质和内涵，是对细胞生物学领域的重要贡献。

5、在植物遗传、生理生化以及植物病理等基础研究中心的应用：利用细胞途径进行染色体操作，可以有目的地创造植物附加系，代换系，易位系为染色体工程的研究开辟新途径；细胞培养和组织培养为研究植物生理活动提供了理想技术体系；在人工培养条件下对植物抗病性进行研究，免除了环境条件的干扰，使得结果更加真实可靠。人工种子的应用前景：

1、微器官人工种子可能最先用于无性繁殖植物：微器官如微芽、试管块茎和试管鳞茎等作为繁殖体时，成苗率高且出苗整齐，具有田间应用的可行性，同时，在立体培养中，可采用脱毒技术首先出去病毒后再进行人工种子生产，可大大提高无性繁殖植物种子的质量，避免天然种苗引起的病害传播。

二、人工种子可用于天然种子繁殖后代群体变异大的植物：不定芽试管苗繁殖体技术已在生产上显示了树体整齐的优越性，以微芽为繁殖体的人工种子技术已经建立，可大大降低生产成本，减少运输损耗。

三、以体细胞胚为繁殖体的应用的可能性体细胞胚胎发生在多种作物中已经进行过深入研究，然而迄今仍未达到实际应用的程度。总之，目前体细胞人工种子技术还不完全成熟，但它在生物学和社会经济发展中的潜在利用价值不容否认。

第三篇：细胞工程学习总结

主要学习内容 植物细胞工程? 是在植物细胞全能性的基础上，以植物细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按照人们的意愿发生改变，从而改良品种或创制新种，或加速繁殖植物个体，或获得有用产物的过程。2 植物细胞的全能性? 生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性。3植物细胞的全能性原理 ? 生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因，从理论上讲，生物体 的每一个活细胞都应该具有全能性。4 植物组织与器官培养? 是指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞（体细胞、生殖细胞等）、胚胎、原生质体等培养在人工配置的培养基上，给予适当的培养条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽，或者长成新的完整植株的一种实验技术。5 愈伤组织? 是指由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。6 脱分化? 一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的细胞团或愈伤组织的现象。7 再分化? 指原已分化的细胞过脱分化后再次分化的现象，最终可进一步形成完整的小植株。8继代培养 ? 是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上进行培养的方式。9 植物细胞培养? 是指在离体条件下，将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养，得到悬浮细胞，再通过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细胞群体的技术。它是在组培基础上发展起来的。10 动物细胞培养? 动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。11细胞系? 由初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群称细胞系.12干细胞? 是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞。13胚胎干细胞? 指由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外抑制培养而筛选出的细胞。14成体干细胞? 指存在于一种已经分化组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞。15全能干细胞? 具有自我更新和分化形成任何类型细胞的能力，有形成完整个体的分化潜能。16细胞融合（体细胞杂交）? 将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。17合胞体 ? 在细胞融合过程中，开始阶段只来自两个细胞的细胞质先聚集在一起，而细胞核仍保持彼此独立，这种特定阶段的细胞结构称为合胞体。18同核体 ? 基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体。是由同源的原生质体融合产生的。19异核体 ? 来自不同基因型的细胞融合形成的杂交细胞为异核体。由非同源的原生质体融合产生的。

20杂种细胞（体细胞杂种）? 来自不同细胞核的染色体合并到一个细胞核内，产生出杂种细胞。由于这种杂种细胞的双亲都是体细胞，因此又叫做体细胞杂种。21单克隆抗体（McAb）? 是由遗传性高度一致的克隆细胞分泌出的成分单

一、有特异性的抗体。22胚胎移植? 也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术，所以也称为“借腹怀胎”。23染色体工程? 是人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。广义上讲它还应包括染色体内部的部分遗传操作技术，因此也称为染色体操作。24 雌核发育? 是单性生殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。同种或异种精子进入卵内只起刺激卵子发育的作用，不形成雄性原核和提供遗传物质，其子代的遗传物质完全来自雌核，只具有母本的性状。转基因动物？将外源重组基因转染并整合到动物受体细胞基因组中，从而形成在体表达外源基因的动物，称为转基因动物。

26随着细胞生物学，分子生物学，遗传学等学科发展核研究的日益深入，细胞工程近年来得到快速的发展，以及成为现代生物工程的一个重要代表性领域，具体而言，细胞工程的一些研究领域包括：1动植物细胞与组织培养 2细胞融合 3染色体工程 4胚胎工程 5细胞遗传工程 动植物细胞与组织培养可分为三个层次上的培养：细胞培养、组织培养和器官培养

28植物细胞与组织培养技术最显著的价值在于: 优良植物的快速繁育与代谢产物的大量制备方面。

29染色体工程主要分为: 动物染色体工程和植物染色体工程 胚胎工程采用的新技术包括:胚胎分割技术、胚胎融合技术、卵核移植技术、体外授精技术、胚胎培养、胚胎移植以及性别鉴定技术、胚胎冷冻技术 31当今，细胞工程已经称为生物学家手中经常应用的技术之一。并已经成为生物工程的重要组成部分和主导领域之一，涉及面及其广泛，在许多领域都有非常重要的应用价值，并且已经取得了惊人成就。如1动植物细胞与组织培养2细胞融合3染色体工程4胚胎工程5细胞遗传工程？

细胞工程应用，内容包括

1、优质植物快速培育与繁殖

2、动物胚胎工程快速繁殖优良、濒危品种

3、利用动植物细胞培养生产活性产物、药品

4、新型动植物品种的培育

5、供医学器官修复或移植的组织工程

6、转基因动植物的生物反应器工程

7、珍惜动植物资源的保存与保护

8、在遗传学、发育学等领域的理论研究

9、在能源、环境保护等领域的应用1234567？

33胚胎工程的最成功的应用领域体现在畜牧业---，主要是采用胚胎移植技术进行优良品种的快速繁殖与胚胎保存-----，----？

染色体工程技术最大的价值体现在-新品种的培育------，主要是单倍体和多倍体----，---育种方法？

35植物细胞工程主要利用传统的-杂交，回交---，-------的方法达到改变染色体的目的？

36动物细胞培养基分类: 1）天然培养基2）合成培养基3)无血清培养基 37干细胞增殖特性1缓慢性:2自稳性:干细胞能自我更新维持自身数目 的恒定

38干细胞的分类，按发生学来源:1胚胎干细胞2 成体干细胞 按分化潜能: 1全能干细胞2多能干细胞3单能干细胞 39体外受精技术主要包括以下几个主要方面：12345？

精子的采集与获能、卵子的回收及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植等。

胚胎工程是在胚胎移植技术上发展起来的现代生物技术，在畜牧业生产和临床上具有广泛的应用，它主要包括12345等？

外受精技术、胚胎移植技术、胚胎分割技术、胚胎冷冻保存技术和性别控制技术 41染色体要确保在细胞分裂中保持稳定，必须要能够自我复制和向子细胞中平均分配。它需要3个关键序列，包括123。？ 自主复制DNA序列、着丝粒DNA序列和端粒DNA序列

42人造微小染色体在大片段DNA分子的克隆、基因组分析、基因功能鉴定、基因治疗以及研究染色体结构与功能关系等研究中得到了广泛的应用，具有极为重要的价值。目前，正在研究或应用的有123？

43转基因动物的方法，123？

反转录病毒法；基因显微注射法；胚胎干细胞移植法 44植物组织培养基本步骤 ？

①培养材料的采集；②培养材料的消毒；③制备外植体；④接种和培养；⑤根的诱导；⑥组织苗的练苗移栽。45图绘植物体细胞杂交的基本过程？

46植物间的体细胞杂交意义？

植物间的体细胞杂交所得到的杂交细胞，已达到了完整的植株水平，获得了新的杂交植物，使来自两个亲本细胞的基因有可能都被表达，这就打破了远缘生物不能杂交的屏障，提供了创造新物种的可能。47图绘植物组织培养过程？

动物细胞特点？

无细胞壁；倍增时间长，生长缓慢；培养中需氧量少，对搅拌敏感；多以聚集体存在；原代细胞培养50代即开始退化；细胞连接复杂 49动物细胞体外培养特点？

1)营养条件苛刻除一般的营养物质外,还要血清；2)适应性差, 对环境敏感包括对PH、溶解氧、二氧化碳等；3)培养时间长，易污染 主要是生长缓慢;显著的污染是培养基的PH迅速改变.50动物细胞体外培养条件？

温度：37度；pH：7.2-7.4；气体：氧，二氧化碳，氮气；营养条件：培养基；需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供。

51图绘动物细胞体外细胞生长增殖过程？

52异种细胞移植存在的问题？

•非自体细胞移植过程中必然发生不同程度的排斥反应，与器官移植不同，它不具有正常器官的解剖结构，一般不需吻合血管；

•在提纯、培养的过程中，常发生损伤和活力丧失或减弱，经过几代传代繁殖后，有可能发生变异；

•由于失去正常生存环境，长期生长常不利。

•非自体细胞用于组织工程实践时，病人的免疫系统摧毁植入物是最大的难题。•尽管同种异休移植免疫排斥反应与异种移植免疫排斥反应机理明显不同，但仍有一些共同特点，补体介导的排斥反应被认为是异种移植的主要障碍(超急性排斥)。

•一旦超急性排斥得以防止，异种移植将面临与同种异体移植物排斥相同的许多问题。

53体外受精的意义？

家畜体外受精技术经过近20年的发展，已取得很大进步，为实现动物胚胎的工厂化生产提供了可能，对充分发挥良种母畜的繁殖潜力，加快家畜品种改良和优良品种遗传资源的开发与利用,加速畜牧业的发展具有重要的科学意义和实用价值。

54胚胎移植的意义？

①发挥优良母畜的繁殖力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广 应用；②缩短世代间隔、增加选择强度，促进家畜改良速度；③长期保存 冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存；④是胚胎分割、胚胎嵌合、性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的 重要手段。

雌核发育的意义？

为生产单性种群提供了可能；能迅速地产生同源型二倍体；提供某些致死突变种的生物品质；在农牧渔业生产中，可人工控制性别繁殖；广泛地用于进行基因-着丝点的定位研究；可利用产生新的纯系来筛选除去有害的等位基因。56染色体分离的基本原理？ 由于荧光染料Hoechst 只对A-T特异性染色，而染料Chromomycin只对G-C特异性染色。染色体上DNA的碱基序列是不同的，因此这些特异性染料和不同染色体上DNA结合的量和比例是不同的。结合这些染料后，再经激光照射，染色体就会呈现不同的荧光带。将特定染色体发出的荧光波长输入计算机，通过计算机控制就可将发出同一波长的染色体收集在一起，从而实现染色体的分离。57体内干细胞的意义？

•在于源源不断地补充体内一些短命组织的细胞来源，如血液细胞、皮肤细胞以及精巢等，或者组织或器官受到局部损伤时，它们可以再分裂形成新的该组织和器官，是体内的一种自我修复机制。

•人类干细胞工程就是利用人体内干细胞的特征来达到体外产生人类所需的产物的探索。主要用于器官修复，基因治疗等。58动物细胞融合技术主要应用？

(1)染色体的基因定位这是融合细胞技术应用的主要成果之一。如：将人体细胞与小鼠细胞融合，在杂种细胞系中，优先排斥人染色体，因此，每种细胞系都仅含有一条或若干条特异性的人染色体。通过对这些细胞系生理生化功能分析，就可以断定特定的人染色体的功能。已经证明，仅保留着1号人染色体的人-小鼠杂种细胞系，才能合成人尿苷单硷酸激酶，证实编码这种激酶的人基因定位在1号染色体上。(2)遗传疾病的治疗与基因互补分析。将不同人类疾病遗传缺陷的突变细胞融合，产生的杂种细胞由于基因的互补作用，可恢复其正常的表型。应用基因互补分析，断定突变体所涉及的基因数目，分析基因的结构，剖析遗传疾病的病因:杂种细胞测定。不互补，缺失同一基因或同一基因产生同样突变；互补，缺失不同基因或同一基因不同部位发生突变

(3)制备特殊活性物质：生产单克隆抗体：将能分泌胰岛素、生长激素等具有特殊功能的细胞，与在体外能长期传代存活的骨髓瘤细胞融合，就可能选择到既能生产特殊活性物质，又具长寿命的杂种细胞克隆系。应用细胞融合技术，有可能得到生产生长激素、促性腺激素、催乳素、胰岛素等各种杂种细胞系。59图绘单克隆抗体技术过程？

免疫动物；融合细胞的制备；细胞融合；杂和细胞筛选；抗体检测；大规模生产

60单克隆抗体技术应用？

①病毒性疾病的诊断和治疗：可检测多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。诊断异常准确，误诊率大大降低。例如，抗乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）的单克隆抗体，灵敏度比当前最佳的抗血清还要高100倍，能检测出抗血清的60％的假阴性。

②癌症治疗：可检查出尚无临床表现的极小肿瘤病灶，检测心肌梗死的部位和面积。人们正在研究“生物导弹”——单克隆抗体作载体携带药物，使药物准确地到达癌细胞，以避免化疗或放射疗法把正常细胞与癌细胞一同杀死的副作用。在人体扫描图技术和肿瘤定位方面已获得很大进展。

③生产免疫避孕药：可精确地检测排卵期，将早期胚胎来制备单克隆抗体。新一代免疫避孕药就是用精子，卵透明带或早期胚胎来制备单克隆抗体，将它们注入妇女体内，人体就会产生对精子的免疫反应，从而起到避孕作用。

④生产生物药品：生物药品主要有各种疫苗、菌苗、抗生素、生物活性物质、抗体等，是生物体内代谢的中间产物或分泌物。过去制备疫苗是从动物组织中提取，得到的产量低而且很费时。现在，利用细胞工程或细胞融合途径，大大提高了效率，还能制备出多价菌苗，可同时抵御两种以上的病原菌的侵害。⑤免疫学研究：鉴定、区分各种抗原检测抗原上的决定簇；对抗体的基因定位及表达进行研究。

⑥大分子蛋白的提纯：将抗体交联到溴化氢活化的琼脂糖基质上，制成免疫亲和层析柱。提纯得到的蛋白质杂质含量低，对产物起始浓度求低。61 转基因动物制备过程 ？

外源目的基因的制备；外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞；选择获得携有目的基因的细胞；选择合适的体外培养系统和宿主动物；转基因细胞胚胎发育及鉴定；筛选所得的转基因动物品系。62转基因动物在生命科学基础研究中的应用？

研究基因的结构与功能；研究基因的组织特异性表达；研究发育相关基因的表达与调控；克隆在发育中起重要作用的基因；基因多级调节系统的研究；细胞功能研究。

第四篇：细胞工程

正交试验设计过程

对于单因素或两因素试验，因其因素少，试验的设计、实施与分析都比较简单。但在实际工作中，常常需要同时考察3个或3个以上的试验因素，若进行全面试验，则试验的规模将很大，往往因实验条件的限制而难于实施。正交试验设计就是安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。

一、正交试验设计的概念及原理

1、正交试验设计的基本概念

正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。

2、正交试验设计的基本原理

在试验安排中，每个因素在研究的范围内选几个水平，就好比在选优区内打上网格，如果网上的每个点都做试验，就是全面试验。如上例中，3个因素的选优区可以用一个立方体表示（图10-1），3个因素各取3个水平，把立方体划分成27个格点。若27个网格点都试验，就是全面试验。3因素3水平的全面试验水平组合数为33=27，4因素3水平的全面试验水平组合数为34=81，5因素3水平的全面试验水平组合数为35=243，这在科学试验中是有可能做不到的。正交设计就是从选优区全面试验点（水平组合）中挑选出有代表性的部分试验点来进行试验。

3、正交表及其基本性质

3.1 正交表

由于正交设计安排试验和分析试验结果都要用到正交表，因此，我们先对正交表作一介绍。常用的正交表已由数学工作者制定出来，供进行正交设计师选用（详见有关参考书）。正交表记号为La（bc），其中L代表正交表，a表示试验的次数即行数，b表示因素的水平数，c表示因素的个数即列数。

3.2 正交表的基本性质

3.2.1正交性

•任一列中，各水平都出现，且出项的次数相等；

• 任两列之间各种不同水平的所有可能组合都出现，且出现的次数相等；

3.2.2代表性

• 一方面，任一列的各水平都出现，使得部分试验中包括了所有因素的所有水平；任两列的所有水平组合都出现，使任意两因素间的试验组合为全面试验。另一方面，由于正交表的正交性，正交试验的试验点必然均衡地分布在全面试验点中，具有很强的代表性。因此，部分试验寻找的最优条件与全面试验所找的最优条件，应有一致的趋势。

3.2.3综合可比性

任一列的各水平出现的次数相等；任两列间所有水平组合出现次数相等，使得任一因素各水平的试验条件相同。这就保证了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干扰。从而可以综合比较该因素不同水平对试验指标的影响情况。

根据以上特性，我们用正交表安排的试验，具有均衡分散和整齐可比的特点。•所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的。

所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的5、试验结果分析

• 分清各因素及其交互作用的主次顺序，分清哪个是主要因素，哪个是次要因素； 判断因素对试验指标影响的显著程度； 找出试验因素的优水平和试验范围内的最优组合，即试验因素各取什么水平时，试验指标最好； 分析因素与试验指标之间的关系，即当因素变化时，试验指标是如何变化的。找出指标随因素变化的规律和趋势，为进一步试验指明方向； 了解各因素之间的交互作用情况； 估计试验误差的大小。

5.1直观分析法——极差分析法

计算简便，直观，简单易懂，是正交试验结果分析最常用方法。

Rj为第j列因素的极差，反映了第j列因素水平波动时，试验指标的变动幅度。Rj越大，说明该因素对试验指标的影响越大。根据Rj大小，可以判断因素的主次顺序。

Kjm为第j列因素m水平所对应的试验指标和，kjm为Kjm平均值。由kjm大小可以判断第j列因素优水平和优组合。

5.1.1确定试验因素的优水平和最优水平组合分析A因素各水平对试验指标的影响。根据正交设计的特性，对A1、A2、A3、A4来说，四组试验的试验条件是完全一样的（综合可比性），可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么kA1、kA2、kA3、kA4应该相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判断A1、A2、A3、A4对试验指标的影响大小。由于试验指标为产率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可断定A2为A因素的优水平。

同理，可以计算并确定B、C、D因素的优水平。

5.1.1确定试验因素的优水平和最优水平组合分析A因素各水平对试验指标的影响。根据正交设计的特性，对A1、A2、A3、A4来说，四组试验的试验条件是完全一样的（综合可比性），可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么kA1、kA2、kA3、kA4应该相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判断A1、A2、A3、A4对试验指标的影响大小。由于试验指标为产率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可断定A2为A因素的优水平。

同理，可以计算并确定B、C、D因素的优水平。

5.1.2确定因素的主次顺序

根据极差Rj的大小，可以判断各因素对试验指标的影响主次。极差越大的，该因素对产率的影响越大，反之越小。

5.1.3绘制因素与指标趋势图

以各因素水平为横坐标，试验指标的平均值（kjm）为纵坐标，绘制因素与指标趋势图。由因素与指标趋势图可以更直观地看出试验指标随着因素水平的变化而变化的趋势，可为进一步试验指明方向。

最后得出试验的最优组合和次优组合。

5.2方差分析

极差分析法简单明了，通俗易懂，计算工作量少便于推广普及。但这种方法不能将试验中由于试验条件改变引起的数据波动同试验误差引起的数据波动区分开来，也就是说，不能区分因素各水平间对应的试验结果的差异究竟是由于因素水平不同引起的，还是由于试验误差引起的，无法估计试验误差的大小。此外，各因素对试验结果的影响大小无法给以精确的数量

估计，不能提出一个标准来判断所考察因素作用是否显著。为了弥补极差分析的缺陷，可采用方差分析。

方差分析基本思想是将数据的总变异分解成因素引起的变异和误差引起的变异两部分，构造F统计量，作F检验，即可判断因素作用是否显著。

方差分析基本思想是将数据的总变异分解成因素引起的变异和误差引起的变异两部分，构造F统计量，作F检验，即可判断因素作用是否显著

5.2.1 偏差平方和

1616

nS总（y

n1

2y）2

j2n12jynCTIV2j2CTG21616,Gn1yn,f总16115S因素IjIIIII4CT

Ij、IIj、IIIj、IVj分别表示第j列中1,2,3,4水平对应的试验结果之和。

总偏差平方和＝各列因素偏差平方和+误差偏差平方和。

5.2.2自由度

f总=试验的次数-1；f因=因素的水平数-1。

5.2.3方差

A因素的方差=A因素的偏差平方和/A因素的自由度

误差的方差=误差的偏差平方和/误差的自由度

5.2.4构造F统计量

5.2.5列方差分析表，作F检验

• 当FA>F0.01(f1，f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有高度显著地影响，记作**。当F0.01(f1,f2)>FA>F0.05(f1,f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有显著地影响，记作*。当F0.05(f1,f2)>FA>F0.10(f1,f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有一定的影响，记作*-。

查表可得F0.01(f1，f2)、F0.05(f1,f2)、F0.10(f1,f2)的值。

6、验证试验结果

经结果分析得出最优生产条件，进行最优试验条件的验证。

7、结论

通过了验证试验，最后可以得出结论。

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S因素

F因素f因素S误差

f误差

第五篇：植物细胞工程总结

绪论

1, 细胞工程：是应用细胞生物学和分子生物学方法，借助工程学的实验方法或技术，在细胞水

平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，以获得特定的细胞、细胞产品或新生物体的有关理论和技术方法的学科。广义的细胞工程包括所有的生物组织、器官及细胞离体操作和培养技术。狭义的细胞工程是指细胞融合和细胞培养技术。

根据研究对象的不同，高等生物的细胞工程分为动物细胞工程和植物细胞工程。动物细胞工程包括细胞培养技术（包括组织培养、器官培养），细胞融合技术，胚胎工程技术（核移植、胚胎分割等），克隆技术（单细胞系克隆、器官克隆和个体克隆）。植物细胞工程包括植物组织、器官培养技术，细胞培养技术，原生质体融合与培养技术，亚细胞水平的操作技术等。

2, 植物细胞工程：以植物组织细胞为基本单位，在离体条件下进行培养、繁殖或人为的精细操 作，使细胞得某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种或创造新物种，或加速繁殖植物个体，或获得有用物质的过程称… 植物细胞工程的应用：

1，利用细胞融合技术，克服远缘杂交不亲和性。2，利用培养变异，筛选优良的突变体。3，倍性育种，缩短育种年限。

4, 离体种质保存。5，细胞培养生产有用的物质。第二章

一，实验室设置及内部设备

实验室建设应考虑的问题：

1、实验的性质

2、实验室的规模

细胞工程实验室: 基本实验室:准备室、无菌操作室、培养室 贮藏室 辅助实验室：细胞学实验室、生化分析实验室 温室

1、准备室

完成所使用的各种药品的贮备、称量、溶解、配制、培养基分装及高压灭菌；器皿、材料的洗涤等工作。

主要设备

纯水器 工作台 药品厨 天平电磁炉 冰箱 玻璃器皿 酸度计 高压灭菌锅 干燥箱等

2、无菌操作室（接种室）

用于植物材料的消毒、接种、培养物的转移、原生质体的制备以及一切需要进行无菌操作的技术程序。

接种室应用推拉门，设有缓冲间，面积2m2为宜。进入接种室前更衣换鞋，减少带入接种室杂菌。

接种室主要设备

超净工作台 ：每次实验前要用紫外灯灭菌20min，关掉紫外灯开始工作，工作过程中注意一直开着吹风机。

无菌操作用具： 离心机 细胞融合仪

3、培养室

用于接种材料的培养。培养室的大小可根据需要培养架的大小、数目、及其他附属设备而定。其设计以充分利用空间和节省能源为原则。控制：温度、光照、湿度。

培养室主要设备：培养架 空调 时控器 自动开灯、关灯温度自动记录仪 摇床 二，培养基

1，培养基的种类

培养基根据其态相不同分为固体培养基与液体培养基。根据培养物的培养过程，培养基分为初代培养基和继代培养基。根据作用不同，培养基为诱导培养基、增殖培养基和生根培养基。根据营养水平不同，培养基分为许多种,常用如下：（1）MS培养基：富盐平衡培养基（还有LS、BL、ER）

特点: ①无机盐浓度较高，元素比例合适，是较稳定的平衡溶液；②微量元素种类齐全； ③营养丰富。

（2）B5培养基 ：高硝态氮培养基（还有N6和SH培养基）

特点: ①硝酸钾含量高； ②氨态氮含量低； ③ VB1含量较高。（3）N6培养基：高硝态氮培养基

特点：硝态氮含量高，氨态氮含量较低。

（4）White培养基：低盐培养基（还有WS、HE、改良Nitsch等 特点：无机盐含量低，有机成分也很低，适于生根培养。（5）KM-8P培养基：

特点:有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。培养基成分：水 无机盐 有机成分 植物激素 培养物支持材料 辅助性物质 2，植物激素的应用规律

①先Aux后CKs处理,有利于细胞分裂但不利于细胞分化。容易产生多倍体细胞（核分裂和胞壁形成不同步所至），cks有利于胞壁形成。

②先CKs 后Aux处理，细胞分裂也分化(可能是内源生长素起作用)③ Aux 和CKs 同时处理，分化率提高。Aux与CKs的比值改变形态建成的方向。

高 有利根分化，抑制芽形成； Aux / CKs 适中 促进愈伤组织生长；

低 有利芽分化，抑制根形成；

在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异, 培养基配制：

1、确定配方

2、移母液

3、定容

4、称蔗糖

5、调PH值（用0.1MNaOH或HCl调PH值为5.8）

6、培养基熬制（加琼脂）

7、分装（100ml的三角瓶约装入30－40ml, 30瓶/L）

8、扎口

9、灭菌

10、接种 三，植物材料灭菌

灭菌方法 ①.培养基灭菌：高压湿热灭菌，某些激素采用过滤灭菌

②.玻璃器皿灭菌：干热灭菌：150℃ 40min;120℃ 2h，湿热灭菌：121℃, 30min 接种前用酒精棉球擦试，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。

③.接种工具灭菌：用前干热灭菌，用前湿热灭菌，接种前用酒精棉球擦试，浸入95%酒精液中，并在酒精灯火焰上灼烧灭菌。电热石英砂灭菌器 ④.实验服、口罩灭菌：湿热灭菌

⑤.接种室灭菌 ：紫外灯照射(接种室、超净台)：波长260nm，距离小于1.2m，15-20min。臭氧灭菌机：1-2h,熏蒸灭菌：(5-8ml甲醛+5g高锰酸钾)/ m3 ,接种台喷雾消毒：75%酒精。⑥.培养室灭菌 : 新建培养室用前要彻底熏蒸1次。

隔1周用洗衣粉水或来苏水拖地1次，用高锰酸钾擦架1次。

⑦.物体表面灭菌: 灭菌方式：喷雾、涂抹杀菌 ,范围：超净台的台面和四壁、双手 消毒剂：70%酒精；1-2%来苏水；1%新洁尔灭等。

⑧.接种材料消毒: A, 取材 营养器官：根、茎尖、茎段、叶片等

生殖器官：胚胎（胚、胚珠、胚乳等）和花药 等

外植体〔explant〕：从植物体上分离下来的用于离体培养的材料 外植体灭菌

用化学灭菌剂灭菌

消毒步骤：①流水冲洗或洗衣粉漂洗②用化学灭菌剂浸润消毒通常：70%酒精30S，0.1%升汞4-10min。表面有较厚蜡质层的的可加吐温-20或吐温-80等浸润剂(灭菌液的0.5%)。③无菌水冲洗3-5次。注：灭菌液要浸没材料 第三章 植物细胞全能性与形态发生

一、植物细胞全能性(totipotency)：植物体每个正常细胞都含有该植物的全部遗传信息，在适宜的条件下如同受精卵一样, 具有发育成完整植株的潜在能力。

细胞分化〔cell differentiation〕指由于细胞分工而导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。细胞脱分化〔cell dedifferentiation〕培养条件下使一个已分化的细胞失去已分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之回复到分生细胞状态或胚性细胞状态的过程。或具有特异结构和功能的细胞转化成没有特异结构和功能的细胞的过程。

愈伤组织〔callus〕植物离体培养过程中脱分化后的细胞，经过细胞分裂，产生的无组织结构、无明显极性、松散的细胞团称为愈伤组织。多在外植体切面上产生。

愈伤组织的特征：细胞分裂快，结构疏散，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。成功地脱分化将导致细胞分裂，形成愈伤组织或胚性细胞团。

植物胚胎干细胞：植物连续的器官分化是由顶端分生组织细胞发育而成，因此，植物顶端分生组织细胞具有较强的表达全能性的能力，被称为植物胚胎干细胞。

生理脱离效应;当细胞或组织脱离母体以后，在适宜的条件下将进行一些特殊的发育方式，如再生、复壮等，child将其称为生理脱离效应

（细胞）或（组织）与母体分离和激素的调控是细胞全能性表达的前提。在离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞脱分化和再分化实现的。脱分化是细胞全能性的表达前提，再分化是细胞全能性的表达最终体现。

静止细胞(G0细胞)启动分裂是分化细胞成功脱分化的重要标志。

细胞脱分化的三个阶段 ：1，启动阶段 细胞质增生并开始向细胞中央伸出细胞质丝，液泡蛋白出现。2，演变阶段 细胞核向中央移动，质体转变为原质体 3，脱分化终结期，回复到分生组织。

细胞再分化〔redifferentiatio〕脱分化后无序生长的分生细胞在离体培养下，重新恢复细胞分化能力，经过细胞分化、组织分化和器官分化递进地进行，最后再生完整植株。

极性(polarity)：植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同的轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异。细胞的不均等分裂是细胞极性建立的标志（即细胞分化的标志）。激素在植物生长发育中具有重要的调控作用，也是离体培养条件下，调控细胞脱分化和再分化的主要因素。其中生长素和细胞分裂素是两类主要的调控培养条件下细胞生长和分化的植物激素。

在离体培养条件下TEs则由愈伤组织薄壁细胞分化形成这是愈伤组织细胞分化器官的前提。植物的离体器官发生：培养条件下的组织或细胞团（愈伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。

离体培养中器官发生的方式

通过器官发生形成再生植株大体上有3种方式：

①先芽后根:是应该选择的方式.②先根后芽 ③根芽同长 植物细胞经再分化形成植株有2条途径：（在离体培养条件下）器官发生 体细胞胚胎发生 体细胞胚（胚状体、体胚）：指离体培养下没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程所形成的胚的类似物。

胚状体有以下几方面的界定：

①体细胞胚是离体培养的产物，只限于在离体培养范围使用，以区别于无融合生殖胚；②体 3 细胞胚起源于非合子细胞，以区别于合子胚；③体细胞胚经过了胚胎发育过程，以区别与离体培中器官发生形成个体的途径。

经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段： ①诱导外植体形成愈伤组织；②诱导愈伤组织胚性化，③体细胞胚形成。体细胞胚的结构与发育特点

1、与器官发生途径相比，体细胞胚在组织学上有3个特征： ①体细胞胚最根本的特征是具有双极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都是单极性的；

②体细胞胚的维管组织与外植体现存组织无解剖结构上的联系，而不定根或不定芽与外植体或愈伤组织的维管组织有联系。

③体细胞胚胎的维管组织分布是独立的Y字形结构，不定芽维管组织无此结构。人工种子：（狭义）植物离体培养中产生的体细胞胚，包裹在含有养分和具有保护功能的物质中，并在适宜条件下能够发芽出苗的颗粒体。

（广义）在体细胞胚、微型营养变态器官、不定芽等微繁体之外加上必要的营养成分后，用具有一定通透性而无毒的材料将其包裹起来，形成的与天然种子相似的颗粒体。第四章 离体培养下的遗传与变异

离体培养中的遗传与变异特点：

1、普遍性：变异可发生在各种培养类型中； 变异发生在各种植物的培养中；变异发生与培养类型有关。

2、局限性：一些单基因控制的性状不仅发生隐形突变，也发生显性突变。

3、嵌合性：是指同一有机体中同时存在有遗传组成不同的细胞它是组织培养中常见的现象。体细胞变异诱导材料的选择：其一，目标性状的可行性。体细胞突变的频率虽然较高，但对于某一个体来讲，变异的性状是个别的，因此选择综合性状良好的植物品种材料，通过诱变改变个别不良性状，是体细胞突变系选择的目的。其二，必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平，只有对起始材料有良好的培养技术，才有可能制定完满的诱变及选择方案。如果起始细胞的培养技术不成熟，不能再生整株，则不能进行后续的各项操作。其三，适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件。第五章植物主要的组织培养技术 第一节快繁

无性繁殖途径：

1、无融合生殖：即不经过减数分裂和受精而形成种子。

2、营养繁殖：即由母株的营养体部分再生出新的植株 植物离体快速无性繁殖：利用离体培养技术,用优良植株的外植体进行培养,在短期内获得大量遗传一致的个体的方法，这种离体无性繁殖方法由于繁殖速度快，又称离体快速无性繁殖。所获得的株群称单株无性系或单芽无性系

初代培养 ：芽、茎段、叶片等外植体在离体培养条件下诱导愈伤组织、侧芽或不定芽、胚状体过程。即接种某种外植体后，最初的几代培养。

生根培养：将芽苗转接到生根培养基上培养成为完整植株的过程 植物快繁常见问题及对策：

（一）污染的原因及预防：原因：细菌、真菌为病源菌；污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。预防措施：（1）防止材料带菌：避免阴雨天在室外采集外植体；春秋组培；材料预培养。（2）严格外植体灭菌（3）接种用具灭菌彻底（4）严守无菌操作规程（5）保持培养室清洁

（二）褐变的原因及预防原因（1）植物品种（基因型）（2）生理状态（3）培养条件（4）材料转接季节 防止措施（1）选择适宜的外植体（2）连续转接3）先液体培养再固体培养（4）加抗氧化剂（5）选择合适的培养条件加活性炭或 暗处培养。

（三）玻璃化的原因及预防原因：

（1）激素浓度（尤其CTK）高（2）琼脂浓度低（3）光照弱（4）温度高（5）通风条件不好（6）培养基离子种类及比例不适宜 预防措施：（1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，减少含氮化合物的用量，降低培养基的水势。（2）适当降低CTK的浓度。考虑加入适当的脱落酸。（3）增加自然光照；增加容器通气，控制温度。（4）加入活性炭、多效唑或CCC等物质。第二节、植物脱毒快繁技术 1热处理脱毒原理：

①病毒是DNA大分子，病毒进入植物细胞后，随植物细胞DNA一起复制。热处理并不能杀死细胞，只是钝化病毒的活性，使病毒在植物体内增殖减缓或增殖停止，而失去病毒的侵染能力。

②热处理是一种物理效应，可加速植物细胞分裂，在激烈分裂的细胞中正常核蛋白合成占优势，使植物细胞在与病毒繁殖的竞争中取胜。因此加速分生组织细胞的分裂，能够获得无病毒植株。

2、热处理脱毒方法：(1)温汤浸渍处理 适用于休眠器官，在50℃左右的温水中浸渍10min至数小时，方法简便易行，但易使材料受伤。(2)热空气处理 热空气处理对活跃生长的茎尖效果较好。将生长的盆栽植株移入温热治疗箱内（35-40℃）处理时间因植物而异，短则几十分钟，长可达数月。

分生组织不带病毒，可能有4方面的原因：

1、植物体病毒的移动主要靠2条途径：一是通过维管系统，而分生组织中尚未形成维管系统；二是通过胞间连丝，但这条途径病毒移动速度非常慢，赶不上茎尖和根尖细胞不断分裂和活跃的生长速度。

2、当植物细胞分裂DNA复制时，病毒DNA随着复制。因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争。在旺盛分裂的分生组织中，代谢活动很高，正常核蛋白合成占优势，使病毒无法进行复制。

3、茎尖中存在高水平内源激素，可抑制病毒的增殖。

4、在植物体内存在有一种“病毒钝化系统”，在分生组织中的活性最高，因而使分生组织不受侵染。

第三节 花药和花粉的培养

花药培养:将花粉发育至一定阶段的花药培养在人工培养基上，诱导其花粉粒改变发育进程，形成花粉胚或愈伤组织，进而分化成苗的过程。（器官培养）花粉培养(小孢子培养)：将发育至一定阶段花粉从花药中分离出来成为分散或游离状态，花粉脱分化后再生成苗。（细胞培养）

单倍体：具有配子体染色体数的孢子体。

单倍体植物3个明显特点：

1、体细胞染色体数减半

2、生长发育弱，体形小

3、雌雄配子严重不育

花药、花粉培养的意义

1、迅速获得纯合型材料，提高选择效率，缩短育种年限

2、获得育种中间材料

3、突变体选育

4、体细胞融合5、遗传研究

6、获得染色体异附加系和代换系

7、遗传工程受体 花粉植株再生途径：

1、经由成愈伤组织再生植株

2、经由胚状体再生植株 花粉分离收集：

由于花粉包于花药内，必须将它们从花药中分离、收集才能进行培养。方法： 1）花粉漂浮自然释放法:将花药接种于液体培养中，使花粉自然释放。2）人工挤压法:用玻璃棒捣碎花药使花粉释放。

3）机械法:用磁力搅拌器打碎花药释放花粉。

释放的花粉粒→ 尼龙网（孔径20—60um）过滤，除去药壁等组织 → 500-1000转/分离心1-5分钟，收集花粉。

花药培养过程中花药为什么要经过低温处理 低温处理的作用机理：

1）预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），进而形成愈伤组织或胚状体。2）提高小孢子的生活力，延缓退化速度，而提高了诱导率。

3）引起小孢子孤立化，即小孢子从花药中分离。因为低温处理过程中，花药内薄壁细胞和绒毡层逐渐退化，从而切断与小孢子之间的联系。花药培养时为什么要用较高浓度蔗糖和较低浓度激素？

蔗糖浓度 培养基中蔗糖浓度比其它组织培养高，尤其早期培养，一般5%—10%原因是花粉母细胞的渗透压比花丝等体细胞高，即高浓度的蔗糖不利于药壁、花丝等体细胞的生长，而利于花粉的生长。

激素 花药壁分化程度高，重新分裂需要较高的激素浓度才能启动。因此，花药培养基的激素水平要相对较低才能抑制二倍体细胞的分裂。确定适宜的激素浓度，以促使花粉细胞分裂的同时又抑制花药二倍体细胞分裂是成功获得单倍体的关键。第四节 胚胎培养

胚胎培养类型 胚培养 胚乳培养 子房培养 胚珠培养

胚培养概念：无菌条件下，把胚从种子、子房或胚珠中分离出来，在培养基上进一步生长发育形成幼苗的过程。

成熟胚培养：是指子叶已形成的种胚。仅提供一定的温度、湿度就可以发芽生成植物体。如种子的发育

成熟胚培养意义：克服发芽障碍；打破种子休眠，缩短育种周期等。幼胚培养：胚龄处于原胚期、球形胚、心形期、早鱼雷期的培养。

幼胚培养意义：

1、克服远缘杂交不育

2、克服珠心胚干扰，提高育种效率

3、幼胚具有较高再生能力，可通过体细胞胚胎发生产生大量的再生植株。

4、为原生质体培养、细胞融合及基因转化提供试验材料。幼胚培养时胚的发育方式有哪几种？各有何特点？

① 胚性发育：幼胚的离体培养，仍按在活体内的发育方式发育，最后形成成熟胚，然后再按种子萌发途径出苗形成完整植株，这种途径发育的幼胚一般一个幼胚将来就是一个植株

② 早熟萌发：离体胚不继续胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗，通常称为早熟萌发。在大多数情况下，一个幼胚萌发成一个植株，但有时会由于细胞分裂产生大量的胚性细胞，以后形成许多胚状体，从而可以形成许多植株，这种现象就是所谓的丛生胚现象。

③愈伤组织：在许多情况下，幼胚的离体培养首先发生细胞增殖，形成愈伤组织。一般来讲由胚形成的愈伤组织大多为胚性愈伤组织，这种胚性愈伤组织很容易分化形成植株。胚乳按发育初期是否形成细胞壁分为①核型胚乳②细胞型胚乳③沼生目型胚乳 试管受精：培养未受精的胚珠或子房并在试管内撒播花粉，使其受精形成具有生活力的种子。未授粉胚珠子房培养与授粉后胚珠子房培养有何不同？

根据培养的胚珠是否受精将胚珠培养分为受精胚珠的培养和未受精的胚珠的培养。(1)未受精的胚珠的培养,目的是为试管受精提供雌配子体。(2)受精后胚珠的培养,胚珠内胚的发育处于早期阶段,从两个细胞的原胚开始至球形胚阶段。

第六章 植物细胞培养及次生产物代谢生产

植物细胞培养：是指在离体条件下对植物单个细胞或小的细胞团进行培养使其 增殖的技术.培养方法：培养规模:小规模培养 大批量培养

培养方式:悬浮培养平板培养 看护培养 产物不同:诱变培养 次生产物培养

培养方式：悬浮培养、单细胞培养、植物细胞的规模化培养及有用物质生产

悬浮培养（cell suspension culture）悬浮培养是细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基进行培养增殖的技术。

成功的悬浮细胞培养体系必须满足3个条件：

1、浮悬培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。

2、均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同，悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。

3、细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加1倍。

培养周期的概念 具有一定起始培养密度的单细胞，从开始培养到细胞数目和总重量增长停止这一过程，称为一个培养周期。

悬浮细胞培养的同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。（植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚进入不同程度的分化状态，因此要达到完全同步化相当困难。）

细胞同步化的方法：①分选法：通过细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞进行分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中。

②饥饿法：在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期。

③抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期—G1期的同步化细胞。④低温法：冷处理也可提高培养体系中细胞同步化程度。

单细胞培养

1、平板培养

2、看护培养

3、微室培养

4、双层滤纸培养 植物次生代谢产物：植物中一大类并非植物生长发育所必需的小分子有机化合物，其产生和分布通常有种属、器官组织和生长发育期的特异性。次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢。

植物细胞大规模培养的技术要求：从细胞生长与培养技术方面讲必须满足以下3个条件

1、培养的细胞在遗传上应是稳定的，以得到产量恒定的产物。

2、细胞生长及生物合成的速度快，在较短的时间内能得到较高产量的终产物。

3、代谢产物要在细胞中积累而不被迅速分解，最好能将其释放到培养基中。固定化培养系统--固定化培养技术的优点在于：

1、可以较容易地控制培养系统的理化环境，从而可以研究特定的代谢途径，并便于调节；

2、细胞位置的固定使其所处的环境类似于在植物体中所处的状态，相互间接触密切，可以形成一定的理化梯度，有利于次生产物的合成；

3、由于细胞固定在支持物上，培养基可以不断更换，可以从培养基中提取产物，免除了培养基中因含有过多的初生产物对细胞代谢的反馈抑制，也由于细胞留在反应器中，新的培养基可以再次利用这些细胞生产初生产物，从而节省了生产细胞所付出的时间和费用；

4、正是由于细胞固定在一定的介质中，并可以从培养基中不断提取产物，因此，它可以进行连续生产。

利用细胞培养生产有用物质的一般程序

1、选材 应注意条件：①药效肯定②对其有效成分有充分的了解④市场短缺或价格昂贵；③有测定有效成分和药理的可靠方法⑤取有药效成分的部位，且该部位较易形成愈伤组织。

2、细胞株系建立

3、大量培养

4、产品提取与纯化 第七章 原生质体培养与融合 原生质体（Protoplast）：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞。

亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。

核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。

胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。

原生质体材料预处理(暗处理，预培养和低温处理)原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率。原生质体纯化方法有：

离心沉淀法 原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。漂浮法 原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。

接口法 原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间。原生质体培养方法

1、固体包埋培养（原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中。）

2、固体平板培养

优点：可以跟踪观察单个原生质体的发育情况，易于统计原生质体分裂频率。缺点: 操作要求严格，尤其是混合时的温度掌握必需合适，温度偏高则影响原生质体的活力，温度偏低则琼脂糖凝固太快原生质体不易混合均匀。

3、液体浅层培养(将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。)优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基转移培养物。缺点：原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。

4、固、液培养 优点：固体培养基中的营养物质可缓慢释放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中加一定量的活性炭，则还可以吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。

缺点：不易观察细胞的发育过程。

5、共培养法（将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合）

6、琼脂糖珠培养

7、饲养层培养

原生质体再生：再生细胞壁、细胞分裂和生长、植株再生（愈伤组织形成）

原生质体融合又称体细胞杂交是指将植物不同种、属甚至科间的原生质体通过人工诱导融合，然后进行离体培养，使其再生杂种植株的技术。融合方法

1、NaNO3法 NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原生质体不再相互排斥，而紧密结合 8 在一起 不足：诱导频率不高。

2、高pH-高Ca离子法 优点：杂种产量高。不足：高pH值对细胞有毒害作用

3、PEG法 特点：融合频率高、可重复性强、诱发融合无特异性、毒性较低

4、电融合法 特点 不存在对细胞毒害的问题、融合效率高、融合技术操作简便 原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。供体-受体式细胞融合包括非对称杂交和细胞质杂交两种方式。

非对称杂交是一亲本的细胞核和细胞质与另一亲本的少量核物质(1～2条染色体)和全部细胞质融合；

细胞质杂交是一亲本的细胞核和细胞质及另一亲本的全部细胞质融合，可能使两种来源不同的核外遗传成分(细胞器)与一个特定的核基因组结合在一起，这种杂种叫细胞质杂种。第九章后

1, 超低温通常是指-80℃以下的低温。常用的保存介质或容器有：超低温冰箱（-80～-150℃）、液氮（-196℃）和液氮蒸汽箱(-140℃液氮)等。

2, 用于离体超低温保存的植物材料一般有愈伤组织、悬浮细胞、胚、花粉和茎尖等。3, 细胞内外水的冻结状态时细胞冻存技术的关键。

4, 种质超低温保存的关键是降温冰冻过程中避免细胞内结冰。在降温过程中必须使细胞发生适当程度的保护性脱水，使细胞内外的水流到细胞外结冰，并且在化冻过程中防止细胞内次生结冰。因此针对不同种类的植物材料，筛选合适的冰冻保护剂，采用适当的降温冰冻速度和化冻方式可能使细胞不受损伤或使损伤减小到最低程度。

5, 超低温保存植物种质资源的程序包括培养材料的准备、预处理、冰冻及保存、化冻处理、细胞活力和变异的评价及植株再生等几个步骤。

6, 降温方法从降温方式来看，有快速冰冻法、慢速冰冻法、两步冰冻法和逐级冰冻法等。7, 玻璃化：是指液体转变为非晶体的固化过程。使溶液玻璃化得两条途径：大幅度提高冷却速率和增加溶液的浓度。

8, 玻璃化溶液（PVS1）,其中包含了20.5％的DMSO、15.5％的乙酰胺、10％的1,2-丙二醇以及6％的聚乙二醇，他们分别起到冰冻保护、毒性中和、强化玻璃化和非渗透聚合的作用。9, 超低温保存方法主要有：玻璃化法、包埋玻璃化法、干燥法、预培养法、预培养-干燥法和包埋脱水法。

10, 包埋脱水法的三个步骤：先将材料用藻酸钙包埋，然后将包埋后含有保存材料的藻酸钙小珠在含有高浓度（或梯度浓度）蔗糖的培养基上预培养，最后侵入液氮。

11, 玻璃化法是将生物材料经极高浓度的玻璃化溶液快速脱水后直接投入液氮，使生物材料连同玻璃化溶液发生玻璃化转变，进入玻璃态。

12, 材料的基本特性包括植物的基因型、抗冻性及器官、组织和细胞的年龄及生理状态。13, 冰冻保护剂具有的特点：易溶于水、对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。冰冻保护剂的作用主要表现在：增加膜透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，稳定细胞膜结构，阻止低温伤害，降低冰点，提高容液的粘滞性，阻止冰晶生长。