细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结

第一篇：细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结

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细胞增殖与毒性检测实验方法及经验总结-CCK-8 法

实验原理：Cell Counting Kit-8（简称CCK-8）试剂可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。其基本原理为：该试剂中含有WST-8【化学名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazan dye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

一、用途：

药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

二、优点：

1.使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂； 2.CCK-8法能快速检测；

3.CCK-8法的检测灵敏度很高，甚至可以测定较低细胞密度； 4.CCK-8法的重复性优于MTT 法，MTT 实验生成的formazan不是水溶性的，需要使用DMSO 等有机溶剂溶解；

5.而本方法产生的formazan是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差；

6.CCK-8法对细胞毒性小，可以多次测定选取最佳测定时间，与MTT 方法相比线性范围更宽，灵敏度更高；

7.CCK-8细胞活性检测试剂中为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。

三、所需设备及仪器：

1.10ul，100-200ul及多通道移液器 2.酶标仪（带有450nm滤光片）3.96孔培养板

4.二氧化碳培养箱

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四、方法及步骤：

实验一：细胞增殖分析

1、制备细胞悬液：细胞计数。

2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约1-2×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。或者直接配置含10%CCK8的培养基（现用现配），以换液的形式加入。

5、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件（建议预实验先摸清楚时间点）。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

6、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

实验二：细胞毒性分析

1、制备细胞悬液：细胞计数

2、接种到96孔板中：根据合适的铺板细胞数（约≥5×104），每孔约100ul细胞悬液，同样的样本可做4-6个重复。3、37℃培养箱中培养：细胞接种后贴壁大约需要培养4小时，如果不需要贴壁，这步可以省去。

4、加入不同浓度的毒性物质。5、37℃培养箱中培养：加入毒性物质的培养时间，要看毒性物质的性质和细胞的敏感性，一般要根据细胞周期来决定，起码要一代以上的时间（例如：6、12、24、48、60、72小时）。

6、加入10ul CCK8：由于每孔加入CCK8量比较少，有可能因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议将枪头浸入培养液中加入且在加完试剂后轻轻敲击培养板以帮助混匀。

7、培养0.5-4小时:细胞种类不同，形成的Formazan的量也不一样。如果显色不够的话，可以继续培养，以确认最佳条件。特别是血液细胞形成的Formazan很少，需要较长的显色时间（5-6小时）。

8、测定450nm吸光度：建议采用双波长进行测定，检测波长450-490nm，参比波长600-650nm。

五、实验注意事项：

·若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。

·如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK8之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

·当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔(100 μl 培养基)。检 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.xiexiebang.com

测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔(100 μl 培养基)。

·酚红和血清对CCK8法的检测不会造成干扰，可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去。

· CCK8可以检测大肠杆菌，但不能检测酵母细胞。在细胞增殖实验每次测定的过程中需要避免细菌污染，以免影响结果。

· CCK-8在0-5℃下能够保存至少6个月，在-20℃下避光可以保存1年。

·当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积不准确而增加误差。一般情况下，最外一圈的孔加培养基或者PBS，不作为测定孔用。

·在培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度即为空白对照。在做加药实验时，还应考虑药物的吸收，可在加入药物的培养基中加入CCK8，培养一定的时间，测定450 nm的吸光度作为空白对照。

·金属对CCK-8显色有影响：当终浓度为1 mM的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降级。如果终浓度是10 mM的话，将会100%抑制。

·悬浮细胞由于染色比较困难，一般需要增加细胞数量和延长培养时间。

·加入CCK-8 时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH 值已变化，建议换用新鲜的培养基。

·用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定，且要擦拭干净样品板了。

六、经验总结及分享：

CCK8的说明书大家一定要认真阅读，里面很多细节的问题都有提到。而且说明书里提供的一些关于各种细胞的种板数都很有参考价值，因为那是反复验证过的最佳数值。但无论如何，做这个试验一定要摸条件。你就算再懒，这个懒不得，否则你都只是在做无用功。以下言论全部以细胞毒性试验为前提，如果你做的是促进细胞生长的药物的药效实验那就另当别论了。

摸条件包括

1、种板数；

2、种板后细胞的贴壁生长时间；

3、加药后的孵育时间；

4、cck8试剂加入量；

5、cck8试剂加入后细胞孵育时间。看起来很多，其实这就是一个实验。而且都是种的空白板，也就是不加药物，只加细胞和CCK8。

1、种板数：这个要查文献，看你所用细胞别人有无做过，把范围大致找出。记住还要参考说明书，这个很重要。然后稀释一系列浓度种板。首先你要观察多长时间细胞可贴壁完全，一般贴壁生长24小时。然后还有在你的实验时间内，不同细胞数下孔内生长情况。比如我拟定考察4天的时间，那么在4天内，细胞是刚好铺满还是堆积生长？因为每块板都会设置对照孔，也就是含有细胞的培养基+CCK8，这个数值是板上的最大数值，CCK8试验最佳OD 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.xiexiebang.com

值在1.0附近，所以这个最大数值最好能控制在1.0左右。我的实验经验是不要让细胞长满，一旦长满了很难去判断是否堆积生长了，对药物能否顺利进入细胞有影响此为其一，其二生长不均匀易导致孔间OD值数据偏差大，而且OD值也很大。

2、贴壁生长的时间我一般就直接让它贴壁长24h了，这个时间细胞已经贴壁完全，而且这样设置时间对自己安排实验时间也方便。没人愿意大半夜爬起来做实验吧。

3、加药后的孵育时间，我的实验摸了3个时间，24h，48h，72h。然后根据数据的稳定性（RSD）、OD值的范围（1.0左右）这些来选择最好的时间。太长了就没有必要了，细胞呆在孔里几天不换液结果可想而知了。

4、CCK8试剂加入量，说明书中明确写出建议加入量为培养基体积的10%。这里有一个问题：假设我要孔内是200微升的体系，即细胞悬液+药液+CCK8=200微升呢，还是细胞悬液+药液=200微升，cck8不算在体系内呢。关于这一点文献报道不一致。本人最终采用的是后者。

5、cck8试剂加入后孵育时间，随着时间的增加，OD值就会增大。总之原则就是把OD值控制在1.0左右。这里我考察了0.5h、1.0h、2.0h。

再说一下关于种板设置问题。众所周知周围一圈孔因为边缘效应都是不用来做实验的。一般每组样品我会设置6个复孔，得到的OD值去掉最大值与最小值，其余取平均值。我用的是排枪，会省很多力气，但是也会增大组内误差。这个只有通过校正移液枪和选用最适枪头了。

做这个实验我想大家遇到的最大问题应该是数据不稳定，组内数据偏差大。讲了很多怎样摸条件，其实就一个原则，把OD值控制在1.0左右。数据不稳定也只能通过增大样品数，借助数据处理来弥补。还有实验操作一定要仔细小心，尽量平行操作。

补充

突然想起用酶标仪检测的时候还有一些细节问题。比如孔里不能有气泡，如果有气泡，就用吸耳球吹掉，气泡会很影响检测结果。样品板要擦拭干净，当然了，盖子一定要记得拿掉啊Big Smile补充说明：这几天有同学提出了一个问题，这个问题非常好也非常关键：将OD值控制在1.0这个说法是否有依据？

这里我还是想提醒大家一定要认真阅读试剂盒的说明书，试想一个试剂盒的上市并且作为技术手段得到认可需要经过多少试验反复验证。我购买的是同仁化学研究所的CCK8试剂盒，说明书的P7Q23：OD值在什么范围比较合适？答：一般情况下OD值在0.1-2.0都可以，在1.0附近比较好。

再说到自己的实验设计，酶标仪的原理其实和紫外分光光度计是一样的，所以UV上很多减小误差的注意事项在酶标仪上同样受用。这就能够理解为什么不能有气泡，为什么要擦拭干净样品板了。再者熟悉UV原理的同学会了解利用紫外检测有一个最佳检测范围，超过了这个范围，数值就会呈现出不稳定，无规律。（大家可以把自己的数据统计分析看看是不是数值控制在1.0附近更稳定。）而更有甚者就是超出了仪器的检测范围，仪器读数为—。一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物www.xiexiebang.com

我在摸条件的时候，cck8加入2.0h后检测就出现过酶标仪读不出数据的情况。

第二篇：LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测

LDH释放检测

方法：

a.根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。

b.吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理(如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续按常规培养。到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。

c.到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。

准备工作：

a.INT溶液(1X)的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀释液，混匀后即配置为200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜现配现用，配置后4℃保存可于当天使用，不宜配置后冻存。

b.LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。样品测定:

a.各孔分别加入60μl LDH检测工作液。

b.混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。c.计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)

细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100

d.可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。

第三篇：细胞凋亡检测方法总结

1、磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中(图3)。Annexin-V是一种分子量为35~36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

PS转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。

碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为早期凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。右上象限为独立的核（FITC-/PI+）。

Annexin-V可以再钙离子存在的情况下，和细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸结合，而磷脂酰丝氨酸的外翻是细胞凋亡的早期事件。

PI是一种DNA染料，当细胞凋亡的晚期，细胞的细胞膜通透性增加，PI从而进入细胞核与DNA结合。

所以

Annexin-V阴性-PI阴性 代表正常细胞

Annexin-V阳性-PI阴性 代表凋亡早期的细胞

Annexin-V阳性-PI阳性 代表凋亡晚期的细胞或坏死的细胞

Annexin-V阴性-PI阳性 一般不存在这一群细胞，如果出现这一团细胞可能是PI标记时间过长，或者操作过于剧烈而伤害到原本正常的细胞。（还有一种说法是凋亡最后阶段的细胞，细胞已经没有细胞膜了说以不结合Annexin-V而只结合PI）

2.线粒体膜电位变化的检测

实验原理

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（FL-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（FL-1 通道）。这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。通过 JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1 单体的最大激发波长为 514nm，最大发射波长为 527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为 585nm，最大发射波长为 590nm。

A-C 为对照，细胞亚群(R1)在 FL-2和FL-1 通道同时显示 JC-1 的荧光信号。D-F 显示 JC-1在FL-2通道荧光信号降低的细胞亚群(R2)显著增加，证明线粒体膜电位△Ψm 下降，细胞发生凋亡。凋亡与线粒体膜电位的去极化相关。细胞凋亡时线粒体膜电位发生去极化，JC-1进入线粒体以单体形式存在，仅在Fl-1通道有荧光。

检测原理

正常细胞：JC-1聚集在线粒体内，形成多聚体，呈鲜红色荧光，细胞质内有绿色；即红光++，绿光++。

凋亡细胞：由于线粒体跨膜电位的破坏，不能聚集到线粒体内，红色荧光减弱，单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。即红光+，绿光++

3、Caspase-3活性的检测

Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

(1)Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

(2)荧光分光光度计分析

检测原理：活化的Caspsae与其特异性底物DEVD-pNA结合切割，释放出游离pNA，通过测定其吸光度，根据其发光强度的高低代表其活化程度。

(3)流式细胞术分析

PharMingen 多克隆或单克隆 Caspase-3 抗体可以识别 Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的 Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端, 荧光标记多克隆兔抗 Active-Caspase-3 抗体为流式细胞术分析凋亡细胞的 Caspase-3 而设计。1、2、3是早期凋亡现象；

4、5是晚期凋亡现象。

4、TUNEL法(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)

细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

5、DNA ladder 细胞凋亡晚期，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。在琼脂糖凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。坏死细胞---连续性条带。

一、形态学观察方法

1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。【苏木精 — 伊红染色法，(hematoxylin-eosin staining)，简称HE染色法。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色 ；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。】

2、丫啶橙（AO）染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

一、细胞凋亡的形态学检测

1、光学显微镜和倒置显微镜

（1）未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。

（2）染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。

2、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜

一般以细胞核染色质的形态学改变为指标来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO 33342(Hoechst 33342)，HO 33258(Hoechst 33258), DAPI。三种染料与 DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度为2~5mg/ml。

DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用终浓度一般为0.5 ~1mg/ml。

结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased），部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体(图1)。

3、透射电子显微镜观察

结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构(图2)；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。图2

七、凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达和细胞定位分析

TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自己知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。同时我们发现，凋亡早期TFAR19蛋白的核转位早于磷脂酰丝氨酸（PS）外翻和细胞核DNA的片段化，提示TFAR19蛋白的核转位是细胞凋亡更早期发生的事件之一。进一步的研究证明，凋亡早期TFAR19的核转位具有普遍意义，不同细胞凋亡早期均出现TFAR19高表达和核转位。这为研究细胞凋亡早期所发生的事件，提供了一种新的技术和指标。

第四篇：细胞凋亡检测方法小结

细胞凋亡检测方法小结

一、定性和定量研究

只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）

进行定量或半定量的研究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。

二、区分凋亡和坏死

可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测，AnnexinV/PI双染色法流式细胞仪检测等。

不能将二者区分开的方法：原位末端标记法、PI单染色法流式细胞仪检测等。

三、样品来源不同选择 组织：主要用形态学方法(HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳)。

四、细胞凋亡检测

1、早期检测: 1)PS(磷脂酰丝氨酸)在细胞外膜上的检测 2)细胞内氧化还原状态改变的检测 3)细胞色素C的定位检测 4)线粒体膜电位变化的检测

2、晚期检测：

细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。

对于晚期检测通常有以下方法：

1)TUNEL(末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记)2)LM-PCR Ladder(连接介导的PCR检测)3)Telemerase Detection(端粒酶检测)

3、生化检测：

1）典型的生化特征：DNA 片段化

2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等 3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的 dNTP（多为dUTP）间接或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

4、LM-PCR Ladder(连接介导的PCR检测)当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。其它方法：

1）Telemerase Detection(端粒酶检测)端粒酶是由RNA和蛋白组成，它可以自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的检测

研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报道，Fas 蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细胞。Bcl-2 和bcl-X(长的)作为抗凋亡（bcl-2 和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前者更快更准确。通过检测fas, bax-alpha 和 bcl-X(长的)基因的 mRNA表达水平来进行细胞凋亡的检测。

5、细胞内氧化还原状态改变的检测：

正常状态下,谷光苷肽(GSH)作为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细胞液就由还原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从而使细胞色素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

6、细胞色素C的定位检测

细胞色素C作为一种信号物质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1（apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。

7、线粒体膜电位变化的检测：

1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系

2）近年来陆续有报道说明线粒体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。

3）在细胞凋亡过程中线粒体跨膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道(PT孔道)能稳定线粒体跨膜电位就能防止细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据：

1）若将纯化的正常的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细胞核即开始凋亡变化。2）形态学观察，看到细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；

3）凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例； 4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平的特征性变化。用于流式细胞仪检测的染料：

PI、Hoechst、EB、DAPI、丫啶橙等，其中PI、Hoechst最常用。PI和Hoechst33342双标：

PI、Hoechst33342均可与细胞核DNA（或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分叶，碎片状，边集。

故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst着色的为调亡细胞。PI和Annexin-V双标：

磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性

五、形态学观察

1、普通光学显微镜观察

2、透射电子显微镜观察

3、荧光显微镜观察

1、普通光镜下观察：

1)用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失

2)Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死细胞染色浅或没染上颜色 直接用倒置显微镜观察： 1）细胞体积变小，全面皱缩；

2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。

2、透射电子显微镜观察

凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。

细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状或呈折缝样，部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。

3、荧光显微镜

常用的荧光染料：丫啶橙、PI、DAPI、Hoechst33258 和Hoechst33342、EB等

Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光激发时发射明亮的蓝色荧光。1）PI双染色法基本原理

Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染色。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

注意事项：细胞凋亡时，其DNA可染性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结果时应该注意。

六、细胞凋亡的分子生物学检测方法: 细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²+和Mg²+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3’-OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口翻译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。过氧化物酶标记测定法

原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以掺入到凋亡细胞双链或单链DNA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光学显微镜下进行观察。

毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反应不到1％，若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc受体非特异性的吸附作用。

本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分离的细胞凋亡测定。(一)试剂配制

1、磷酸缓冲液PBS（pH7.4）：磷酸钠盐 50mM，NaCl 200mM。

2、蛋白酶K（200μg/ml，pH7.4）：蛋白酶K 0.02g；PBS 100ml。

3、含2%H2O2的PBS缓冲液（pH7.4）：H2O2 2.0ml；PBS缓冲液 98.0ml。

4、TdT酶缓冲液（新鲜配）：Trlzma碱 3.63g用 0.1N HCl调节pH至 7.2，加ddH2O定容到1000ml；再加入二甲砷酸钠 29．96g和氯化钴0.238g。

5、TdT酶反应液：TdT酶32μl；TdT酶缓冲液 76μl，混匀，置于冰上备用。

6、洗涤与终止反应缓冲液：氯化钠 17.4g；柠檬酸钠 8.82g；ddH2O 1000ml 7、0.05％二氨基联苯（DAB）溶液：DAB 5mg；PBS 10ml，pH7.4, 临用前过滤后，加过氧化氢至0.02%。8、0.5％甲基绿（pH4.0）：甲基绿0.5g；0.1M乙酸钠100ml。9、100％丁醇，100％、95％、90％、80％和70％乙醇，二甲苯，10％中性甲醛溶液，乙酸，松香水等。

10、过氧化物酶标记的抗地高辛抗体（ONCOR）

（二）实验步骤

1、标本预处理：（1）石蜡包埋的组织切片预处理：将组织切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次5min。用无水乙醇洗两次，每次3min。用95％和75％乙醇各洗一次，每次3min。用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml），于室温水解15min，去除组织蛋白。用蒸馏水洗4次，每次2min，然后按下述步骤2进行操作。

（2）冰冻组织切片预处理：将冰冻组织切片置10％中性甲醛中，于室温固定10min后，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min。置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中，于-20℃处理5min，去除多余液体。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

（3）培养的或从组织分离的细胞的预处理：将约 5 × 107个/ml细胞于 4％中性甲醛室温中固定 10min。在载玻片上滴加 50～100μl细胞悬液并使之干燥。用PBS洗两次，每次5min，然后按下述步骤2进行操作。

2、色缸中加入含2％过氧化氢的PBS，于室温反应5min。用PBS洗两次，每次5min。

3、用滤纸小心吸去载玻片上组织周围的多余液体，立即在切片上加2滴 TdT酶缓冲液，置室温1～5min。

4、用滤纸小心吸去切片周围的多余液体，立即在切片上滴加 54μl TdT酶反应液，置湿盒中于37C反应 1hr（注意：阴性染色对照，加不含TdT酶的反应液）。

5、将切片置于染色缸中，加入已预热到37℃的洗涤与终止反应缓冲液，于37℃保温30min，每10min将载玻片轻轻提起和放下一次，使液体轻微搅动。

6、组织切片用PBS洗 3次，每次 5min后，直接在切片上滴加两滴过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，于湿盒中室温反应30min。

7、用PBS洗4次，每次5min。

8、在组织切片上直接滴加新鲜配制的0.05％DAB溶液，室温显色3～6min。

9、用蒸馏水洗4次，前3次每次1min，最后1次5min。

10、于室温用甲基绿进行复染10min。用蒸馏水洗3次，前两次将载玻片提起放下10次，最后1次静置30s。依同样方法再用100％正丁醇洗三次。

11、用二甲苯脱水3次，每次2min，封片、干燥后，在光学显微镜下观察并记录实验结果。

（三）注意事项

一定要设立阳性和阴性细胞对照。阳性对照的切片可使用DNaseI部分降解的标本，阳性细胞对照可使用地塞米松（1μM）处理3-4hr的大、小鼠胸腺细胞或人外周血淋巴细胞。阴性对照不加TdT酶，其余步骤与实验组相同。

第五篇：细胞裂解实验方法总结

细胞裂解是改变细胞通透性和活性的重要实验方法。主要分为化学法和机械法，前者比较温和，后者虽然产量高，但反应更剧烈，很有可能造成细胞中的DNA断裂。本文主要是介绍细胞的裂解方法以及实验过程中的方法探讨。

裂解方法包括化学裂解、酶裂解和机械裂解。化学裂解和酶裂解通常是比较温和的方法，通常会很少使DNA 断裂。这两种方法(包括SDS 和溶菌酶处理等)提取纯化DNA中常用的方法。机械裂解可以更均一的裂解细胞，同化学裂解相比，机械处理具有更高的裂解效率和更低的选择性。机械处理可以更剧烈和全面的裂解细胞，但也会造成DNA 的断裂。

一、机械裂解法主要有以下两种：

1.热休克(Thermal shock)，既反复冻溶法，是一种常用的机械裂解方式比，通常由冷冻和解冻两部分组成(freezing and thawing)。原理：由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。冷冻通常在液氮或-20 ℃ 冰上进行，解冻可以在37、50、65 或100 ℃水浴中进热休克比化学裂解温和，但是很有效，有资料表明用热休克和溶菌酶与SDS的方法获得了90%的细胞裂解率。

2.超声波处理(Ultrasonication)既利用超声加热的方法，把细胞破碎。但这种处理会导致DNA 的断裂，所以加热不宜过剧烈，要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护酶的活性。bead-beating 也是常用的机械处理方式，有报道指出bead-beating 比热休克和化学裂解的细胞裂解效果更好虽然DNA产量较高，但通常得到的DNA片段较小。

二、化学裂解和酶裂解法(在提核酸时联合使用)主要是裂解液处理法，细胞裂解液的主要目的有以下几种：

（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；

（2）溶解蛋白；

（3）蛋白变性使其稳定；

（4）抑制蛋白酶活性。

主要根据不同的目的，裂解液的组成有所不同，主要有提取核酸和蛋白两中。在提取RNA或DNA时，我们主要是要充分裂解细胞，得到更多的核酸；如果我们的目的是蛋白，那要根据蛋白的位置、特性等因素考虑裂解液，在提取蛋白后，再根据实验需要复性蛋白等。以下是细胞裂解中常用试剂和其作用： 50 mMTris-HCl pH 7.4(缓冲体系)，150 mMNaCl(等渗体系)，1 mM PMSF(强大的蛋白酶抑制剂)，1 mM EDTA(变性剂和稳定剂)，5 µg/ml Aprotinin(蛋白酶抑制剂)，5 µg/ml Leupeptin(蛋白酶抑制剂)，1% Triton x-100(破坏细胞)，1% Sodium deoxycholate(中度变性剂和蛋白溶解剂)，0.1% SDS(强变性剂和蛋白溶解剂)。7M 尿素，2M硫脲(可以提高膜蛋白的融解)，蛋白酶K等。细胞裂解时间把握问题：孔板里细胞用PBS洗2次后，加入细胞裂解液，然后去测总蛋白含量和酶的活力，不知道细胞要裂解到什么程度? 答：因为所用的细胞类型不一样，所以实验的条件也需要摸索，建议这样来做：加入细胞裂解液后，不同时间取样，以时间和总蛋白含量和酶的活力作曲线，这样就可以找到裂解的最佳时间，仅供参考。

原核表达的细胞裂解问题：做原核表达，用BL21表达，之后如何裂解细胞才行呢?我的菌液只有300微升，说明书上用超声裂解细胞，但没给出具体做法，我们这只有大的探头，不好做，有什么好的办法么? 要是用超声裂解，要怎么做才行?我是超声15 s间隔10 s座4次。裂解不好，应该怎样改呀?!答：请试一试IFCC推荐法： 1.收集细胞悬液

2.4 ℃ 低温离心(3000 rpm，5min)3.弃上清，加入一定量PBS(200 ul)，轻轻吹打混匀，-20 ℃ 冷冻30 min，37 ℃ 解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液

三、western blot细胞裂解方法个人小结：

过些天准备做western blot，昨天就提前把细胞裂解了，提出蛋白来保存。一下是我做的方法，大家参考，可能有不正确的地方，希望大家指出来，谢谢!1.取一瓶细胞(100 ml的瓶子)，PBS洗2次，胰酶消化，加入10 ml 培养液，制备成细胞悬液；

2.将细胞悬液移入10 ml离心管中，4 ℃，2500 rpm，离心5 min；

3.弃上清，加入预冷的PBS(即4 ℃ 存放的PBS)于离心管中，吹打，4 ℃，2500 rpm，离心5min；弃上清，重复上述步骤一次；共洗细胞2次，充分洗掉培养液；

4.弃上清，加入200 ul细胞裂解液(每1 ml裂解液中加入10 ulPMSF)，置于冰上，裂解40 min～1 h；裂解过程中可用枪头吹打或间断摇动离心管，以使蛋白充分裂解； 5.取出离心管，于4 ℃，12000 rpm，离心5 min； 6.将上清移入EP管中，-20 ℃ 保存，即可。

注：本来应该在培养瓶或培养皿中裂解，但出于某种原因，我为节约细胞裂解液，故试着在离心管中裂解，不知道这样裂解是否充分。但我想这种方法也是可以考虑的。

四、核蛋白裂解液配方与步骤： 1.核蛋白裂解液配方 Buffer A 10 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 10 mMKCl 0.5 mM DTT，0.05% NP40(or 0.05% Igepal or Tergitol)pH 7.9 Buffer B 5 mM HEPES 1.5 mM MgCl2 0.2 mM EDTA 0.5 mM DTT 26% glycerol(v/v)，pH 7.9 2.核蛋白裂解操作步骤 Method 1.Prepare 1 ml of buffer A with added cocktail of usual inhibitors from frozen stock and store on ice.2.Add 500 μl of buffer a per large petri dish on ice and scrape thoroughly，leave on ice for 10 min.3.Centrifuge at 4 °C at 3000 rpm for 10 min.4.Remove supernatant and keep it(this will contain everything except large plasma membrane pieces，DNA，nucleoli)，extract out 10 μl for Bradford assay.5.On ice resuspend pellet in 374 μl of buffer B and add 26 μl of 4.6 M NaCl to give 300mM NaCl(high salt helps lyse membranes and forces DNA into solution).6.Homogenize with 20 full strokes in Dounce or glass homogenizer on ice.7.Leave on ice for 30 min.8.Centrifuge at 24，000 g for 20 min at 4 °C.9.Aliquot supernatant，remove 10 μl for Bradford assay and store at-70 °C.细胞裂解机制被广泛应用于各类的生物实验中，最突出的当属WB。为达到最佳的实验结果，需要注意的是所有的实验步骤都需在四度以下进行，并且避免过多的反复冻融。而且整个实验过程中记得戴手套。编辑： 呜咽