第一篇：细胞工程小论文
转基因植物的安全性问题
生命科学院
13级生物工程1班
20132076 周晓香
摘要：随着现在生物基因工程技术的发展和现代科技的进步，转基因植物越来越多，也为社会经济带来巨大利益。转基因技术可以将外源基因转入植物，但目前还不能精确预测转基因的所有表型效应，转基因植物的可能后果也还不明确。因此，转基因植物面临着环境释放安全性和食品安全性两方面的安全性问题。【1】而且，转基因一直以来都是备受争议的话题，有很多不同的声音。
关键词：转基因植物；环境释放安全性；食品安全性。
正文：转基因植物是指利用DNA重组技术将克隆的优异的外源基因转入到植物的细胞或组织中并表达，从而获得具有特定目标性状或具有新的遗传性状的植物。【2】而植物转基因技术是将从植物、动物、病毒或细菌等生物中分离得到的目的基因通过基因枪、农杆菌介导以及病毒感染等方法转入到受体植物的基因组中，使之稳定遗传并赋予受体植物新的优异性状，如：抗虫、抗病、抗旱、抗除草剂、耐寒、高产、优质等。【3】随着转基因技术的诞生以及它的快速发展，使人们能够按照自身的意愿去改变植物的基因，培育出新的品种，甚至改变它的遗传特性。可想而知，转基因植物的发展将在很大程度上推动社会的进步和产业的发展。但在转基因植物取得惊人的成果的同时，它的安全性也成为了科学家、政府以及广大消费者关注的焦点，也成了当今世界共同讨论的话题。1 转基因植物的食品安全性
转基因食品又称基因修饰食品，即用转基因生物制造或产生的食品。1994 年美国 Calgene 公司的转基因延熟番茄经FDA 批准上市, 成为第一例通过安全评价的转基因植物食品。迄今为止, 全世界已有 40 多个可能作为食品来源的转基因植物获得批准上市。主要包括延熟番茄 ,抗除草剂的玉米、抗虫棉等。【4】转基因植物的食品安全问题包括以下几个方面： 1.1转基因食品的营养物质
由转基因植物加工而成的食品是否与同种类的非转基因植物加工成的食品或者说天然的绿色食品一样，可以提供人类或动物生长繁殖必需的营养物质。人们担心的是在进行转基因操作时会导致某些营养成分的减少，甚至缺失，会造成营养水平的改变，降低食用价值，长期吃食转基因食品，可能会对人体造成不利的影响，甚至会造成某些疾病。1.2转基因植物的毒性问题
由于目前转基因植物大量使用来源于细菌或病毒中的基因序列作为外源基因的组成部分 ,消费者担心这些外源基因会像细菌或病毒一样对人体有毒害作用。目前 ,转基因作物大多是直接用于饲料 ,有的则通过加工转化成其他食品。一些研究者认为，转基因植物中表达的抗虫毒素或蛋白酶抑制剂，既然能使取食其叶片的昆虫消化系统功能受到损害，也就有对人畜产生伤害的可能性，这种毒素的积累是个相当长的过程，但它可能正在进行中，因此目前尚不能确保转基因食品没有毒性。1.3过敏源问题
在某些转基因植物中，可能含有已知或未知的过敏源,引起人体的过敏反应。在 自然条件下存在着许多过敏源，在基因工程中如果将控制过敏源形成的基因转入新的植物中，则会对过敏人群造成不利的影响。所以，为了保证转基因植物的安全问题，含有过敏源的转基因植物是不被允许的，也不能批准商品化。2 转基因植物的环境安全性
转基因植物的环境安全性是指转基因植物对环境生态系统存在的潜在风险。【5】目前植物转基因以转抗除草剂和抗虫基因为主，其次为抗病毒和抗逆基因，故对环境生态系统带来的潜在风险来源于多个方面，包括转基因植物自身或通过与野生近缘种间的基因流动演变为杂草的可能性、对靶标生物及非靶标生物种群的影响及对土壤生态系统和生物地球化学循环的影响等。2.1转基因植物的杂草化
转基因植物的杂草化将类似外来物种的入侵，会改变自然的生物种群，打破生态平衡，对生物多样性造成危害。转基因植物可通过传粉进行基因转移，可能将一些抗虫、抗病、抗除草剂或对环境胁迫具有耐性的基因转移给近缘种或杂草，如果杂草获得了这些抗性，就会变成超级杂草，使农田杂草难以控制。杂草之所以具有广泛的适应性和较强的生存竞争力，是因为它与普通植物相比具有更强的抗逆能力，它甚至可以参差不齐的成熟、发芽，然后迅速成长。而我们培养转基因植物的目的就是希望能提高它的抗逆能力，从而加强它的生存竞争能力，所以，转基因植物可能存在杂草化的风险。2.2转基因漂流到近缘野生种的可能性
基因漂移是指基因通过花粉授精、杂交等途径在种群之间扩散的过程。【6】自然条件下，有些栽培植物会与周围生长的近缘野生种发生天然杂交，转基因植物中的转化基因也可以通过花粉漂移到近缘野生种，转基因植物也可能接受来自近缘野生种的花粉形成杂种。另外，转基因在野生种群中的固定还可能导致野生等位基因的丢失，造成遗传多样性的丧失。如果有多种基因同时转入一个野生种时，将会带来无法预料的后果。2.3 对自然生物种群的影响
转基因植物所转基因多与抗虫或抗病性有关，直接作用对象是生物，除对靶标生物致毒外，还可能会对环境中的非靶标生物产生直接或间接的危害，从而导致生物种群的变化。长期种植转基因作物还可能加速靶标生物的抗性进化。有研究表明，在实验室选择条件下已有17 种害虫对 Bt 基因产生了抗性。【7】研究表明，转基因植物会影响生物种群的结构，会对生态环境产生影响。转基因植物对土壤生态系统的影响
研究表明，转基因植物可能会对土壤中的微生物、昆虫、软体动物等产生负面效 应,对土壤环境的生态平衡产生长远的影响。这有可能降低植物的分解率,影响 土壤肥力,以及土壤内和地面上的物种多样性。如带有几丁质酶的抗真菌的转基 因植物,在其遗传分解时几丁质酶可以消化掉带有几丁质的菌根的细胞壁,使个体死亡,从而减少土壤中菌根的种群,造成土壤凋落物不能被分解,营养流被阻 断,整个生态系统的功能被阻滞。转基因植物对生物多样性的影响
随着转基因植物的大面积推广,对自然生态系统特别是自然界的生物多样性可 能产生有害作用。因为转基因植物比自然植物更强调单一种植,这在客观上淘汰 了大量具有一定优良遗传性状的自然品种及其它遗传资源,造成不可挽回的遗 传多样性的损失。事实已经证明单一性种植可能引起毁灭性的病虫害;导致植物 生态群落结构简单、生物群落贫乏,自然基因库缩小,真正的遗传多样性消失的严 重后果。
结束语：转基因植物的安全性问题，是一个比较复杂的问题，目前还没有定论，但转基因植物产业却在飞速发展，并逐渐成为各国农业竞争的热点。转基因植物既有减少化学农药对环境的影响、提高农作物产量、改善品质等多方面的潜在优势，同时又有可能对自然生态环境和人类健康产生潜在危险。我们必须理性认识和客观对待转基因植物，努力摸索能够快速准确检测转基因植物生态风险的新方法和新技术，建立转基因植物安全性评价的技术体系。相信随着科学技术的发展和完善，人类一定可以解决转基因植物的安全性问题。参考文献
【1】 李志勇.细胞工程.北京：科学出版社，2010.7 【2】 马祥建，郝德荣． 转基因植物的安全性问题及其解决途径［J］． 江苏农业科学，2011，39(6):501 －504．
【3】 谢杰，余沛涛，王全喜.转基因植物的安全性问题及其对策［J］.上海农业学报，2006，22(1):80-84.【4】 张艳华，季静，王罡.转基因植物与生物安全性.作物杂志，2006,3:4-7.【5】 马祥建，郝德荣． 转基因植物的安全性问题及其解决途径［J］． 江苏农业科学，2011，39(6):501 －504.【6】 谢杰，余沛涛，王全喜.转基因植物的安全性问题及其对策［J］.上海农业学报，2006，22(1):80-84.
第二篇：细胞工程论文
细胞工程制药的研究进展
摘要：通过对基因工程，细胞工程，微生物工程的介绍，分别讲叙其中的发展情况与技术问题。最后总结细胞工程制药的进展。关键词:细胞工程，制药
Research Progress in the Production of
Cell-derived Drugs Abstract:Through genetic engineering, cell engineering, microbial engineering introduction, water respectively the development situation and technical problems.Most live summarizes cell engineering pharmaceutical progress.Keywords: cell engineering，pharmacy 1.引言: 细胞工程制药包括植物工程制药，动物工程制药以及微生物工程制药。随着细胞培养、基因工程等生物技术的发展，近年来细胞工程制药有了较快的进展。细胞工程制药解决了许多药物的短缺问题，并且按人们的意愿产生了许多人工难以合成的药物，对于疾病诊断，预防和治疗方面起到重要作用。同时，生物技术目前也已被广泛应用于食品、化学、农业及环保等领域，为这些行业带来了一场新的技术革命。
当前细胞工程所涉及的主要技术领域包括细胞融合技术、细胞器特别是细胞核移植技术、染色体改造技术、转基因动植物技术和细胞大量培养技术等方面。这些技术的发展对细胞工程制药有着巨大的推动作用。2.基因工程
近十几年来，在利用生物技术制取新药方ICI取得了惊人成就，己有不少药物应用于临床。如人胰岛素、人生长激素、干扰素、乙肝疫苗、人促红细胞生 成素.GM一集落刺激因子(GM一CSF、组织溶纤酶原激活素、白细胞介素-2及白介素一11等。正在研究的有降钙素基因相关因子、肿瘤坏死因子、表皮生长因子等140多种[1]。
2.2应用基因工程技术建立新药的筛选模型在新药研究开发中日益广泛使用的各种酶、受体筛选模型所需的靶酶和受体往往来自动物体内，因而数量有限而不利于进行大量筛选。将一些靶酶的活性中心或受体的配体、亚基等在微生物中大量表达可以解决这一难题。3细胞工程
细胞工程是在细胞水平上的生物工程。人们认识到培养的动、植物细胞可以通过无性繁殖扩大群体数景同时保持木身遗传性状一致。通过细胞融合技术发展起来的单克隆抗体技术取得了重大成就，该技术被誉为免疫学中的“革命”。3.1单克隆抗体技术单克隆抗体技术是将能在体外无限繁殖的恶性瘤细胞与能产生单一抗体的B淋巴细胞融合，使融合细胞具有两种亲木细胞特性的技术。单克隆抗体最受重视的用途是在肿瘤诊断和治疗方ICI的应用。经抗体与药物结合制成“生物导弹”，能定位杀灭瘤细胞避免或减少对止常细胞的伤害，从而大大减轻了抗癌药物的副作用。目前，以单克隆抗体为基础的诊断和治疗试剂在全球的销售额己超过40亿美元[1]。
3.2植物细胞培养生产次生代谢产物利用特殊设计适于植物细胞培养的发酵罐，培养经过细胞系筛选，条件优化的植物细胞，可获得有经济价值的次生代谢产物，它们常常是药物[3]。次生代谢产物的低产现象是制约细胞培养法生产植物人然产物技术产业化应用的核心问题之一，与初生代谢相比，植物次生代谢产物的合成具有更加复杂的调控机制，并且更易受外界因素的影响[4]。
我们最近的研究结果表明，在桔青霉细胞壁诱泞子处理约2h后，红显杉悬浮细胞中NO开始增加并在6h左右时达到最高，随后出现下降，表明真菌诱,可以诱发红显杉细胞中NO的生物合成[5]。
3.3动物细胞培养目前，动物细胞培养主要用于通过大量的细胞培养获得细胞产品。同时可用来进行病毒抗原的制作和疫苗的生产，如制作带状疤疹、水痘、传染性肝炎等疫苗。它的应用大大减少了用于疾病预防、治疗和诊断的试验动物，为生产疫苗、细胞囚子、生物产品乃至人造组织等产品提供了强有力的工具[6]。
动物细胞的大规模高效培养技术是生物制药的关键技术.通过动物细胞培养生产生物产品已成为全球生物工业的主要支住.目前动物细胞培养生产较多的生物制剂是蛋白和抗体，通常采用中国仓鼠的卵巢细胞，事先将能产生某种蛋白质药品的基因片段与仓鼠卵巢细胞的DNA融合.再在培养液中大量培养它们、最后得到所需药品。与微生物发酵法比，虽然产量相对较低。但设备费用节省得多，如属于小品种、小产品类生物工程产品.可采用此法[7,8]。4微生物工程
微生物工程也称发酵工程，它在原有发酵技术的基础上又采用了新技术使工艺水平大大提高。所采用的新技术主要应用于3个方面工艺改进、新药研制和菌种改造。工艺改进主要依赖于计算机理论及技术的发展。新药研制则得益于医学研究中对疾病机理的深入了解。菌种改造主要利用基因工程原理及技术[9,10]。止是由于采用其它学科的理论和新技术成果，使得微生物工程成为一高新技术。现代发酵工程不但生产酒精类饮料、醋酸和ICI包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等[11]多种医疗保健药物。5结束语
细胞工程的快速发展有赖于其他生物技术的发展，它们相互促进相互影响。细胞工程在制药方面已经取得了许多惊人的成果，解决了生物药的短缺问题。同时也产生了很大的经济效益。但目前细胞制药工程人面临这许多的问题，其中大规模细胞制药任然是一些生物药生产的一大瓶颈。未来将实验室小生产转变为工业化大生产，将是细胞工程技术的一大飞跃。【参考文献】
[1]沈子龙，廖建民，徐寒梅.转基因动物技术与转基因动物制药[J].中国药科人学学报，2002,33(2):81一86.[2]赵玉平，杨夏，高峰丽.植物细胞制药的研究进展[J].中国中医药现代远程教育, 2012,10(12）
[3]成静，郭勇.植物细胞工程药物生产的研究进展[J].江西科学, 2000,18（1）[4]徐茂军.一氧化氮:植物细胞次生代谢信号转导网络可能的关键点的点[J].自然利一学进展，2007,17(12):1622 [5]徐茂军，菊芳，朱睦兀，NO参与真菌诱导子对红豆杉恳浮细胞中PAL 活化和紫杉醇生物合成的促进作用[J]科学通报，2004,8(49):667-672 [6]滑静，杨柳，张淑萍，上虹.生物工程制药研究进展[J].中国畜牧兽医,2006, 33(10)[7]马瑞丽.动物细胞工程制药的研究进展[J].科技资讯,2007(14)[8]米力，陈志南.动物细胞人规模培养生产蛋自的工艺选择.中国生物工程杂志,2003,23(7):1.[9]周亚风，张先恩.分子酶工程学研究进展.生物工程学报，2002,18(4):401-406.[10]李红艳，徐梅.向青等.空间诱变致生长减慢CHO(dhfr一)细胞株的特性，中 国康复理论与实践.2004，10(11):647-648.[11]秦惠基.转基因动物制药.医药导报，2001（2）:75一78.
第三篇：细胞工程
正交试验设计过程
对于单因素或两因素试验，因其因素少，试验的设计、实施与分析都比较简单。但在实际工作中，常常需要同时考察3个或3个以上的试验因素，若进行全面试验，则试验的规模将很大，往往因实验条件的限制而难于实施。正交试验设计就是安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。
一、正交试验设计的概念及原理
1、正交试验设计的基本概念
正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。
2、正交试验设计的基本原理
在试验安排中，每个因素在研究的范围内选几个水平，就好比在选优区内打上网格，如果网上的每个点都做试验，就是全面试验。如上例中，3个因素的选优区可以用一个立方体表示（图10-1），3个因素各取3个水平，把立方体划分成27个格点。若27个网格点都试验，就是全面试验。3因素3水平的全面试验水平组合数为33=27，4因素3水平的全面试验水平组合数为34=81，5因素3水平的全面试验水平组合数为35=243，这在科学试验中是有可能做不到的。正交设计就是从选优区全面试验点（水平组合）中挑选出有代表性的部分试验点来进行试验。
3、正交表及其基本性质
3.1 正交表
由于正交设计安排试验和分析试验结果都要用到正交表，因此，我们先对正交表作一介绍。常用的正交表已由数学工作者制定出来，供进行正交设计师选用（详见有关参考书）。正交表记号为La（bc），其中L代表正交表，a表示试验的次数即行数，b表示因素的水平数，c表示因素的个数即列数。
3.2 正交表的基本性质
3.2.1正交性
•任一列中，各水平都出现，且出项的次数相等；
• 任两列之间各种不同水平的所有可能组合都出现，且出现的次数相等；
3.2.2代表性
• 一方面，任一列的各水平都出现，使得部分试验中包括了所有因素的所有水平；任两列的所有水平组合都出现，使任意两因素间的试验组合为全面试验。另一方面，由于正交表的正交性，正交试验的试验点必然均衡地分布在全面试验点中，具有很强的代表性。因此，部分试验寻找的最优条件与全面试验所找的最优条件，应有一致的趋势。
3.2.3综合可比性
任一列的各水平出现的次数相等；任两列间所有水平组合出现次数相等，使得任一因素各水平的试验条件相同。这就保证了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干扰。从而可以综合比较该因素不同水平对试验指标的影响情况。
根据以上特性，我们用正交表安排的试验，具有均衡分散和整齐可比的特点。•所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的。
所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的5、试验结果分析
• 分清各因素及其交互作用的主次顺序，分清哪个是主要因素，哪个是次要因素； 判断因素对试验指标影响的显著程度； 找出试验因素的优水平和试验范围内的最优组合，即试验因素各取什么水平时，试验指标最好； 分析因素与试验指标之间的关系，即当因素变化时，试验指标是如何变化的。找出指标随因素变化的规律和趋势，为进一步试验指明方向； 了解各因素之间的交互作用情况； 估计试验误差的大小。
5.1直观分析法——极差分析法
计算简便，直观，简单易懂，是正交试验结果分析最常用方法。
Rj为第j列因素的极差，反映了第j列因素水平波动时，试验指标的变动幅度。Rj越大，说明该因素对试验指标的影响越大。根据Rj大小，可以判断因素的主次顺序。
Kjm为第j列因素m水平所对应的试验指标和，kjm为Kjm平均值。由kjm大小可以判断第j列因素优水平和优组合。
5.1.1确定试验因素的优水平和最优水平组合分析A因素各水平对试验指标的影响。根据正交设计的特性，对A1、A2、A3、A4来说，四组试验的试验条件是完全一样的（综合可比性），可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么kA1、kA2、kA3、kA4应该相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判断A1、A2、A3、A4对试验指标的影响大小。由于试验指标为产率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可断定A2为A因素的优水平。
同理，可以计算并确定B、C、D因素的优水平。
5.1.1确定试验因素的优水平和最优水平组合分析A因素各水平对试验指标的影响。根据正交设计的特性，对A1、A2、A3、A4来说，四组试验的试验条件是完全一样的（综合可比性），可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么kA1、kA2、kA3、kA4应该相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判断A1、A2、A3、A4对试验指标的影响大小。由于试验指标为产率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可断定A2为A因素的优水平。
同理，可以计算并确定B、C、D因素的优水平。
5.1.2确定因素的主次顺序
根据极差Rj的大小，可以判断各因素对试验指标的影响主次。极差越大的，该因素对产率的影响越大，反之越小。
5.1.3绘制因素与指标趋势图
以各因素水平为横坐标，试验指标的平均值（kjm）为纵坐标，绘制因素与指标趋势图。由因素与指标趋势图可以更直观地看出试验指标随着因素水平的变化而变化的趋势，可为进一步试验指明方向。
最后得出试验的最优组合和次优组合。
5.2方差分析
极差分析法简单明了，通俗易懂，计算工作量少便于推广普及。但这种方法不能将试验中由于试验条件改变引起的数据波动同试验误差引起的数据波动区分开来，也就是说，不能区分因素各水平间对应的试验结果的差异究竟是由于因素水平不同引起的，还是由于试验误差引起的，无法估计试验误差的大小。此外，各因素对试验结果的影响大小无法给以精确的数量
估计，不能提出一个标准来判断所考察因素作用是否显著。为了弥补极差分析的缺陷，可采用方差分析。
方差分析基本思想是将数据的总变异分解成因素引起的变异和误差引起的变异两部分，构造F统计量，作F检验，即可判断因素作用是否显著。
方差分析基本思想是将数据的总变异分解成因素引起的变异和误差引起的变异两部分，构造F统计量，作F检验，即可判断因素作用是否显著
5.2.1 偏差平方和
1616
nS总（y
n1
2y）2
j2n12jynCTIV2j2CTG21616,Gn1yn,f总16115S因素IjIIIII4CT
Ij、IIj、IIIj、IVj分别表示第j列中1,2,3,4水平对应的试验结果之和。
总偏差平方和＝各列因素偏差平方和+误差偏差平方和。
5.2.2自由度
f总=试验的次数-1；f因=因素的水平数-1。
5.2.3方差
A因素的方差=A因素的偏差平方和/A因素的自由度
误差的方差=误差的偏差平方和/误差的自由度
5.2.4构造F统计量
5.2.5列方差分析表，作F检验
• 当FA>F0.01(f1，f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有高度显著地影响，记作**。当F0.01(f1,f2)>FA>F0.05(f1,f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有显著地影响，记作*。当F0.05(f1,f2)>FA>F0.10(f1,f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有一定的影响，记作*-。
查表可得F0.01(f1，f2)、F0.05(f1,f2)、F0.10(f1,f2)的值。
6、验证试验结果
经结果分析得出最优生产条件，进行最优试验条件的验证。
7、结论
通过了验证试验，最后可以得出结论。
1] 唐宗祥等.小麦成熟胚离体培养研究[J].植物学报,2003,5-6.[2] 腾世云,王殿久.小麦幼胚组织培养及其再生植株移栽条件的研究[J].植物生物学学报,1990,1：49-55.[3] 王亚馥,崔凯荣,陈克明,等.小麦幼胚培养中体细胞胚发生和植株再生[J].植物学通报增刊,1992,：29.[4] Larkin PJ,Pyan SA,Brettell RIS,et al.Heritable Sornaclonal Variation
in Wheat.Theor.Appl.Genet.1984,67：443-445.[5] Maddock SE.VA Lancaster,R,Risiott,et al,Plant Regeneration From Cultered Immature Embryos and Inflorescences of 25 Cultivars of Wheat.Journal of Erperimental Botany,1983,34(144):915-926.[6] 杨淑慎,郭振,徐虹.小麦胚愈伤组织的诱导和植株再生[J].西北农业学
报,2002,11(4):46-48.[7] 陈漳，来秀英.水稻种胚离体培养的遗传研究[J].植物学报,l992,11:850-855.[8] 潘向群，梁海曼.大麦成熟胚培养的培养基研究[J].作物学报.1991.4:267-272.[9] 周洪生.甜玉米胚愈伤组织诱导、继代、植株再生的研究[J].作物学
报,1993,1:55-61.[10] 柳建军,于洪欣,冯兆礼.小麦成熟胚愈伤组织诱导及分化的研究[J].山东农业
大学学报,1996,4:451-456.[11] 梁竹青，高明尉.不同小麦基因型对体细胞组织培养的反应[J].中国农业科
学,1986,2:42-48.[12] 王大元.经济作物组织培养[M].北京:科学出版社,1988:73-78.[作者简介] 孙百虎（1981-）男，陕西西安人，助教，天津大学在读硕士，研究方向：生物技术。
S因素
F因素f因素S误差
f误差
第四篇：细胞工程说课稿
《细胞工程》说课稿
各位专家、领导下午好！
今天我就《细胞工程》的教学向各位作一简单汇报。
一、讲教材
《细胞工程》我们采用的教材是国家高职高专“十一五”规划教材，是在掌握“生物化学、细胞生物学、分子生物学、普通生物学”等的基础上进行教学的。“细胞工程”是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工具。所以通过本课程的学习，学生要掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术基础。
本课程共分三大篇，第一篇为细胞工程的基本知识，第二篇为植物细胞工程，第三篇为动物细胞工程。整个课程是以“细胞全能性”为基本理论，“无菌操作”为主要操作技能，“定方案-配培养基-选择外植体-培养”为基本流程。1.教学目标：理论知识方面，重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞工程中的指导作用；掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。
实践技能方面，重点掌握细胞工程的基本操作技术—无菌操作；掌握外植体选择、愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术；
2.教学重点难点：掌握”细胞全能性“理论的指导下，不同组织、器官和细胞培
养的调控方式。
3.情感态度：通过了解“细胞工程”技术在国民生活生产中的重要意义，来激发
学生的学习热情和动力。同时在实验操作中，培养学生的团结互助精神。
二、讲教法
主要通过已有的生物的基础知识和生活中的实例来引出学生的参与。
《细胞工程》有三大篇组成，第一篇是基础知识部分，主要内容围绕“基本仪器的功能，配制培养基和创造无菌环境”展开。利用学生掌握的生物知识，根据培养基的功能让学生尝试着回答出“培养基的主要组成成分”。讲到创造无菌环境部分，用家庭中开水烫容器和大型餐厅用紫外消毒柜给餐具消毒的事例引出所用仪器设备以及环境消毒的原则和方法。第二篇和第三篇以同一种模式讲解，多“以旧带新”的方式讲，在掌握植物组织培养的基础上，整个讲课环节都可以在共性的基础“选择培养材料→选择培养基→在合适条件下培养”上，然后根据每一章节的特殊之处进行详细讲解。例如“茎尖脱毒技术”中，除植物组织培养流程之外，需要补充到病毒的检测和脱毒的预处理，同时茎尖剥离技术也是需要掌握的重点技能。在课堂讲操作原则，实践课上进行具体的操作。
三、讲学法
学生在掌握基本知识和操作技能的基础上，通过老师的提示，在课堂上回答新的
第五篇：题库细胞工程
²
细胞工程：以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状,生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。
²
培养基母液：把培养基中的各种大量元素用量扩大l0倍，微量元素、有机元素和激素等用量扩大l00倍，分别或混合溶解制成浓缩液，这种浓缩液称为母液 ²
植物生长调节物质：调节植物生长的物质，以极微小的量影响到植物细胞的分裂、分化、发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许许多多的生理生化活动，包括植物激素和人工合成的植物生长调节剂
²
离体培养：指从植物体分离出符合需要的组织、器官、细胞或原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术
²
细胞全能性：是指细胞具有发育成完整个体的遗传潜能。也可以指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜能。
²
外植体：指用于离体培养的活的植物器官、组织、细胞和原生质体等
²
愈伤组织：自然条件下，植物在受伤之后，创伤部位的细胞脱分化不断增殖，形成松散排列、无特定结构的非器官化组织
组织培养中，人工培养基上由外植体细胞经脱分化产生的一团不定形的、疏松排列的、没有分化的薄壁细胞
²
极性：通常是指在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。
²
细胞分化：由发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程
²
细胞去分化：一个成熟细胞回复到分生状态或胚性细胞状态的现象，即失去已分化细胞的典型特征的过程
²
细胞再分化：脱分化的分生细胞重新恢复分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞的过程
²
胚状体：经体细胞胚发生形成类似合子胚的结构
²
次生胚：有些植物从体细胞胚的细胞中又可产生体细胞胚，这一过程称为重复体细胞胚胎发生，形成的体细胞胚称为次生胚 ²
胚性细胞：又称体胚原始细胞，一类独特的细胞，它与分生细胞相似，通常较小，近圆形，具较大的核和核仁，并能高度染色，胞质浓厚
²
看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞使其生长和增殖 ²
人工种子：将植物离体培养中产生的胚状体（体胚）或者能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等），包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。
²
原生质体：去除细胞壁后存活的植物细胞
²
细胞系：经过再培养后而形成的具有增殖能力、特性专
一、类型均匀的培养细胞 ²
细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。
²
体细胞杂交:采用细胞融合的方法，使原来不能或很难进行有性杂交的两种生物，通过体细胞融合将它们的染色体核基因共存于一个杂交细胞 ²
体细胞变异：非性细胞产生的遗传变异或表观遗传变异
体细胞无性系变异：植物外植体经组织、细胞培养的脱分化和再分化过程，表现于再生植株中的变异
²
突变体：是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。由于基因或染色体的DNA序列发生改变，导致细胞或生物体获得了不同于野生型（原始、未突变）的新表型
²
异核体：不同种属或同一种属的不同生物个体的亲本细胞发生融合所形成的含有不同细胞核的融合细胞
²
成批培养：将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行密封培养看卖弄
²
原代培养：也称初代培养期。从体内取出组织接种在培养瓶中培养到第一次传代前阶段，一般持续1-4周。
继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养 接触抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加
【简答题】：
1.简述细胞工程在生物技术领域中的地位。
细胞工程是细胞水平上的生物工程，是现代生物技术的桥梁与纽带，也是该领域中最直接应用于生产实践并取得显著效益的应用科学。它与其他相关学科理论（基因工程、发酵工程、生化工程等）交叉发展，必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用
2.目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？
1）MS培养基
特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。养分的数量和比例较合适
2）B5培养基
其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。
3）White培养基
其特点是无机盐数量较低，适于生根培养
4）N6培养基
其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。5）KM8P培养基
其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。
3.配制培养基时，为什么要先配母液？如何配制母液？
1）培养基中含有的元素很多，每次配制培养基时，要对所有的元素一个个进行称量、溶解，非常繁琐。特别是微量元素用量很少，用普通天平很难称量准确。配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏，可多次利用
2）确定培养基----按照扩大倍数称量----溶解----按顺序混合----定容----母液分装----贴标签----保存于冰箱
大量元素应配成浓度为10倍的母液，一般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍
配置时化合物应分别称量，分别溶解；混合时注意先后顺序，防止产生沉淀；混合时要边搅拌边混合
4.例举三种常用的物理灭菌方式，简述其原理和优缺点。
湿热灭菌：在密闭的蒸锅内，蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达到121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢（穿透力强）干热灭菌：利用烘箱烘烤灭菌，温度与灭菌时间成反比，一般设定160℃，灭菌时间2-3h，主要用于玻璃器皿的灭菌
过滤灭菌：用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的除菌
5.常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？
1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。缺点：如果是对培养基或液体溶液灭菌，灭菌时间与需要灭菌的培养基或液体溶液的体积密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养基内的化学物质遭到破坏，影响培养基成分。
2）过滤除菌 优点：有些灭菌的材料不能受热，可以用过滤法来灭菌，可以滤除绝大多数微生物的营养细胞 缺点：易污染，过滤法的最大缺点是不能滤除病毒.多数滤器具吸附性
3）干热灭菌 优点：在干热条件下可将细菌杀死，方便，不易污染，杀菌效果较理想 缺点：干热灭菌存在能源消耗大、浪费时间、安全性差问题；在干燥状态下，热穿透力弱，温度不宜均匀
4）紫外线灭菌 优点：具有较高的杀菌效率，运行安全可靠；对隐孢子虫和贾第虫有特效消毒效果；不产生有毒有害产物；操作简单 缺点：由于紫外线穿透物质的能力很弱，所以只适于空气中和物体表面的灭菌，而且要求距照射物质以不超过1.2m为宜。
5）药剂灭菌 优点：方法简便，只需要药剂喷洒在要消毒的空间或材料表面即可，杀菌又除尘 缺点：浓度太高，可能有腐蚀作用
6.配制培养基时，加入一定量的植物生长调节物质，它们在离体培养过程中有哪些作用？
包括植物生长调节剂与植物激素，是植物细胞生长的调节物质，以极微小的量起作用。它能诱导细胞分裂、愈伤组织再分化以及胚状体发育。植物激素主要包括生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类，有时也使用脱落酸、乙烯等物质。
生长素类：用于诱导愈伤组织的形成、根的分化以及细胞的分裂和伸长，诱导胚状体产生
细胞分裂素类：促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成
赤霉素：加速细胞的伸长生长，也促进细胞分裂。
大多数情况下对组培中器官和胚状体的形成表现抑制作用，但对已形成器官和胚状体的生长通常有促进作用 脱落酸：适量的ABA可提高体细胞胚发生的频率和质量，抑制异常体细胞胚的发生
7.试述植物细胞全能性的含义和应用。
含义：植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞均具有该物种的全套遗传信息；只有在适宜的条件下，植物细胞才具有发育成完整植株的能力；植物每个细胞均具有发育成完整植株的能力
应用：无性系的快速繁殖；培养无病毒种苗；新品种的选育（花培和单倍体育种、离体胚培养和杂种植株的获得、体细胞诱变和突变体筛选、细胞融合和杂种植株的获得）；人工种子；药用植物和次生物质的工业化生产
8.实现植物细胞全能性的条件是什么？
具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体条件下；赋予离体细胞一定刺激，包括营养物质、植物激素、光周期、温度、酸碱度等
9.优良愈伤组织有何生长特性？
（1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物
（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体
（3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系（4）经过长期继代保存而不丧失胚性，便有可能对它们进行各种遗传操作 10.何为胚状体？胚状体和合子胚有何异同？
胚状体 离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。
异：胚状体起源于非合子细胞，是体细胞体外培养而来，不同于合子胚，合子胚是经过受精发育而来的
与合子胚相比，体细胞胚子叶不规范、胚小、含水量高、对脱水敏感、没有休眠
相同点：都含有一整套遗传信息,都可以发育成新一代生物个体。胚状体的维管束与合子胚一样,是独立产生的,与母体维管束不相连 11.影响胚状体发生的主要因素有哪些？
因素：氮源【NH4+与NO3-的相对和绝对量都影响体细胞胚的发生，诱导培养基中还原态氮的存在与否最为关键】
生长素【内源IAA含量上升或维持在相对高水平是诱导胚性细胞发生的基础，胚性愈伤组织内源生长素的含量远高于非胚性愈伤组织】
组织起源【对于距活体胚胎发育较近的组织和成熟及未成熟的胚胎在离体条件下可能更利于体细胞胚的诱导】
供体植物的基因型、培养物的生理状况、培养基中的外源激素、天然提取物和活性炭等都可影响胚状体的发生
12.如何区分离体培养条件下的不定芽和胚状体？
体细胞胚经过了胚胎发育过程，具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构
体细胞胚最根本的特征为两极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端；不定芽是在器官发生方式分化的单极性特征下形成的。体细胞胚的维管组织分布是独立的“Y”字形结构，与外植体组织无结构上的联系；而愈伤组织上分化的不定芽一般在愈伤组织表面，与外植体或愈伤组织的维管组织相联系
13.目前研制的人工种子结构是怎样的？
人工种子由以下三部分组成：
①具有良好发育的体细胞胚，并能发育成正常完整植株：广义的体细胞胚由组织培养中获得的体细胞胚即胚状体、愈伤组织、原球茎、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体组成。②人工胚乳，一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成，养分包括矿质元素、维生素、碳源及激素等。③胶囊之外的包膜称之为人工种皮，有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。
14.控制胚性细胞同步化的方法有哪些？
①抑制剂法促进细胞同步分裂；培养初期加入DNA合成抑制剂，使DNA合成暂时停止，当除去DNA合成抑制剂，细胞开始进行同步分裂 ②低温处理促进细胞同步分裂；抑制了细胞分裂，一段时间后再恢复正常培养温度
③渗透压控制同步化法；不同发育阶段的胚，具有不同的渗透压要求，通过调节渗透压来控制胚的发育，使其停留在某一阶段，然后同步发育 ④同步胚的分段收集筛选法；用不同孔径的尼龙网或采用密度梯度离心来选择不同发育阶段的胚，然后再转入适宜它们发育的培养基上，使幼胚继续发育。⑤通气法。乙烯的产生与细胞分裂密切相关，在细胞分裂达到高峰前，有一个乙烯合成高峰，在培养基中通入乙烯或氮气，控制细胞同步分裂 15.植物离体无性繁殖主要适用于哪些植物？与常规无性繁殖相比有什么优势？
植物离体无性繁殖主要适用于园艺观赏植物、农作物、药用植物及经济林木的种苗生产。（1）周期短，便于控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高。（2）占用空间小，不受地区、季节限制。（3）繁殖珍稀、濒临苗木和突变体，是优良品种培养的有效途径。（4）利物保持原来品种的特性。
16.分离植物单细胞的方法有哪些？
有以下三种：
(一)机械法:主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。
(二)酶解法：主要是根据植物细胞壁的组成特点选用某一专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。
(三)愈伤组织诱导法：通过组织培养获得callus，由于细胞结构松散，可通过高频振动使单个细胞分离处理
17.植物单细胞培养的方法有哪些？各有何特点？
1、平板培养法
特点：单细胞在培养基中分布均匀，便于定点观察，易筛选；通气差，排泄物易积累造成细胞毒害
2、看护培养
特点：简便、成功率高；不能在显微镜下直接观察.3、饲养层培养
特点：操作简便；不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成
4、微室培养法
特点：在培养过程中可连续进行显微镜观察；由于培养基少，水分难以保持，培养基的成分及pH等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。
5、液体浅层静置培养法
特点: 易于补加新鲜培养基、可以镜检
6悬浮培养法
特点：能提供大量同步分裂的细胞，且细胞增殖速度快，可用于大规模工业化生产
7双层滤纸植板法：在饲养细胞层与靶细胞层之间放两层滤纸，上面一层滤纸用于把靶细胞转移到其它培养基上继续培养。
8条件培养:含有植物细胞培养上清液或静止细胞；在平板培养和看护培养的基础上发展起来的；看护培养中愈伤组织可以提供单细胞生长繁殖所需的物质；植物细胞上清液或静止细胞也有相同效果 18.什么叫细胞的悬浮培养？分批培养和连续培养各有何特点？
细胞的悬浮培养：将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。
分批培养特点：培养系统基本处于封闭状态，要及时更换培养液进行继代培养；细胞数量随着培养时间的变化呈S形曲线；操作简单，重复性好，往往能获得理想的培养效果；特别适合于突变体的筛选、遗传转化等研究
连续培养特点：培养过程中培养液不断得到更换；设备复杂，但便与自动化，产品质量稳定；营养物利用率低于分批培养，菌种易退化，易污染，因此连续时间有限
19.在细胞悬浮培养中，如何进行细胞生长量的计算？
（1）细胞计数：通常用血球计数器计数，计算较大的细胞数量时，可以使用特制的计数盘；（2）细胞密实体积（PCV）：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示，测定时，将细胞 离心于离心管内，测定细胞层所占的体积。
（3）细胞鲜重：将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，称重
（4）细胞干重：用以知质量的干尼龙网依上法收集细胞，在60°C下烘箱内烘12h，细胞干重恒定后再称重
（5）有丝分裂指数：指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。通过富尔根染色法对愈伤组织染色，再在载玻片上制片并镜检，随机检查500个细胞，统计处于有丝分裂各个时期的细胞数。指数越高，表明细胞分裂速度越快
20.悬浮培养细胞同步化的方法主要有哪些？
1、物理方法
(1)分选法: 细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞利用一定大小的筛网过滤分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中
(2)冷处理法: 收集细胞,在4℃温度下处理数天,添加新鲜培养液培养.2、化学方法
(1)饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。
(2)抑制法：通过向培养基中添加尿苷(1μg/ml),5-氟脱氧尿苷(2 μg/ml)等化学抑制剂抑制细胞分裂,可使培养细胞同步化。(3)有丝分裂抑制法:在指数生长期的细胞悬浮培养物中加入一定浓度的秋水仙素
21.在植物细胞培养中如何提高植物次生代谢产物的产量？
（一）筛选得到高产细胞系（株）常用方法有：
1、克隆选择（有相同遗传基因的细胞群）
指通过单细胞克隆技术和细胞团克隆技术，将培养细胞中能够积累较多次生代谢物且具有相同遗传基因的细胞群挑选出来，并加以适当的培养形成高产细胞系。
2、抗性选择
指在选择压力下，通过直接或间接的方法得到抗性变异的细胞系。
3、诱导选择
是通过化学诱变或紫外线照射等各种物理化学方法诱变产生比原亲本细胞全成能力高的细胞系（株）
（二）培养条件 1适宜温度
2、不断调节PH
3、营养成分：一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。
4、光：包括光强、光质和光照时间对细胞生长和次生代谢产物合成都有一定影响。
5、通气量和搅拌转速
6、前体饲喂
7、诱导子的应用：诱导子是指能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径的物质，可分为生物诱导子和非生物诱导子。不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物。
8培养方法:两步培养法、两相培养法（有利于代谢物的分离提取，促进胞内代谢物的分泌）等
22.简述细胞活力鉴定的方法。
1、相差显微镜观察法：观察细胞质环流和正常细胞核的存在
2、FDA染色法 ：在活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分（荧光素）释放出来。荧光素不能自由地穿越细胞质膜，能在完整的活细胞中积累，紫外线照射下发绿色荧光
3、伊凡蓝染色法：只有活力受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料
4氧电极法：活细胞光合作用放出氧气
23.简述细胞计数的方法
24.影响原生质体分离效果的因素有哪些？试做分析。
（1）材料种类和生理状况：植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应当处于生长早期或指数生长期
（2）酶解温度：温度高、得率高，但存活率低（3）酶解时间：过短得率小、过长存活率低（4）渗透压稳定剂的种类和浓度：因种而异
（5）氧气：酶解时尽量采用振荡，使细胞得到足够的氧气进行呼吸作用（6）黑暗：抑制原生质体形成细胞壁（7）酶液活力：储存时间过长会使酶液失活
25.制备原生质体时为何要在等渗或稍高渗溶液中进行？
只有培养在等渗或稍高渗培养基中植物才能正常生长 如果植物的原生质体培养在非等渗或低渗或高渗培养液中植物有可能会因为浓度差而吸水或是失水从而导致植物的死亡，所以植物的原生质体要培养在等渗或稍高渗培养基中。
26.原生质体再生植株的基本过程。（1）细胞壁再生
（2）细胞分裂：分裂前细胞质增加、色素体扩大、颜色加深
（3）再生植株：直接分裂形成苗（第一次分裂便表现极性）；通过愈伤组织形成苗；通过球状体再生成苗（原生质体---细胞---表面光滑的球状体或盘状体---通过出芽方式形成小苗）27.简述原生质体培养的意义。
研究细胞壁的再生过程和植株的再生过程；为植物细胞融合扫平了障碍，特别是为制造新杂种（种间杂种）开辟了道路；原生质体可摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性可与植物全能性相结合，为植物遗传修饰打下基础；获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料
28.原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点？
⑴液体浅层培养法： 优点：
原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：
原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。⑵双层培养法——液体-固体双层培养法：
优点：
固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。
缺点：
不易观察细胞的发育过程。⑶固体平板培养法
优点：
使原生质体处于固定位置，避免了细胞间有害代谢产物的影响，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。
缺点：操作要求比较严格，温度对原生质体与培养基混合有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。
（4）琼脂糖珠培养：
优点：摇床震荡培养，改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成
29.原生质体融合要经过哪些过程？
30.PEG融合与电融合各有何特点？两种方法的原理和关键技术是什么？
PEG法特点：（1）融合率10%左右，融合较繁琐（2）具有一定毒害作用；容易形成由2个以上原生质体融合形成的融合体
电融合特点：(1)效率高（70 %以上），但存活率低；对原生质体伤害性小(2)装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程。(3)免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。
PEG诱导融合法原理：PEG为多聚化合物，其分子具有轻微的负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和糖类等形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，从而使原生质体发生粘连。当用培养基将与膜相连的PEG分子洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重配。
电融合的原理：①交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。②施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。【老师ppt 在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体】
31.原生质体融合产物有哪些类型？ 杂种细胞：原生质和核都融合
异核体：细胞质融合，细胞核没有融合 同核体：同一亲本的原生质体融合产生
非对称杂种：由于人工处理或其它原因造成某一亲本的染色体部分丢失 细胞质杂种：某一亲本染色体全部丢失而细胞质融合
32.体细胞杂交有何意义？
（1）实现远缘杂交，形成新的物种。
克服常规有性远缘杂交存在的生殖隔离和杂交不亲和的障碍，为广泛重组遗传物质、形成新的物种开辟的新途径
（2）创造细胞质杂种。融合了双亲的细胞质，可将细胞质基因重组，将双亲细胞质基因遗传给子代
（3）培育作物新种质和新品种。通过近缘种内或种间的体细胞杂交可获得稳定的具有双亲两套染色体的体细胞杂种植株。往往可育，能作为育种的新材料通过常规育种获得新品种
33.什么是植物体细胞无性系变异？引起或影响植物体细胞无性系变异的因素有哪些？
植物细胞、组织、器官在无菌条件下进行离体人工培养，经过脱分化和再分化过程，重新形成愈伤组织和完整植株时所产生的变异 称为植物体细胞无性系变异
因素：（1）自发突变，与培养物的遗传背景、外植体类型及培养类型有关，同时也受培养时间、培养成分等因素的影响
（2）人工诱变，包括物理诱变和化学诱变。物理诱变就是利用X射线、γ射线、β射线、中子、激光、电子束、离子束、紫外线等物理因素辐射诱发变异。化学诱变是利用化学试剂诱发的变异。诱变剂包括碱基类似物，烷化剂，DNA分子结构插入物三大类。
34.试述植物体细胞无性系变异的遗传学基础。
体细胞无性系变异的遗传基础：
（1）染色体组型变异，如出现多倍体和非整倍体。
（2）染色体结构变异，由染色体重排造成的基因丢失，或“关闭”一个能使其相应隐性基因产生表现型效应的显性等位基因等。（3）基因突变
（4）DNA总量变异和DNA重复序列拷贝数的变异（5）基因丢失（6）DNA碱基修饰
（7）转座子的激活，由转座引起突变。（8）基因重排
35.试述农杆菌Ti质粒基因转化的原理。
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌G-，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根
根癌农杆菌中含有Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此可以将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，然后借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株
36.植物基因转化的方法有哪些？各自的特点是什么？
1）农杆菌介导法：受体类型广泛，简单易行、周期短、转化频率高，转化体常出现“嵌合”现象，影响转化频率的因素相对较少等。
2）病毒介导法：特点是 病毒增殖水平较高、增殖速度快，基因组较小，宿主范围广，易于纯化等。
3）基因枪转化法：适用范围广、无宿主限制、靶受体类型广泛、可控度高、操作简便、快速等。
4）电击法 特点是 对细胞不产生毒性，但对细胞损伤较大 5）PEG介导法：特点是成本低廉、效果稳定
6）花粉管通道法： 特点是方便易行，不需专门仪器和昂贵药品，直接得到转化的种子，受季节限制。
7）显微注射法：特点是转化效率高，转化细胞的培养过程无需特殊的选择系统。
【老师ppt】
（1）农杆菌介导转化法：优： 转化效率高；能够插入非重排的外源DNA长片段；DNA片段主要以单拷贝或低拷贝形式插入；不需要特殊的专用设备
缺：转化的寄主范围有限，特别是对许多单子叶植物不适用；外源的转基因只能以T-DNA插入的方式被导入寄主细胞（2）基因枪介导转化法
与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制（3）花粉管通道法：
优：不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握
缺：不同作物导入DNA的最佳时间有较大差异，要针对不同的植物作出相应的改动
(4)DNA直接转换法：适用对农杆菌感染不敏感的植物(5)化学药剂诱导法：在没有载体的情况下可使用，但转化率低(6)电击法：对细胞不产生毒性，但对细胞损伤较大(7)显微注射法：适合大细胞操作，主要用于动物细胞
(8)低能离子束法、激光束法、超声波法、脂质体介导、病毒介导、转座子介导等
37.试述转基因植物在农业生产上的应用。
在农业生产上的应用主要有：1.抗除草剂转基因植物；2.抗虫转基因植物；3.抗病转基因植物；4.抗逆转基因植物；5.改良作物营养质的转基因植物。
【问答题】：
1.离体无性繁殖一般可分为哪几个阶段？简述其操作的一般程序。
离体无性繁殖一般可分为5个阶段。
1、植株的准备：供体植株应生长旺盛、健壮、不病虫害，并尽可能生长在干净的环境中。
2、无菌培养物的建立：获得无菌材料并诱导外植体生长和发育。包括从供体植株上采取外植体进行消毒、接种及启动外植体生长等程序。
3培养物的增殖：通过反复培养使第一阶段获得的数量有限的嫩枝、芽苗、胚状体或原球茎等培养物的总量增加。
4生根培养：将增殖阶段形成的无根芽苗转移到生根培养基上诱导产生不定根，获得健壮的具有根、芽、茎的完整小植株。
5试管苗的移栽及鉴定：移栽是将具根试管苗转移到土壤中的过程，是试管苗从离体培养逐步适应温室或田间生长环境的过程
2.简述植物细胞大规模培养反应器的类型及原理。机械搅拌式反应器：利用机械搅动使细胞得以悬浮和通气
鼓泡式反应器：从反应器底部通入无菌空气产生大量气泡，带动培养液循环 气升式反应器：利用通入反应器的无菌空气带动培养液循环
光生物反应器：植物体内的多种酶需要光照的刺激和诱导才能合成或表现较高的生理活性
转鼓式反应器：通常是通过转盘或转鼓的旋转达到混合的目 3.简述植物细胞固定化的几种方法。
1、包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部
包括：凝胶包埋法 以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内，固定后细胞被限制在凝胶的微孔内进行生长、繁殖和新陈代谢 使用的载体：海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂、琼脂等
半透膜包埋法 将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内
2、吸附法 ：使用固体吸附剂（惰性材料），将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法
包括：物理吸附法（physical adsorption）作用力：氢键、疏水键。离子结合法 作用力：离子键
3、共价结合法：细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而形成为固定化细胞
4、交联法：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键
4.试述原生质体分离的方法和步骤。
(1)机械法：在高渗溶液中细胞质壁分离的状态下，用利刀切割细胞壁,使原生质体流出或释放出来
高渗溶液预处理----轻微质壁分离----利刀切割或机械磨损组织
(2)酶解法：常用的制备原生质体的酶包括；果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。实际应用中需要根据不同的细胞来源选择合适的酶。酶解法分：
顺序法（两步法）：先用果胶酶预处理，再用纤维素酶 直接法（一步法）：直接用果胶酶和纤维素酶 优点：获得量大，适用广泛。
缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。
【ppt】
（1）取生长旺盛的植物细胞
（2）悬浮于有渗透压稳定剂的高渗溶液中
（3）加入适量的细胞壁水解酶，在一定条件下使细胞壁解体（4）分离除去细胞壁碎片等杂质（5）得到原生质体
5.植物体细胞无性系突变体筛选的方法有哪些？
（一）从再生植株中直接筛选有用突变株（常规育种）
（二）对离体培养物的筛选 1.直接筛选法
（1）正选择法：在离体培养基中加入对正常细胞有害的化学物质，使正常表型细胞死亡（一步、多步）
(2)负选择法：使用特定培养基使突变体细胞受到抑制不分裂呈休眠状态，然后用一种对休眠态突变细胞无害，而能毒害正常生长细胞的药物淘汰掉正常型细胞，最后用正常培养基恢复突变细胞的生长（主要适用于营养缺陷型或温度敏感型突变体的筛选）2.间接筛选法：借助与突变表现型有关的性状作为选择指示或筛选压的方法
（三）绿岛法：利用已分化组织进行筛选的方法。例如，一些除草剂只作用于绿色光合细胞，可以对整棵植株用除草剂，使抗性细胞存活下来，形成局部绿色斑点（绿岛），然后切下该部位细胞进行培养，再分化形成抗性植株
6.成批培养（batch culture）细胞的生长曲线包括哪几个时期？各时期有何特点？ 延迟期：细胞很少分裂、数目不增加
对数生长期：细胞开始分裂，数目开始大量增加 直线生长期：细胞生长旺盛，数目大增 减慢期：细胞分裂速度减慢 静止期：细胞停止分裂
死亡期：细胞开始死亡，数量减少
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