细胞工程考试课件

第一篇：细胞工程考试课件

第一章

绪论

1细胞工程:应用细胞生物学和分子生物学的理论、方法和技术，按人的设计，有计划地大规模培养组织或细胞以获得生物产品，或改变细胞的遗传物质以产生新的物种或品系。

2生物工程:也称生物工艺学,一般称为生物技术.是以生命科学为基础,利用生物体系和工程学原理来获得生物制品和创造新物种的一门综合技术。

生物工程的发展历史

传统生物工程:利用非纯种微生物自然发酵工艺为标志的生物技术，如酿酒。

1857，Pasteur L发现发酵是微生物作用的结果，而后形成的采用纯种微生物的发酵工艺。

近代生物工程：以抗生素工业的兴起为标志。

现代生物工程：1973基因工程和1975年单克隆抗体技术建立为标志的生物工艺。

生物工程的组成

一、发酵工程

二、酶工程

三、细胞工程

四、基因工程

五、蛋白质工程

六、生化工程 一，发酵工程

1现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。

现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。

2一般发酵工程包括以下基本步骤：（1）菌种选育；

（2）细胞大规模培养即发酵过程；（3）生产活性产物的诱导；（4）菌体及产物的收获

3发酵工程的产品范围非常广泛。

从食品、药品、精细化工产品到许多工业用原料等等，生物可降解塑料PHB等

四，基因工程

1基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。2 稀少珍贵的蛋白质药物

1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品——人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。

人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-

2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等 3畜牧业中的应用

动物疫苗、生长激素等

例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA 4种植业中的应用 用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物 抗化学除草剂基因，转基因西红柿，固氮酶基因„„

环境保护等等

五，蛋白质工程：利用生物技术手段，对蛋白质的DNA编码序列进行有目的的改造并分离、纯化蛋白质，从而获得自然界没有的具有优良性质或适用于工业生产条件的全新蛋白质技术。

蛋白质工程的主要步骤通常包括：

（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；

（2）测定其氨基酸序列；

（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括折叠与去折叠等对其活性与功能的影响；

（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用。

六，生化工程

生物化学工程是由生物科学与化学工程相结合的交叉学科，主要研究将生物技术的实验室成果转化为生产力过程中的带有共性的工程技术问题。

细胞工程的分类

1、根据研究对象划分：微生物细胞工程、植物细胞工程、动物细胞工程。

2、根据研究水平划分：组织水平、细胞水平、细胞器水平、基因水平。

细胞工程主要研究内容

1）植物细胞和组织培养技术

2）动物细胞和组织培养技术

3）细胞融合技术（体细胞杂交技术）

4）细胞器移植技术

5）染色体工程技术

6）胚胎工程技术

第三章

植物组织培养

第一节 植物组织培养

植物组织培养的基本概念

植物组织培养的应用 1.无性系快速繁殖

2.去除病毒、真菌和细菌等病毒 3.培育新品种的得力手段 4.种质资源的保存 5.次生代谢物的生产

植物组织培养的基本流程

脱分化：一个成熟细胞转变为分生状态的过程即形成愈伤组织叫脱分化。愈伤组织：在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。再分化：愈伤组织内的细胞具有异质性，能重新分化成各种类型的组织细胞。

植物组织培养的理论依据（1）细胞全能性

全能性：任何有完整的细胞核的植物细胞拥有形成一个完整植株所必需的遗传信息，理论上都能发育成为一棵植株。

植物组织培养是建立在细胞具有全能性的理论基础上的，（2）细胞分化

在体内维管组织是高度分化的部分，主要受生长素和蔗糖的影响，木质部的分化与细胞分裂素、赤霉素和细胞分裂相关。

在体外的培养细胞通过茎芽的分化或细胞胚胎发生能再生长成为完整的植株

第二节 植物细胞培养

1所谓细胞培养,是指在离体条件下,将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中进行振荡培养,得到分散成游离的悬浮细胞,通过继代培养使细胞增殖,从而获得大量细胞群体的一种技术.2.与植物组织培养的区别

细胞培养是指动植物细胞在体外条件下的存活或生长,此时细胞不在生长成组织.对于植物,组织培养主要是指我们常用的快繁技术,而细胞培养主要有以生产次生代谢产物为目的的大规模细胞培养技术.植物单细胞培养技术 一.单细胞的分离

１.由植物器官分离单细胞

（１）机械法

主要通过机械磨碎.切割植物体从而获得游离的单细胞．

（２）酶解法

这种方法是目前最为有效的一种获得单细胞的方法，主要是利用果胶酶的处理，获得大量的细胞． ２.由愈伤组织获得单细胞

该方法通过愈伤组织培养获得愈伤组织，并通过培养使愈伤组织增殖．由于愈伤组织细胞之间的结构非常疏散，因此可以通过高频率振动使细胞脱落，从而获得单细胞．

二.单细胞培养方法

（１）平板培养法:指将制备好的单细胞，按照一定的密度，接种在约１mm厚的薄层固体培养基上进行培养的方法．

（２）看护培养法:

指利用生长的愈伤组织所产生的物质来培养单细胞的方法

（３）饲养层培养法

指用处理过的无活性的或者分裂很慢.不具备分裂代谢能力的细胞来饲养所需培养的细胞，使其分裂和生长．

（４）液体浅层静置培养法

将一定密度的悬浮细胞放在培养皿中形成一浅薄层，封口静止培养．

（５）细胞悬浮培养法

主要指将细胞接种于液体培养基中，在保持良好的分散状态情况下进行培养

悬浮细胞同步化的方法

（一）物理方法

1、体积选择法

2、冷处理法

（二）化学方法

1、饥饿法

2、抑制法

3、有丝分裂法

细胞的保存

１.继代培养保存法

每隔1—2周换液进行一次继代培养 ２.低温保存法

5—10℃培养,每10天换液 ３.冰冻保存

原生质体的分离和培养

原生质体定义：植物除去细胞壁分离剥下的部分 来源:叶片,根尖,愈伤组织.一，原生质体的分离

1）机械法：在细胞质壁分离的状态下，用利刀切割

2）酶解法

二，.原生质体鉴定与活力测定

(一)原生质体鉴定

1.低渗爆破法

2.荧光染色法

(二)原生质体活力测定

1.渗透压法

2.氧电极法

3.二乙酸荧光法(FDA)三，原生质体培养方法

1.液体培养法

2.固体培养法

3.双层培养法

在琼脂培养基上部加入一薄层液体原生质体培养液培养原生质体

四，原生质体的发育和植株的再生

1.细胞壁再生

2.分裂

3.愈伤组织的形成 4.植株再生

3.3植物器官培养

植物器官培养：指将植株上的各种器官从母体上分离出来，放在无菌的人工环境中让其进一步发育，最终长成幼苗的过程。主要包括：毛状根，芽，体细胞胚等

3.31植物脱毒培养技术

如何在一个已经受感染的群体中获得无病植株？

a.种子繁殖

b.消除病原菌 消除病原菌的方法

a.热处理：热水或热空气。b.茎尖培养。c.愈伤组织培养。

3.32 体细胞胚胎发生

体细胞胚：在离体或活体条件下，由除受精卵之外的体细胞形成的胚。体细胞胚胎发生的过程

1、取植物的一部分组织(如根、茎、叶的切段或胚等)，用组织培养的方法，分裂产生愈伤组织，这个阶段一般采用固体培养方法。通常所采用的脱分化试剂是2,4-D，有的植物除2,4-D以外，还需要附加少量的细胞分裂素。至于2,4-D的浓度，则因植物而异，一般宜采用较高的浓度。外植体的年龄也很重要，一般幼龄的较容易产生愈伤组织。

2、用所得的愈伤组织进行悬浮培养，使细胞分散。

3、将悬浮培养物倒在没有植物激素的固体平面培养基上，再进行固体培养，其中有些胚性细胞就有可能发生体细胞胚。

3.33 人工种子

利用人工种皮包被体细胞胚可以制造人工种子，用以繁殖遗传工程植物，自交不亲合植物，稀有植物，远缘杂交种等

人工种皮：藻酸钠 人工种皮的选择: 1)对所要包埋的胚乳无伤害。

2)有足够的柔软性,可以保护胚乳,并允许其发育.3)具有一定的硬度,避免运输.操作过程中的伤害.4)具有穿透性,传递细胞生长所需的营养;并能容纳其他附加成分。5)可以用现有的温室或农机机械进行播种。

海藻酸盐具有成胶容易、操作条件温和、使用方便、毒性极低、成本低廉等特点。

人工种子的包埋方法

1.复合凝聚：两种带相反电荷的电解质在水中相互作用形成多聚体包被溶液.2.界面聚合：在两相界面处因溶解度低而成膜.3.离子交换凝胶：经过离子交换而形成络合物成为凝胶.4.变温凝胶：高温下为液体，低温下为固体凝胶。

3.4植物细胞的生物反应器大规模培养

生物反应器培养（培养方法和各自特点）

1、分批培养：一次性添加培养液培养，期间不更换培养液。是一种封闭式的培养体系。

2、半连续培养：在培养过程中将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法。

3、连续培养法：在培养过程中不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养液，使培养物不断补充并保持其恒定体积的培养。

目前生物反应器主要分为以下三种：

机械搅拌式、鼓泡式、气升循环式

植物细胞两相培养技术

如何使细胞内的次生代谢产物分泌出来并加以提取分离是降低成本、进行连续培养的关键。两相培养技术是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物，使培养体系形成上下两相，细胞在水相中生长，合成的次生代谢产物分泌出来后转移至有机相中。

可以减少产物的反馈抑制作用从而提高产物含量；通过有机相的不断回收及循环使用实现培养的连续化。

植物细胞固定化方法

1、海藻酸盐固定化

2、卡拉胶固定化

3、琼脂糖固定化

4、琼脂固定化

植物细胞固定化生物反应器培养

1、流化床生物反应器

2、填充床生物反应器

3、膜生物反应器

第四章

动物组织培养

1、连接方式：

（1）紧密连接

（2）间隙连接：质膜间有2—3nm的间隙

（3）隔壁连接：20--30nm的间隔，有横隔

（4）中间连接： 20--30nm无横隔的透明区

（5）桥粒连接

动物细胞与组织培养的定义

定义：是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术 体外培养分为原代培养和传代培养

原代培养指将机体取出的细胞或组织进行实效培养的过程

传代培养：从原代培养的细胞继续转接培养

体外培养的细胞根据生长方式分为

1、贴附型细胞

（1）成纤维细胞型细胞

（2）上皮型细胞（3）游走型细胞

（4）多形型细胞

2、非帖附型细胞

动物细胞体外培养的特点

（1）哺乳动物细胞只有附着在固体或半固体的表面才能生长

（2）动物细胞对营养要求更加苛刻

（3）对于培养环境的适应性更差，对环境极其敏感

（4）动物细胞生长缓慢，培养时间较长

（5）动物细胞培养还需要防治污染问题 培养工具：无毒塑料制成的培养瓶、培养皿

载体：空心纤维和微珠 培养条件

（1）温度：最适温度37℃

（2）PH：最适PH7.2—7.4

（3）气体

（4）营养：①天然培养基

②合成培养基 ③无血清培养基

④动物细胞培养必需的溶液

动物细胞培养必需的溶液

1、平衡盐水

2、培养基PH调整液

3、细胞消化液

4、抗生素溶液

培养液中加入适量的抗生素，可以预防由于操作不慎而产生的微生物污染。

青、链霉素:青霉素能抑制细菌细胞壁的合成;链霉素能抑制细菌蛋白质的合成.卡那霉素:卡那霉素也能抑制细菌蛋白质的合成.制霉菌素:干扰细菌细胞质膜的合成.体外培养细胞的生长与增殖过程

（1）原代培养期：1—4周（2）传代期：10—50次

（3）衰退期

动物细胞培养的传统方法

（1）悬滴培养法

（2）旋转管培养法（3）灌注小室培养法

（4）培养瓶培养法（5）培养板培养法

生长特

①游离期

②吸附期：平均时间5－20分钟

③繁殖期：接触抑制

④退化期：轮廓变强，细胞内有膨胀的线粒体颗粒堆积

动物细胞大规模培养技术

（1）气升式深层培养系统

（2）悬浮培养技术

（3）微载体培养系统

（4）多孔载体培养

（5）微囊化培养技术

（6）中空纤维培养法

组织工程是应用细胞生物学和工程学原理，将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖、扩增，然后种植到人体内所需要的部位，从而达到器官修复或再造的治疗目的的一种技术

器官培养：取出动物器官或进一步修整成器官型植块，将其接种到培养基上或培养液中，在适当的营养、气相、生长基质等条件下使其存活或生长的技术

第五章

细胞融合与单克隆抗体

第一节

细胞融合 定义：又称体细胞杂交.指用自然或人工方法,使两个或更多个不同来源的原生质体相融合并使之分化再生、形成新物种或新品种的技术。细胞融合的意义

1、用于遗传性状的改良。

2、克服远缘杂交中的不亲和障碍。

3、可以更加广泛的组合起各种植物的优良遗传性状，从而培育出理想的新品种。

细胞融合技术

为了使制备好的原生质体或细胞能融合在一起，选择适宜有效的诱导融合方法很重要。诱导融合方法可分为：

1、仙台病毒法

2、PEG（聚乙二醇）诱导法

3、电融合诱导法

一，生物法——仙台病毒法

仙台病毒也称日本血凝病毒，是RNA病毒，多呈颗粒状，由于被感染细胞表面发生某些改变，使得这些细胞容易发生融合，甚至处死的仙台病毒也具有促进细胞融合的作用。

仙台病毒具有促使凝结的细胞发生融合的能力，这是因为各种能被其作用的细胞均有相应受体的缘故。现已基本知道，其促进细胞融合的有效部位在于它的膜，被超声波打碎的病毒膜片仍具有促进细胞融合的功能。

病毒促使细胞融合的主要步骤如下

1、两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼 此靠近。

2、通过病毒与原生质体或细胞膜的作用使两个细胞膜间相互渗透，胞质互相渗透。

3、两个原生质体的细胞核互相融合，融为一 体。

4、进入正常的细胞分裂途径，分裂成含有两种染色体的杂种子细胞。

二、PEG（聚乙二醇）诱导法

原理：由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成氢键，从而在原生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘连进而促使原生质体的融合。

PEG诱导融合的特点

1）其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。

2）PEG可能对细胞有毒害。

三、电融合诱导法 电融合的基本过程：

1）细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时，电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原生质体紧密接触排列成串；

2）膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。优点：

1、融合率高，达70％－80％，甚至100％。

2、不存在对细胞的毒害问题。

3、融合技术操作简便。

融合细胞的选择

1、遗传互补筛选法

2、抗性互补筛选法

3、利用物理特性筛选法

4、利用生长特性筛选法

1、遗传互补筛选法

利用每一亲本贡献一个功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令杂种细胞表现正常。

如：亲本1：叶绿体缺陷型

亲本2：光致死型

两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长。

2、抗性互补筛选法

利用亲本细胞原生质体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差异选择杂种细胞。

如：亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基上不能生长

亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上生长

杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上生长，而亲本和其它细胞死亡。

3、利用物理特性筛选法

根据亲本的原生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。

亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原生质体

亲本2：叶肉细胞原生质体

在荧光显微镜下，亲本1为红色，亲本2为绿色，杂种细胞可以区分。

4、利用生长特性筛选法

利用原生质体对培养基成分要求与反应的差异选择杂种细胞。

例如：粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质体均需外源激素才能生长，但其融合细胞可以产生内源激素，在培养基上不需加激素。

第二节单克隆抗体

抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。

特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。

单克隆抗体(monoclonal antibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。

单抗的制备过程 动物免疫与亲本细胞的选择 细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备 3 HAT培养基筛选杂交瘤细胞 杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等 5 杂交瘤细胞的克隆化培养 6 单克隆抗体的大量制备

一、亲本细胞的选择

骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT－(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)或TK－（胸腺嘧啶核苷激酶）。多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。

三，HAT选择系统

HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种。

杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生； TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。

含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。

淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。

杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。

在HAT培养基中，HPRT-或TK-亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。

单抗的大规模生产

1、利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维培养系统等进行大规模培养。

2、体内接种杂交瘤细胞，制备血清或腹水 1）实体瘤法：

对数生长期的杂交瘤细胞按1-3×107个/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml。待肿瘤达到一定大小后（一般10-20天）则可采血，从血清中获得单抗含量可达1－10mg/ml，但采血量有限。2）腹水的制备

将稳定分泌单抗的细胞株，通过扩大培养，接种于Balb/c小鼠腹腔内，使其以腹水瘤形式在小鼠腹腔内增殖，从而得到大量含单抗的腹水。

方法是将异十八烷或石蜡油注入Balb/c小鼠腹腔，0.5ml/只，7天后腹腔接种1×106 个 杂交瘤细胞。10-20天后即可抽取腹水，每毫升腹水中约含5-20mg单抗。

第六章

染色体工程

染色体工程: 是在细胞遗传学研究的基础上,利用已在染色体上标记的基因, 人们按照一定的设计，有计划地消减、添加或代换同种或异种染色体，从而达到定向改变遗传性和选育新品种的一种技术。

第一节 人工诱导多倍体

常见多倍体有三、四、五、六和八倍体。

多倍体产生的途径

1、原种或杂种所形成的未减数配子的受精结合2、原种或杂种的合子的染色体加倍 染色体加倍的技术方法

1、生物学方法

生物学上主要通过杂交尤其是种间杂交获得异源多倍体。

例如用雌性草鱼（2n＝48）与雄性三角鲂（2n＝48）杂交可以获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体。

这种不同科、属、种之间的远源杂交、会导致第二极体不排出，而产生多倍体

2、物理学方法

温度休克法：冷休克法（0～5度）和热休克法（30度左右）。

定义：用略高于(冷休克)或略低于(热休克)致死温度来诱导三倍体或四倍体的方法。

关键：能否成功地阻止第二次成熟分裂或第二极体的排出。要达到这一点，必须考虑温度处理的开始时间（TA）、处理持续时间（D）和处理温度（T）这三个因素。目前对鱼类使用温度休克法诱导三倍体的工作报道较多。一般来说，冷水性鱼类如鲑科种类应用热休克法、而温水性鱼类用冷休克效果较好。

优点：廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于大规模生产使用。

水静压法：采用较高的水静压（65kg/cm2）来抑制第二极体的放出或第一次卵裂产生多倍体。

这种方法诱导率高（一般在90％～100％）、处理时间（3～5min）短，对受精卵损伤小、成活率高。

但是，该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产的。

高盐高碱法:高盐高碱法是近几年才尝试使用的方法,采用高PH值或高盐条件来诱导产生多倍体.3、化学方法

有些化学物质也可以用来阻止第二极体的排出或受精卵的有丝分裂而产生三倍体或四倍体。

细胞松弛素B能抑制肌动蛋白聚合微丝，从而抑制细胞质分裂,常用于动物多倍体诱导。

秋水仙碱可以抑制细胞分裂中纺锤丝的形成，因而抑制有丝分裂，这在植物中已经广泛应用。

PEG是一种常见的细胞融合剂.用PEG处理虹鳟精子,使精子细胞融合后,再与卵子受精,也可获得三倍体.其它药物还有麻醉剂，如N2O、和聚乙二醇等。

缺点：化学药品一般比较昂贵、且具有毒性，影响处理后的胚胎发育，同时加上化学药物诱导产生的多倍体往往是在育种上没有价值的镶嵌体，所以化学方法在实际中的应用不及物理方法。第二节 人工诱导雌、雄核发育

雌核发育:俗称假受精，意指精子虽然正常地钻入和激活卵子，但精子的细胞核并未参与卵球的发育，精子的染色体很快消失，胚胎的发育仅在母体遗传的控制下进行。

赫特威氏效应:指只有在适当的高辐射剂量下，才能导致精子染色体完全失活，届时精子虽能穿入卵内，却能起到激活卵球启动发育的作用。

雌核发育的关键问题..要达到二倍体雌核发育目的，必须解决两个最主要的问题。第一：人为地使精子的遗传物质失活； 第二：阻止雌性个体染色体数目的减少。

染色体转移又称为染色体转导，是指把同特定基因表达有关的染色体或染色体片段取转入受体细胞，使之表达，并能在细胞分裂中一代一代传递下去的技术。

微细胞：是指含有一条或几条染色体（即只含有一部分基因组），外有一薄层细胞质和一个完整质膜的核质体

微细胞介导的基因转移法 方法：

1、微细胞的制备

用化学试剂阻断供体细胞的有丝分裂，使染色体停滞在有丝分裂中期，从而在染色体周围逐渐形成核膜而形成众多的微核。然后在细胞松弛素B的作用下使微核逐渐突出细胞膜外，最后经过离心获得含有一个微核、四周有一薄层细胞质和质膜界限的微细胞

2、微细胞融合与细胞融合方法相同

第七章 胚胎工程

胚胎工程（embryo engineering）是指所有对配子和胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能，发生量和质的变化的综合技术。

胚胎工程的意义

1、发挥优良母畜的繁殖潜力

2、促进家畜改良的速度

3、作为胚胎操作的基础

4、保存遗传资源

精子的成熟和获能

精子离开精巢后，无使卵受精的能力，它必须经过在附睾中成熟及在雌性生殖道内获能，才具有使卵受精的能力。

在附睾液和精液中存在着附睾蛋白和精清蛋白，称为去获能因子，精液中的精子表面被覆了这种因子。在雌性生殖道中的分泌物可以去掉这些覆盖物而使精子质膜、顶体发生一系列变化。

早期胚胎发育

卵裂：合子发生分裂形成无数小细胞。卵裂细胞不生长而连续分裂。主要是卵裂球的有丝分裂器与表层胞质变化的过程。

桑椹胚：卵裂数次后，出现实心细胞团，形似桑椹得名 胚胎发育

胚泡：哺乳动物的胚胎处于16细胞期的桑椹期时，胚胎是球型细胞团，细胞之间形成充满液体的腔隙，然后它们联合形成一个大腔位于胚胎的一端，即为胚泡结构。

囊胚：桑椹胚随着卵裂出现充满液体的囊胚腔，围绕囊胚腔的细胞组成囊胚层

原肠胚：囊胚继续发育、分化，形成双胚层或三胚层的原肠胚。外层为外胚层、迁到里面的称为内胚层和中胚层。

7.2配子操作 采卵(方法)1输卵管内采卵：以鼠为例，一般为了防止干燥可将屠杀后取出的输卵管放在平皿内，用石蜡油覆盖，在实体显微镜下找到输卵管膨大部，用磨尖的钟表镊子，切开输卵管膨大部，使内容物溢出而找到卵。

2对于稍大一些的动物可以用活体输卵管采卵，例如将兔子的腹部正中线切开，找出子宫角和输卵管。然后利用逆向冲卵法，自子宫输卵管连接处插入注射针，伞部以平皿接着冲洗；或在子宫输卵管连接处下1cm处，剪成V形小口，插入塑料细管，自伞部输卵管腹腔口插入，将液体推入，得到冲出的卵。

3.对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。

4.对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体壁进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。

体外受精（in vitro fertilization，IVF）就是将哺乳动物卵母细胞从母体取出，在体外进行精卵结合的过程。

胚胎操作

1胚胎培养

2胚胎移植

3胚胎保存

4胚胎分割

5胚胎嵌合 培养方法

即微滴培养法、输卵管培养法和中间受体培养法。

微滴培养法是利用塑料平皿制成50μl培养液小滴数个，每滴加入一定数量胚胎，在上面覆以灭菌且平衡好的液体石蜡。或先将液体石蜡倒入平皿中，用注射器吸培养液和胚胎，垂直伸到平皿底部制成小滴。然后将培养皿放到5％CO2、95％空气饱和湿度的37.5℃CO2培养箱中培养所需要的时间。如果更换培养液，应在实体显微镜下，用注射器或口控微吸管将培养液吸出，并加入新培养液，继续培养。

输卵管培养法取发情动物的输卵管洗涤后，置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同种或异种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进行培养。中间受体培养法是指，将受精卵或早期胚胎移入同种或异种动物的胚胎，该方法没有种属特异性，但为了在培养后容易找到胚胎和对胚胎的保护，一般先用琼脂包埋后再培养。同期发情

胚胎移植时，供体胚胎必须与受体子宫内膜发育状态高度同步化，才能获得好效果，这个过程称为同期发情（oestrus ynchronization），包括自然同期发情和人工同期发情。

自然同期发情即不经任何药物处理，依靠动物自身的性周期规律，选择处于适当时期的母畜作为受体。

胚胎移植

移植分为手术移植和非手术移植，胚胎保存

保存的方法可以分为非冷冻保存和冷冻保存。

非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法。

胚胎分割的原理

根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点，人们就考虑用这种实验技术，生产同卵双胎或多胎，以加速优良种群的繁殖。

胚胎的分割在不同时期有不同的分离培养方法，如卵裂球分离培养法、致密化前各期胚胎分割法、桑椹胚至囊胚期胚胎分割法等。

嵌合体（chimera）是指在同一个体中，由于基因型不同的细胞或组织互相接触，且各自独自并存的状态

发育早期，如卵裂球甚至受精卵所形成的嵌合体称为原发性嵌合体，而把在发育的较晚期，如胚层已经分化，或器官开始形成后，通过组织移植或嫁接等方法所形成的部分组织或器官的嵌合，称为次生性嵌合体

植入前胚胎嵌合体的制作方法

聚合法

第一种可以利用胚胎与胚胎聚合，即使用发生致密化后的胚胎，用酸性台氏液（pH2.5）或0.5％链霉蛋白酶除去透明带，充分洗涤后，放入含有5μg/ml植物凝集素A（PHA）的聚合液滴中。让一个胚胎垂直位于另一胚胎之上，借机械压力和PHA的作用，更易聚合。若放到37℃时，效果更佳，聚合完毕后，洗除PHA，继续培养，或进行胚胎移植。

第二种是利用卵裂球或细胞与胚胎聚合，将胚胎卵裂球解离或用其他游离的细胞，与胚胎聚合。当用一个已经除去透明带的胚胎时，将卵裂球或细胞在胚胎的正上方慢慢释放，使两者直接接触，借助PHA的作用使之聚合。当用两个无透明带胚胎时，以类似“三明治”的方式，把细胞放到两个胚胎之间，使之聚合。

第三种利用两种细胞间聚合。聚合时，各取数个细胞或卵裂球，放入空透明带内，用PHA使之聚合在一起，并用琼脂包埋。通过中间受体培养一段时间后，观察其发育的情况。

囊胚注射法

第八章

细胞重组与克隆技术

细胞重组：又叫细胞拆合，是指从活细胞中分离出细胞器及其组分，然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组，使其重新装配成为具有生物活性的细胞或细胞器的一种试验技术 细胞重组的方式：

1、胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种

2、微细胞与完整细胞重组形成微细胞异核体

3、胞质体与核体重新组合形成重组体

细胞重组技术

（一）显微操纵术

（二）细胞分离技术

1、梯度沉降分离法

2、等密度沉降分离法

3、流式细胞仪分离法

（三）细胞破碎方法

1、超声波破碎法

2、反复冻融法

3、化学裂解法

4、高速组织捣碎法

（四）细胞器的分离

（五）胞质体、核体和微细胞的制备

克隆的技术方法

（一）细胞核移植

细胞核移植技术是一种利用显微操作技术将一种动物的细胞核移入同种或异种动物的去核成熟卵内的精细技术

（二）核移植技术一般操作程序

1、核受体细胞的准备（1）卵母细胞的来源（2）核受体细胞的去核

2、核供体细胞的准备（1）核供体细胞的要求

（2）核供体的种类：胚胎卵裂球和体细胞

3、细胞核移植

胞质内注射和透明带下注射

4、激活

电刺激和化学试剂法（乙醇、DMAP）

5、重组胚的体内或体外培养

6、胚胎移植

克隆动物一般制备技术

1、胚胎细胞核移植法

2、胚胎干细胞核移植

3、胎儿成纤维细胞核移植

第九章

转基因生物与生物反应器

几种有效的转基因方法

一物理方法1电穿孔法

2、微注射法

3、裸露DNA直接注射法

4、基因枪介导的DNA转移 二，化学方法

1、DEAE－葡聚糖法

2、DNA-磷酸钙沉淀法

3、脂质体（liposome）介导的基因转移 三，生物学方法 病毒介导的基因转移

病毒载体包括：

DNA病毒载体

反转录病毒载体

第二篇：细胞工程

正交试验设计过程

对于单因素或两因素试验，因其因素少，试验的设计、实施与分析都比较简单。但在实际工作中，常常需要同时考察3个或3个以上的试验因素，若进行全面试验，则试验的规模将很大，往往因实验条件的限制而难于实施。正交试验设计就是安排多因素试验、寻求最优水平组合的一种高效率试验设计方法。

一、正交试验设计的概念及原理

1、正交试验设计的基本概念

正交试验设计是利用正交表来安排与分析多因素试验的一种设计方法。它是由试验因素的全部水平组合中，挑选部分有代表性的水平组合进行试验的，通过对这部分试验结果的分析了解全面试验的情况，找出最优的水平组合。

2、正交试验设计的基本原理

在试验安排中，每个因素在研究的范围内选几个水平，就好比在选优区内打上网格，如果网上的每个点都做试验，就是全面试验。如上例中，3个因素的选优区可以用一个立方体表示（图10-1），3个因素各取3个水平，把立方体划分成27个格点。若27个网格点都试验，就是全面试验。3因素3水平的全面试验水平组合数为33=27，4因素3水平的全面试验水平组合数为34=81，5因素3水平的全面试验水平组合数为35=243，这在科学试验中是有可能做不到的。正交设计就是从选优区全面试验点（水平组合）中挑选出有代表性的部分试验点来进行试验。

3、正交表及其基本性质

3.1 正交表

由于正交设计安排试验和分析试验结果都要用到正交表，因此，我们先对正交表作一介绍。常用的正交表已由数学工作者制定出来，供进行正交设计师选用（详见有关参考书）。正交表记号为La（bc），其中L代表正交表，a表示试验的次数即行数，b表示因素的水平数，c表示因素的个数即列数。

3.2 正交表的基本性质

3.2.1正交性

•任一列中，各水平都出现，且出项的次数相等；

• 任两列之间各种不同水平的所有可能组合都出现，且出现的次数相等；

3.2.2代表性

• 一方面，任一列的各水平都出现，使得部分试验中包括了所有因素的所有水平；任两列的所有水平组合都出现，使任意两因素间的试验组合为全面试验。另一方面，由于正交表的正交性，正交试验的试验点必然均衡地分布在全面试验点中，具有很强的代表性。因此，部分试验寻找的最优条件与全面试验所找的最优条件，应有一致的趋势。

3.2.3综合可比性

任一列的各水平出现的次数相等；任两列间所有水平组合出现次数相等，使得任一因素各水平的试验条件相同。这就保证了在每列因素各水平的效果中，最大限度地排除了其他因素的干扰。从而可以综合比较该因素不同水平对试验指标的影响情况。

根据以上特性，我们用正交表安排的试验，具有均衡分散和整齐可比的特点。•所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的。

所谓均衡分散，是指用正交表挑选出来的各因素水平组合在全部水平组合中的分布是均匀的5、试验结果分析

• 分清各因素及其交互作用的主次顺序，分清哪个是主要因素，哪个是次要因素； 判断因素对试验指标影响的显著程度； 找出试验因素的优水平和试验范围内的最优组合，即试验因素各取什么水平时，试验指标最好； 分析因素与试验指标之间的关系，即当因素变化时，试验指标是如何变化的。找出指标随因素变化的规律和趋势，为进一步试验指明方向； 了解各因素之间的交互作用情况； 估计试验误差的大小。

5.1直观分析法——极差分析法

计算简便，直观，简单易懂，是正交试验结果分析最常用方法。

Rj为第j列因素的极差，反映了第j列因素水平波动时，试验指标的变动幅度。Rj越大，说明该因素对试验指标的影响越大。根据Rj大小，可以判断因素的主次顺序。

Kjm为第j列因素m水平所对应的试验指标和，kjm为Kjm平均值。由kjm大小可以判断第j列因素优水平和优组合。

5.1.1确定试验因素的优水平和最优水平组合分析A因素各水平对试验指标的影响。根据正交设计的特性，对A1、A2、A3、A4来说，四组试验的试验条件是完全一样的（综合可比性），可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么kA1、kA2、kA3、kA4应该相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判断A1、A2、A3、A4对试验指标的影响大小。由于试验指标为产率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可断定A2为A因素的优水平。

同理，可以计算并确定B、C、D因素的优水平。

5.1.1确定试验因素的优水平和最优水平组合分析A因素各水平对试验指标的影响。根据正交设计的特性，对A1、A2、A3、A4来说，四组试验的试验条件是完全一样的（综合可比性），可进行直接比较。如果因素A对试验指标无影响时，那么kA1、kA2、kA3、kA4应该相等。如果kA1、kA2、kA3、kA4不相等。说明，A因素的水平变动对试验结果有影响。因此，根据kA1、kA2、kA3、kA4的大小可以判断A1、A2、A3、A4对试验指标的影响大小。由于试验指标为产率，若kA2>kA3>kA1>kA4，所以可断定A2为A因素的优水平。

同理，可以计算并确定B、C、D因素的优水平。

5.1.2确定因素的主次顺序

根据极差Rj的大小，可以判断各因素对试验指标的影响主次。极差越大的，该因素对产率的影响越大，反之越小。

5.1.3绘制因素与指标趋势图

以各因素水平为横坐标，试验指标的平均值（kjm）为纵坐标，绘制因素与指标趋势图。由因素与指标趋势图可以更直观地看出试验指标随着因素水平的变化而变化的趋势，可为进一步试验指明方向。

最后得出试验的最优组合和次优组合。

5.2方差分析

极差分析法简单明了，通俗易懂，计算工作量少便于推广普及。但这种方法不能将试验中由于试验条件改变引起的数据波动同试验误差引起的数据波动区分开来，也就是说，不能区分因素各水平间对应的试验结果的差异究竟是由于因素水平不同引起的，还是由于试验误差引起的，无法估计试验误差的大小。此外，各因素对试验结果的影响大小无法给以精确的数量

估计，不能提出一个标准来判断所考察因素作用是否显著。为了弥补极差分析的缺陷，可采用方差分析。

方差分析基本思想是将数据的总变异分解成因素引起的变异和误差引起的变异两部分，构造F统计量，作F检验，即可判断因素作用是否显著。

方差分析基本思想是将数据的总变异分解成因素引起的变异和误差引起的变异两部分，构造F统计量，作F检验，即可判断因素作用是否显著

5.2.1 偏差平方和

1616

nS总（y

n1

2y）2

j2n12jynCTIV2j2CTG21616,Gn1yn,f总16115S因素IjIIIII4CT

Ij、IIj、IIIj、IVj分别表示第j列中1,2,3,4水平对应的试验结果之和。

总偏差平方和＝各列因素偏差平方和+误差偏差平方和。

5.2.2自由度

f总=试验的次数-1；f因=因素的水平数-1。

5.2.3方差

A因素的方差=A因素的偏差平方和/A因素的自由度

误差的方差=误差的偏差平方和/误差的自由度

5.2.4构造F统计量

5.2.5列方差分析表，作F检验

• 当FA>F0.01(f1，f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有高度显著地影响，记作**。当F0.01(f1,f2)>FA>F0.05(f1,f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有显著地影响，记作*。当F0.05(f1,f2)>FA>F0.10(f1,f2)时，说明该因子水平的改变，对试验结果有一定的影响，记作*-。

查表可得F0.01(f1，f2)、F0.05(f1,f2)、F0.10(f1,f2)的值。

6、验证试验结果

经结果分析得出最优生产条件，进行最优试验条件的验证。

7、结论

通过了验证试验，最后可以得出结论。

1] 唐宗祥等.小麦成熟胚离体培养研究[J].植物学报,2003,5-6.[2] 腾世云,王殿久.小麦幼胚组织培养及其再生植株移栽条件的研究[J].植物生物学学报,1990,1：49-55.[3] 王亚馥,崔凯荣,陈克明,等.小麦幼胚培养中体细胞胚发生和植株再生[J].植物学通报增刊,1992,：29.[4] Larkin PJ,Pyan SA,Brettell RIS,et al.Heritable Sornaclonal Variation

in Wheat.Theor.Appl.Genet.1984,67：443-445.[5] Maddock SE.VA Lancaster,R,Risiott,et al,Plant Regeneration From Cultered Immature Embryos and Inflorescences of 25 Cultivars of Wheat.Journal of Erperimental Botany,1983,34(144):915-926.[6] 杨淑慎,郭振,徐虹.小麦胚愈伤组织的诱导和植株再生[J].西北农业学

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大学学报,1996,4:451-456.[11] 梁竹青，高明尉.不同小麦基因型对体细胞组织培养的反应[J].中国农业科

学,1986,2:42-48.[12] 王大元.经济作物组织培养[M].北京:科学出版社,1988:73-78.[作者简介] 孙百虎（1981-）男，陕西西安人，助教，天津大学在读硕士，研究方向：生物技术。

S因素

F因素f因素S误差

f误差

第三篇：考试,课件

10月11日，网友“后来”在自己的QQ空间晒出了温馨的一幕

并配上了帅帅的军人男友给她剥栗子的几张照片。这条信息一经发布，立即在网上引来点赞和惊叹一片。这本来是件很触动人们内心最柔软的地方、非常温馨的一件事。展示了军人不仅是铮铮铁汉，更富有侠骨柔情。对展示军人形象、展现军人风采，非常正面。

然而，这几天，有人在网上造谣传谣，说这位军人男友“被总参查处通报，所在部队全面清查手机，部队党委做检查”等；更有人直接给这位军人编造了几个具体单位，造谣说这位军人“受到了除名处分”，所在单位领导从师、团到营、连全部受到了责令转业、各种行政处分等严厉处理，等等。

这些谣言在微博、微信群、朋友圈被大量传播。引来许多不明真相的网友对军队领导机关、甚至是整个军队的质疑和语言攻击。

发现这一网络信息后，笔者迅速进行了多方查证。经详细调查，网传这位军人所在的几个单位、院校要不就根本不存在，要不就没有这位军人；军委有关部门更是从来没有发出过类似通报；所有网传涉及此事的部队，也没有作出过类似处理决定。

经过几天仔细摸排查找，从点滴信息中终于找到了这位当事军人。经逐级核实，这位军人所在单位的上级机关没有发出过处理通报，这位军人所在单位没有就此事查处过这位军人、没有清查过手机，无论是这位军人还是他的各级领导没有一人因此受到过批评或处分。经这位军人所在单位调查核实，之前他与女友视频是在业余时间着便装进行的、剥栗子是利用个人休息时间进行的，目前没有发现该军人有其他违反部队规定的问题。该战士女友发现自己空间的信息被人转发造谣后，立即进行了删除并向所在地警方报案。

造谣动动嘴，辟谣跑断腿。因为这一网络谣言，展开了大量调查核实工作，牵扯了许多人力、精力；这些谣言的广泛传播，也给军队和军人形象造成了很大损害。

以上是新闻案例 可以做成三张PPT（我想如果可以的话）将事情两次转折分开。以下是我想的问题和探究 问题1：为什么会有人去造谣？

答：从看笑话的心态期待他人发生悲剧以此来达到内心卑劣的满足感

制造热点炒作热度从中获益 问题2：怎样看待这种造谣行为？

答：造谣动动嘴，辟谣跑断腿。因为这一网络谣言，展开了大量调查核实工作，牵扯了许多人力、精力；这些谣言的广泛传播，也给军队和军人形象造成了很大损害。利用互联网编造传播涉军谣言是违法甚至犯罪行为。问题3：这个辟谣出来之后会对新闻界的发展产生什么影响？

答：网友纷纷表示“以后的新闻真的不知道该不该相信了”，新闻失实会降低人们对新闻报道的信任度，阻碍新闻业发展，违背了新闻的真实性原则。

第四篇：细胞工程说课稿

《细胞工程》说课稿

各位专家、领导下午好！

今天我就《细胞工程》的教学向各位作一简单汇报。

一、讲教材

《细胞工程》我们采用的教材是国家高职高专“十一五”规划教材，是在掌握“生物化学、细胞生物学、分子生物学、普通生物学”等的基础上进行教学的。“细胞工程”是现代生物技术的重要组成部分，同时也是现代生物学研究的重要技术工具。所以通过本课程的学习，学生要掌握生物组织、器官及其细胞离体培养的原理与技术，为从事生物学领域的相关研究及其与细胞工程有关的生物技术产业奠定良好的理论和技术基础。

本课程共分三大篇，第一篇为细胞工程的基本知识，第二篇为植物细胞工程，第三篇为动物细胞工程。整个课程是以“细胞全能性”为基本理论，“无菌操作”为主要操作技能，“定方案-配培养基-选择外植体-培养”为基本流程。1.教学目标：理论知识方面，重点掌握本学科的基本原理和基本技术即：细胞全能性学说在细胞工程中的指导作用；掌握不同组织、器官的培养特点和控制方法。了解细胞工程的各类技术在现代生物学与生物技术领域的应用途径与发展潜力。

实践技能方面，重点掌握细胞工程的基本操作技术—无菌操作；掌握外植体选择、愈伤组织和胚状体诱导、器官发生调控等基本技术；

2.教学重点难点：掌握”细胞全能性“理论的指导下，不同组织、器官和细胞培

养的调控方式。

3.情感态度：通过了解“细胞工程”技术在国民生活生产中的重要意义，来激发

学生的学习热情和动力。同时在实验操作中，培养学生的团结互助精神。

二、讲教法

主要通过已有的生物的基础知识和生活中的实例来引出学生的参与。

《细胞工程》有三大篇组成，第一篇是基础知识部分，主要内容围绕“基本仪器的功能，配制培养基和创造无菌环境”展开。利用学生掌握的生物知识，根据培养基的功能让学生尝试着回答出“培养基的主要组成成分”。讲到创造无菌环境部分，用家庭中开水烫容器和大型餐厅用紫外消毒柜给餐具消毒的事例引出所用仪器设备以及环境消毒的原则和方法。第二篇和第三篇以同一种模式讲解，多“以旧带新”的方式讲，在掌握植物组织培养的基础上，整个讲课环节都可以在共性的基础“选择培养材料→选择培养基→在合适条件下培养”上，然后根据每一章节的特殊之处进行详细讲解。例如“茎尖脱毒技术”中，除植物组织培养流程之外，需要补充到病毒的检测和脱毒的预处理，同时茎尖剥离技术也是需要掌握的重点技能。在课堂讲操作原则，实践课上进行具体的操作。

三、讲学法

学生在掌握基本知识和操作技能的基础上，通过老师的提示，在课堂上回答新的

第五篇：题库细胞工程

²

细胞工程：以生物细胞、组织或器官为研究对象，运用工程学原理，按照预定目标，改变生物性状,生产生物产品，为人类生产或生活服务的科学。

²

培养基母液：把培养基中的各种大量元素用量扩大l0倍，微量元素、有机元素和激素等用量扩大l00倍，分别或混合溶解制成浓缩液，这种浓缩液称为母液 ²

植物生长调节物质：调节植物生长的物质，以极微小的量影响到植物细胞的分裂、分化、发育，影响植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠、萌发等许许多多的生理生化活动，包括植物激素和人工合成的植物生长调节剂

²

离体培养：指从植物体分离出符合需要的组织、器官、细胞或原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术

²

细胞全能性：是指细胞具有发育成完整个体的遗传潜能。也可以指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再生成完整个体的遗传潜能。

²

外植体：指用于离体培养的活的植物器官、组织、细胞和原生质体等

²

愈伤组织：自然条件下，植物在受伤之后，创伤部位的细胞脱分化不断增殖，形成松散排列、无特定结构的非器官化组织

组织培养中，人工培养基上由外植体细胞经脱分化产生的一团不定形的、疏松排列的、没有分化的薄壁细胞

²

极性：通常是指在器官、组织甚至细胞中，在不同的轴向上存在某种形态结构和生理生化上的梯度差异。

²

细胞分化：由发育起始状态的合子沿个体发育方向不断分化出形态结构、生理功能不同的细胞、组织、器官而最终形成完整植株的过程

²

细胞去分化：一个成熟细胞回复到分生状态或胚性细胞状态的现象，即失去已分化细胞的典型特征的过程

²

细胞再分化：脱分化的分生细胞重新恢复分化能力，沿着正常的发育途径，形成具有特定结构和功能的细胞的过程

²

胚状体：经体细胞胚发生形成类似合子胚的结构

²

次生胚：有些植物从体细胞胚的细胞中又可产生体细胞胚，这一过程称为重复体细胞胚胎发生，形成的体细胞胚称为次生胚 ²

胚性细胞：又称体胚原始细胞，一类独特的细胞，它与分生细胞相似，通常较小，近圆形，具较大的核和核仁，并能高度染色，胞质浓厚

²

看护培养：用一块活跃生长的愈伤组织块来看护单个细胞使其生长和增殖 ²

人工种子：将植物离体培养中产生的胚状体（体胚）或者能发育成完整植株的分生组织（不定芽、小鳞茎、短枝、毛状根、愈伤组织等），包裹在有养分和具有保护功能的物质中形成的类似于天然植物种子的结构，并在适宜条件下发芽出苗的颗粒体。

²

原生质体：去除细胞壁后存活的植物细胞

²

细胞系：经过再培养后而形成的具有增殖能力、特性专

一、类型均匀的培养细胞 ²

细胞融合：是在自发或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。

²

体细胞杂交:采用细胞融合的方法，使原来不能或很难进行有性杂交的两种生物，通过体细胞融合将它们的染色体核基因共存于一个杂交细胞 ²

体细胞变异：非性细胞产生的遗传变异或表观遗传变异

体细胞无性系变异：植物外植体经组织、细胞培养的脱分化和再分化过程，表现于再生植株中的变异

²

突变体：是指发生突变的个体，具有与野生型不同的表型的特点。由于基因或染色体的DNA序列发生改变，导致细胞或生物体获得了不同于野生型（原始、未突变）的新表型

²

异核体：不同种属或同一种属的不同生物个体的亲本细胞发生融合所形成的含有不同细胞核的融合细胞

²

成批培养：将一定量的细胞或细胞团分散在一定量的液体培养基中进行密封培养看卖弄

²

原代培养：也称初代培养期。从体内取出组织接种在培养瓶中培养到第一次传代前阶段，一般持续1-4周。

继代培养：是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上，这种转移称为继代培养或传代培养 接触抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加

【简答题】：

1.简述细胞工程在生物技术领域中的地位。

细胞工程是细胞水平上的生物工程，是现代生物技术的桥梁与纽带，也是该领域中最直接应用于生产实践并取得显著效益的应用科学。它与其他相关学科理论（基因工程、发酵工程、生化工程等）交叉发展，必须与其它生物技术相结合才能更好地发挥作用

2.目前，常用的植物细胞培养基种类有哪些？各有什么特点？

1）MS培养基

特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的平衡溶液。养分的数量和比例较合适

2）B5培养基

其主要特点是含有较低的铵，这是因为铵对不少培养物的生长有抑制作用。

3）White培养基

其特点是无机盐数量较低，适于生根培养

4）N6培养基

其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。5）KM8P培养基

其特点是有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合培养。

3.配制培养基时，为什么要先配母液？如何配制母液？

1）培养基中含有的元素很多，每次配制培养基时，要对所有的元素一个个进行称量、溶解，非常繁琐。特别是微量元素用量很少，用普通天平很难称量准确。配制母液不但可以保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取，而且还便于低温保藏，可多次利用

2）确定培养基----按照扩大倍数称量----溶解----按顺序混合----定容----母液分装----贴标签----保存于冰箱

大量元素应配成浓度为10倍的母液，一般将微量元素配制成100倍的母液，使用时再稀释100倍

配置时化合物应分别称量，分别溶解；混合时注意先后顺序，防止产生沉淀；混合时要边搅拌边混合

4.例举三种常用的物理灭菌方式，简述其原理和优缺点。

湿热灭菌：在密闭的蒸锅内，蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达到121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢（穿透力强）干热灭菌：利用烘箱烘烤灭菌，温度与灭菌时间成反比，一般设定160℃，灭菌时间2-3h，主要用于玻璃器皿的灭菌

过滤灭菌：用细菌不能通过致密具孔滤材的原理以除去气体或液体中微生物的方法。常用于气体、热不稳定的药品溶液或原料的除菌

5.常用的灭菌方法有哪些，各有哪些优缺点？

1）湿热灭菌（高压蒸汽灭菌）优点：高温高压蒸汽对生物材料有良好的穿透力，能造成蛋白质变性凝固而使微生物死亡，是一种最有效的灭菌方法。缺点：如果是对培养基或液体溶液灭菌，灭菌时间与需要灭菌的培养基或液体溶液的体积密切相关，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养基内的化学物质遭到破坏，影响培养基成分。

2）过滤除菌 优点：有些灭菌的材料不能受热，可以用过滤法来灭菌，可以滤除绝大多数微生物的营养细胞 缺点：易污染，过滤法的最大缺点是不能滤除病毒.多数滤器具吸附性

3）干热灭菌 优点：在干热条件下可将细菌杀死，方便，不易污染，杀菌效果较理想 缺点：干热灭菌存在能源消耗大、浪费时间、安全性差问题；在干燥状态下，热穿透力弱，温度不宜均匀

4）紫外线灭菌 优点：具有较高的杀菌效率，运行安全可靠；对隐孢子虫和贾第虫有特效消毒效果；不产生有毒有害产物；操作简单 缺点：由于紫外线穿透物质的能力很弱，所以只适于空气中和物体表面的灭菌，而且要求距照射物质以不超过1.2m为宜。

5）药剂灭菌 优点：方法简便，只需要药剂喷洒在要消毒的空间或材料表面即可，杀菌又除尘 缺点：浓度太高，可能有腐蚀作用

6.配制培养基时，加入一定量的植物生长调节物质，它们在离体培养过程中有哪些作用？

包括植物生长调节剂与植物激素，是植物细胞生长的调节物质，以极微小的量起作用。它能诱导细胞分裂、愈伤组织再分化以及胚状体发育。植物激素主要包括生长素类、细胞分裂素类和赤霉素类，有时也使用脱落酸、乙烯等物质。

生长素类：用于诱导愈伤组织的形成、根的分化以及细胞的分裂和伸长，诱导胚状体产生

细胞分裂素类：促进细胞分裂和分化，诱导胚状体和不定芽形成，延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成

赤霉素：加速细胞的伸长生长，也促进细胞分裂。

大多数情况下对组培中器官和胚状体的形成表现抑制作用，但对已形成器官和胚状体的生长通常有促进作用 脱落酸：适量的ABA可提高体细胞胚发生的频率和质量，抑制异常体细胞胚的发生

7.试述植物细胞全能性的含义和应用。

含义：植物细胞无论是体细胞还是生殖细胞均具有该物种的全套遗传信息；只有在适宜的条件下，植物细胞才具有发育成完整植株的能力；植物每个细胞均具有发育成完整植株的能力

应用：无性系的快速繁殖；培养无病毒种苗；新品种的选育（花培和单倍体育种、离体胚培养和杂种植株的获得、体细胞诱变和突变体筛选、细胞融合和杂种植株的获得）；人工种子；药用植物和次生物质的工业化生产

8.实现植物细胞全能性的条件是什么？

具有较强全能性的细胞从植物组织抑制性影响下解脱出来，使其处于独立发育的离体条件下；赋予离体细胞一定刺激，包括营养物质、植物激素、光周期、温度、酸碱度等

9.优良愈伤组织有何生长特性？

（1）高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植物

（2）容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性的原生质体

（3）旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系（4）经过长期继代保存而不丧失胚性，便有可能对它们进行各种遗传操作 10.何为胚状体？胚状体和合子胚有何异同？

胚状体 离体培养条件下，没有经过受精过程，但是经过了胚胎发育过程所形成的胚状类似物，此现象无论在体细胞培养还是生殖细胞培养中均可以看到，因而统称为体细胞胚或胚状体。

异：胚状体起源于非合子细胞，是体细胞体外培养而来，不同于合子胚，合子胚是经过受精发育而来的

与合子胚相比，体细胞胚子叶不规范、胚小、含水量高、对脱水敏感、没有休眠

相同点：都含有一整套遗传信息,都可以发育成新一代生物个体。胚状体的维管束与合子胚一样,是独立产生的,与母体维管束不相连 11.影响胚状体发生的主要因素有哪些？

因素：氮源【NH4+与NO3-的相对和绝对量都影响体细胞胚的发生，诱导培养基中还原态氮的存在与否最为关键】

生长素【内源IAA含量上升或维持在相对高水平是诱导胚性细胞发生的基础，胚性愈伤组织内源生长素的含量远高于非胚性愈伤组织】

组织起源【对于距活体胚胎发育较近的组织和成熟及未成熟的胚胎在离体条件下可能更利于体细胞胚的诱导】

供体植物的基因型、培养物的生理状况、培养基中的外源激素、天然提取物和活性炭等都可影响胚状体的发生

12.如何区分离体培养条件下的不定芽和胚状体？

体细胞胚经过了胚胎发育过程，具有胚根、胚芽和胚轴的完整结构

体细胞胚最根本的特征为两极性，即在发育的早期阶段从方向相反的两端分化出茎端和根端；不定芽是在器官发生方式分化的单极性特征下形成的。体细胞胚的维管组织分布是独立的“Y”字形结构，与外植体组织无结构上的联系；而愈伤组织上分化的不定芽一般在愈伤组织表面，与外植体或愈伤组织的维管组织相联系

13.目前研制的人工种子结构是怎样的？

人工种子由以下三部分组成：

①具有良好发育的体细胞胚，并能发育成正常完整植株：广义的体细胞胚由组织培养中获得的体细胞胚即胚状体、愈伤组织、原球茎、不定芽、顶芽、腋芽或小鳞茎等繁殖体组成。②人工胚乳，一般由含有供应胚状体养分的胶囊组成，养分包括矿质元素、维生素、碳源及激素等。③胶囊之外的包膜称之为人工种皮，有防止机械损伤及水分干燥等保护作用。

14.控制胚性细胞同步化的方法有哪些？

①抑制剂法促进细胞同步分裂；培养初期加入DNA合成抑制剂，使DNA合成暂时停止，当除去DNA合成抑制剂，细胞开始进行同步分裂 ②低温处理促进细胞同步分裂；抑制了细胞分裂，一段时间后再恢复正常培养温度

③渗透压控制同步化法；不同发育阶段的胚，具有不同的渗透压要求，通过调节渗透压来控制胚的发育，使其停留在某一阶段，然后同步发育 ④同步胚的分段收集筛选法；用不同孔径的尼龙网或采用密度梯度离心来选择不同发育阶段的胚，然后再转入适宜它们发育的培养基上，使幼胚继续发育。⑤通气法。乙烯的产生与细胞分裂密切相关，在细胞分裂达到高峰前，有一个乙烯合成高峰，在培养基中通入乙烯或氮气，控制细胞同步分裂 15.植物离体无性繁殖主要适用于哪些植物？与常规无性繁殖相比有什么优势？

植物离体无性繁殖主要适用于园艺观赏植物、农作物、药用植物及经济林木的种苗生产。（1）周期短，便于控制培养条件。繁殖速度快，经济效益高。（2）占用空间小，不受地区、季节限制。（3）繁殖珍稀、濒临苗木和突变体，是优良品种培养的有效途径。（4）利物保持原来品种的特性。

16.分离植物单细胞的方法有哪些？

有以下三种：

(一)机械法:主要通过机械磨碎、切割植物体从而获得游离的单细胞。

(二)酶解法：主要是根据植物细胞壁的组成特点选用某一专一性水解酶，在温和条件下将壁物质分解掉，从而释放出细胞。

(三)愈伤组织诱导法：通过组织培养获得callus，由于细胞结构松散，可通过高频振动使单个细胞分离处理

17.植物单细胞培养的方法有哪些？各有何特点？

1、平板培养法

特点：单细胞在培养基中分布均匀，便于定点观察，易筛选；通气差，排泄物易积累造成细胞毒害

2、看护培养

特点：简便、成功率高；不能在显微镜下直接观察.3、饲养层培养

特点：操作简便；不能在显微镜下追踪细胞的分裂和细胞团的形成

4、微室培养法

特点：在培养过程中可连续进行显微镜观察；由于培养基少，水分难以保持，培养基的成分及pH等也易于变动，细胞短期培养后往往不能再生长。

5、液体浅层静置培养法

特点: 易于补加新鲜培养基、可以镜检

6悬浮培养法

特点：能提供大量同步分裂的细胞，且细胞增殖速度快，可用于大规模工业化生产

7双层滤纸植板法：在饲养细胞层与靶细胞层之间放两层滤纸，上面一层滤纸用于把靶细胞转移到其它培养基上继续培养。

8条件培养:含有植物细胞培养上清液或静止细胞；在平板培养和看护培养的基础上发展起来的；看护培养中愈伤组织可以提供单细胞生长繁殖所需的物质；植物细胞上清液或静止细胞也有相同效果 18.什么叫细胞的悬浮培养？分批培养和连续培养各有何特点？

细胞的悬浮培养：将游离的单细胞或细胞团按照一定的细胞密度悬浮在液体培养基中进行培养的方法。

分批培养特点：培养系统基本处于封闭状态，要及时更换培养液进行继代培养；细胞数量随着培养时间的变化呈S形曲线；操作简单，重复性好，往往能获得理想的培养效果；特别适合于突变体的筛选、遗传转化等研究

连续培养特点：培养过程中培养液不断得到更换；设备复杂，但便与自动化，产品质量稳定；营养物利用率低于分批培养，菌种易退化，易污染，因此连续时间有限

19.在细胞悬浮培养中，如何进行细胞生长量的计算？

（1）细胞计数：通常用血球计数器计数，计算较大的细胞数量时，可以使用特制的计数盘；（2）细胞密实体积（PCV）：以每毫升培养液中细胞总体积的毫升数表示，测定时，将细胞 离心于离心管内，测定细胞层所占的体积。

（3）细胞鲜重：将悬浮培养物倒在下面架有漏斗的已知重量的湿尼龙网上，用水洗去培养基，真空抽滤以除去细胞上沾着的多余水分，称重

（4）细胞干重：用以知质量的干尼龙网依上法收集细胞，在60°C下烘箱内烘12h，细胞干重恒定后再称重

（5）有丝分裂指数：指在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占总细胞的百分数。通过富尔根染色法对愈伤组织染色，再在载玻片上制片并镜检，随机检查500个细胞，统计处于有丝分裂各个时期的细胞数。指数越高，表明细胞分裂速度越快

20.悬浮培养细胞同步化的方法主要有哪些？

1、物理方法

(1)分选法: 细胞体积大小分级，直接将处于相同周期的细胞利用一定大小的筛网过滤分选，然后将同一状态的细胞继代培养于同一培养体系中

(2)冷处理法: 收集细胞,在4℃温度下处理数天,添加新鲜培养液培养.2、化学方法

(1)饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿之后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同步进入分裂。

(2)抑制法：通过向培养基中添加尿苷(1μg/ml),5-氟脱氧尿苷(2 μg/ml)等化学抑制剂抑制细胞分裂,可使培养细胞同步化。(3)有丝分裂抑制法:在指数生长期的细胞悬浮培养物中加入一定浓度的秋水仙素

21.在植物细胞培养中如何提高植物次生代谢产物的产量？

（一）筛选得到高产细胞系（株）常用方法有：

1、克隆选择（有相同遗传基因的细胞群）

指通过单细胞克隆技术和细胞团克隆技术，将培养细胞中能够积累较多次生代谢物且具有相同遗传基因的细胞群挑选出来，并加以适当的培养形成高产细胞系。

2、抗性选择

指在选择压力下，通过直接或间接的方法得到抗性变异的细胞系。

3、诱导选择

是通过化学诱变或紫外线照射等各种物理化学方法诱变产生比原亲本细胞全成能力高的细胞系（株）

（二）培养条件 1适宜温度

2、不断调节PH

3、营养成分：一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次生代谢产物。

4、光：包括光强、光质和光照时间对细胞生长和次生代谢产物合成都有一定影响。

5、通气量和搅拌转速

6、前体饲喂

7、诱导子的应用：诱导子是指能引起植物细胞某些代谢强度或代谢途径的物质，可分为生物诱导子和非生物诱导子。不同诱导子作用于不同植物可以产生多种多样的次生代谢产物。

8培养方法:两步培养法、两相培养法（有利于代谢物的分离提取，促进胞内代谢物的分泌）等

22.简述细胞活力鉴定的方法。

1、相差显微镜观察法：观察细胞质环流和正常细胞核的存在

2、FDA染色法 ：在活细胞内FDA可以被酯酶裂解，将能发荧光的极性部分（荧光素）释放出来。荧光素不能自由地穿越细胞质膜，能在完整的活细胞中积累，紫外线照射下发绿色荧光

3、伊凡蓝染色法：只有活力受损伤的细胞和死细胞能够摄取这种染料

4氧电极法：活细胞光合作用放出氧气

23.简述细胞计数的方法

24.影响原生质体分离效果的因素有哪些？试做分析。

（1）材料种类和生理状况：植物幼苗或新生枝的完全伸展叶片的叶肉组织是分离原生质体的最方便、最合适的植物材料。用于分离原生质体的愈伤组织或悬浮细胞应当处于生长早期或指数生长期

（2）酶解温度：温度高、得率高，但存活率低（3）酶解时间：过短得率小、过长存活率低（4）渗透压稳定剂的种类和浓度：因种而异

（5）氧气：酶解时尽量采用振荡，使细胞得到足够的氧气进行呼吸作用（6）黑暗：抑制原生质体形成细胞壁（7）酶液活力：储存时间过长会使酶液失活

25.制备原生质体时为何要在等渗或稍高渗溶液中进行？

只有培养在等渗或稍高渗培养基中植物才能正常生长 如果植物的原生质体培养在非等渗或低渗或高渗培养液中植物有可能会因为浓度差而吸水或是失水从而导致植物的死亡，所以植物的原生质体要培养在等渗或稍高渗培养基中。

26.原生质体再生植株的基本过程。（1）细胞壁再生

（2）细胞分裂：分裂前细胞质增加、色素体扩大、颜色加深

（3）再生植株：直接分裂形成苗（第一次分裂便表现极性）；通过愈伤组织形成苗；通过球状体再生成苗（原生质体---细胞---表面光滑的球状体或盘状体---通过出芽方式形成小苗）27.简述原生质体培养的意义。

研究细胞壁的再生过程和植株的再生过程；为植物细胞融合扫平了障碍，特别是为制造新杂种（种间杂种）开辟了道路；原生质体可摄入外源DNA、细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性可与植物全能性相结合，为植物遗传修饰打下基础；获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料

28.原生质体的培养方法有哪些？各有何优缺点？

⑴液体浅层培养法： 优点：

原生质体在液体环境中有较强的吸收营养物质的能力，表现出较强的细胞分裂能力。操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。缺点：

原生质体分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象而影响其进一步的生长和发育。此外，难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。⑵双层培养法——液体-固体双层培养法：

 优点：

固体培养基中的营养物质可以缓慢放到液体培养基中，如果在下层固体培养基中添加一定量的活性炭，则还可能吸附培养物产生的一些有害物质，促进原生质体的分裂和细胞团的形成。

 缺点：

不易观察细胞的发育过程。⑶固体平板培养法

 优点：

使原生质体处于固定位置，避免了细胞间有害代谢产物的影响，有利于对单个原生质体的细胞壁再生及细胞团形成的全过程进行定点观察。



缺点：操作要求比较严格，温度对原生质体与培养基混合有一定影响；另外，固体中单细胞生活能力弱，通气状况不良，第一次细胞分裂时间会推迟2d左右。

（4）琼脂糖珠培养：

优点：摇床震荡培养，改善了培养物的通气和营养环境，从而促进了原生质体的分裂和细胞团的形成

29.原生质体融合要经过哪些过程？

30.PEG融合与电融合各有何特点？两种方法的原理和关键技术是什么？

PEG法特点：（1）融合率10%左右，融合较繁琐（2）具有一定毒害作用；容易形成由2个以上原生质体融合形成的融合体

电融合特点：(1)效率高（70 %以上），但存活率低；对原生质体伤害性小(2)装置精巧、方便简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程。(3)免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。

PEG诱导融合法原理：PEG为多聚化合物，其分子具有轻微的负极性，可与具有正极性基团的水、蛋白质和糖类等形成氢键，在原生质体之间形成分子桥，从而使原生质体发生粘连。当用培养基将与膜相连的PEG分子洗掉后，膜上电荷发生紊乱而重配。

电融合的原理：①交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠。②施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流。【老师ppt 在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体】

31.原生质体融合产物有哪些类型？ 杂种细胞：原生质和核都融合

异核体：细胞质融合，细胞核没有融合 同核体：同一亲本的原生质体融合产生

非对称杂种：由于人工处理或其它原因造成某一亲本的染色体部分丢失 细胞质杂种：某一亲本染色体全部丢失而细胞质融合

32.体细胞杂交有何意义？

（1）实现远缘杂交，形成新的物种。

克服常规有性远缘杂交存在的生殖隔离和杂交不亲和的障碍，为广泛重组遗传物质、形成新的物种开辟的新途径

（2）创造细胞质杂种。融合了双亲的细胞质，可将细胞质基因重组，将双亲细胞质基因遗传给子代

（3）培育作物新种质和新品种。通过近缘种内或种间的体细胞杂交可获得稳定的具有双亲两套染色体的体细胞杂种植株。往往可育，能作为育种的新材料通过常规育种获得新品种

33.什么是植物体细胞无性系变异？引起或影响植物体细胞无性系变异的因素有哪些？

植物细胞、组织、器官在无菌条件下进行离体人工培养，经过脱分化和再分化过程，重新形成愈伤组织和完整植株时所产生的变异 称为植物体细胞无性系变异

因素：（1）自发突变，与培养物的遗传背景、外植体类型及培养类型有关，同时也受培养时间、培养成分等因素的影响

（2）人工诱变，包括物理诱变和化学诱变。物理诱变就是利用X射线、γ射线、β射线、中子、激光、电子束、离子束、紫外线等物理因素辐射诱发变异。化学诱变是利用化学试剂诱发的变异。诱变剂包括碱基类似物，烷化剂，DNA分子结构插入物三大类。

34.试述植物体细胞无性系变异的遗传学基础。

体细胞无性系变异的遗传基础：

（1）染色体组型变异，如出现多倍体和非整倍体。

（2）染色体结构变异，由染色体重排造成的基因丢失，或“关闭”一个能使其相应隐性基因产生表现型效应的显性等位基因等。（3）基因突变

（4）DNA总量变异和DNA重复序列拷贝数的变异（5）基因丢失（6）DNA碱基修饰

（7）转座子的激活，由转座引起突变。（8）基因重排

35.试述农杆菌Ti质粒基因转化的原理。

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌G-，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根

根癌农杆菌中含有Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此可以将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，然后借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株

36.植物基因转化的方法有哪些？各自的特点是什么？

1）农杆菌介导法：受体类型广泛，简单易行、周期短、转化频率高，转化体常出现“嵌合”现象，影响转化频率的因素相对较少等。

2）病毒介导法：特点是 病毒增殖水平较高、增殖速度快，基因组较小，宿主范围广，易于纯化等。

3）基因枪转化法：适用范围广、无宿主限制、靶受体类型广泛、可控度高、操作简便、快速等。

4）电击法 特点是 对细胞不产生毒性，但对细胞损伤较大 5）PEG介导法：特点是成本低廉、效果稳定

6）花粉管通道法： 特点是方便易行，不需专门仪器和昂贵药品，直接得到转化的种子，受季节限制。

7）显微注射法：特点是转化效率高，转化细胞的培养过程无需特殊的选择系统。

【老师ppt】

（1）农杆菌介导转化法：优： 转化效率高；能够插入非重排的外源DNA长片段；DNA片段主要以单拷贝或低拷贝形式插入；不需要特殊的专用设备

缺：转化的寄主范围有限，特别是对许多单子叶植物不适用；外源的转基因只能以T-DNA插入的方式被导入寄主细胞（2）基因枪介导转化法

与农杆菌转化相比，基因枪法转化的一个主要优点是不受受体植物范围的限制（3）花粉管通道法：

优：不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握

缺：不同作物导入DNA的最佳时间有较大差异，要针对不同的植物作出相应的改动

(4)DNA直接转换法：适用对农杆菌感染不敏感的植物(5)化学药剂诱导法：在没有载体的情况下可使用，但转化率低(6)电击法：对细胞不产生毒性，但对细胞损伤较大(7)显微注射法：适合大细胞操作，主要用于动物细胞

(8)低能离子束法、激光束法、超声波法、脂质体介导、病毒介导、转座子介导等

37.试述转基因植物在农业生产上的应用。

在农业生产上的应用主要有：1.抗除草剂转基因植物；2.抗虫转基因植物；3.抗病转基因植物；4.抗逆转基因植物；5.改良作物营养质的转基因植物。

【问答题】：

1.离体无性繁殖一般可分为哪几个阶段？简述其操作的一般程序。

离体无性繁殖一般可分为5个阶段。

1、植株的准备：供体植株应生长旺盛、健壮、不病虫害，并尽可能生长在干净的环境中。

2、无菌培养物的建立：获得无菌材料并诱导外植体生长和发育。包括从供体植株上采取外植体进行消毒、接种及启动外植体生长等程序。

3培养物的增殖：通过反复培养使第一阶段获得的数量有限的嫩枝、芽苗、胚状体或原球茎等培养物的总量增加。

4生根培养：将增殖阶段形成的无根芽苗转移到生根培养基上诱导产生不定根，获得健壮的具有根、芽、茎的完整小植株。

5试管苗的移栽及鉴定：移栽是将具根试管苗转移到土壤中的过程，是试管苗从离体培养逐步适应温室或田间生长环境的过程

2.简述植物细胞大规模培养反应器的类型及原理。机械搅拌式反应器：利用机械搅动使细胞得以悬浮和通气

鼓泡式反应器：从反应器底部通入无菌空气产生大量气泡，带动培养液循环 气升式反应器：利用通入反应器的无菌空气带动培养液循环

光生物反应器：植物体内的多种酶需要光照的刺激和诱导才能合成或表现较高的生理活性

转鼓式反应器：通常是通过转盘或转鼓的旋转达到混合的目 3.简述植物细胞固定化的几种方法。

1、包埋法：将细胞包埋在多孔载体内部

包括：凝胶包埋法 以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内，固定后细胞被限制在凝胶的微孔内进行生长、繁殖和新陈代谢 使用的载体：海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶、聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂、琼脂等

半透膜包埋法 将细胞包埋在由各种高分子聚合物制成的小球内

2、吸附法 ：使用固体吸附剂（惰性材料），将细胞吸附在其表面而使细胞固定化的方法

包括：物理吸附法（physical adsorption）作用力：氢键、疏水键。离子结合法 作用力：离子键

3、共价结合法：细胞表面上功能团和固相支持物表面的反应基团之间形成化学共价键连接，从而形成为固定化细胞

4、交联法：利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团（如氨基酸、羟基、咪唑基等）发生反应，使其彼此交联形成网状结构的固定化细胞，其结合力是共价键

4.试述原生质体分离的方法和步骤。

(1)机械法：在高渗溶液中细胞质壁分离的状态下，用利刀切割细胞壁,使原生质体流出或释放出来

高渗溶液预处理----轻微质壁分离----利刀切割或机械磨损组织

(2)酶解法：常用的制备原生质体的酶包括；果胶酶、蜗牛酶、纤维素酶等。实际应用中需要根据不同的细胞来源选择合适的酶。酶解法分：

顺序法（两步法）：先用果胶酶预处理，再用纤维素酶 直接法（一步法）：直接用果胶酶和纤维素酶 优点：获得量大，适用广泛。

缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。

【ppt】

（1）取生长旺盛的植物细胞

（2）悬浮于有渗透压稳定剂的高渗溶液中

（3）加入适量的细胞壁水解酶，在一定条件下使细胞壁解体（4）分离除去细胞壁碎片等杂质（5）得到原生质体

5.植物体细胞无性系突变体筛选的方法有哪些？

（一）从再生植株中直接筛选有用突变株（常规育种）

（二）对离体培养物的筛选 1.直接筛选法

（1）正选择法：在离体培养基中加入对正常细胞有害的化学物质，使正常表型细胞死亡（一步、多步）

(2)负选择法：使用特定培养基使突变体细胞受到抑制不分裂呈休眠状态，然后用一种对休眠态突变细胞无害，而能毒害正常生长细胞的药物淘汰掉正常型细胞，最后用正常培养基恢复突变细胞的生长（主要适用于营养缺陷型或温度敏感型突变体的筛选）2.间接筛选法：借助与突变表现型有关的性状作为选择指示或筛选压的方法

（三）绿岛法：利用已分化组织进行筛选的方法。例如，一些除草剂只作用于绿色光合细胞，可以对整棵植株用除草剂，使抗性细胞存活下来，形成局部绿色斑点（绿岛），然后切下该部位细胞进行培养，再分化形成抗性植株

6.成批培养（batch culture）细胞的生长曲线包括哪几个时期？各时期有何特点？ 延迟期：细胞很少分裂、数目不增加

对数生长期：细胞开始分裂，数目开始大量增加 直线生长期：细胞生长旺盛，数目大增 减慢期：细胞分裂速度减慢 静止期：细胞停止分裂

死亡期：细胞开始死亡，数量减少