第一篇：细胞毒性试验总结
（一）实验前应明确的问题
1.选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。
2.药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。
3.时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。
4.培养时间。200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。
5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。6.理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。
7.实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。
8.避免血清干扰。用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。
（二）实验步骤
贴壁细胞：
1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2.5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况.3.5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。5.终止培养，小心吸去孔内培养液。
6.每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7.同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：
1）收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 lug/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ul(储存液100 1640）。2）置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3）每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4）离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
（三）MTT的配制
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操作台上的照明灯关掉。配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶。
PBS配方:Nacl 8g，Kcl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调ph 7.4，定容1L。
（四）关于细胞的接种(铺板)
细胞过了30代以后就不要用了,因为状态不好了;培养板要用好的（最好进口板），不好的板或重复利用的板只可做预实验。接种时最好按照预实验摸索出的密度接种, 因为细胞密度在10000/ml左右时，所测得的OD值的区间即细胞抑制率（或者增值率）的所呈现的线性关系最好，结果最可信。如果铺的太稀细胞的杀伤不会很明显，太密细胞可能都会凋亡，因为细胞长的太快营养会不够，最后导致死亡。且而细胞过密或者过少，增殖都会过快或者过慢，其增值率线性关系不佳。故而MTT细胞密度多采用10000/ml，100ul/孔。
细胞密度要根据不同细胞的特点来定.如果你做的药品对细胞具有刺激作用那么取小点的细胞浓度，如果你做的药品对细胞具有抑制作用那么取大点的细胞浓度，这样与对照的区别更明显，数据更好。悬浮细胞每孔的细胞数可达到105,贴壁细胞可为103-104.（五）加入MTT
个人认为MTT最关键的是你的细胞数目和你加入真正起作用的的MTT的适当比例，具体细胞数目和真正起作用的的MTT之间的关系确实不好确定，我认为MTT多加一些比少加好一些 MTT的量各家报道不同，一般是过量的，所以10ul即够了。如果不使用96孔板，培养基超过100ul，MTT按照10%的比例加入.加入MTT以后振荡一下让MTT与培养基混匀，不过这个应该关系不大。
如加入MTT后都有个别孔立即变为蓝黑色，则污染的可能性極大,另外MTT稀釋後加入細胞前還是需要以過濾的方式滅菌為宜.且在加MTT前可以先在镜下观察，看看是否有孔染菌，染菌的孔常常是临近的。因为血清中白蛋白对大部分的药物都有结合效应，所以可以单独将药物和MTT加在一起，看会不会起反应。如果不起反应，就不用去除含药物的培液，直接加MTT即可。首先说说我的一点经验：
1.吹打时悬液总量不能太多，达到吸管吸液量的3到4倍，可能比较容易混匀。10ml的离心管里面最好装3~4ml的悬液：悬液太少容易吹起很多气泡，悬液太多又不容易吹成单细胞悬液。。2.吸管的吸液量最好在1ml左右：吸液量过多的话，一下吸起很多液体，管中所剩就很少，这样吹打容易起泡，吸液量过少，吹打的力度就不够，吹打就会不均匀。如果是吸液量1ml多的吸管，总液量在5ml左右为益
3.吸的时候要在悬液底部，然后提起来一点，但是吹下去的时候不要离开液面，否则容易吹打出气泡。
4.吹打次数100左右，就可以吹打均匀了（有人认为加细胞前吹打30－50次基本就差不多均匀了。加细胞的时候每接种2孔反复吹打3次，每吹打3次后枪头垂悬与细胞悬液中5秒钟，然后再以一定的速度吸取悬液。）
5.向每孔中用枪头加入细胞时不要太快，否则你会发现细胞在加入的瞬间会由于枪头的冲力在孔底聚集一堆，一般都在孔的底部中央，而周边很少，这种不均匀的分散会产生接触抑制，影响细胞的生长。所以速度不能太快也不能太慢。我习惯每块板加完后平握手中，向左3下，向右3下，在往返回复3下移动，目的是使得细胞能分散的均匀些。（铺板技术是MTT实验的关键，也是基础，一定要练好。曾经有同学用漩涡振荡器混匀细胞，最后细胞全死了，建议不要采用这种方法混匀细胞。其它的声音：
1.首先细胞的接种密度一定不能过大，一般每孔1000个左右就够了，我认为宁少勿多。尤其是对于肿瘤细胞。10000/孔是太高了，这样即使药物有作用，MTT方法也是表现不出的，最佳点板浓度在4000-5000/孔，太少的话SD值会很大。
2.MTT本身就是比较粗的实验，增殖率10%左右的波动都不算奇怪。特别是新手，20％的波动也是常见的，所以很可能是技术原因引起的，特别是种板技术一定要过关。
3.我做的是肿瘤细胞的MTT实验,这种细胞长的很快一开始我是用100000/ML的浓度来接种的,结果细胞长的太满结果是没有梯度也没有线性关系.后来调整浓度,用过40000~80000/ML的浓度都做过MTT实验,结果发现做的结果比较好点的是60000~70000/ML的浓度组的.用40000/M的浓度的组,由于细胞少,药物作用的梯度还是有,只是没有很好的线性关系.还有根据细胞生长速度以及药物的特性(有时间依赖性和浓度依赖性的药物)来确定培养时间是48小时还是72小时.注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。虽然移液器比移液管精确得多，但是如果操作不熟，CV会在8%左右。另外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练些、快些上板。
第二篇：有机溶剂毒性总结
有机溶剂毒性总结 1.有机溶剂之毒性
人若长时间吸入有机溶剂之蒸气将会引起慢性中毒的现象，但短时间暴露高浓度有机溶剂蒸气之下，也会有急性中毒致命的危险。在工业卫生上，有机溶剂对人体之危害与溶剂的挥发性具有密切的关系。在常温下，低挥发性溶剂在空气中不易造成危险。其他对人体危害有关系者尚有溶剂之脂溶性，反应性、含杂质情形、人体吸收之方式及途径、人体之代谢速率、累积情形、个体感受及敏感性、暴露时间之长短等。
2.对人体危害之途径
(1)经由皮肤接触引起之危害：
有机溶剂蒸气会刺激眼睛粘膜而使人流泪；与皮肤接触会溶解皮肤油脂而渗入组织，干扰生理机能、脱水；且因皮肤干裂而感染污物及细菌。表皮肤角质溶解引起表皮角质化，刺激表皮引起红肿及气泡部份。溶剂渗入人体内破坏血球及骨髓等。(2)经由呼吸器官引起之危害：
有机溶剂蒸气经由呼吸器官吸入人体后，人往往会产生麻醉作用。蒸气吸入后大部份经企管而达肺部，然后经血液或淋巴液传送至其他器官，造成不同程度之中毒现象。因人体肺泡面积为体表面积数十倍以上，且血液循环扩散速率甚快，常会对呼吸道、神经系统、肺、肾、血液及造血系统产生重大毒害，固有机溶剂经由呼吸器官引起之中毒现象，最受人重视。(3)经由消化器官引起之危害：
有机溶剂经由消化企管主要引起之原因，为在污染溶剂蒸气场所进食、抽烟或手指沾口等，其引起之危害，首先受害为口腔，进入食道及胃肠，引起恶心、呕吐现象，然后在由消化系统，危害到其他器官。
3.对人体危害之生理作用
有机溶剂中毒之一般症状为头痛、疲怠、食欲不振、头昏等。高浓度之急性中毒抑制中枢神经系统，使人丧失意识，而产生麻醉现象，初期引起兴奋、昏睡、头痛、目眩、疲怠赶、食欲不振、意识消失等；低浓度蒸气引起之慢性中毒则影响血小板、红血球等造血系统，鼻孔、齿龈及皮下组织出血，造CHENGREN体贫血现象。一般有机溶剂对人体危害生理之影响有下列几种：(1)对神经系统破坏：
因抑制神经系统的传导冲动功能，产生麻醉，神经系统障碍或引起神经炎等。如二硫化碳引起的神经炎；甲醇中毒影响视神经等。此类溶剂尚有酒精、苯、氯化乙醇、二氯乙烷、汽油、甲酸戊酯、醋酸戊酯、二甲苯、三氯乙烯、丁醇、松节油、煤油、丙酮、酚、三氯甲烷、异丙苯等。
(2)对肝脏机能损伤：
因损伤肝脏机能，引起恶心、呕吐、发烧、黄疸炎及中毒性肝炎；一般氯化烃类均会引起肝脏中毒现象。此类溶剂有四氯化碳、氯仿、三氯乙烯、四氯乙烷、苯及其衍生物等。(3)对肾脏机能破坏： 肾脏为毒物排泄器官，故最易中毒，且因血氧量减少，亦足以使肾脏受害，发生肾炎及肾病。此类溶剂包括烃类之卤化物、苯及其衍生物、二元醇及其单醚类、四氯化碳、乙醇等。(4)对造血系统破坏：
因破坏骨髓造成贫血现象。此类溶剂包括苯及其衍生物如甲苯、氯化苯、二元醇等。(5)对粘膜及皮肤刺激：
因刺激粘膜，使鼻粘膜出血，喉头发炎，嗅觉丧失或因皮肤敏感产生红肿、发痒、红斑及坏疽病等。此类溶剂包括氯仿、三氯甲烷、醚、苯、醋酸甲酯、煤油、丙酮、甲醇、石油、氯酚、二氯乙烯、四氯化碳等。
溶剂名称沸点（1ATM）溶解性毒性
液氨 33.35℃特殊溶解性：能溶解碱金属和碱土金属剧毒性、腐蚀性
液态二氧化硫 10.08 溶解胺、醚、醇苯酚、有机酸、芳香烃、溴、二硫化碳，多数饱和烃不溶剧毒
甲胺 6.3 是多数有机物和无机物的优良溶剂，液态甲胺与水、醚、苯、丙酮、低级醇混溶，其盐酸盐易溶于水，不溶于醇、醚、酮、氯仿、乙酸乙酯中等毒性，易燃
二甲胺 7.4 是有机物和无机物的优良溶剂，溶于水、低级醇、醚、低极性溶剂强烈刺激性 石油醚不溶于水，与丙酮、乙醚、乙酸乙酯、苯、氯仿及甲醇以上高级醇混溶与低级烷相似 乙醚 34.6 微溶于水，易溶与盐酸.与醇、醚、石油醚、苯、氯仿等多数有机溶剂混溶麻醉性 戊烷 36.1 与乙醇、乙醚等多数有机溶剂混溶低毒性
二氯甲烷 39.75 与醇、醚、氯仿、苯、二硫化碳等有机溶剂混溶低毒，麻醉性强 二硫化碳 46.23 微溶与水，与多种有机溶剂混溶麻醉性，强刺激性 溶剂石油脑与乙醇、丙酮、戊醇混溶较其他石油系溶剂大
丙酮 56.12 与水、醇、醚、烃混溶低毒，类乙醇，但刺激性较大 溶剂名称沸点（1ATM）溶解性毒性
1，1-二氯乙烷 57.28 与醇、醚等大多数有机溶剂混溶低毒、局部刺激性
氯仿 61.15 与乙醇、乙醚、石油醚、卤代烃、四氯化碳、二硫化碳等混溶中等毒性，强麻醉性
甲醇 64.5 与水、乙醚、醇、酯、卤代烃、苯、酮混溶中等毒性，麻醉性
四氢呋喃 66 优良溶剂，与水混溶，很好的溶解乙醇、乙醚、脂肪烃、芳香烃、氯化烃吸入微毒，经口低毒
己烷 68.7 甲醇部分溶解，比乙醇高的醇、醚丙酮、氯仿混溶低毒。麻醉性，刺激性
三氟代乙酸 71.78 与水乙醇、乙醚、丙酮苯、四氯化碳、己烷混溶,溶解多种脂肪族、芳香族化合物
1，1，1-三氯乙烷 74.0 与丙酮、、甲醇、乙醚、苯、四氯化碳等有机溶剂混溶低毒类溶剂 四氯化碳 76.75 与醇、醚、石油醚、石油脑、冰醋酸、二硫化碳、氯代烃混溶氯代甲烷中毒性最强
乙酸乙酯 77.112 与醇、醚、氯仿、丙酮、苯等大多数有机溶剂溶解，能溶解某些金属盐低毒，麻醉性
乙醇 78.3 与水、乙醚、氯仿、酯、烃类衍生物等有机溶剂混溶微毒类，麻醉性 丁酮 79.64 与丙酮相似，与醇、醚、苯等大多数有机溶剂混溶低毒，毒性强于丙酮 苯 80.10 难溶于水，与甘油、乙二醇、乙醇、氯仿、乙醚、、四氯化碳、二硫化碳、丙酮、甲苯、二甲苯、冰醋酸、脂肪烃等大多有机物混溶强烈毒性
环己烷 80.72 与乙醇、高级醇、醚、丙酮、烃、氯代烃、高级脂肪酸、胺类混溶低毒，中枢抑制作用
乙睛 81.60 与水、甲醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、丙酮、醚、氯仿、四氯化碳、氯乙烯及各种不饱和烃混溶，但是不与饱和烃混溶中等毒性，大量吸入蒸气，引起急性中毒 异丙醇 82.40 与乙醇、乙醚、氯仿、水混溶微毒，类似乙醇 1，2-二氯乙烷 83.48 与乙醇、乙醚、氯仿、四氯化碳等多种有机溶剂混溶高毒性、致癌 乙二醇二甲醚 85.2 溶于水，与醇、醚、酮、酯、烃、氯代烃等多种有机溶剂混溶。能溶解各种树脂，还是二氧化硫、氯代甲烷、乙烯等气体的优良溶剂吸入和经口低毒
三氯乙烯 87.19 不溶于水，与乙醇.乙醚、丙酮、苯、乙酸乙酯、脂肪族氯代烃、汽油混溶有机有毒品
三乙胺 89.6 水:18.7以下混溶，以上微溶。易溶于氯仿、丙酮，溶于乙醇、乙醚易爆，皮肤黏膜刺激性强
丙睛 97.35 溶解醇、醚、DMF、乙二胺等有机物，与多种金属盐形成加成有机物高毒性，与氢氰酸相似
溶剂名称沸点（1ATM）溶解性毒性
庚烷 98.4 与己烷类似低毒，刺激性、麻醉性 水 100 略略
硝基甲烷 101.2 与醇、醚、四氯化碳、DMF、等混溶麻醉性，刺激性
1，4-二氧六环 101.32 能与水及多数有机溶剂混溶，仍溶解能力很强微毒，强于乙醚2~3倍
甲苯 110.63 不溶于水与甲醇、乙醇、氯仿、丙酮、乙醚、冰醋酸、苯等有机溶剂混溶低毒类，麻醉作用
硝基乙烷 114.0 与醇、醚、氯仿混溶，溶解多种树脂和纤维素衍生物局部刺激性较强
吡啶 115.3 与水、醇、醚、石油醚、苯、油类混溶。能溶多种有机物和无机物低毒，皮肤黏膜刺激性
4-甲基-2-戊酮 115.9 能与乙醇、乙醚、苯等大多数有机溶剂和动植物油相混溶毒性和局部刺激性较强
乙二胺 117.26 溶于水、乙醇、苯和乙醚，微溶于庚烷刺激皮肤、眼睛 丁醇 117.7 与醇、醚、苯混溶低毒，大于乙醇3倍 乙酸 118.1 与水、乙醇、乙醚、四氯化碳混溶不溶于二硫化碳及C12以上高级脂肪烃低毒，浓溶液毒性强
乙二醇一甲醚 124.6 与水、醛、醚、苯、乙二醇、丙酮、四氯化碳、DMF等混溶低毒类 辛烷 125.67 几乎不溶于水，微溶于乙醇，与醚、丙酮、石油醚、苯、氯仿、汽油混溶低毒性，麻醉性
乙酸丁酯 126.11 优良有机溶剂，广泛应用于医药行业，还可以用做萃取剂一般条件毒性不大
吗啉 128.94 溶解能力强，超过二氧六环、苯、和吡啶，与水混溶，溶解丙酮、苯、乙醚、甲醇、乙醇、乙二醇、2己酮、蓖麻油、松节油、松脂等腐蚀皮肤，刺激眼和结膜，蒸汽引起肝肾病变
氯苯 131.69 能与醇、醚、脂肪烃、芳香烃、和有机氯化物等多种有机溶剂混溶 低于苯，损害中枢系统
乙二醇一乙醚 135.6 与乙二醇一甲醚相似，但是极性小，与水、醇、醚、四氯化碳、丙酮混溶低毒类，二级易燃液体
对二甲苯 138.35 不溶于水，与醇、醚和其他有机溶剂混溶一级易燃液体
二甲苯 138.5~141.5 不溶于水，与乙醇、乙醚、苯、烃等有机溶剂混溶，乙二醇、甲醇、2氯乙醇等极性溶剂部分溶解一级易燃液体，低毒类
间二甲苯 139.10 不溶于水，与醇、醚、氯仿混溶，室温下溶解乙睛、DMF等一级易燃液体 醋酸酐 140.0 邻二甲苯 144.41 不溶于水，与乙醇、乙醚、氯仿等混溶一级易燃液体 溶剂名称沸点（1ATM）溶解性毒性
N，N-二甲基甲酰胺 153.0 与水、醇、醚、酮、不饱和烃、芳香烃烃等混溶，溶解能力强低毒
环己酮 155.65 与甲醇、乙醇、苯、丙酮、己烷、乙醚、硝基苯、石油脑、二甲苯、乙二醇、乙酸异戊酯、二乙胺及其他多种有机溶剂混溶低毒类，有麻醉性，中毒几率比较小
环己醇 161 与醇、醚、二硫化碳、丙酮、氯仿、苯、脂肪烃、芳香烃、卤代烃混溶低毒无血液毒性刺激性
N，N-二甲基乙酰胺 166.1 溶解不饱和脂肪烃，与水、醚、酯、酮、芳香族化合物混溶微毒类
糠醛 161.8 与醇、醚、氯仿、丙酮、苯等混溶部分溶解低沸点脂肪烃，无机物一般不溶有毒品，刺激眼睛，催泪
N-甲基甲酰胺 180~185 与苯混溶，溶于水和醇，不溶于醚一级易燃液体
第三篇：细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结
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细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法
实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
一、用途：
药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。
二、优点：
1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8法能快速检测；
3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；
5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；
6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；
7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
三、所需设备及仪器：
1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板
4.二氧化碳培养箱
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四、方法及步骤：
实验一：细胞增殖分析
1、制备细胞悬液：细胞计数。
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。
5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
实验二：细胞毒性分析
1、制备细胞悬液：细胞计数
2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。
4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。
6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。
7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。
8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。
五、实验注意事项：
·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.xiexiebang.com
测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。
·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。
· CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。
·当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。
·在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。
·金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。
·悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。
·加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。
·用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。
六、经验总结及分享：
CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。
摸条件包括
1、种板数；
2、种板后细胞的贴壁生长时间；
3、加药后的孵育时间；
4、cck8试剂加入量；
5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。
1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.xiexiebang.com
值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。
2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。
3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。
4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。
5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。
再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。
做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。
补充
突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？
这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。
再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.xiexiebang.com
我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。
第四篇：LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测
LDH释放检测
方法：
a.根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。
b.吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理(如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续按常规培养。到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。
c.到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
准备工作：
a.INT溶液(1X)的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀释液，混匀后即配置为200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜现配现用，配置后4℃保存可于当天使用，不宜配置后冻存。
b.LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。样品测定:
a.各孔分别加入60μl LDH检测工作液。
b.混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。c.计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)
细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100
d.可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。
第五篇：细胞凋亡总结
细胞凋亡 凋亡（apoptosis）一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。一般表现为单个细胞的死亡，且不伴有炎症反应。
1．细胞凋亡的意义 细胞凋亡普遍存在于生物界，既发生于生理状态下，也发生于病理状态下。由于细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义，至今仍是生物医学研究的热点。细胞凋亡过多可引起疾病发生，如：①爱滋病的发展过程中，CD4+T细胞数目的减少；②移植排斥反应中，细胞毒性T细胞介导的细胞死亡；③缺血及再灌注损伤，导致心肌细胞和神经细胞的凋亡增多；④神经系统退化性疾病（Alzheimer病、Parkinson's病）的重要原因是细胞凋亡的异常增加。神经细胞的凋亡参与老化及Alzheimer病的发生。Alzheimer氏病是一种常见的老年病，患者在临床上表现为进行性的智力减退。⑤暴露于电离辐射可引起多种组织细胞的凋亡。细胞凋亡过少也可引起疾病发生：在肿瘤的发生过程中，诱导凋亡的基因如p53等失活、突变，而抑制凋亡的基因如bCL-2等过度表达，都会引起细胞凋亡显著减少，在肿瘤发病学中具有重要意义；针对自身抗原的淋巴细胞的凋亡障碍可导致自身免疫性疾病；某些病毒能抑制其感染细胞的凋亡而使病毒存活。
2．细胞凋亡的形态变化 电镜下细胞凋亡的形态学变化是多阶段的，可分为 ①细胞浆浓缩，核糖体、线粒体等聚集，细胞体积缩小，结构更加紧密； ②染色质逐渐凝聚成新月状附于核膜周边，嗜碱性增强。细胞核固缩呈均一的致密物，进而断裂为大小不一的片段：
③胞膜不断出芽、脱落，细胞变成数个大小不等的由胞膜包裹的凋亡小体(apoptotic bodies)。凋亡小体内可含细胞浆、细胞器和核碎片，有的不含核碎片；④凋亡小体被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬、降解： ⑤凋亡发生过程中，细胞膜保持完整，细胞内容物不释放出来，所以不引起炎症反应。左图 典型凋亡小体：染色质呈新月状，并可见细胞器 右图 凋亡细胞：凋亡细胞(↑)与邻近细胞分离 细胞凋亡 光镜下凋亡一般累及单个或少数几个细胞，凋亡细胞呈圆形，胞浆红染，细胞核染色质聚集成团块状。由于凋亡细胞迅速被吞噬，又无炎症反应，因此，在常规切片检查时，一般不易发现，但在某些组织如反应性增生的次级淋巴滤泡生发中心则易见到。病毒性肝炎时，嗜酸性小体形成即是细胞凋亡。
3．细胞凋亡的机制 细胞凋亡是一系列依赖能量的分子水平变化的终点，细胞凋亡过程包括以下4个阶段，即：诱导启动、细胞内调控、实施和凋亡细胞的吞噬搬运阶段。
（1）诱导启动 引起凋亡的信号可以来自细胞外，通过跨膜传导对细胞内的调控分子起作用；也可以直接作用于细胞内的靶分子。一些跨膜作用的抑制因子(如生长因子、某些激素、细胞因子、某些病毒蛋白等)具有抑制凋亡的作用，有利于细胞的生存。当这些因子缺乏时，会激发细胞凋亡。另外一些跨膜作用的刺激因子通过受体与配体的结合而激活细胞凋亡程序，其中最重要的是肿瘤坏死因子受体家族。此外，尚有多种其它凋亡诱导因子。在胚胎发育过程中，形态发生蛋白、生长因子、分化因子对细胞凋亡可起促进作用，又可起抑制作用。
（2）细胞内调控 细胞内的某些特异蛋白与细胞死亡信号相连接，这些特异蛋白对细胞的死亡与否起决定作用。BCL-2蛋白家族(BCL-2 family of proteins)是调节线粒体通透性的主要成分，通过形成同源(BCL-2/BCL-2, Bax/Bax)和异源(BCL-2/Bax)二聚体对细胞凋亡进行调控。BCL-2同源二聚体抑制细胞凋亡，Bax同源二聚体促进细胞凋亡。此外，细胞表面受体Fas(CD95)，属TNFR家族，当免疫细胞产生的Fas的配体与T细胞表面的Fas结合时，也启动了死亡程序。这种Fas-Fas配体介导的凋亡在清除免疫反应(如自身免疫病)中被激活的淋巴细胞非常重要。细胞凋亡后的梯状DNA 足叶乙甙诱导白血病细胞凋亡后的梯状DNA
（3）凋亡的实施 细胞凋亡的实施是通过蛋白水解的一系列连锁反应实现的。各种组织的细胞凋亡都要激活caspase家族。Caspase成员作为酶原的形式存在于细胞内，经裂解激活后，迅速启动序列性酶解死亡程序，裂解细胞骨架和细胞核蛋白基质并激活了核酸内切酶。在内源性核酸内切酶作用下，DNA进行有控降解，产生长度为180～200 bp整倍数的DNA片段，这正好是缠绕组蛋白多聚体的长度，提示染色质DNA恰好是在核小体与核小体连接部被切断。DNA琼脂糖凝胶电泳出现ladder也成为检测凋亡发生的重要标志。
（4）凋亡细胞的吞噬搬运 凋亡细胞碎片的表面有标志分子(血小板反应素、粘附糖蛋白)有利于临近的巨噬细胞以及其他细胞的识别、吞噬和处理。凋亡细胞的吞噬搬运过程非常有效而迅速，凋亡细胞很快消失，不留痕迹，也无炎症反应。
4．细胞凋亡与坏死的区别 凋亡 坏死
1机制 基因调控的程序化（programmed）细胞死亡，主动进行（自杀性）意外事故性（accident）细胞死亡，被动进行（他杀性）
2诱因 生理性或轻微病理性刺激因子诱导发生，如生长因子缺乏 病理性刺激因子诱导发生，如缺氧、感染、中毒 死亡范围 多为散在的单个细胞 多为聚集的大片细胞
3形态特征 细胞固缩，核染色质边集，细胞膜及各细胞器膜完整，膜可发泡成芽，形成凋亡小体 细胞肿胀，核染色质絮状或边集，细胞膜及各细胞器膜溶解破坏，溶酶体酶释放，细胞自溶
4生化特征 耗能的主动过程，有新蛋白合成，DNA早期规律降解为180-200bp片段，琼脂凝胶电泳呈特征性梯带状 不耗能的被动过程，无新蛋白合成，DNA降解不规律，片段大小不一，琼脂凝胶电泳不呈梯带状
5周围反应 不引起周围组织炎症反应和修复再生，但凋亡小体可被邻近细胞吞噬 引起周围组织炎症反应和修复再生
细胞自噬
细胞自噬的生理功能
1及时清除细胞中随时产生的“垃圾”（如破损或衰老的细胞器、长寿命蛋白质、合成错误或折叠错误的蛋白质等），2维持细胞自稳状态.无论是肿瘤细胞还是正常细胞，保持一种基础、低水平的自噬活性是至关重要的
3.同时，自噬的产物，如氨基酸、脂肪酸等小分子物质，又可为细胞提供一定的能量和合成底物.可以说，细胞自噬就是一个“备用仓库”.鉴于上述作用，在正常生理情况下，细胞自噬可以帮助细胞在缺乏营养的恶劣环境中生存.自噬也可为肿瘤细胞带来几大好处：
（1）首先，肿瘤细胞本身就具有高代谢的特点，对营养和能量的需求比正常细胞更高，但肿瘤微环境往往不能如意，如肿瘤发生初始期到血管发生之前、肿瘤长大发生血管崩塌时、肿瘤细胞脱离原发灶游走时等都会出现营养不足或供应中断，而此时提高自噬活性可以有助于度过这一危机
（2）（2）当化疗、放疗后，肿瘤细胞会产生大量的破损细胞器、损坏的蛋白质等有害成分，此时提高自噬活性可及时清除这些有害物质，并提供应急的底物和能量为修复受损DNA赢得时间和条件.(3)另外，抑制细胞自噬可以导致细胞更容易发生凋亡，然而，细胞自噬在肿瘤的生成和癌症的发展中到底扮演怎样的角色，目前还没有取得广泛一致的意见.细胞自噬可以抑制细胞发生癌变，可能产生于以下几种机制
(1)细胞自噬的抑制会加重坏死细胞的局部炎症反应，从而导致肿瘤的生长(2)而细胞自噬可以清除坏死的细胞器，调整内源性的压力，从而稳定基因组,减少细胞向癌细胞的转变.(3)细胞自噬既可以加强细胞检验点的检查作用，又起到了稳定基因组的作用，从而减少了细胞的癌变
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