第一篇：酵母表达系统概述及相关研究进展
酵母表达系统的研究进展和前景
(XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX学院)
摘要：酵母表达系统在表达真核生物蛋白方面已经得到广泛而成功的应用，表达出的重组蛋白表现出较高甚至比原物种体内的蛋白质更高的生物活性。近年来，利用酿酒酵母和毕赤巴斯德氏酵母表达人源蛋白或肽类活性物以及其它中间体取得了新的进展。本文主要从上游设计，重组表达，分离纯化和活性验证等方面进行了总结，并且对未来更好的利用酵母生产药物等活性物质作出展望。
关键词：酵母表达系统；蛋白分泌：异源基因；糖基化修饰；人源活性药物
引言
酵母作为一种表达外源基因的宿主菌, 既具有操作简单, 生长快等特点, 又具有真核细胞的翻译后修饰加工系统。在表达某些基因工程产品时, 可以大规模生产, 从而有效地降低成本。常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统, 甲基营养型酵母表达系统和裂殖酵母表达系统。酿酒酵母（Saccharomyces.cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。但由于酿酒酵母的局限，1983 年美国Wegner 等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。其中毕赤酵母（P.pastoris）是继S.cerevisiae 之后被迅速推广的一种外源基因表达的宿主菌。
酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。但是，可以通过基因敲除或改造用酿酒酵母表达亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)或非蛋白活性物质及其中间体（如青蒿素，色素）。与原核和其它真核表达系统相比，巴斯德毕赤酵母作为重组蛋白表达系统有以下优点
[1]：（1）生长速率快，易于高密度培养（2）在几乎不含蛋白质的培养基中具有高水平产率
（3）消除了内源毒性和噬菌体感染（4）易于对具有明确特征的酵母表达载体进行操作（5）对毕赤酵母的噬菌体对人没有病原性（6）具有多种翻译后修饰包括多肽折叠，糖基化，乙酰化，甲基化，蛋白质降解调控以及定位至亚细胞结构（7）能够构建分泌的蛋白，这样只需从生长培养基中提纯而不必收集酵母本身细胞。
基因工程与酵母表达系统
即使酵母表达系统具有一些优势，但在用于生产蛋白质等药物时，还需要选择合适的载体并对宿主菌的某些代谢途径进行改造，使之利于目标产物的表达，要用于工业生产，还需根据实际情况优化培养条件，比如pH，温度，溶氧量，培养基营养，特殊添加剂等。
酿酒酵母的表达载体有自主复制型和整合型，自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘露糖，致使产物的抗原性明显增强。
毕赤酵母的表达载体多采用整合型载体，即将异源基因通过载体整合进酵母基因组中，这是由于没有适合毕赤酵母的游离型表达载体。所有巴斯德氏毕赤酵母的表达载体都是一个表达组件，它由一个启动子序列（大多是AOX1启动子），一个来自AOX1的转录终止序列用以指导3’终止过程和mRNA的多聚腺苷酸化，在它们之间有一个或多个克隆位点用以插入外源基因。这样的设计保证了产物(cap-AOX1 5′UTR-ORF-3′UTR-polyA)是一个成熟的mRNA以适应毕赤酵母的细胞体系，确保了信息的稳定性和有效性。检测表达所用的标记基因一般是HIS4（组氨醇脱氢酶基因），有时也用kan（卡那霉素抗性基因）或Sh ble.此外，有时为了防止酵母自身蛋白酶对所要表达的异源蛋白的降解，会使用蛋白酶缺陷突变型或降低发酵温度，保证目的蛋白的产量和得率。发酵过程一般分两个阶段，第一阶段是细胞以甘油为碳源生长，甘油耗尽后进入第二阶段，加入甲醇诱导AOX1启动子的转录翻译，从而使异源基因表达，生产目标蛋白。
酵母表达系统研究进展
1． 利用酿酒酵母生产青蒿素前体——青蒿酸
青蒿素（Artemisinin）是目前治疗疟疾的高效药物，这主要是由于疟原虫（Plasmodium falciparum）逐渐对其它药物产生了抗药性。现在青蒿素的产量远达不到需求量，所以Jay D.Keasling 等人通过酿酒酵母生产它的前体——artemisinic acid，成本低，环保，可作为高质[2]R
量和可靠的青蒿素来源。这个实验通过改造甲羟戊酸途径，引入两个来自青蒿（Artemisia annua）的外源酶amorphadiene synthase(ADS)和cytochrome P450 monooxygenase(CYP71AV1)使酿酒酵母获得将amorpha-4,11-diene氧化为artemisinic acid的三步途径。同时，还导入了CYP71AV1的天然氧化还原配体CPR(cytochrome P450 oxidoreductase)，在这之前，还需将法尼基焦磷酸即FPP（farnesyl pyrophosphate）的合成途径修饰，减少它用于固醇的合成，使之更多的用于合成amorphadiene。然后，利用改造的酿酒酵母EPY224生产artemisinic acid，不仅纯度较高，易于提取分离，而且不受气候影响。
2．利用毕赤巴斯德氏酵母生产人源抗菌肽——LL-37
抗菌肽是生物体抵御外源性病原体的防御反应中所产生的一类小分子多肽。许多传统的抗生素具有毒副作用且能够诱导耐药菌株的产生，发展克服耐药性问题的新型抗生素显得越来越重要。抗菌肽具有分子质量小、水溶性好、耐热性强、无免疫原性、抗菌谱广和作用机制独特等特点，还有研究表明，hCAP（Human cathelicidin antimicrobial peptide）是人皮肤在受伤或炎症刺激下，嗜碱性粒细胞分泌的一种防御或抗微生物的肽，在人类中只有LL-37一种。固相化学合成技术可以生产像肽这样较短的氨基酸序列，不过成本太高。Yong-Seok Kim等人[3]利用pGAPZ-E（pGAPZB载体的游离形式）将编码成熟LL-37的111bp的基因片段采用电穿孔方法转化到P.pastoris X-33中，进行细胞内表达，表达的重组LL-37通过LC-ESI-MS/MS检测确定，发现有5kDa的LL-37条带。酵母的表达出来的LL-37的粗提取物对Micrococcus luteus具有抑制活性。表达载体采用GAP强启动子，另外还进行了有a-MF外分泌信号的载体pGAPZaA，结果采用这个载体的X-33培养物中没有发现胞外分泌的LL-37.另外还利用蛋白酶缺陷型菌株SMD1168H进行了转化，LL-37在其中的表达水平与在X-33中的没有显著差异。这个实验说明了利用游离型表达载体在P.pastoris X-33中可以成功表达LL-37，并且具有生物活性，可以用于生产这类抗菌肽药物。
3．人源化的毕赤酵母生产糖蛋白类药物
人体内，除了抗体外的大多数糖蛋白的半衰期和治疗潜力依赖于末端的唾液酸化，这是由于一个糖蛋白的其它末端糖比如甘露糖，N-乙酰葡糖胺和半乳糖等会被体内的糖特异性受体或凝集素识别并被清除，也就失去疗效了。酵母和丝状真菌在表达这类糖蛋白方面具有一定前景。用酵母表达在人体内具有活性的糖蛋白需要进行很多基因删除或修饰，Tillman U.Gerngross等人[4]利用毕赤酵母构建出能表达重组红细胞生成素（EPO）的菌株P.pastoris YSH597。这个菌株是在以前的菌株RDP762基础上利用pSH926载体引入了5个新的外源基因构建成的，为的是使这个酵母能完成人源的末端唾液酸化。对天然酵母的改造设计到四个酵
母特异性糖酰化基因的敲除和14个异源基因的导入。利用SDS-PAGE和HPLC提纯分离的重组EPO具有与剂量相关的生物学活性。EPO是一种高度糖基化的蛋白质，利用酵母表达需要在N-乙酰葡糖胺或甘露糖等修饰后再加上人源的唾液酸化过程，才能产生有活性的EPO（已经进行动物试验）。这项研究表明利用酵母生产EPO等同类糖蛋白具有可行性，不仅能节省时间，而且节约成本，大量生产以缓解对这类医疗药物的需求。
酵母表达的糖蛋白不同于哺乳动物表达的杂合型或复杂型糖蛋白，而是高甘露糖型或过度甘露糖化糖蛋白。杨晓鹏等人[5]在前期成功敲除毕赤酵母α-1,6-甘露糖转移酶(Och1p)基因、阻断毕赤酵母过度糖基化，获得毕赤酵母过度糖基化缺陷菌株GJK01(ura3、och1)的基础上，构建了PGE-URA3-PNOI-GAP-signal-MDSI载体，通过表达不同物种来源的α-1,2-甘露糖苷酶I(MDSI)的活性区与酵母自身定位信号的融合蛋白，并通过DSA-FACE(基于DNA 测序仪的荧光辅助糖电泳)分析筛选报告蛋白HSA/GM-CSF(人血清白蛋白与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子融合蛋白)的糖基结构，发现当编码酿酒酵母α-1,2-甘露糖苷酶(MnsI)基因的内质网定位信号与带有完整C-端催化区的拟南芥MDSI基因融合表达时，毕赤酵母工程菌株能够合成Man5GlcNAc2 哺乳动物甘露糖型糖蛋白。这为在酵母体内合成类似于哺乳动物杂合型或复杂型糖基化修饰的糖蛋白奠定了基础。
4．在巴斯德氏毕赤酵母中高水平表达一种合成酶——植酸酶
植酸（Phytate）,即肌醇六磷酸（IP6），是植物种子中磷元素的主要储存形式, 普遍存在于植物性食品和饲料。人和单胃动物畜禽和鱼类等缺乏内源性植酸酶不能利用有机植酸磷。饲料中常添加无机磷酸盐以满足单胃动物的磷营养需求，随之产生了诸多问题，最主要的是植酸作为一种抗营养因子，在体内络合多种矿质元素和蛋白质等，常引起人和单胃动物各种营养不良症，而且未被利用的植酸磷被微生物降解释放无机磷易引发水体磷污染。植酸酶（Phytase）是一类特殊的正磷酸单酯磷酸水解酶，催化植酸水解生成低级肌醇磷酸衍生物和无机磷酸，在动物营养、资源环境保护和人类健康等领域愈来愈显示出巨大的应用潜力和研究价值。植酸酶普遍存在于植物、真菌、酵母和细菌，其中微生物植酸酶因活性高、生产比较容易等诸多优点，对其研究和开发最为广泛和深入。Ai-Sheng Xiong等人利用一种担子菌隔孢伏革菌(Peniophora lycii)的植酸酶[6]（一种6’-植酸酶）基因，优化出适合P.pastoris的密码子的基因序列——phy-pl-sh，连接上信号肽MF4I的基因，采用含有AOX1启动子的pPIC9K载体，转化并使毕赤酵母GS115合成并分泌了植酸酶，产量为12.2g/L.控制的培养条件是：30°C，pH5.5，溶氧量30%，高密度培养。酶蛋白检测和酶活测试发现，酶的糖基化较严重，用水解酶Endo Hf在37°C下处理提纯的酶蛋白4h，得到的片段较均一，且在pH4.5下具有最大
酶活力。对基因稳定性和酶的热稳定性检测发现效果良好，此外他们还利用DNA Shuffling获得了几种热稳定的酶的候选基因，这项研究表明利用毕赤巴斯德氏酵母生产6’-植酸酶具有很大潜力，可以用于工业生产。
5．毕赤酵母表达大分子类药物
在毕赤酵母表达系统表达具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，显著地提高了SOD 保护HeLa 细胞免受氧化损伤的能力。细胞质转导肽(CTP，一种能够携带外源大分子穿过细胞膜，定位于细胞质的短肽)运输人铜锌超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)跨过细胞膜进入细胞质，可以提高其生物利用度。李沛志等[7]利用P.pastoris GS115(his4-)及其整合型分泌表达质粒pPIC9K转化表达了融合蛋白CTD-SOD。首先，设计含有CTD转导肽基因序列的融合基因，连接至pPIC9K 质粒并用它转化E.coli Top10并进行菌落PCR筛选，抽提出重组质粒并电击转化巴斯德毕赤酵母，将转化成功的酵母接种到YPD 培养基中，通过加入甲醇至终浓度0.5％诱导表达。培养结束后分析发酵液中诱导蛋白的表达量，纯化后并进行对细胞的保护作用测试。本研究成功地在毕赤酵母表达系统中高效表达了具有生物活性的CTP-SOD 融合蛋白，发酵上清中重组蛋白的含量为156.5 mg/L。纯化得到的CTP-SOD 分子量约为22.5 kDa。CTP-SOD 预处理Hela 细胞可显著地提高了邻苯三酚(Progallol)诱导氧化胁迫下HeLa 细胞的存活率，较野生型SOD 相比具有较强的保护作用。但是，CTP 和其他种类的PTD（蛋白转导域，Protein transduction domain）相比是否更有利于SOD或其他在细胞质中起作用的药物发挥功能都有待进一步深入的研究来证明，具有跨膜转导能力的新一代药物运输载体PTD 将会促进多肽、核酸等大分子药物的快速发展，为生物大分子药物的应用带来更广阔的前景。
在哺乳动物中, 三叶型家族(trefoil factorfamily, TFFs)蛋白通过增强细胞迁移，促进细胞增殖，对抗细胞凋亡等过程参与黏膜的修复并维持其完整性。Bm-TFF2, 一种从大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的两栖类三叶因子, 具有比人三叶因子更强的生物学活性。余果宇等人
[8]以Bm-TFF2 的cDNA 为模板, 利用PCR 方法扩增Bm-TFF2 基因, 然后插到含有AOX1 启动子和α-因子信号肽序列的表达载体pPIC9K 中, 采用毕赤酵母表达系统进行分泌表达, 并用G418 筛选高拷贝整合转化子。SDS-PAGE 和Western blotting 都检测到Bm-TFF2 被分泌性表达于酵母上清。在1%的甲醇诱导表达不同时间后, 重组蛋白在72 h 的表达量最大, 可达50 mg/ L;而不同浓度的饱和硫酸铵沉淀菌液上清时, 80%的饱和硫酸铵沉淀量最大。这些结果表明, 重组质粒Bm-TFF2-pPIC9K 成功构建并在真核细胞中高效表达, 这为进一步研究Bm-TFF2 的生物学活性及其结构与功能关系奠定了基础。
6．毕赤酵母在表达病毒蛋白用于疫苗和诊断方面的应用
人轮状病毒的VP7 基因目前已有用大肠埃希氏菌、乳酸杆菌，植物和哺乳动物细胞等表达系统的报道，而酵母表达尚未见报道。利用巴斯德毕赤酵母表达轮状病毒的保护性抗原VP7，以制备轮状病毒基因工程疫苗，可为预防轮状病毒感染提供一条有效途径。卢颖等人
[9]将已构建的重组质粒VP7-pPICZαA 经SacⅠ线性化后，通过电转化法转入毕赤酵母GS115中，然后Zeocin平板筛选并进行PCR鉴定及Mut 表型筛选，成功构建VP7 基因的重组酵母表达系统，为进一步表达VP7 基因提供理论依据和实验基础。
为了分析真核体系中表达的乙型脑炎病毒E蛋白的生物学特性，张健等人[10]以乙脑病毒SA-14 株为代表，构建了E 蛋白基因的毕赤酵母表达系统。首先，应用RT-PCR 法扩增乙型脑炎病毒E蛋白表达基因，定向克隆入载体pPICZαA，然后将重组质粒以PmeⅠ线性化并电转化入毕赤酵母GS115 感受态细胞，最后用Zeocin筛选转化子进行鉴定。PCR 扩增产物约为1 350 bp，定向克隆获得pPICZαA-E 表达载体，经测序结果与Genbank 相应序列比较，核苷酸序列同源性为100%，电转化得到巴氏毕赤酵母重组菌株GS115-E，提取其基因组DNA 经PCR鉴定与预期相符。本研究构建的乙型脑炎病毒E 基因毕赤酵母表达系统为进一步进行E蛋白真核表达研究奠定了基础。
酵母表达系统表达病毒蛋白抗原还在血清学诊断方面有所进展。于天飞等人[11]在多酵母表达系统（GS115/pPIC9-TY，GS115/pPIC9K-ts（Mut+），KM71/pPIC9-ts）中表达了含有猪传染性胃肠炎病毒S 基因B 和C 抗原位点片段。经检测表明，不同类型酵母表达系统蛋白表达量和抗原性差异不大，研究中获得的重组蛋白为建立TGE血清学检测方法提供了必要的物质基础．本试验所获得蛋白为PRCV S蛋白缺失部分，以此重组蛋白作为诊断抗原建立的血清学诊断方法可望避免潜在的PRCV感染对检测TGE的干扰，得出筛选生长速度较快的GS115/pPIC9-TY适合作为今后进一步应用的候选重组菌．
总结
由于酵母表达外源蛋白，特别是药用蛋白质的种种优势，促使研究人员不断改进酵母的遗传特性和生理特性。这些突破更加提高了酵母在生产药用蛋白中的应用。在工作中对不同来源、不同作用特点外源蛋白的研究和开发应用，毕赤酵母表达体系是一个很好的选择，我们需要综合考虑这一表达体系的上述特点，对目的外源蛋白基因进行相应的改造，设计合理的构建策略，使重组外源蛋白按我们的要求进行表达，有助于获得大量有活性的表达产物。相信这一表达体系的采用和不断深入研究势必为基因工程药物的发展提供加速度。
参考文献
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第二篇：酵母表达系统使用心得
Pichia酵母表达系统使用心得
甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。甲醇酵母部分优点：
1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系 统简单，非常适合大规模工业化生产；
4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化；
5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。
产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。
毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步——构建载体
Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。
红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。
leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的
时间了。
基本熟悉了毕赤酵母，了解了她生长的喜好（多糖偏酸环境），生长的周期等等情况后，当然更多的精力还是应该花在表达的目的蛋白上，我的表达蛋白有些恐怖，有100KD，本来当然应该放在大肠杆菌中表达，但是为了分泌表达（其实后来发现大肠杆菌pET系列分泌表达系列也不错）和糖基化修饰（主要是这个方面，因为我的蛋白是人源的，表达出来用于酵母双杂，因此需要有完备的糖基化修饰）。这样我的DNA片段由于较长，所以在做克隆的时候也要非常小心，需要注意的是：
①酶切位点不能出现在目的DNA片段中——如果片段长无法避免，可以采用平末端连接；
②虽然α-factor可以自动切除，但是在设计表达的时候，如果在N端不能出现任何多余的aa（比如药物蛋白表达），需要特别留意（说明书上有详细说明：P13）；
③有三种不同的读码框（对于pPICZα系列来说就是对上α-factor序列），在设计克隆的时候要反复确定自己的读码框是否正确，这可是致命的问题；
④无论pPICZ还是pPICZα都有TGA（终止密码子），但是pPICZ系列没有ATG（起始密码子），有人认为酵母启动子与外源基因的ATG之间的距离越短对于表达的该基因越有利；
⑤如果不希望有c-myc和His-tag，可以在基因片段末尾加入终止密码子；
⑥Pichia的密码子与酿酒酵母的相似，有关基因表达偏好密码子的问题有人认为没有必要更换，有人认为一定要换，个人认为以产量为主要目的的可以考虑更换基因密码子，而如果片段过长就比较麻烦，不过有许多真核保守蛋白其实是和酵母密码子相似的；
⑦克隆菌株需要有recA，endA，试剂盒带有的TOP10挺好用的（其它像是DH5α都行），但是要注意带有筛选抗生素Zeocin的培养基要用低盐培养基（NaCl减半），这主要是因为怕影响到抗生素作用（Zeocin平板要避光保存）；
⑧测序引物可以用α-factor信号引物，也可以用5'AOX1引物；
⑨如果需要高量表达，可以考虑做克隆的时候串联基因片段进行表达，另外也可以在转化酵母的时候重复转化。
⑩目的基因中最好不要含有pro-glu-ser-thr这样的序列，因为这个序列是激活蛋白水解酶的作用底物，会影响表达，另外也不要含有x-phe-x-arg-gln和gln-arg-x-phe-x这样的序列（x=任何氨基酸），因为这些序列容易受到容酶体的切割，而且目的蛋白末端最好是ala,asp,val,ser这样的氨基酸。除此之外许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录，也需要多加注意。
第二步就是将线性化的DNA转化入Pichia酵母中：
Xiang Yang：EasySelect试剂盒准备了三种菌株：X33，GS115和KM71H。我倾向于选择X33，因为这个菌株转化率和表达量相对而言较高，如果你有电转仪（electroporator），可以尝试一下。如果没有的话，EasySelect也准备了化学转化试剂——EasyComp Transformation，但是由于转化率的缘故，我建议使用电转仪。
leslie：在得到了正确的序列之后就可以准备转化毕赤酵母了，试剂盒携带有的是X-33，GS115和KM71H这三种毕赤酵母（另外常用的还有SMD1168），每种酵母的特点有些不尽相同
（Manual上写的很清楚），其中X-33由于是野生型，因此耐受性比较好，如果担心转化率的话可以考虑这种酵母菌，而GS115与X33一样都是属于MUT＋表现型，也就是说可以在含甲醇的培养基中快速生长，但是据说会对外源基因表达有影响，KM71是MUT-型酵母，在甲醇培养基中生长缓慢，但是也有利于翻译后加工，比如形成二硫键，糖基化等等，另外SMD1168则是基因组中的Pep4基因发生突变，造成蛋白水解酶活性的丧失，可以保护表达产物免受降解，促进表达量的提高。
一般来说，如果是胞内表达，应尽量用Mut－细胞，这样得到的蛋白产物中醇氧化酶蛋白量较少而目的蛋白量相对较多(约占Pp总分泌蛋白量的30-90%，如人乙酰胆碱酯酶B变异链的含量占到90%，使下游纯化更易进行。而对于分泌蛋白的表达，无论是甲醇利用慢(Mut-)还是甲醇利用快(Mut+)的细胞都可应用，如在人血清白蛋白(HSA)(为分泌型蛋白)的表达中就看不出两种类型的细胞之间有什么明显差别。
所以一般手册都会建议同时在这几种菌株中进行转化，这主要是因为不同的基因在不同的酵母菌中可能表达量截然不同，因此在最开始的时候建议多用几种酵母菌实验。
另外有个保存问题，原始酵母菌一定要保存好，因为酵母在传代多次后会影响其转化率和表达量，所以一方面分多管分装保存于-80℃，另一方面如果出现了转化或者表达的问题，在其它方面都没有出错的前提下可以考虑重新取出新菌液（每次都要涂平板挑菌）。
在准备酵母菌的同时也需要准备质粒，由于酵母菌转化对转化质粒的要求较高，量也较大（5-10ug），因此许多时候都会用PEG大提质粒，或者用大提试剂盒，总而言之要准备好足够量的质粒，并且不要忘记也要同时准备空载体以做对照。在转化前质粒需要进行线性化，这主要是为了增加重组率（EasySelect试剂盒表达量高的一个重要原因也就在于其原理是将目的片段整合到载体上，大大的增加了目的片段的表达）。线性化位点个人认为也会影响到表达量，对于基因片段不大的蛋白可以考虑用几个线性化位点同时进行转化筛选，但是如果片段大，就有可能供选择的机会少，而且也有可能遇上没有合适的线性化位点的情况，这个时候也不是说不能进行表达，但是准备的质粒就要增加10倍，另外也可以进行部分酶切（即先进行预实验，掐定时间和酶量保证被切开的质粒有部分是在线性化位点切开而基因片段保存完好）。
在线性化之后的质粒就可以酒精沉淀回收了——中间步骤需要使酶失活，说明书建议是热失活或者EDTA，个人认为前者比较好，主要是担心EDTA对于转化的影响，另外这三种酶失活的温度都是65℃/20min。沉淀回收之后是离心10分钟，用80%的酒精洗涤后风干，这一步需要多加注意保证风干完全，因为有实验证明残留的酒精对于转化的影响颇大。
接下来就是酵母转化了，这是令许多人头疼的一步，也是影响实验决定表达的关键步骤。转化方法有不少，例如电转，化学转化，原生质体转化，其方法的难易程度和转化率高低呈反向递减的，也就是说电转最容易，转化率较高（但要求有电转仪），而原生质体最麻烦，而且效果不好（比较传统），因此不建议使用，EasySelect说明书上这么建议，并且也详细说明了电转，化学转化（EasyComp和LiCl）方法的过程，可以按部就班。需要注意的是（电转过程）：
①最好每次都从平板上挑酵母菌，用培养过的酵母放置时间不要超过一个星期；
②扩大培养的浓度一定要控制好，个人认为不需要OD600达到1.3-1.5，1.0-1.3的就好，这个时候的酵母比较新鲜，转化率比较高； ③整个感受态制作过程中一定要在冰上操作，离心最好也用冷冻离心机，这是影响转化的关键——为了进一步保证这一点，无菌水可以是冰水混合物，另外山梨醇和电转杯都要预冷；
④电转仪需要预热，所以准备感受态的时候就可以把电转仪打开了，电转后山梨醇的加入要快，曾有人做实验证明晚一秒就会降低转化的数量级，虽然不一定可信，但是我个人也认为这个过程要快，电转后可以看看时间，如果时间过短（比如(4)就可能说明杂质较多，会影响转化率；
⑤转化后温育是个增加同源重组，增加存活率的过程，需要注意不要感染了大肠杆菌，再加入培养基30℃摇一段时间，可以取部分涂板（不同浓度抗生素），或者也有人将菌短暂离心，弃去上清，剩余全部涂板以保证转化率。
(化学转化)
如果没有电转仪，LiCl转化是一种可供选择的方法，转化率是102到103cfu/ug。
主要过程为： 取过夜活化培养的菌液按1：1000接种于15ml新鲜的YPD液体培养基，30℃培养至OD600达到0.8-1.0；4℃，4500rpm离心5分钟，用8ml冰预冷的无菌水洗涤菌体，倾除洗涤液，用1mL，4℃，4500rpm离心5分钟，沉淀用50μl冰预冷的100mmol/L LiCl悬浮，最后定容至80-90ml。
LiCl转化 取适量单链鲑精DNA（2mg/mL）煮沸5min，立即置于冰上备用，取上述制备好的感受态细胞12 000rpm，离心15s，吸弃LiCl溶液，按顺序依次加入 50%PEG240ml 1mmol/L LiCl
ml 单链鲑精DNA
25ml 线性化质粒DNA 10 ml(约10mg)用吸头反复吹打，使细胞沉淀与加入的溶液混匀，30℃静置温育30min，42℃热击20-25min，4500rpm离心10min，吸弃转化液，细胞沉淀加1ml YPD培养基于30℃ 200 rpm培养2-4hr，取转化混合液100ml涂布含100µg/mL ZeocinTM 的YPDS平板，30℃培养2-3天。
第三步——挑克隆筛选
Xiang Yang：在protocol中用了许多篇幅来指导这一步，包括如何去通过平板筛选，观测生长速率来确定Mut表现型等。这个过程需要3到5天，而我一般只用用了4个小时进行PCR（AOX引物）筛选。
leslie：完成转化后就是克隆鉴定的过程了，包括高拷贝筛选，PCR鉴定和表型鉴定的过程，其中我做的比较多的是PCR鉴定（因为比较快），具体过程protocol上说的很清楚，其实也很简单，就是冻融破菌进行菌落PCR，但是其中许多具体细节问题也挺让人头痛的，第一就是破壁的问题，许多人用PCR方法进行鉴定都无法得到结果，甚至在表达出了以后还是无法得到这张鉴定图片，主要原因之一就是无法正常释放酵母基因组，一般通过培养菌然后进行沸水和-20℃冷冻循环过程裂解细胞在目的蛋白片段比较合适的范围以内是可以得到好的结果的，但是有时候片段过长，模壁就会阻碍扩增，所以我们实验室会用蜗牛酶（很便宜的酶来的）来帮助溶菌，我看许多实验室也会这么做，不过加入的时间不同而已，其次也有奢侈的用试剂盒的。
第二就是是模板量，个人建议模板真的不要加太多了，按照说明书的上的5ul我觉得还是多了，而且建议总体积不用这么大，当然加入模板的量也与自己培养菌的浓度以及用来冻融的菌数量有关。其次是假阳性和假阴性结果，在Mut-和Mut+情况是不一样的，如果用的是5'AOX引物，KM71H会出现3.6kb的片段，而Mut+则会出现AOX1基因原本长度的片段——大约长2.2kb，因此如果的基因片段长度相似，要注意区分。建议PCR过程中使用多对引物进行反应，包括自己基因的，α-factor的，5'AOX的，都可以，反正各种对照多了有利于比较——当然前提是你不能晕了头。
掉了毛的鸵鸟：巴斯德毕赤酵母包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子的转录终止子(5’AOX1和3’AOX1),他们被多克隆位点分开,外源基因可在此插入,此外，载体中还包含组氨酸脱氢酶基因(HIS4)选择标记（HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使组氨酸缺陷型宿主（his4）恢复野生型.HIS4区或AOX1区位点的整合都使转化子具有HIS4基因，因而可利用表型差异进行筛选，酵母GS115具有组氨醇脱氢酶缺陷型基因his4，可接受含HIS4的载体而具有HIS＋表型以筛选转化子.）及3’AOX1区,当整合型载体转化受体菌感受态细胞时,他的5’AOX1和3’AOX1能与染色体上的同源基因重组,从而使整个载体和外源基因插入到受体菌染色体上，在加入甲醇作为唯一碳源的培养基中,外源基因在5’AOX1启动子的控制下表达.在载体中引入Tn903Kanr基因(抗G418)有助于筛选高拷贝转化子,转化子的拷贝数与抗G418的能力有关,通过筛选抗G418能力强的酵母即可获得高拷贝转化子.外源基因是以同源重组的方式插入到酵母菌的染色体中,因此不易丢失，多次传代后酵母仍能稳定表达外源蛋白，具有良好的遗传稳定性.第四步——表达
Xiang Yang：将你的克隆在YPD培养基中培育到OD600值达到6.0，就可以离心收菌。用表达培养基（比如BMMY）重悬沉淀，在30ºC培育过夜。
leslie：筛选鉴定出自己的重组子可以说什么都不能证明，还是要看这一步的酵母表达，有许多人在酵母表达上花费了大量的时间——不同于大肠杆菌的两天出结果，一次毕赤酵母的表达就需要起码一周的时间，筛选了上百上千的克隆，但是仍然是竹篮打水一场空，我个人建议如果在筛选完3批以上就可以放弃这一批转化的酵母菌，另外调整进行重新转化。
另外刚开始的时候可以用小量表达，可以用5ml：生长慢型，生长快型，阴性对照（空质粒），阳性对照（可以是曾经表达成功的重组子）和没有进行转化的酵母菌的单克隆，BMGY中培养到OD值2-6，离心收菌（如果怕污染或者麻烦，可以放置酵母菌一段时间，一半为20-30分钟，让菌沉淀下来，小心倾倒去上清培养基获得菌），转入BMMY中诱导表达，这些步骤都需要在超净工作台里进行，如果要区分是否染菌，可以取一些到显微镜下观察，或者闻气味（酸甜的是酵母），观颜色（乳白色的是酵母）。除此之外，如果是小量表达，有可能会在没有达到4天的时间培养基就干了，所以可以适当补充一些，以及在摇床里放置盛有无菌水的深口瓶，来保持摇床里湿度。
诱导物甲醇注意要在超净台中打开，可以分装到灭过菌的瓶子中——当然甲醇是不能灭菌的，而且也要注意在用酒精灯过甲醇瓶口的时候要小心，如果真的引起爆炸那可就损失大了。另外如果觉得每天添加甲醇麻烦，也有人用一次性注射器透过纱布添加甲醇，这个方法可能会造成染菌，慎选。说到纱布就想到了通气性问题，酵母在无氧和有氧的情况下都可以存活，但是在甲醇诱导的情况下毕赤酵母用的是醇氧化酶，自然氧气量对于这一基因的表达影响重大，但是由于害怕感染大肠杆菌，纱布裹的也不能太少，最好专辟出一个摇床进行三十度酵母表达，这样可以考虑将纱布减少到3—5层，同时需要注意的是摇瓶内菌液体积不要超过10-30%。
每天取样出来进行SDS-PAGE电泳鉴定，能这样最好，不过每天做胶跑胶染色真的很麻烦，可以汇集一批同时跑，不过样品一定要煮过冻存，而且每次取样不要反复冻融，最好分装保存——因为蛋白经煮沸变性会不稳定，容易降解。另外为了防止蛋白在分泌出来的过程就降解了（特别是小分子蛋白），也可以通过调节培养基pH值抑制蛋白水解酶的活性（这一方面说明书讲解得详细），还可以加入酪蛋白氨基酸等保护物质，竞争性抑制蛋白水解酶 的活性来防止表达产物降解。
如果使用的是分泌型培养基，按道理收集培养基上清就可以进行下一步分析了，但是由于培养基中的蛋白浓度PAGE胶一般是检测不出来的——除非你的表达蛋白量非常大。所以需要进行浓缩，方法有TCA法，硫酸氨盐析，PEG沉淀，透析，超滤等等，当然最简单的就是煮沸蒸发水分浓缩了。另外跑胶的时候同时对照酵母胞内蛋白，以防没有分泌出来。SDS-PAGE的配置参见分子克隆，注意你的蛋白大小与胶的浓度的对应性，如果小到20kD以下，可以考虑用tricine胶，不过是个需要全盘重新准备的过程，要考虑清楚。如果选用的载体是带有信号肽的，虽说是分泌表达好纯化，但实际上毕赤酵母本身还是有本底表达的，而且有时候会造成假阳性，所以最后表达过程需要用Western blot或者Elasa，通常都是用WB，具体的细节可见Western Blotting前传：想成为高手吗？系列文章，另外要提一句的是，如果本身蛋白没有合适抗体（如果是利用从大肠表达出来的蛋白做出的抗体也有可能与用真核系统表达出来的蛋白无法发生免疫作用），可以选用anti-myc或者anti-his的，前提当然是你的蛋白没有提前终止。
其它在表达中可能出现的情况包括表达量低，没有分泌表达（针对pPICZa系列），头两天蛋白量较大，无法重复，表达出来的蛋白偏大等等，需要分各个方面分析原因，比如蛋白明明加上了信号肽，但是就是无法分泌出来，这可能是蛋白结构在通过细胞膜的时候受到了阻碍，可能需要重新转化，更换线性化位点或者更换菌株；如果蛋白表达第一天较高，但是之后越来越少，这很有可能是蛋白降解了或者产生了竞争表达；毕赤酵母无法重复的问题比较严重，许多情况下在第一次获得了高量表达之后就再怎么也重复不了这个结果，遇到这种情况真是令人非常痛苦，可是除了重新摸索条件还能怎么样呢？而表达出来的蛋白分子量偏大则是个正常现象，除了糖基化以外还有其它原因，比如二聚体，这些需要进行WB或进一步实验验证。
第五步——发酵和产物纯化
Xiang Yang：我用的是HisTraP Columns（GE Healthcare），经过简单的纯化之后我可以得到90%的目的蛋白。我的目的蛋白是一个大小为45kDa，可以通过二硫键形成反向平行二聚体(antiparallel homodimer)的糖蛋白，经过纯化，我通过一个细胞增殖实验(cell proliferation assay)检测了其活性，结果表明表达出来的蛋白在体外有完全的活性。并且我也在体外利用受体分析了蛋白结合活性，与对照(通过大肠杆菌和Bacular细胞未带tag的蛋白)相比，his-tag有一点副作用。
伊可丽：由于在摇瓶培养中巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的水平往往不能准确地反映罐发酵中的表达情况，使之成为令人头痛的问题。主要原因是在摇瓶培养中，培养液的pH值无法控制，培养物通气不充分及无法控制添加碳源的最适速率。但是为了避免对每一个表达菌株进行繁琐的发酵罐培养条件的实验，仍需摸索表达菌株的摇瓶培养条件，使其产物的表达量与预期的发酵罐培养结果相近。
总而言之，EasySelect系统是一个便于操作的酵母表达系统，我已经使用这一系统表达过15个类似物了，每一个我都获得了超过1mg/1升培养液的纯化蛋白。
第三篇：酵母双杂交技术研究进展
酵母双杂交技术研究进展
提 要 酵母双杂交技术是一种有效的真核活细胞内研究方法，在蛋白质相互作用的研究方面得到了广泛的应用并取得了许多有价值的重要发现。作为一个完整的实验系统，它自建立以来经过了不断的改进与完善，不仅进一步提高了实验结果的可靠性与精确性，而且在此基础上又发展了反向双杂交，三杂交及核外双杂交等多项技术。这些都将对功能基因组学和蛋白质组学的研究起到促进作用。
0 引言
随着分子生物学研究尤其是人类基因组计划的迅速发展，大量关于基因结构的信息不断涌现，对这些信息进行系统研究以了解新基因功能的要求也日益迫切。这不仅需要利用计算机进行生物信息学的分析和预测，而且必须结合生物学实验获取证据。为适应同时对多个基因或蛋白进行研究的发展趋势，已出现了很多新技术，如DNA微阵列技术（DNA micoarry）,基因表达的系列分析（SAGE）,肽质谱分析法，蛋白双向胶电泳技术及酵母双杂交技术（Yeast Two-Hybrid System）等。其中酵母双杂交技术以其简便，灵敏，高效以及能反映不同蛋白质之间在活细胞内的相互作用等特点在基因功能的研究中得到了广泛的应用。酵母双杂交技术的基本原理
1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统〔1〕。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。
酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。酵母双杂交技术的应用现状
酵母双杂交技术产生以来，它主要应用在以下几方面：(1）检验一对功能已知蛋白间的相
互作用。(2）研究一对蛋白间发生相互作用所必需的结构域。通常需对待测蛋白做点突变或缺失突变的处理。其结果若与结构生物学研究结合则可以极大地促进后者的发展。(3)用已知功能的蛋白基因筛选双杂交cDNA文库，以研究蛋白质之间相互作用的传递途径。(4)分析新基因的生物学功能。即以功能未知的新基因去筛选文库。然后根据钓到的已知基因的功能推测该新基因的功能。常见问题的解决与改进
酵母双杂交系统应用中常遇到的问题一是假阳性较多，二是转化效率偏低。所谓假阳性就是:在待研究的两个蛋白间没有发生相互作用的情况下,报告基因被激活。主要原因是由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用,或者这种融合蛋白的激活作用被外来蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合,则也可单独激活报告基因的表达。因此,为排除假阳性就需要作严格的对照试验。应对诱饵和靶蛋白分别作单独激活报告基因的鉴定。目前几个公司推出的酵母双杂系统都采用了多个报告基因,且每个报告基因的上游调控区各不相同,这可减少大量的假阳性。另外,报告基因通常整合到染色体上,可以使基因表达水平稳定,消除了由于质粒拷贝数变化引起基因表达水平波动而造成的假阳性。即使根据严格的对照实验证明确实发生了蛋白间的相互作用，还应对以下方面进行分析：
(1)这种相互作用是否会在细胞内自然发生,即这一对蛋白在细胞的正常生命活动中是否会在同一时间表达且定位在同一区域。
（2)某些蛋白如是依赖于遍在蛋白的蛋白酶解途径的成员,它们具有普遍的蛋白间的相互作用的能力。
（3)一些实际上没有任何相互作用的但有相同的模体(motif)如两个亲a-螺旋的蛋白质间可以发生相互作用。十年来,酵母双杂交技术一直在消除假阳性方面不断改进,并且已取得较好的效果。
在酵母双杂交的应用中有时也会遇到假阴性现象。所谓假阴性，即两个蛋白本应发生相互作用,但报告基因不表达或表达程度甚低以至于检测不出来。造成假阴性的原因主要有两 方面：一是融合蛋白的表达对细胞有毒性。这时应该选择敏感性低的菌株或拷贝数低的载体。二是蛋白间的相互作用较弱，应选择高敏感的菌株及多拷贝载体。目前假阴性现象虽不是实验中的主要问题,但也应予以重视。
转化效率是酵母双杂交文库筛选时成败的关键之一，特别是对低丰度cDNA库进行筛选时，必须提高转化效率。转化时可采用共转化或依次转化，相比之下共转化省时省力。更重要的是如果单独转化会发生融合表达蛋白对酵母细胞的毒性时,共转化则可以减弱或消除这种毒性。一种更有效的方法是将诱饵蛋白载体与靶蛋白载体分别转入不同接合型的单倍体酵母中,通过两种接合型单倍体细胞的杂交将诱饵蛋白与靶蛋白带入同一个二倍体细胞。目前很多机构建立了大量的cDNA文库和基因组文库，但这些文库大多无法直接用于双杂交系统的筛选。而文库的质量对于转化和筛选又非常关键。因此，大量构建适用于酵母双杂交的文库非常必要。现已出现一种采用体内重组技术来达到这个目的的方法。酵母双杂交技术的新发展
酵母双杂交技术在应用中发挥了巨大的作用，但人们也注意到了它有一定的局限性。为此发展了多种适应不同目的需要的改型的双杂交技术。
反向双杂交技术 在研究中检测并鉴定出那些能阻断两个蛋白间相互作用的因素有重要意义。在研究那些能使相互作用被阻断的因素(如寻找哪些结构域上发生突变可使相互作用中
断或那些分子可以阻断相互作用)时，传统的双杂交技术有较大的局限性。因此，反向双杂交系统(Reverse Two-Hybrid System)应运而生。这项技术的特点是采取了反选择筛选策略。根据反选择设计的不同，大致可以分为两类。一类是用便于反选择的URA3或CYH2基因作为报告基因。URA3基因编码尿嘧啶合成途径中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脱羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）转变为细胞毒性物质，使细胞无法生长。反之，在能生长的细胞中，外界因素已使蛋白间的相互作用不能发生，而我们想知道的正是这些因素。因此，只要对存活的克隆进行检测就可以得到结果。Vidal等人用这种技术发现了影响转录因子E2F1中与DP1相互作用必需区内的点突变。另一类是将常规报告基因(如HIS3)置于大肠杆菌转座子Tn10编码的tet-抑制因子(TetR)/操纵基因控制之下。待测蛋白之间发生相互作用后首先激活tet-R基因表达抑制因子TetR,TetR结合到tet操纵基因后就抑制了报告基因的表达，结果转化子不能生长。只有当待测蛋白之间的相互作用被某种因素所阻断而无法激活tet-R基因时，报告基因才能摆脱tet操纵基因的控制而表达，使转化子获得在选择培养基上生长的能力。Shih 等人利用这种方法鉴定出cAMP-应答元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位点的Ser133突变会阻断其与辅助激活因子(CREB结合蛋白)的相互作用。
三杂交技术 在许多细胞内信号传递过程中，两个蛋白间的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究这些大分子对蛋白间相互作用的影响过程中发展了一种新的技术系统——三杂交系统(Three-Hybrid System)，其本质与双杂交是相同的，只是需通过第三个分子的介导把两个杂交蛋白带到一起。例如小配体三杂交系统(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以渗透的二聚体化学诱导物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作桥梁，将AD和BD融合蛋白连接到一起，激活报道基因的表达。研究较多的是免疫抑制剂FK506。Belshaw等将FK506与环孢菌素A(Cyclosporin
A)构建成异源二聚体，它能把分别与FK506和环孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活报告基因。Licitra将FK506与地米塞松(dexamethasone)通过共价键连接成二聚体。通过实验进一步证实了FK506与蛋白FKBP-12间的特异性相互作用，表明用这种方法鉴定蛋白与小分子间的相互作用是切实可行的。RNA与蛋白之间的相互作用是许多细胞生命活动的基础，例如mRNA的翻译，早期发育以及RNA病毒的感染等。然而可用于这方面研究的简便方法却很少。RNA三杂交系统(RNA Three-Hybrid System)的建立为分析RNA与蛋白之间的相互作用提供了有效的手段。这个系统主要是由一个RNA分子和两个都能结合该RNA的蛋白质组成。此RNA的一部分与一个已知蛋白结合后就可利用它的另一部分去筛选新的RNA结合蛋白。因此这种技术既可检测由RNA介导的两个蛋白质之间的相互作用，也可筛选鉴定新的蛋白结合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突变体RevM10与Gal4 DB域融合作为诱饵蛋白，利用该RevM10蛋白能识别并结合其靶RNA中Rev蛋白反应元件(Rev responsive element,RRE)的作用去筛选同样也能与此RNA结合并已与Gal4 AD域融合的未知蛋白。根据同样的原理，如将一个已知RNA与RRE融合形成杂合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作为诱饵，便可用于筛选该RNA结合蛋白的cDNA克隆。SenGupta 等利用RNA噬菌体衣壳蛋白能识别结合其基因组内一种21核苷酸的RNA茎环结构的特性，将RNA噬菌体衣壳蛋白与Lex DB域融合，构建成可用于寻找体内的RNA结合蛋白的酵母三杂交系统。
核外双杂交技术 在传统的酵母双杂交系统中，蛋白之间的相互作用是在细胞核内发生的。因此,它不能检测某些在核外蛋白之间的相互作用。为了克服这种局限性，近年来有人建立了核外双杂交技术。其中SRS 和USPS就是这种技术的两个代表。SRS也称Sos蛋白召集系统(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分别将待测蛋白X与哺乳动物细胞的一种鸟苷交换因子(EGF)Sos蛋白融合；将Y蛋白与锚定在酵母细胞膜上的Src肉豆寇烯化信
号蛋白融合，并使它们共表达于一个cdc25-2基因温度敏感型突变的酵母菌株内。由于该菌株中cdc25-2基因编码的EGF蛋白在36℃条件下不能激活细胞膜上的Ras蛋白，Ras途径不通。所以细胞无法在36℃条件下生存。但如果待测蛋白X与Y之间发生相互作用就能把Sos蛋白带到细胞膜上并激活附近的Ras蛋白，从而打通Ras途径，使该菌株获得在36℃条件下生存的能力。Aronheim等用此技术鉴别出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分离到了一个AP-1抑制因子JDP2。USPS也称为基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的设计是根据这样一个事实，即真核细胞中遍在蛋白与某一蛋白之间新生成的融合会被遍在蛋白特异的蛋白酶(UBPs)迅速切开，但这种切割只有当遍在蛋白正确折叠时才会发生。研究发现，遍在蛋白基因的N端和C端这两部分即使分离，只要共表达与同一个细胞内，它们仍能正确折叠。将待测蛋白X与带有点突变的遍在蛋白N端片段融合，将待测蛋白Y与下游接有报告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它们共表达与同一个细胞内。因遍在蛋白N端片段内含有点突变，它与C端片段之间不能自然形成正确的折叠。只有当蛋白X和Y之间发生相互作用时才能克服点突变的影响，使遍在蛋白的两端形成正确折叠，从而引来UBPs切除与C端片段连接的报告蛋白。此技术建立之初是通过Western blot检测有无被切下的报告蛋白来判断待测蛋白之间是否发生了相互作用的，所以操作比较繁琐，不便于推广。最近有人对它作了改进，以一种融合的转录激活因子PLV作为报告蛋白。PLV一旦被从遍在蛋白C端片段上切下，它就会进入细胞核内激活特定的报告基因，如：LacZ 和HIS3等。这样就可以根据转化细胞是否生长及显色来判断待测蛋白之间有无相互作用。因此极大地简化了操作步骤，提高了筛选效率。酵母双杂交技术发展与应用的趋势
在后基因组时代更具意义且更能发挥酵母双杂交技术的领域是研究生命活动中的网络调节。第一个具有开拓性的工作是Bartel利用酵母双杂交技术建立了一个T7-噬菌体的网络调节图(linkage-map)。Fromont-Racine等对筛选到的阳性克隆进行鉴定测序，并将它们分为5类，然后对其中的四类(非编码序列除外)通过15轮的筛选与分析，绘制出一张综合了酵母蛋白相互作用的全局性信息图。这是以往的实验所难以获得的。
为适应功能基因网络调控研究的需要，CLONTECH公司在Merck-Washington大学的EST项目研究成果基础上，采用了与传统建库方式完全不同的细胞内同源重组方法，以高通量规模构建了一种阵列模式的酵母双杂交cDNA文库。它主要有以下特点：
(1)来源于多种组织器官和细胞系，因此含有几乎所有基因的cDNA；
（2）所含各种cDNA的丰度趋于平衡；
（3)含有较长的插入序列，但不是全长cDNA序列。
这样既避免了5’非编码区可能存在的终止密码阻碍融合蛋白的翻译，又保证了表达出的蛋白构象接近于天然。这种建库方法不仅减少了工作量，而且在双杂交中新发现的相互作用蛋白种类也明显增多。
最后，有必要指出的是，酵母双杂交技术必须与其它技术结合才能有利于对实验结果作出更为完整和准确的判断。
胡文峰
2007040380106
第四篇：毕赤酵母表达系统简介
巴斯德毕赤酵母及启动子
1.1 毕赤酵母表达系统简介
随着蛋白异源表达的飞速发展，越来越多的表达系统被建立并得到应用。酵母作为单细胞真核生物，因具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力，仍表现出不可比拟的优势。以甲醇营养型酵母（Methylotrophic yeast）-毕赤酵母为代表的第二代酵母表达系统，是近年来被公认的最有效的外源蛋白表达系统之一，已有多种外源蛋白在该宿主系统中获得了成功表达[1]。作为生产外源蛋白的重要宿主菌，依靠其各种不同功能的表达载体，已经得到广泛的应用。表达的蛋白质包括酶、膜蛋白、抗原、抗体和调节蛋白等[2,3]。
毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真表达系统。它是甲醇营养型酵母菌，有两个乙醇氧化酶（alcohol oxidase，Aox）码基因AOX1和AOX2，两者序列相似，AOX1基因严格受甲醇诱导和调控。当甲醇为唯一碳源时，AOX1启动子可被甲醇诱导，启动乙醇氧化酶的表达，从而用甲醇进行代谢[4]。含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的因的表达。
随着Invitrogen公司开发的一系列毕赤酵母表达试剂盒的应用，目前用该统已成功表达出了数以千计的来自细菌、真菌、原生动物、植物、无脊椎动物、包括人在内的脊椎动物以及病毒等的具有生物学功能的外源蛋白或蛋白结构[5,6]。1.1.1 P.Pastoris表达载体及其元件
由于毕赤酵母没有稳定的附加质粒，表达载体需与宿主染色体发生同源重组，外源基因表达框架整合于染色体中以实现外源基因的表达整合表达的优点在于保持外源基因稳定性并可产生多拷贝基因。典型的毕赤氏酵母表达载体含有醇氧化酶基因的调控序列，主要的结构包括：5′AOX1启动子片段、多克隆位点(MCS)、转录终止和 polyA形成基因序列(TT)、筛选标记(His4或 Zeocin)、3′AOX1基因片段，作为一个能在大肠杆菌中繁殖扩增的穿梭质粒，它还有部分pBR322质粒或COLE1序列。如果是分泌型表达载体，在多克隆位点的前面，外源基因的5′端和启动子的3′端之间插人了分泌作用的信号肽序列。在这个分泌信号的引导下，外源蛋白在内质网和高尔基体中经修饰和加工后能够由胞内转移至胞外，将成熟的蛋白质分泌到细胞外。目前所采用的表达体均为穿梭质粒，先在大肠杆菌保存、复制、扩增，然后线性化后被导入宿主母细胞。
常用的表达载体包括胞内表达载体及分泌表达载体如下表：
表1 常用表达载体及其选择标记
表达方式 载体名称 pPICZA,B,C
胞内表达 pPIC6A,B,C PGAPZA,B,C
启动子 AOX1 AOX1 GAP
选择标记 Zeocin blasticidin Zeocin pPIC3.5K PAO815 PFLD pPICZαA,B,C pPIC6αA,B,C 分泌表达 PGAPZαA,B,C pPIC9k pFLDα
AOX1 AOX1 FLD AOX1 AOX1 GAP AOX1 FLD
His4 kanmycin ampicillin His4 ampicillin Zeocin ampicillin Zeocin blasticidin Zeocin
His4 kanmycin ampicillin Zeocin ampicillin
1.1.2 毕赤酵母表达系统的优势
自从1987年Cregg等首次用巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）作为宿主表达外源蛋白以来,作为一种新的高效的表达系统，毕赤酵母越来越引起人们的重视，到1995年，已有四十多种外源蛋白在该宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，它除了具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性之外，同酿酒酵母等传统真核表达系统相比，它还具有以下的优势:（1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达；
（2）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖；
（3）外源蛋白基因遗传稳定。外源基因能以高拷贝数整合到毕赤酵母基因组中，不易丢失并能够到高表达菌株；
（4）作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能。
1.2
AOX启动子序列分析现状
启动子是基因表达调控的顺式元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。启动子在转录水平上的重要作用，不仅决定了基因的表达水平，也决定了基因表达的时空顺序[7,8]，可以说启动子活性的高低在很大程度上影响着基因表达最终产物的表达水平。所以找到一个转录启动功能较好的启动子，对于外源蛋白高效表达的研究具有重要的意义。目前，已有不少的启动子被克隆和功能鉴定[9]。
新型疫苗主要包括亚单位疫苗、基因缺失疫苗、核算疫苗、重组活载体疫苗等，尽管大多数被认为较为安全，但往往都需要免疫刺激性强的佐剂来提高免疫效果。菌蜕疫苗可通过发酵大量生产且无需加入佐剂即可获得坚强的免疫效果。
目前，毕赤酵母表达系统中较常用的表达载体有两类[10]：种是分泌型表达载体(如pPIC9K)，另一种是组成型表达载体(如pGAPZB)。前者(以pPIC9K为例)含有的醇氧化酶启动子pAOX1，可以在甲醇的诱导下高效表达。该载体自身携带有α 分泌信号肽，可以将外源蛋白直接分泌到胞外。后者(以pGAPZB 为例)含有三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子pGAP，可以在多种碳源如葡萄糖、甘油、甲醇或油酸条件下表达外源蛋白，且不需添加诱导物[11]。
在启动子功能的研究中，多数是利用报告基因的表达量来达到功能研究的目的，常用的报告基因有绿色荧光蛋白GFP(green fluorescent protein)、红色荧光蛋白RFP(red fluorescent protein)β-葡糖醛酸糖苷酶GUS(β-glucuronidase)和氯霉素乙酰转移酶CAT(chloramphenicolacetyltransferase)等[12,13]。在前期的工作中，克隆了启动子pScgpd，并在巴斯德毕赤酵母中研究了AOX1 启动子的功能[14]。实验以人血清白蛋白(HSA）作为报告基因，在Pichia pastoris GS115中表达。
到目前为止，利用AOX启动子表达的蛋白有很多，例如：在AOX1(醇氧化酶)启动子调控下，类似天然抗菌肽大小的magainin 及cecA-mil 蛋白获得分泌表达[15]；人前列腺特异性抗原的表达[16]；重组木糖异构酶的分泌和表达[17]；人骨唾液酸蛋白的表达等[18]。
第五篇：数据机房供电概述及系统设计
机房供电概述及系统设计
（一）机房供电概述
1.供配电系统
供配电是数据中心机房的生命线，这句话一点也不夸张，因为离开了电我们的机房是连一分钟也运行不了的，因此要建一个好的机房，首先要将供配电解决好。一般要求主要开关设备应该被设计成适合增容、维护和冗余，并提供双倍的或隔离的冗余配置。设计时应该考虑到开关装置、总线或断路器维护的方便性。瞬时电压浪涌抑制(TVSS)应该被安装在电力分配系统的每一级上，并且采用适当的规格，以便能够抑制可能发生的瞬时的能量。
不同类别机房对电源的要求：
A类机房：停电后会产生重大损失和社会影响，要求建立不停电电源系统。
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B类机房：停电后会产生一定损失和社会影响，要求建立备用电源系统。
C类机房：停电后不会产生大的陨失和社会影响，可按一般用户配置。
2.市电输变电系统
对于一级负荷机房应该有从不同变电站供给的双路供电，加上柴油发电机，通过应急电源柜切换后供给机房内的UPS和精密空调机组，ATS切换最好做在机房配电系统就近，切换后以最短距离输送给机房设备。备用发电机系统是至关重要的一个因素。即便其中有一个故障时，也能够直接地向计算机和其它设备提供一个理想质量和容量的电力供应。发电机的设计应能够处理UPS系统或电脑设备负荷的谐波电流。备用发电机应该提供备用电源给所有的冷却设备，避免负载设备温度上升以及停止运行。如果发电机不支持这些系统，它们所带来的益处就显得很有限。在自动控制发生故障时，发电机应该能够采用手动控制。应该给每一个发电机输出提供瞬时电压浪涌抑制(TVSS)装置。
发电机燃料应该是柴油，这样启动比较快。考虑现场储藏量的要求，通常需要保证4小时到60天。并且需要给所有燃料储藏系统提供一个远程的燃料监控和警报系统。由于微生物增长是柴油燃料最常见的故障，应设计有便携的或安装固定的清洁系统。在寒冷的季节，2 / 15
需要考虑给燃料系统加热或循环，避免柴油燃料胶凝。当确定好现场燃料储藏系统的容量时，同时需要考虑燃料供货商在紧急情况时的反应时间。
在发电机周围提供UPS照明电源或单独的电池，在发电机和装置同时发生故障时提供照明。同样，在发电机周围也应该提供UPS供电插座。
在组件的分别测试之外，备用发电机系统、UPS系统和自动转换开关应该作为一个系统一起测试。在冗余系统测试单个组件的故障时，冗余系统是为在一个组件发生故障时能够继续起作用而设计的。此外，一旦数据中心开始运行，应该定期测试系统，确保各个组件能够继续正常地发挥作用。
3.机房用电的配置
配电必须充分考虑到今后的发展余量。如lBMP550A服务器，每台高配功率为lKW，一个机柜若装6台就是6KW，假如预期机房在今后会装到最多四十个机柜那就是240KW；UPS一般可按照设备容量的1.3倍计算，就是312KVA，再加上适当的余量，选用3台200KVAUPS冗余供电是一种较为理想的方案。
UPS的供电总容量2台200KVA冗余UPS可少算一台400KVA，精密空调单台的实际耗电功率为20KW，假如配置10台精密空调的话，总功率为10*20引200KW，机房UPS、空调总功率为：400+200=600KW，3 / 15
机房供配电要考虑到日后的发展余量等因素，一般可按照UPS与空调容量总和的150%配置，就是600*1.5=900KW，另外再加上新风机4KW、照明等的用电算8KW，则机房总的配电容量应为912KW其中由应急柜供电的为UPS和精密空调。
4.作为国家A类标准的计算机机房都要求具备双路市电电源接入供电，但双路电源的切换开关（ATS0最好要安装在UPS输入的附近，这样接法相比在远端的配电柜切换来，可以消除从配电问到UPS之间动力线路，开关等引起的故障）。机房供配电的安全可靠性牵涉的问题很多，从市电输入到UPS，从UPS输出到各级ATS、各级开关然后到输出端的各个接线盒及插座，每一个环节都十分重要，特别是处于供配电上游的UPS输入总开关和输出总开关以及ATS。其中任何一个一旦出现问题，都会引发严重的停电事故，后果将不堪设想，因此其配置问题必须慎之又慎，另外对于动力电缆的配置问题也很值得研究，由于机房内大量非线性负载的存在，使得谐波电流很大，所以一般机房刚建好时零地电压都很低，而设备装满时零地电压都会大大增加•我们的有效办法之一就是降低零线的电阻，以前我们的零线、地线的线径一般都比相线要，小很多，但实践中三相配电线路内，相线上的3的整数倍谐波在中性线上会叠加，使中性线的电流值可能超过相线上的电流。但是从隆低谐波电流和零地电压的目标出发，我们应该将零线和地线的线径选得与相线相同甚至更粗一点。
（二）负荷等级和额定容量
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依据计算机的用途和性质以及负荷分级的规定，采取相应的供电技术:对于一级负荷采用一类供电，重要机房供电属于一级负荷，按一级负荷的供电要求，必须保证两个以上独立的电源点供电，采用两条专用干线引进，两路独立电源在末端互投，建立不停电系统，而且要保证供电的质量;对于二级负荷采用二类供电，建立带备用的供电系统;对于三级负荷采用三类供电，按一般用户供电考虑。
机房用电系统要求提供的电源额定容量一般以两种方式给出:
(1)确定机房用电系统的总功率大小或机房用电系统的总电流。这是选取电力设备、总断路器、供电电缆、机房的总发热量以及精密空调时都必需考虑的问题。通常供电总功率应留有不少于25%的余量。
(2)确定各机柜、分机、设备等所要求的工作电流。这对设计计算机房的配电柜、选取合适的传输导线和分路开关也是必需的。针对电气设备额定电流，在整定总断路器和分路开关时要注意电气设备的启动电流值。在进行方案设计时，有些经验数据可供估算时参考，如:l)UPS功率:主机房可按350W~400W/㎡计算;照明用电可按l5W~20W/㎡计算。
2)空调机电功率要根据机房制冷量考虑。主机房制冷量按400W/㎡计算，辅助机房制冷量按300W/m2计算，然后再根据电气设备不同的效率和换算系数，确定空调系统用电负荷量。
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（三）防雷和接地
接地极的接地电阻，当系统采用联合接地时，R≤10Ω(北京地区可按0.5Ω考虑);当采用单独接地时，R≤4Ω。在总配电室要做总等电位连接，各楼层的智能化系统设备机房、楼层弱电间、楼层配电间的接地，采用局部等电位联接。贯穿弱电竖井的接地干线，应当是镀锌扁钢，截面尺寸不小于一40mm×4mm。
机房的重要设备和配电柜(箱)，必须按GB50057一1994(2000年版)，并安装电涌保护器、做好等电位连接。
机房供电系统设计
机房电气工程中，安全、可靠是机房供配电系统设计的关键出发点，由于机房的供配电系统、照明、设备防雷、机房接地、UPS不间断电源等与一般的强电设计有所不同，又与弱电专业的十几个子系统密切相关。因此，它们处于强、弱电专业设计分工的接合部。
机房在智能建筑中的重要性确定了安全、可靠是供配电系统设计的关键出发点。由于机房的供配电系统、照明、设备防雷、机房接地、UPS不间断电源等与一般的强电设计有所不同，又与弱电专业的十几个子系统密切相关。因此，它们处于强、弱电专业设计分工的接合部。有两种专业技术规范在这些界面上，有些规定也不十分明确，带来的问题是:机房各子系统的设计深度差距较大；主要弱电机房预留的位置不合适，面积过大或偏小；弱电竖井中遗漏接地干线和电源插座；
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UPS电源容量、支持时间长短不一；UPS电源供电方式是采用集中式还是分散式不能确定；各子系统的供电和接地方式不规范等。一部分设计文件中，还经常发现有文字说明描述不清楚、系统图和平面图五花八门、图形符号不按现行制图，标准绘制等问题。
机房常用的供电方式不间断电源(UPS)供电。由于采用了脉宽调频技术、高效功率器件的成熟、微处理器的发展等因素，不间断电源已经成为计算机房供电的主要手段。不间断电源最大的特点，在于不间断性，而且能最大限度地提供稳定电压，隔离外电网的干扰。外电网一旦停电，UPS能在设备所允许的极短时间内(微秒至毫秒级)自动从备用能源经逆变器变换成电压、频率和相位都与原供电电源相同的电能继续向计算机供电。或者平时由逆变器供电，只在逆变器发生故障时，由静态电子开关自动将计算机瞬时切换到外电网供电或切换到另一台与之并联的UPS上，实现不间断供电。UPS提供的电源具有较高的电压和频率稳定性，波形失真也较小，干扰更优于外电网，是计算机系统最理想的供电方式。几乎所有的重要计算机设备都采用UPS供电。
(一)电源布置和系统设计
设计和施工必须充分了解并掌握供电对象。充分搜集机房设备和系统的资料才能做好电源布置和系统设计，从而合理地满足机房用电需要。
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机房应设单独电源管理间，用符合防火要求的隔墙与弱电设备隔离，避免电源管理间操声、蓄电池酸碱液渗漏和电气火灾等事故传播到计算机设备机房内。计算机设备机房与电源管理间中间设单扇朝电源管理间方向开启的连通门，还可考虑设置玻璃观察视窗。电源管理间应做水泥地面，为防潮、防湿可砌高0.3~0.5m的水泥平台搁置配电柜和UPS电源等。
UPS主供:主机设备、网络设备、保安监控设备、多媒体、消防、应急照明等。
市电主供:空调设备、普通照明和给排风、维修插座、一般动力等。
(二)动力供配电系统
由总配电柜馈出的动力供配电系统采用50Hz交流电，380/220V三相五线电源，TN-S接地方式，零线和地线分开设置且零地线之间电压小于lV。动力配电柜、照明配电箱采用放射式配电直接配至各用电设备。
机房内所有线缆须设计钢制桥架、线槽或钢管敷设。由于精密空调的供电电流大、负载动态范围宽，为防止干扰，应考虑另选路径单独敷设电缆。
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动力配电柜(箱)具有火警联动保护功能，出现火警时可与消防系统联动及时切断电源，关闭防烟防火阀，并且在值班室安装手动电源切断装置。动力柜、照明箱内的开关和主要元器件采用进口产品，并设置有效的防雷措施。有条件时，大型机房最好采用专用电力变压器供电。
(三)UPS供配电系统
UPS供配电系统的供电范围是计算机设备(主机和附属设备)、通信设备、网络设备、保安监控设备、消防系统、应急照明等。UPS输出配电回路(每个配电控制开关为一个回路)需按机房内设备要求设置，小型机/服务器、网络核心交换机及重要路由器要由独立双回路供电，其他计算机设备可用一个回路带3~4个插座，固定于地板下。UPS电源分别送到主机房配电柜(末端)既可靠，又方便使用。还应该考虑为数据中心中关键的负载设备安装电源分配单元(PDU)，这些设施是合并了几个组件功能到一起的一个装置，通常很小，比分开安装几个独立的面板和变压器更有效。如果机房细分为不同的房间或空间，每一个房间或空间是由它们各自独立的紧急电源开关(EPO)所支持，那么这些空间应该拥有自己独立的水平分布区域。
电源分配单元(PDU)集成了独立的变压器、瞬时电压浪涌抑制(TVSS)、输出面板和电源控制的功能，并提供了更多的优点。
一个典型的PDU包括以下组件。
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● 离线变压器双输入断路器应被视为允许连接一个临时接驳，允许维护或资源冉分布时不用关闭关键的负载。
● 变压器:尽可能靠近负载以减少从地线到零线之间的共模噪声，减少电压源接地和信号源接地之间的差别。当变压器位于PDU装置内时，就达到了最近的位置。
● 瞬时电压浪涌抑制(TVSS):当导线长度尽可能的短时，最好低于2OOm皿，瞬时电压浪涌抑制(TVSS)装置的效率将大大地提高了。通过提供在同一个装置中瞬时电压浪涌抑制(TVSS)作为分配面板，可以提高效率。
● 分配面板:可以将面板与变压器安装在同一个机柜中或在需要更多面板的情况下，可以使用一个远程的电源面板。
● 计量、监测、警报、和远程控制当提供一个传统的面板系统时，通常意味着大量的空间要求。
● 紧急电源关闭(EPO)控制。
单点接地总线应该用电力分配单元(PDU)将电源分配到关键的负载上。在需要额外分支电路的地方，面板或PDU“sidecars”可以是次级反馈的。应该提供两个冗余PDU给每个机架供电，每一个PDU最好采用不同的UPS系统供电;提供给单相或三相计算机设备一个可以安装在机架上的快速转换开关或从每一个PDU馈给的静态开关。选
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择性地，可以提供给单线和三线设备，从分开的UPS系统馈给的双馈给静态开关式PDU，尽管这种安排提供稍微少一些的冗余和灵活性。应该考虑用彩色的表示牌和馈给电缆来区别A和B分布，例如，所有的A侧用白色，所有的B侧用蓝色。
一条电路不应该服务多于一个机架，防止一条电路对多个机架产生电路故障。为了提供冗余，每一个机架和机柜应该各自独有的、两个专用的、从两个不同的电力分配单元(PDU)或供电面板来的16A、220V的电路。对于高密度的机架可能要求更高的安培容量，一些新服务器可能要求一个或多个、单相或三相插座，额定电流要求5OA或更高。每一个插座应该用服务于它的PDU或电路号来标识。
(四)配电设备的安装和线路敷设问题
在机房设备布局确定的前提下，按照电气设备用途和设计图纸进行设备安装和线路敷设。
(1)设备安装。机房配电柜、UPS电源柜落地安装;动力配电箱、照明配电箱底边距地1.4m墙上暗装;根据机房内设备负荷容量和分布情况，机柜(箱)内元器件配置作到排列有序、安装牢固、理线整齐、接线正确、标志明显、外观良好，内外清洁。分设单相、三相回路，配用小型真空断路器，如C65N等线路保护开关。箱内设置辅助等电位接地母排。电源柜及其他电气装置的底座应与建筑楼地面牢靠固定。电气接线盒内无残留物，盖板整齐、严密、紧贴墙面。同类电
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气设备安装高度应一致。吊顶内电气装置应安装在便于维修处。特种电源配电装置应有明显标志，并注明频率、电压。暗装照明箱或开关面板安装在机房出入口附近墙面的方便位置。分体空调插座设置在机房内墙面上距地1.8m处。
主机房内应分别设置维修和测试用电源插座，两者应有明显的区别标志。测试用电源插座应由计算机主机电源系统供电。其他房间内应适当设置维修用电源插座。单相检修电源回路要在电源管理间各墙面距地0.3m设置检修电源插座，禁止使用2kW以上大功率电感性电动工具。确需使用这类工具以及三相检修设备，应使用施工移动式配电盘从机房所在楼层附近的动力或照明配电箱接取电源。
(2)线路敷设。供电距离尽量短，主要是从供电安全考虑，电子计算机电源间应靠近主机房设备。主机房内活动地板下部的低压配电线路应采用铜芯屏蔽导线或铜芯屏蔽电缆。机房内的电源线、信号线和通信线应分别铺设，排列整齐，捆扎固定，长度留有余量。UPS电源配电箱(柜)引出的配电线路，穿薄皮钢管或阻燃PVC管，沿机房活动地板下敷设至各排机柜和配线架的背面，经带穿线孔的活动地板引上，穿管保护迸大金属导轨式插座线槽、机柜或配线架。控制台或设备桌后的敷线，用金属导轨式插座线槽并用螺栓固定，安装在设备桌背面距活动地板0.1~0.3m处。
信号线缆在活动地板下从机柜、配线架至各设备，应采用金属线槽沿设备周围或主机房从设备背面的活动地板穿线孔引人的设
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备(注意不得与电源线路共用活动地板穿线孔，且间距大于0.1m)，信号线缆避免沿机房墙边敷设以防与强电线管交叉。活动地板下部的电源线应尽可能远离计算机信号线，并避免并排敷设。当不能避免时，应采取相应的屏蔽措施。桌上设备之间的信号连线是短线的(长度于3m)应沿设备背部桌面明敷，但不得悬吊在设备桌背侧空中;是长线的(长度大于3m)应从活动地板穿线孔翻下(上)穿薄皮钢管在活动地板下敷设。机房照明负荷和普通空调负荷，由电源管理间分别引出动力和照明回路供电。照明和空调负荷线路均沿吊顶内或墙面敷设，避免在弱电机房
(3)可靠接地。总配电柜、UPS电源柜、动力配电箱、照明配电箱的金属框架及基础型
钢必需接地(PE)或接零(PEN)可靠。门和框架的接地端子间用裸编铜线连接。柜、箱内配线整齐。照明配电箱内的漏电保护器的动作电流不大于30mmA，动作时间不大于0.ls。接地(PE)或接零(PEN)支线必须单独与接地(PE)或接零(PEN)干线相连接，不得串联连接。UPS电源柜输出端的中性线(N极)，必须与由接地装置直接引来的接地干线连接，作重复接地，接地电阻小于4Ω。当灯具距地面高度小于2.4m时，灯具的可接近裸露导体必须接地(PE)或接零(PEN)可靠，并应有专用接地螺栓和标识。外电源进线至机房电源管理间时，应将电缆的金属外皮与接地装置连接;从楼外引入的皑装信号电缆和屏蔽信号线，进入弱电机房前也应注意采取防雷击措施，避免沿建筑外墙
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或防雷引线引雷人室，遭受雷击和高频电磁干扰。同轴电缆的屏蔽层必须与机壳一起接地。
上述线缆进人机房后，应设金属接线箱(盒)，并将线缆金属(屏蔽)外皮连接避雷器或浪涌电压抑止器(SPD)，然后与机房等电位接地母排，用截面积不小于16mm2的铜芯绝.缘线连通。这样可以有效的抑制线缆接收到的电磁干扰信号，从而保证信号传输的质量。从机房送出的信号线路应采用金属线槽沿墙并在吊顶内敷设，避免与其他电气管路平行紧贴。尽量避开空调、消防、暖气和给排水等管道，与它们的间距按相关规范执行。金属电缆桥架及其支架和引入或引出的金属电缆导管必须接地(PE)或接零(PEN)可靠，且必须符合下列规定:
1)金属电缆桥架及其支架全长应不少于2处与接地(PE)或接零(PEN)干线相连接。
2)电缆桥架间连接板的两端跨接铜芯接地线，接地线最小允许截面积不小于6mm2。
3)接地(PE)或接零(PEN)线在插座间不串联连接。
工程实施中按上述做法可以较好地处理机房供电的可靠和安全，各种不同电压和频率的信号线缆敷设安全、相互隔离度好、整齐、美观并方便维护管理。
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(4)消防系统的要求。消防系统的设备动力电缆，控制电缆、电线，按规范要求选用耐
火型电缆、电线。其他弱电系统所用电缆、电线均采用阻燃型。在设备选择及线路敷时，应充分考虑电磁兼容问题。
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