附件9
食品中硼酸的快速检测
姜黄素比色法
(KJ201909)
范围
本方法规定了食品中硼酸的姜黄素比色快速检测方法。
本方法适用于粮食制品、淀粉及淀粉制品、糕点、豆制品、速冻食品(速冻面米食品、肉丸、蔬菜丸)中硼酸的快速测定。
原理
本方法采用姜黄素比色法的原理,通过超声辅助用水提取样品中硼酸,用乙基己二醇-三氯甲烷溶液对样品中的硼酸进行快速的富集、萃取,利用硫酸与姜黄素混合生成的质子化姜黄与硼酸反应生成红色产物。溶液颜色的深浅与样品中硼酸的含量成正相关,通过色阶卡进行目视比色,确定样品中硼酸的含量。
试剂与材料
除另有规定外,本方法所用的试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水。
3.1
试剂
3.1.1
硫酸。
3.1.2
无水乙醇。
3.1.3
亚铁氰化钾。
3.1.4
乙酸锌。
3.1.5
姜黄素(CAS:458-37-7),纯度≥
99%。
3.1.6
冰乙酸。
3.1.7
2-乙基-1,3-己二醇(色谱纯)。
3.1.8
三氯甲烷(色谱纯)。
3.1.9
硫酸溶液(1+1):取等体积的硫酸(3.1.1)与水,将硫酸缓慢加入到水中,并用玻璃棒不断的搅拌,待冷却后装入塑料容器中。
3.1.10
亚铁氰化钾溶液:称取10.6
g亚铁氰化钾(3.1.3),用水溶解并稀释至100
mL。
3.1.11
乙酸锌溶液:称取22.0
g乙酸锌(3.1.4),用水溶解并稀释至100
mL。
3.1.12
2-乙基-1,3-己二醇-三氯甲烷溶液(EHD-CHCl3溶液):称取2-乙基-1,3-己二醇(3.1.7)
10.6g,用三氯甲烷(3.1.8)溶解并稀释至100
mL,此溶液保存于塑料容器中。
3.1.13
姜黄-冰乙酸溶液:称取姜黄素(3.1.5)40
mg,溶于100
mL冰乙酸(3.1.6)中,此溶液保存于塑料容器中,该溶液需临用新制。
3.2
参考物质
硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量见表1。
表1
硼酸参考物质中文名称、英文名称、CAS号、分子式、相对分子质量
中午名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相对分子质量
硼酸
Boric
Acid
10043-35-3
H3BO3
61.8
3.3
标准溶液配制
3.3.1
硼酸标准储备液(1000
μg/mL):准确称取在硫酸干燥器中干燥5
h以上的硼酸标准品适量,用水溶解并配制成1000
μg/mL的标准储备液,保存于塑料容器中。
3.3.2
硼酸标准溶液(100
μg/mL):取硼酸标准储备液10.0
mL,加水定容至100
mL,保存于塑料容器中。所配制溶液于0℃~4℃冰箱中可储存3个月。
3.4
材料
硼酸快速检测试剂盒,需在阴凉、干燥、避光条件下保存。
仪器与设备
4.1
电子天平:感量为0.01
g。
4.2
样品捣碎机。
4.3
超声仪。
4.4
离心机:转速≥4000
r/min。
4.5
氮气吹干仪或空气吹干仪:温度控制≥60℃。
4.6
涡旋振荡器。
4.7
移液器:200
µL、1
mL、10
mL。
分析步骤
5.1
试样的制备
取适量样品,充分粉碎混匀。
5.2
试样的提取
准确称取混合均匀的试样2
g(精确至0.1
g),置于50
mL离心管中,准确加水7
mL,加入硫酸溶液(3.1.9)2
mL,涡旋振荡提取1min后超声提取15
min,期间振摇2~3次,加入0.5mL亚铁氰化钾溶液(3.1.10)与0.5
mL乙酸锌溶液(3.1.11),混匀后于4000
r/min离心5
min(若离心效果不佳,可适当提高离心转速),准确吸取1.0
mL上清液于2.0
mL离心管中,向离心管中加入EHD-CHCl3溶液(3.1.12)0.5
mL,上下颠倒振摇15~20次,静置分层(若有乳化现象,可低速离心),将上层溶液去除干净,取下层液体100
μL于2.0
mL离心管中,加入400
μL姜黄素-冰乙酸溶液(3.1.13),再加入20
μL硫酸溶液(3.1.9),于60℃~70℃水浴中氮气(或空气)吹至近干,加入1
mL无水乙醇,振摇使残渣全部溶解,为待测液。
注:粉丝、粉条等干基样品加入水和硫酸溶液后需浸泡15
min,再进行后续处理。
5.3
测定步骤
将待测液与标准色阶卡目视比色,15
min内判读结果。需进行平行试验,两次测定结果应一致,即显色结果无肉眼可辨识差异。
注:整个试验避免在阳光直射的地方操作。
5.4
质控试验
每批样品应同时进行空白试验和质控样品试验(或加标质控试验)。用色阶卡和质控试验同时对检测结果进行控制。
5.4.1
空白试验
称取空白样品,按照5.1~5.3步骤与样品同法操作。
5.4.2
质控样品试验(或加标质控试验)
5.4.2.1
质控样品
硼酸质控样品:采用典型样品基质或相似样品基质模拟实际生产工艺生产的,含有一定量硼酸(可考虑基质本底最大可能硼酸量),并可稳定保存的样品。样品需经参比方法确认质控样品中硼酸的含量。
5.4.2.2
加标质控样品
硼酸加标质控样品:准确称取空白试样2
g(精确至0.1
g),加入适量硼酸标准溶液(1000
µg/mL
或100
µg/mL)(3.3),使在不同基质样品中硼酸含量与5.4.2.1相同。
质控样品(或加标质控样品)按5.1和5.2步骤与样品同法操作。
结果判定要求
观察待测液的颜色,与标准色阶卡比较判读样品中硼酸的含量。颜色浅于检测限(2.5
mg/kg)则为阴性样品;颜色深于检测限的根据颜色的深浅进行判读。色阶卡见图1。
图1
硼酸色阶卡
质控试验要求:空白试验测定结果应为阴性,质控样品试验测定结果应在其标示量值允差范围内,加标质控试验测定结果应与加标量相符。
结论
由于色阶卡目视判读存在一定误差,为尽量避免出现假阴性结果,读数时遵循就高不就低的原则。
性能指标
8.1
检测限
2.5mg/kg。
8.2
灵敏度
灵敏度应≥99%。
8.3
特异性
特异性应≥85%。
8.4
假阴性率
假阴性率应≤1%。
8.5
假阳性率
假阳性率应≤15%。
注:性能指标计算方法见附录A。
其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便,在使用本方法时不作限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前,须对其进行考察,应满足本方法规定的各项性能指标。色阶卡应确保在试剂盒保质期内不出现褪色或变色的情况。
若检测结果大于检测限,需对其进行研判,并采用参比方法确证。
本方法的参比方法为GB
5009.275-2016《食品安全国家标准
食品中硼酸的测定》。
附录A
快速检测方法性能指标计算表
表A.1
性能指标计算方法
样品情况a
检测结果b
总数
阳性
阴性
阳性
N11
N12
N1.=N11+N12
阴性
N21
N22
N2.=N21+N22
总数
N.1=N11+N12
N.2=N21+N22
N=N1.+N2.或N.1+N.2
显著性差异(х2)
c2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度(df)=1
灵敏度(p+,%)
p+=N11/N1.特异性(p-,%)
p-=N22/N2.假阴性率(pf-,%)
pf-=N12/N1.=100-灵敏度
假阳性率(pf+,%)
pf+=N21/N2.=100-特异性
相对准确度,%c
(N11+N22)/(N1.+N2.)
注:
a由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果;
b由待确认方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。用于确认方法时,结果≥2.5mg/kg时,判定为阳性(仅用于计算性能指标);
c本方法规定:用于计算灵敏度和假阴性率的阳性样品,由参比方法检验得到的结果范围应在2.5~10mg/kg之间。
N:任何特定单元的结果数,第一个下标指行,第二个下标指列。例如:N11表示第一行,第一列,N1.表示所有的第一行,N.2表示所有的第二列;N12表示第一行,第二列。
d为方法的检测结果相对准确性的结果,与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价。
本方法负责起草单位:陕西省食品药品监督检验研究院
验证单位:江南大学、四川省食品药品检验检测院、湖北省食品质量安全监督检验研究院
本方法的主要起草人为:李涛
林芳
袁磊
乔蓉霞
孙秀兰
王一欣
周陶鸿