牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

第一篇：牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

《中国科学院研究生院（海洋研究所）》 2008年

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牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

张玉青

【摘要】： 本文克隆了牙鲆的成肌因子MyoD和Myf5,以及牙鲆的Forkhead基因FoxD1、FoxD3和FoxD5,并对其在牙鲆肌肉发育中的功能进行了分析。牙鲆MyoD和Myf5基因都具有三个外显子,两个内含子。其编码的氨基酸序列都含有保守的bHLH;牙鲆FoxD1,FoxD3,FoxD5基因都只有一个外显子,编码的氨基酸序列都含有保守的翼状螺旋DNA结合结构域。在胚胎发育早期,Myf5在近轴中胚层中表达,体节发生过程中,Myf5在体节中表达,MyoD基因最早在分节板的体节前细胞中表达,随后在近轴细胞、体节中表达;随着胚胎的发育,Myf5在成熟体节中表达量降低,在新生体节中表达较强;MyoD自30个体节时期后只在新生的尾部体节中表达,在成熟的体节中表达量降低;在孵化期,MyoD和Myf5在头部及鳍的肌肉、尾部的体节中表达;生长期的牙鲆中,Myf5在骨骼肌和肠中表达,成体牙鲆中,Myf5只在肌肉中表达;生长期的牙鲆及成体牙鲆中,MyoD只在肌肉组织中表达。牙鲆MyoD和Myf5的启动子可以驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼肌肉纤维中表达,其包含了这两个基因正常表达所需的核心区域,并可以跨物种行使功能。在胚胎发育早期,FoxD3在未迁移神经嵴前体细胞、体节、耳后的基板、头部和躯干的神经嵴细胞、松果体中表达。牙鲆FoxD1主要在脑,体节,肾脏及肠中表达。牙鲆FoxD5主要在体节、尾芽、前脑、耳泡中表达。在斑马鱼中过量表达牙鲆FoxD3,并与斑马鱼的同源基因进行比较,结果表明注射牙鲆和斑马鱼FoxD3的斑马鱼胚胎表型一致,它们在中轴两侧的发育出现了不同步现象,MyoD和Myf5在近轴中胚层中的表达受到不同程度抑制。因此,FoxD3在不同物种之间保守,并且FoxD3在肌肉发育的调控通路中可能通过与MyoD和Myf5相互作用而行使功能。在斑马鱼中过量表达FoxD1后,MyoD在一侧体节中的表达受到了严重抑制,而在近轴细胞中的表达未受影响,Myf5在体节前中胚层,近轴细胞,及体节中的表达都受到了抑制。FoxD1在胚胎发育的早期可能通过调控MyoD和Myf5的表达而参与肌肉发育的调控。将牙鲆FoxD5在斑马鱼中过量表达,MyoD在一侧体节中的表达量有所升高,而在近轴细胞中的表达未受影响;Myf5在一侧体节和体节前中胚层中的表达也有所升高,表明牙鲆FoxD5可以调控肌肉调节因子MyoD和Myf5的表达而参与早期肌肉发育的调控。

【关键词】：牙鲆 Paralichthys olivaceus Myf5 MyoD FoxD1 FoxD3 FoxD5 RT-PCR 原位杂交 显微注射 过量表达

【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2008 【分类号】：Q78;S917.4 【目录】：

 摘要6-8                                       Abstract8-10 第一章 引言10-36 1.胚胎肌肉发育10-14 1.1 动物的肌肉发育10-12 1.2 鱼类的肌肉发育12-14 2.骨骼肌发育的特化信号14-20 2.1 Hedgehog 信号系统14-16 2.2 Wnt 信号系统16-17 2.3 TGF-β 信号17-18 2.4 成纤维细胞生长因子18-19 2.5 Pax 基因家族19-20 3.肌肉调节因子(MRFs)20-26 3.1 肌肉调节因子的结构与功能20-24 3.2 肌肉调节因子的调控24-26 4.FoxD 家族基因及其在胚胎发育中的作用26-34 4.1 Forkhead 家族基因概述26-30 4.2 FoxD 家族基因30-34 5.用显微注射方法在斑马鱼中进行基因功能研究34-35 6.研究意义35-36 第二章 牙鲆 MyoD 和 Myf5 的克隆、表达及功能分析36-74 1.材料与方法36-44 1.1 牙鲆和斑马鱼的培育与实验材料的获得36-37 1.2 实验试剂37 1.3 质粒与菌株37 1.4 仪器37 1.5 计算机程序37 1.6 引物37-38 1.7 实验方法38-44 2.牙鲆肌肉调节因子 MyoD 的克隆与功能分析44-57 2.1 牙鲆 MyoD 基因组,cDNA 的克隆及序列分析44-51 2.2 牙鲆 MyoD 在胚胎中的时空表达51-53 2.3 牙鲆 MyoD 在生长的牙鲆中的时空表达53-54 2.4 牙鲆 MyoD 在胚胎发育早期及成体中表达的半定量分析54-56 2.5 小结56-57 3.牙鲆肌肉调节因子 Myf5 的克隆与功能分析57-70 3.1 牙鲆 Myf5 基因的克隆与序列分析57-62 3.2 牙鲆 Myf5 启动子和第一个内含子的保守序列分析62-65 3.3 牙鲆 Myf5 在胚胎中的时空表达65-68                                 3.4 牙鲆 Myf5 在生长的牙鲆不同组织中的表达68 3.5 牙鲆 Myf5 在胚胎发育早期及成体中表达的半定量分析68-70 3.6 小结70 4.牙鲆 MyoD 和 Myf5 启动子驱动的绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎中的表达70-74 4.1 重组质粒 MyoDP-GFP,Myf5P-GFP 的构建71 4.2 牙鲆 MyoD 和 Myf5 启动子驱动的绿色荧光蛋白在肌肉中特异的表达71-73 4.3 小结73-74 第三章 牙鲆 FoxD3 的克隆、表达及功能分析74-94 1.材料与方法75-77 2.牙鲆 FoxD3 基因的克隆与序列分析77-83 3.牙鲆 FoxD3 在胚胎发育早期的表达83-85 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD3 对早期胚胎发育的影响85-89 5.讨论89-92 6.小结92-94 第四章 牙鲆 FoxD1 的克隆、表达及功能分析94-108 1.材料与方法94 2.牙鲆 FoxD1 基因的克隆与序列分析94-99 3.牙鲆 FoxD1 在胚胎中的时空表达99-102 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD1 对早期胚胎发育的影响102-104 5.讨论104-106 6.小结106-108 第五章 牙鲆 FoxD5 的克隆、表达及功能分析108-121 1.材料与方法108 2.牙鲆 FoxD5 基因的克隆与序列分析108-111 3.牙鲆 FoxD5 在胚胎中的时空表达111-116 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD5 对早期胚胎发育的影响116-117 5.讨论117-120 6.小结120-121 结论121-124 参考文献124-145 发表文章145-146 致谢146

第二篇：水稻持绿基因的分子克隆及其功能分析的研究

水稻持绿基因的分子克隆及其功能分析的研究

Molecular cloning and function analysis of the stay greengene in rice 前言

水稻持绿色突变体(stay green rice,sgr)，由新疆农业科学院梁乃亭等人通过对日本水稻“花之舞”品种的干种子经过γ射线处理后,在M2代群体中选育出的，主要表现为在自然衰老和暗诱导衰老过程中能够保持很高的叶绿素含量，叶片保持可见的绿色。

对持绿基因进行定位并克隆，此后可将该基因导入蔬菜、烟草、花草、树木等植物，培育永绿色蔬菜、观赏性花草树木新品种。

但要与绿色超级稻的概念相区别。绿色超级稻：由中国科学院院士、华中农业大学生命科学技术学院院长张启发教授提出的水稻新概念，即水稻基本不打农药、少施化肥、节水抗旱的水稻。

持绿突变体的类型：功能型突变体（A型：衰老开始较晚，以正常速率结束；B型：衰老开始正常但结束相对缓慢）；非功能型突变体（C型：由于霜冻或干旱，持绿最终导致叶片死亡。D型：由于对叶绿素降解机制不起作用，叶绿素可以无限期的存在，衰老过程与野生型相同；E型：保持很高的叶绿素含量，光合作用不增加。）水稻持绿基因的分子克隆 2.1 分离持绿色突变体

图1籽粒灌浆期后 图2 黑暗条件下

持绿色表现型在F1群体中不表达，在回交F2群体中野生型与持绿型出现3：1的分离比，表明持绿色突变是由单个隐性核基因控制。

突变体净光合速率（Pn）相对于野生型没有明显的提高,光化学效率(Fv/Fm)没有明显的改变。

SGR突变阻碍了叶绿素降解,使叶片呈现出持绿色表型,但在植物衰老过程中不能维持其光合效率。因此它属于非功能C型突变体。

2.2 克隆持绿基因

在1880株F2突变群体中通过图位克隆和DNA序列分析（STS)精确定位，突变基因是位于水稻第九个基因的长臂上,是一个单核苷酸突变（A251突变为G251）（如下图）。

2.3 SGR过表达载体转基因植株

为了研究SGR转录是怎样影响叶片衰老，利用花椰菜花叶病毒35S为启动子把SGR转入到野生型水稻中，形成两个独立的转基因家系。

整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为：目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。

GUS基因（又称报告基因）的组织化学法检测即具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。SGR的过表达可以通过此法看出表达情况。（筛选重组子）如下左图

由半定量RT-PCR（逆转录酶PCR）分析可测定叶片中目的基因SGR的表达量增加或减少。(表达的量)如上右图

水稻持绿基因功能分析 3.1 SGR的表达和调控

通过Rt-PCR表达结果分析表明：SGR不仅可以在叶子中存在，也存在于萌发的种子和根中。如下图

在营养液中分别培养离体叶片，结果如图所示，野生型水稻中，ABA加速了叶绿体分解，促进叶片黄化；而6-BA抑制叶绿体分解，延缓叶片黄化。而在突变体中ABA、6-BA影响不是很明显。如下图

由下图可以看出：在野生型和突变体暗诱导衰老过程中SGR和PaO都处于上调状态。在ABA的作用下，增加了它们的上调程度，而6-BA减少了上调的程度。

通过Western Blot(蛋白质印迹)分析表明：水稻叶片中SGR蛋白水平随着SGR表达的增加而增加。经ABA处理后SGR蛋白表现出明显的增加，而6-BA处理后SGR蛋白比正常生长叶片中SGR蛋白更少。

3.2 叶绿体色素的变化

在正常的光照下水稻野生型和突变体的Chl,Carotenoids,Chla/b没有明显不同而SGR过表达载体转基因植株的叶片Chl相对于野生型低30%,而Chla/b高10%；

在黑暗条件下，野生型和突变体的叶绿素总含量分别下降了80%、90%，Chl a/ b也明显下降，而突变体保留了75%的Chl，Chl a/b也增加了。

3.3 蛋白质的变化

在黑暗条件下，野生型和突变体中可溶性蛋白(主要为Rubisco)和膜蛋白（主要为捕光蛋白）都在下降，但突变体较野生型更稳定。

但在突变体中可溶性蛋白明显下降也解释了突变体在衰老过程中不能保持光合作用的原因。

结论

4.1 SGR突变在自然衰老和暗诱导衰老过程中能够保持很高的叶绿素含量,叶片保持可见的绿色。但突变体净光合作用速率（Pn）、光化学效率(Fv/Fm)相对于野生型没有明显的提高。因此,水稻持绿色突变体属于非功能C型永绿色突变体。

4.2 SGR的表达受脱落酸（ABA）促进，但被6-BA(一种细胞分裂素)抑制。

4.3 SGR突变能够在叶片衰老过程中阻滞叶绿体内类囊体解体、叶绿素降解和部分蛋白质的降解。随着sgr转录的增加也提高了水稻叶绿体的破坏。4.4 在水稻中叶绿素降解需要一系列叶绿素降解酶的作用。在叶片衰老过程中,突变体具有较高的Chla/Chlb值，SGR可能参与PaO活性的调控。

第三篇：基因表达专题

30.（20分）烟草是种植广泛的经济作物，由于相关病毒的侵染会导致大量减产。烟草花叶病毒（TMV）和车前草病毒（HRV）主要由蛋白质外壳和RNA组成，这两种病毒感染烟草时都能引起花叶病，但在烟叶上出现的病斑不同。请分析并回答：

（1）为确定烟草花叶病毒的遗传物质，实验设计思路是首先将病毒的蛋白质外壳与RNA分离，然后，如果实验结果是，则可以推测烟草花叶病毒的遗传物质是RNA。

（2）科学家还进行了著名的植物病毒重建实验，再次证明烟草花叶病毒的遗传物质是RNA。实验过程如图—20所示。

用杂合病毒去感染烟草，甲、乙烟叶上出现的分别为的病斑和的病斑，从感染后的两组烟草细胞中均分离提纯得到了完整的病毒。请画出分离得到的病毒的模式图。

（3）研究人员利用转基因技术培育出了抗TMV的烟草，主要流程如图—21所示。

图中过程①表示，经过程②获得的目的基因两侧除应含有相关的酶切位点外，目的基因的两端还必须有。由图分析，构建的重组质粒上含有的标记基因是基因。过程⑤采用的是技术，培养基中除含有卡那霉素及植物必需的各种营养成分外，还必须添加，以保证受体细胞经培养再生成植株。过程⑥可采取的方法，检测植株是否合成了相关蛋白。在个体水平的鉴定过程中，可通过的方法来确定植株是否具有抗性。

29．（14分）

禽流感是由禽流感病毒(一种非逆转录RNA病毒)引起的急性传染病，能感染人类。研

究者针对禽流感病毒进行了相关研究。请回答下列问题：

（1）禽流感病毒遗传物质的基本组成单位有种。对禽流感病毒的基因测

序时，主要工作目标是测定禽流感病毒

（2）病毒除感染家禽外，还能感染其他哺乳动物，说明不同种类的被感染细胞表面具

有相似的细胞中，通过RNA复制与过程合成病毒蛋白，从而产生子代病毒，机体被感染细胞的清除可通过

（3）某男子感染了禽流感病毒并已产生相应抗体，无明显病症，但这并不能保证他短

期内再次感染时不会成为禽流感患者，理由是

29.(18分)下图表示某植物在红光照射下，叶肉细胞中发生的一系列生化反应（图中的SSU、LSU和LHCP表示三种不同的蛋白质）。

请分析回答：

（1）完成图中的过程①时，需遵循的碱基互补配对原则是，此过程既需要

作为原料，还需要与基因启动部位结合的酶进行催化。由图分析，过程②发生在位于的核糖体上。

（2）若图中的LHCP中有一段氨基酸序列为“---丝氨酸---谷氨酸---”，携带丝氨酸和谷

氨酸的tRNA上的反密码子分别为AGA、CUU，则基因b中供转录用的模板链碱基序列

为。从图中分析，LHCP合成后转移至上发挥作用，影响与之相关的光合作用

过程的主要环境因素是(至少答两点)。

（3）图中的SSU和LSU组装成Rubisco酶，说明Rubisco酶的合成受控制。从其分布

位置推断，RuBisCo酶与光合作用的阶段有关。

31.（18分）凋亡抑制蛋白与肿瘤的发生、发展有关，科学家利用先天无胸腺的裸鼠，探

究凋亡抑制蛋白基因的反义脱氧核苷酸链对肠癌肿瘤的抑制作用。请分析回答下列问题：

（1）人工合成部分序列为5’GGCAAC„„„„ACCCAT3’反义脱氧核苷酸链，能够与凋亡

抑制蛋白基因的__________配对结合，使其分子构象发生改变，不能与____________结

合，抑制翻译。请写出凋亡抑制蛋白基因的部分序列：____________。另外，人工合成的序列不应与人类其他基因的碱基序列相同，以避免该序列

（2）将肠癌细胞置于含5%__________的恒温培养箱中培养，对培养细胞用0.4%台盼蓝染

料染色，拒染率＞95%，说明绝大部分培养细胞为活细胞，其细胞膜具有___________性。

将拒染的细胞制成单细胞悬液，每只实验裸鼠接种等量的单细胞悬液于背部皮下，2周左

右成瘤，成瘤率为100%。成瘤率为100%的原因是裸鼠

________________________________。

（3）将若干只生长状况相同的裸鼠等分为两组，对皮下瘤体分别注射适量含

_________________的生理盐水和等量的生理盐水，检测_______________，计算抑制率，抑制率=（1‒治疗组瘤重量/对照组瘤重量）×100%。若抑制率_______________，则说明反

义脱氧核苷酸链能够明显抑制裸鼠肠癌移植瘤的生长。

29．（16分）2013年初，我国部分地区陷入严重的雾霾和污染天气中，北京的空气污染

指数PM2.5曾接近1000。据统计，北京近十年来肺癌患者增加了60%，引起肺癌的因素

有多种，如大气污染、吸烟、免疫力降低等。

分析以下材料，回答相关问题：

材料I：某学生研究小组用生理盐水制备香烟浸出液，进行“香烟生理盐水浸出液对

大鼠体重影响” 的研究。

（1）将生理状态相似的大鼠随机分为三组，每天同一时间分别对小剂量组和中剂量组

按每百克体重0.5ml、1.0ml灌胃香烟生理盐水浸出液，同时对照组按每百克体重1.0ml灌

胃___________________。结果如下图所示。

由图可以得出的结论是_______________。

（2）若进一步研究香烟生理盐水浸出液对大鼠身体健康的影响，还需对肝脏病理、肺

部纤维增生程度进行检查，并通过显微镜观察______________来初步判断是否发生癌变

等。若肺部细胞已发生癌变，其根本原因是_______。

材料II：研究人员利用基因工程技术对肺癌的治疗进行了大量研究，肺部细胞中的let-7

基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基

因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图

所示，据图回答。

（3）形成重组载体时，需用酶切

割。

（4）进行过程②时，需用酶处理贴附在培养皿壁上的细胞，以利于传代培

养。

（5）研究发现，let-7基因能影响RAS基因的表达，其影响机理如图乙所示。从分子

水平的角度分析，其作用机理是let-7基因通过转录形成miRNA，从而抑制肺癌细胞的增殖。

31．（18分）为探究存在于肿瘤细胞中的逆转录病毒是否能通破坏坏哺乳动物的免疫监测

功能，科学家利用RNA干扰技术抑制小鼠黑色素瘤细胞（ERV）中的逆转录病毒关键基因的表达，进行了如图15所示的实验，据此回答有关问题：

（1）图15-甲所示，酶能与表达载体上的启动子结合，该酶来

自。以RNA干扰序列为模板经过程生成的干扰RNA，通过原则与ERV中逆转录病毒关键基因的mRNA结合，导致该基因无法表达。

（2）被导入表达载体的ERV称为ERV。将等量的ERV和ERV分别注射到多只免疫缺陷小

鼠体内，结果如图15-乙所示。从图乙可知，两种肿瘤细胞在免疫缺陷小鼠体内的增长速

率。说明抑制逆转录病毒基因的表达对ERV的成瘤能力。

（3）将等量的ERV和ERV分别注射到多只正常小鼠体内，一定时间后，计算小鼠的，结果如图15-丙所示。实验组注射、小鼠存活率高，证明

了。

31．（16分）下图1表示某细菌的抗除草剂基因的部分片段，其中a、b、c分别表示该基

因片段中特定的碱基对。图2表示该细菌细胞内DNA自我复制及控制多肽合成的过

程。请分析回答：

① ②

KDKDKDAUGGCUUCUUUCCUACCG 甲硫氨酸—丙氨酸—丝氨酸—苯丙氨酸—亮氨酸—脯氨酸UCC CUU 氨基酸的 UUC CCG GCU ACU 部分密码子 UCU UUA CCC GCACUA CCU

图1 图

2（1）图2所示遗传信息的传递方向是。在真核细胞内，核基因控制的该过程发

生在同一场所的是（选填序号）。过程①的产物分子中只有一条单链是新

合成的，因此这种合成方式被称为。过程②需要_________催化。完成③

时，一般在一条mRNA上会结合多个核糖体，其意义是。

（2）基因突变是由于，导致基因结构的改变。若图1中基因位点a的碱基对变

为的碱基对变为，位点的突变A C T

对生物性状表现无影响，其原因是。

（3）若将此抗除草剂基因转入大豆根细胞中，欲检测转基因是否成功，应将转入目的基因的细胞培养在含的全营养固体培养基中。抗除草剂基因能在大

豆细胞中表达说明。

30．（18分）优质彩棉是通过多次杂交获得的品种，其自交后代常出现色彩、纤维长短等

性状遗传不稳定的问题。请分析回答：

（1）欲解决彩棉性状遗传不稳定的问题，理论上可直接培养，通过式，快速获得纯合子。但此技术在彩棉育种中尚未成功。（2）为获得能稳定遗传的优质彩棉品种，研究人员以白色棉品种57-4做母本，棕色

彩棉做父本杂交，受粉后存在着精子与卵细胞不融合但母本仍可产生种子的现象。这样的种子萌发后，会出现少量的父本单倍体植株、母本单倍体植株及由父本和母本单倍体细胞组成的嵌合体植株。

①欲获得纯合子彩棉，应选择____植株，用秋水仙素处理植株的____，使其体细胞染色体数目加倍。②下图是研究人员在诱导染色体数目加倍时的实验处理和结果，本实验的目的是探究

____，实验效果最好的实验处理是____。

③欲鉴定枝条中染色体数目是否加倍，可以通过直接测量比较作出判断。欲检测染色体数目已加倍的植株是否为纯合体，在实践中应采用____的方法，依据后代是否出现____作出判断。

30.（18分）

普通甘蓝为二倍体（2n=18），通过育种得到四倍体。

（1）一般得到四倍体植株是利用试剂处理二倍体植株进行分裂的部位，上述育种方法是。

（2）二倍体甘蓝正常减数分裂后产生的细胞，其染色体彼此为

（3）若减数第一次分裂前期同源染色体均联会，后期同源染色体分离，使得染色体平均分配到子细胞中，则四倍体甘蓝减数分裂后的细胞中染色体数为条。

（4）实际观察四倍体甘蓝的器官，减数第一次分裂时，前期多数为4或2条同源染色体联会，3条染色体联会或1条染色体单独存在的情况占少数；而中期则出现较多独立的1条染色体，且染色体总数不变，表明联会的染色体会出现现象。

（5）上述情况表明：四倍体甘蓝减数分裂过程出现异常，导致减数分裂后形成的细胞中的染色体数有17、19、21条等，说明细胞内出现了加或减少的现象，使其育性/减弱/增强）。

第四篇：基因表达调控习题

第11单元 基因表达的调控和基因工程

（一）名词解释

1．操纵子； 2．启动子； 3．增强子； 4．衰减子； 5．反式作用因子； 6．降解物基因活化蛋白；7．克隆技术； 8．限制性核酸内切酶； 9．基因组DNA文库； 10． cDNA文库。

（二）填充题

1．正调控和负调控是基因表达的两种最基本的调节形式，其中原核细胞常用

模式，而真核细胞常用

模式。

2．在原核细胞中，由同一调控区控制的一群功能相关的结构基因组成一个基因表达调控单位，称为，其调控区包括

基因和

基因。

3．有些基因的表达较少受环境的影响，在一个生物体的几乎所有细胞中持续表达，因此被称为

；另有一些基因表达极易受环境的影响，在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因是可的基因，相反，如果基因对环境信号应答时被抑制，这种基因是可的基因。

4．在基因重组技术中，切割DNA用，连接DNA用。

5．除噬菌体外，和

也是分子克隆的常用载体。

6．用动物病毒DNA改造的基因载体有

和

。用于植物基因工程的常用载体是。

7．将重组质粒导入细菌称，将噬菌体DNA转入细菌称。

8．Southern印迹法、Northern印迹法和Western印迹法是分别用于研究、和

转移和鉴定的几种常规技术。

（三）选择题（在备选答案中选出1个或多个正确答案）

1．一个操纵子通常含有

A．一个启动序列和一个编码基因

B．一个启动序列和数个编码基因

C．数个启动序列和一个编码基因

D．数个启动序列和数个编码基因

E两个启动序列和数个编码基因

2．有关操纵子学说的论述，正确的是

A．操纵子调控系统是真核生物基因调控的主要方式

B．操纵子调控系统是原核生物基因调控的主要方式

C．操纵子调控系统由调节基因、操纵基因、启动子和结构基因组成 D．诱导物与阻遏蛋白结合启动转录

E．诱导物与启动子结合而启动转录

3．转录因子是

A．调节DNA结合活性的小分子代谢效应物

B．调节转录延伸速度的蛋白质

C．调节转录起始速度的蛋白质

D．调节转录产物分解速度的蛋白质

E．促进转录产物加工的蛋白质

4．阻遏蛋白（阻抑蛋白）识别操纵子中的

A．启动基因

B．结构基因

C．操纵基因

D．内含子

E．调节基因

5．在下列哪种情况下，乳糖操纵子的转录活性最高

A．高乳糖，低葡萄糖

B．高乳糖，高葡萄糖

C．低乳糖，低葡萄糖

D．低乳糖，高葡萄糖

E．不一定

6．顺式作用元件是指

A．基因的5ˊ侧翼序列

B．基因的3ˊ侧翼序列

C．基因的5ˊ和3ˊ侧翼序列

D．基因的5ˊ和3ˊ侧翼序列以外的序列

E．具有转录调节功能的特异DNA序列

7．反式作用因子是指

A．具有激活功能的调节蛋白

B．具有抑制功能的调节蛋白

C．对自身基因具有激活功能的调节蛋白

D．对另一基因具有激活功能的调节蛋白

E．对另一基因有调节功能的蛋白质因子

8．下列关于限制性内切酶的叙述哪一项是错误的

A．它能识别DNA特定的碱基顺序，并在特定的位点切断DNA

B．切割点附近的碱基顺序一般呈回文结构

C．它能专一性降解经甲基化修饰的DNA

D．是重组DNA的重要工具酶

E．主要从细菌中获得

9．基因工程中，不常用到的酶是

A．限制性核酸内切酶

B．DNA聚合酶

C．DNA解链酶

D．DNA连接酶

E．反转录酶

10下列哪项不能作为表达载体导入真核细胞的方法?

A．磷酸钙转染

B．电穿孔

C．脂质体转染

D．氯化钙转染

E．显微注射

11．重组体的筛选方法有

A．抗药标志筛选

B．标记补救

C．分子杂交

D．免疫化学

E．酶联免疫检测

12．cDNA是指

A．在体内合成的与病毒DNA或RNA互补的DNA

B．在体外经反转录合成的与DNA互补的DNA

C．在体外经转录合成的与DNA互补的RNA

D．在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA

E．在体内经转录合成的与DNA互补的RNA

13．建cDNA文库时，首先需分离细胞的

A．染色体DNA

B．线粒体DNA

C．总mRNA

D．tRNA

E．rRNA

（四）判断题

1．高等真核生物的大部分DNA是不为蛋白质编码的。

2．大多数管家基因编码低丰度的mRNA．

3．乳糖可以诱导乳糖操纵子的表达，所以乳糖对乳糖操纵子的调控属于正调控系统。

4．某些蛋白质既可以作为阻遏蛋白又可以作为激活蛋白参与基因表达的调控。

5．准备用原核生物表达真核基因时，最好通过cDNA获取目的基因。

6．用原核生物表达真核生物的糖蛋白，其表达产物不会有正常的生物学功能。

7．Ti质粒可以随土壤农杆菌进入植物细胞。

8．用λ噬菌体作克隆载体时，外源DNA片断越小，克隆的成功率越高。

9．基因克隆选择的宿主细胞必须无限制性核酸内切酶。

10．采用蓝白斑选择法时，蓝色菌落或噬菌斑是含有重组载体的克隆。

（五）分析与计算题

1．简述操纵子的基本结构。

2．举例说明基因表达的诱导与阻遏，正调控与负调控。

3．概述原核生物基因表达调控的特点。

4．概述真核生物基因组的特点。

5．概述真核生物基因表达调控的特点。

6．简答真核生物基因表达的调控方式。

7．常用的限制性核酸内切酶有哪些特点?

8．在基因克隆中，目的基因有哪些主要来源?

9．什么是cDNA文库?cDNA文库与基因组文库有何差别?

10．用于DNA重组的载体应具备什么条件?常用的载体有哪一些?各有何特点?

11．简述连接目的基因与载体的主要方法?

12．概述筛选和鉴定DNA重组体的常用方法。

参考答案

（一）名词解释

1．原核生物的几个功能相关的结构基因往往排列在一起，转录生成一个mRNA，然后分别翻译成几种不同的蛋白质。这些蛋白可能是催化某一代谢过程的酶，或共同完成某种功能。这些结构基因与其上游的启动子，操纵基因共同构成转录单位，称操纵子。

顺式调控元件：指可影响自身基因表达活性的真核DNA序列。根据顺式作用元件在基因中的位置、转录激活作用的性质及发挥作用的方式，分为启动子、增强子及沉默子等。

2．是RNA聚合酶结合位点周围的一组转录控制组件，包括至少一个转录起始点。在真核基因中增强子和启动子常交错覆盖或连续。有时，将结构密切联系而无法区分的启动子、增强子样结构统称启动子。

3．是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现的长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物，甚至在原核生物中都发现了增强子。增强子通常占100～200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，基本核心组件常为8～12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在。

4．在原核生物的Trp操纵子结构中，第一个结构基因与启动子P之间有一个区域含Trp密码子，称衰减子。当环境中Trp浓度很高时，它可通过编码并翻译，使正在转录的mRNA形成终止信号，从而终止Trp操纵子的表达。这种转录衰减实质上是转录与一个前导肽翻译过程的偶联，它是原核生物特有的一种基因调控机制。

5．大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，通过与特异的顺式作用元件相互作用（DNA－蛋白质相互作用），或通过与基它调节因子的相互作用（蛋白质－蛋白质相互作用），反式激活另一基因的转录，故称反式作用蛋白或反式作用因子。

6．也就是cAMP受体蛋白（cAMP receptor protein，CRP），它与cAMP的复合物可以促进某些原核操纵子（如乳糖操纵子）的转录。

7． “克隆”作为名词指相同的分子或细胞构成的群体，或一个共同的祖先通过无性繁殖所得到的群体，作为动词指获取“克隆”的过程。克隆技术特指获取“克隆”的过程，包括分子克隆，细胞克隆等技术。

8．就是识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。限制性核酸内切酶存在于细菌体内，与相伴存在的甲基化酶共同构成细菌的限制、修饰体系，限制外源DNA，保护自身DNA，对保持细菌遗传物质的稳定具有重要意义。限制性核酸内切酶分为三类，其中的Ⅱ类酶能特异性在一定的核苷酸序列处切割双链DNA，因而在基因工程中得到广泛的应用。

9．利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成一定大小的片段，将这些片段分子与适当的克隆载体拼接成重组DNA分子，继而转入受体菌，使每个细菌内都携带一种重组DNA分子。不同细菌中的重组DNA分子可能包含不同的染色体DNA片段，这样，只要得到的转化细菌所携带的重组DNA分子种类足够多，则全部转化细菌所携带的各种染色体片段就代表了染色体的整个基因组。存在于转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA片段的集合称基因组DNA文库。基因组DNA文库涵盖了基因组的全部基因信息。

10．以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。另外，对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接，去除了内含子的cDNA。一般来说，从cDNA文库获得的基因，因不含内含子而片段较小，更适合于用作基因工程的目的基因。由于原核生物不存在将hnRNA加工成mRNA的酶系统，若用原核生物表达真核基因，则目的基因一定要通过cDNA获取。

（二）填充题

1．负调控，正调控；

2．启动子，启动，操纵； 3．管家基因，诱导，阻遏； 4．限制性核酸内切，DNA连接； 5．质粒，病毒； 6．腺病毒载体，反转录病载体，Ti质粒。7．转化，转导； 8．DNA，RNA，蛋白质；

（三）选择题（在备选答案中选出1个或多个正确答案）

1．（B）操纵子均含有数个编码基因，但启动序列只有1个。

2．（B，C，D）操纵子调控系统由调节基因，操纵基因，启动子和多个结构基因组成，是原核生物基因表达调控的主要方式，诱导物与组遏蛋白结合启动转录。诱导物不能直接与启动子结合。真核生物不存在操纵子调控系统。

3．（C）转录因子是调节转录起始的蛋白质，对转录延伸的速度，转录产物分解的速度和转录产物的加工均无影响。

4．（C）操纵基因位于启动基因与结构基因之间，阻遏蛋白与操纵基因结合后，与启动基因结合的RNA聚合酶不能转录结构基因。

5．（A）参与乳糖代谢的三种酶的表达同时受控于正负调控两种机制，只有在正调控发挥作用，负调控不起作用的时候，这三种酶才能有效的表达。当培养基中加入乳糖的时候，参与负调控的阻遏蛋白将失去活性，但如果培养基中含有葡萄糖，则细菌优先利用葡萄糖，这时参与乳糖代谢的酶仍然不能有效的表达，这是因为葡萄糖降低了细胞内的cAMP水平，而cAMP浓度的降低，导致降解物激活蛋白丧失活性，正调控的机制失去作用，这时三种酶不可能正常的表达。

6．（E）顺式作用元件是对某基因自身有调节功能的DNA序列，其中的启动子多在基因的5ˊ侧翼，但增强子既可以在5ˊ侧翼，又可以在3ˊ侧翼，一般距基因较远。有些顺式作用元件甚至可以在基因内部。

7．（E）反式作用因子是指对另一基因的表达有激活或抑制作用的蛋白质因子。

8．（C）限制性核酸内切酶主要存在于细菌，它可以水解外源DNA，而自身DNA因在特定位点被甲基化而可以免遭水解。限制性核酸内切酶由于可识别特定的碱基序列并在特定的位点切割双链DNA，因而在基因工程中得到广泛的使用。

9．（C）DNA聚合酶可用来获取目的基因，测序和PCR等项工作，限制性核酸内切酶用于DNA酶切片段长度的多态性分析，载体和目的基因的特异性切割等工作，DNA连接酶可用于基因重组的连接反应。DNA解链酶在基因工程中几乎用不到。

10．（D）CaCl2处理受体细胞是提高细菌转化率的常用方法，不适用于真核生物，题中列出的其余4种方法均可用于将表达载体导入真核细胞。

11．（A，B，C，D，E）题中列出的5种方法均可用于重组体的筛选。

12．（D）cDNA指在体外经反转录合成的与RNA互补的DNA。

13．（C）cDNA文库应包含某一细胞在某一状态下所表达的基因，因此，构建cDNA文库首先要分离细胞的总mRNA。

（四）判断题

1．对。高等真核生物的DNA中含有不少高度重复序列的非编码序列，基因内部又有内含子，不少基因内含子的总长度远远大于外显子。因此，真核生物的编码区只占DNA总长度的一小部分，一般认为，编码区不超过总长度的5%。

2．对。管家基因是持续表达的，mRNA丰度不高，但寿命较长，翻译效率较高。

3．错。乳糖被转化为别乳糖后，与乳糖操纵子调节基因产生的阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白失去活性。由于这一调控方式起作用的是阻遏蛋白，故属于负调控。

4．对。某些蛋白质能够与DNA分子的不同区域结合，分别发挥激活蛋白或阻遏蛋白的作用。

5．对。真核生物的基因多数含有内含子，原核生物缺乏从转录初级产物切除内含子的加工系统，另外，如果将基因组DNA作为目的基因，基因片段因含有内含子而过大，也会降低基因转移的成功率。cDNA是以成熟mRNA为模板经过反转录制成的，不含内含子，适合于作为目的基因用于基因的克隆或表达。

6．对。原核生物缺乏真核生物的翻译后加工系统。不能对蛋白质进行糖基化。因此，表达糖蛋白要用真核表达系统。

7．错。土壤农杆菌可以促进Ti质粒进入植物细胞，但农杆菌本身并不进入植物细胞。

8．错。λ噬菌体的外壳蛋白只能包装长度为 噬菌体DNA78%～105%的DNA，若外源DNA片段太小，重组体DNA的长度小于 噬菌体DNA的78%，就不能在体外包装成噬菌体，因而，克隆很难成功。

9．对。如果宿主细胞有限制性核酸内切酶，将会水解进入宿主细胞的重组体DNA，导致克隆失败。

10．错。采用蓝的斑选择法时，克隆位点被选在表达 －肽的基因内，含有空载体的受体菌可以在IPTG（异丙基硫代－ －D－半乳糖苷）的诱导下，表达 －肽，通过与受体菌的 －互补，能够水解X－gal（5－溴－4氯－3－吲哚 － －D－半乳糖苷）生成蓝色的水解产物，因而菌落或噬菌斑为蓝色。含有重组DNA的受体菌，由于外源基因插入表达 －肽的基因内，不能表达 －肽，因而，菌落或噬菌斑为白色。

（五）分析与计算题

1．操纵子的调控区有一个操纵序列，一个启动序列及一个CAP位点，调控区下游有几个结构基因，还有一个调节基因编码阻遏蛋白，阻遏蛋白与操纵序列结合，使操纵子受阻遏而处于关闭状态。若cAMP 与CAP结合，形成的复合物与CAP位点结合，可增大操纵子的转录活性。阻遏蛋白的负性调节和CAP的正性调节共同调节结构基因的表达，操纵子机制在原核基因表达调控中具有较善遍的意义，因其多是几个功能相关基因串联于同一操纵子上，故在同一启动序列控制下，可转录出能为多种蛋白质编码的mRNA，即多顺反子mRNA。

2．在特定的环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，则这种基因是可诱导的。可诱导基因在特定的环境中表达增强的过程称为诱导。例如有DNA损伤时，修复酶基因就会在细菌内被诱导激活，使修复酶的活性增加。相反，如果基因对环境信号应答时被抑制则这种基因是可阻遏的，可阻遏基因表达产物水平降低的过程称为阻遏，例如，当培养液中色氨酸供应充分时，在细菌内编码色氨酸合成相关酶的基因表达会被抑制。如果某种基因在没有调节蛋白存在时是表达的，加入某种调节蛋白后基因表达活性便被关闭，这样的控制为负调控。例如，乳糖操纵子。相反，若某种基因在没有调节蛋白存在时是关闭的，加入某种调节蛋白后基因活性就被开启，这种控制称为正调控。例如代谢物阻遏。

3．原核基因表达调控与真核存在很多共同之处，但因原核生物没有细胞核和亚细胞结构，其基因组结构要比真核生物简单，基因表达的调控因此而比较简单。虽然原核基因的表达也受转录起始、转录终止、翻译调控及RNA、蛋白质的稳定性等多级调控，但其表达开、关的关键机制主要发生在转录起始。其特点包括以下3方面：（1）σ因子决定RNA聚合酶的识别特异性：原核生物只有一种RNA聚合酶，核心酶催化转录的延长，亚基识别特异启动序列，即不同的 因子协助启动不同基因的转录。（2）操纵子模型的普遍性：除个别基因外，原核生物绝大数基因按功能相关性成簇地连续排列在染色体上，共同组成一个转录单位即操纵子，如乳糖操纵子等。一个操纵子含一个启动序列及数个编码基因。在同一个启动序列控制下，转录出多顺反子mRNA。（3）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性：在很多原核操纵子系统，特异的阻遏蛋白是控制启动序列活性的重要因素。当阻遏蛋白与操纵基因结合或解离时，结构基因的转录被阻遏或去阻遏。

4（1）基因组结构庞大：哺乳动物基因组DNA由约 bp的核苷酸组成。大约有3万个左右的基因，90%以上的DNA不为蛋白质编码。真核细胞DNA与组蛋白结合形成复杂的染色质结构，基因表达调控机制更加复杂。（2）单顺反子：真核基因转录产物为单顺反子，即一个编码基因转录生成一个mRNA分子，经翻译生成一条多肽链。许多蛋白质由几条不同的多肽链组成，因此存在多个基因的协调表达。（3）重复序列：重复序列在真核DNA中普遍存在，重复序列长短不一，短的在10个核苷酸以下，长的达数百，乃至上千个核苷酸。据重复频率不同分为高度重复序列、中度重复序列及单拷贝序列。（4）基因的不连续性：结构基因的两侧有不被转录的非编码序列，往往是基因表达的调控区。在编码基因内部有一些不为蛋白质编码的间隔序列，称内含子，而编码序列称外显子，因此真核基因是不连续的。

5．同原核生物一样，真核基因表达调控的最基本环节也是转录起始，而且某些机制是相同的，但也存在明显差别：（1）RNA聚合酶：真核有3种RNA聚合酶，分别负责3种RNA转录。（2）活性染色质结构变化：当基因被激活时，可观察到染色体相应区域发生结构和性质变化。包括对核酸酶敏感，DNA拓扑结构变化，DNA碱基修饰变化和组蛋白变化。（3）正调节占主导地位：真核RNA聚合酶对启动子的亲和力极小或根本没有实质性的亲和力，二者的结合必须依赖一种或多种激活蛋白。尽管发现少量基因存在负性顺式作用元件，但普遍存在的是正性调节机制。（4）转录与翻译分隔进行：真核细胞有胞核及胞质等区间分布，转录与翻译在不同亚细胞结构中进行。（5）转录后加工：真核基因的内含子和外显子均被转录，内含子在转录后要被剪接去除，使外显子连接在一起，形成成熟的mRNA。不同剪接方式可形成不同的mRNA，翻译出不同的多肽链。因此，转录后加工是真核基因表达调控的另一重要环节。

6．（1）DNA水平的调控：a．基因丢失，即DNA片段或部分染色体的丢失，如蛔虫胚胎发育过程有27%的DNA丢失。b．基因扩增，即特定基因在特定阶段的选择性扩增，如非洲爪蟾卵母细胞中的rDNA是体细胞的4000倍。c．DNA序列的重排，如哺乳动物免疫球蛋白各编码区的连接。d．染色质结构的变化，通过异染色质关闭某些基因的表达。e．DNA的修饰，如DNA的甲基化关闭某些基因的活性。（2）转录水平的调控。a．染色质的活化，如核小体结构的解开、非组蛋白的作用等。b．转录因子的作用，转录因子与RNA聚合酶及特定的DNA序列（启动子、增强子）相互作用实现对转录的调控。（3）转录后水平的调控。a．mRNA前体的加工，如5′端加帽、3′端加尾、拼接、修饰、编辑等。B．mRNA的选择性拼接，如抗体基因的选择性拼接。（4）翻译水平的调控。a．控制mRNA的稳定性，如5′端的帽子结构、3′端polyA尾巴和mRNA与蛋白质的结合有利于mRNA的稳定。b．反义RNA的作用，反义RNA可以选择性抑制某些基因的表达。c．选择性翻译，如血红素缺乏时，通过级联反应使eIF2磷酸化。d．抑制翻译的起始。（5）翻译后水平的调控。a．多肽链的加工和折叠，如糖基化、乙酰化、磷酸化、二硫键形成、蛋白质的降解。b．氨基酸的重排，如合成伴刀豆蛋白A时，氨基酸序列大幅度地被剪接重排。c．通过肽链的断裂等的加工方式产生不同的活性多肽。

7．Ⅱ型限制性核酸内切酶（限制酶）是基因工程中常用的重要工具酶，是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的核酸内切酶，常用的限制酶主要有以下特点：（1）均来自于微生物，并以其来源的微生物学名进行命名；（2）相对分子质量小，仅需Mg2＋作为辅助因子，无需ATP；（3）识别特异性DNA双链顺序，在序列内特异切割产生特异性DNA片段；（4）识别序列长度为连续的4/6/8bp；（5）识别序列呈二重旋转对称，称回文结构，富含GC；（6）有3种切口：5′端突出的黏性末端（如HindⅢ），3′端突出的黏性末端（如Pst Ⅰ）和平末端（如H加工）。

8．（1）从染色体DNA中直接分离：主要针对原核生物。（2）化学合成法：由已知多肽的氨基酸序列，推得编码这些氨基酸的核苷酸序列，利用DNA合成仪人工合成其基因。（3）从基因组DNA文库中筛选分离组织/细胞染色体DNA：利用限制性核酸内切酶将染色体DNA切割成片段，与适当的克隆载体连接后转入受体菌扩增，即获得基因组DNA文库，用核酸探针将所需目的基因从基因文库中“钓”取出来。（4）从文库中筛选cDNA：提取mRNA，利用反转录酶合成与其互补的DNA（cDNA）分子，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，即获得cDNA文库，然后采用适当方法从cDNA文库中筛选出目的cDNA。（5）用PCR从基因组DNA或cDNA中扩增目的基因。

9．同mRNA互补的DNA称为cDNA。cDNA文库是以某一细胞的总mRNA为模板，在无细胞系统中，在反转录酶的作用下，首先合成互补DNA的第一链，破坏RNA模板后，再以第一链为模板合成第二链，得到双链cDNA。选用适合的载体，与合成的cDNA重组，导入寄主细胞，经筛选得到的cDNA克隆群称为cDNA文库。由于cDNA技术合成的是不含内含子的功能基因，因此是克隆真核生物基因的一种通用方法。由于细胞内的基因在表达的时间上并非是统一的，具有发育的阶段性和时间性，有些则需要特殊的环境条件。所以，cDNA文库不可能构建得十分完全，也就是说任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物的全部编码基因。cDNA文库与基因组文库的主要差别是：（1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因。（2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响，cDNA文库克隆的是被转录DNA序列（因它受发育和调控因子的影响）。（3）基因组文库中的编码基因是含有内含子和外显子，而cDNA克隆的基因不含内含子。

10．DNA重组载体应具备的条件：（1）能自主复制；（2）具有一种或多种限制性内切酶的单一切割位点，并在位点中插入外源基因后，不影响其复制功能；（3）具有1～2个筛选标记；（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入其他生物细胞；（5）易于操作，转化效率高。常用的基因载体有以下几种：（1）质粒：是细菌染色体以外的小型环状双链DNA分子，本身有复制功能，且带有某些选择信息，但可插入的目的基因片段较小。（2）噬菌体DNA：是一种病毒DNA，能插入比较大的外源DNA片段，在DNA分子上有多种限制性核酸内切酶识别位点，便于多种外源DNA酶切片段的克隆。（4）柯斯质粒载体和酵母人工染色体：前者结合了质粒和 噬菌体载体的优点，也是一种环形双链DNA分子，具有质粒的性质，可以转化大肠杆菌，并自行复制和增殖，但它不会产生子代噬菌体，构建成的此种载体较小，因此能插入比较大的外源DNA片段，所以被广泛地用于构建基因组文库。后者既含有大肠杆菌来源的质粒复制起始位点，又含有酵母菌染色体DNA着丝点，端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因，可在转化的酵母菌细胞内，按染色体DNA复制的形式复制重组DNA，容纳外源DNA片段的能力比前3种载体大得多。

11．（1）黏性末端连接：用同一限制酶切割载体及目的基因后，产生完全相同的黏性末端，可以用DNA连接酶直接进行共价连接。或两种不同的限制性核酸内切酶切割产生的配伍末端（相同类型的黏性末端）之间也可以进行黏性末端连接。（2）平端连接：某些限制酶切割DNA后产生平头末端，由于平头末端5′端带有磷酸，3′带有游离羟基，可在DNA连接酶作用下直接连接，并且不管末端序列如何均可连接，但连接效率要比黏性末端之间的连接低。（3）同聚物加尾连接：利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。如果载体和目的基因上找不到共同的酶切点时，可经不同的限制酶切割后，用单链核酸酶将其各自的黏性末端切平，在末端核苷酸转移酶作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列，制造出黏性末端，而后连接。（4）人工接头连接：将磷酸化接头连到平末端，使产生新的限有制性酶切核酸酶位点，再用限制酶切割，产生黏性末端后连接。

12．在转基因操作以后，载体只能进入部分宿主细胞，即使含有载体的细胞，也并非都含有目的基因，有些宿主细胞可能含有自身连接成环的载体分子或非目的基因与载体形成的重组体。因此，须在不同层次不同水平上进行筛选和鉴定，以确定哪一菌落所含的重组DNA分子确实带有目的基因，这一过程为筛选。根据载体体系、宿主细胞特性及外源基因在受体细胞表达情况的不同，可采用：（1）直接选择法：针对载体携带某种或某些标志基因和目的基因，直接测定该基因或基因表型的方法。a．抗药标志的筛选：载体具有某种抗生素的抗性基因，在转化后只有含载体的细菌才能在含该抗生素的培养平板上生长并形成单菌落，而未转化细胞则不能生长，这样即可将转化菌与非转化菌区别开来。b．插入失活法：将目的基因插入载体某一耐药基因内使该基因失活，可区分单纯载体或重组载体（含目的基因）的转化菌落。如pBR322含ampr、Tetr双抗药基因，若将目的基因插入载体的Tetr基因中，则含目的基因的转化细胞只能在含Amp的培养液中生长，而不能在含Tet的培养液中生长。c．标志补救：若克隆的基因能在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这称为标志补救。如重组体为亮氨酸自养型（Leu＋），将重组子导入亮氨酸异养型（Leu－）的宿主细胞后，在不含Leu的培养液中可生长，而不含重组体的细胞则不能生长。－互补法筛选（见43题）也是一种标志补救选择方法。d．酶切图谱筛选：分别挑取独立的菌落，培养后快速提取重组体DNA，用重组时所采用的限制酶切割后，进行琼脂糖凝胶电泳，可以从DNA片段的大小和有无判断所选的菌落是否为阳性克隆。e．核酸杂交筛选：将转化子DNA或克隆的DNA分子片段转移至合适的膜上，利用标记探针进行杂交，直接选择并鉴定目的基因。f．原位杂交筛选：是将待选菌在平板上培养成菌落，按相应位置（原位）转移至合适的膜上，经变性使膜上的DNA成单链，再与标记的探针（与目的基因互补）杂交，找出平板上的菌落位置，即为重组的阳性菌落。（2）免疫学方法筛选：利用特异抗体与目的基因表达产物的特异相互作用进行筛选。这种方法不直接鉴定基因，属非直接筛选法。分为免疫化学方法及酶联免疫检测分析等。基本的工作原理是将琼脂培养板上的转化子菌落经氯仿蒸汽裂解、释放抗原，再将固定有抗血清的膜覆盖在裂解菌落上，在膜上得到抗原抗体复合物，最后用合适的方法检出阳性反应菌落。

第五篇：基因的表达.教案

一、第四章 基因的表达

第一节 基因指导蛋白质的合成（一）教学目标

知识方面了解什么叫基因的表达； 大概了解基因指导蛋白质合成所要经历的两大过程；

详细学习RNA；

详细学习转录。

能力方面运用类比的方法，比较RNA和DNA之间的异同点； 学习观察转录的模拟图，并结合自己的空间想象力，理解并能熟练描述转录的 整个过程。

情感方面 通过学习基因的表达，了解恢复已经灭绝的生物，或者拯救濒危生物的途径之一

是利用它们的DNA的原因，增强学生对其他生物的保护意识。

二、教学重点，难点，以及解决方法

1教学重点

（1）RNA的结构，种类，以及它与DNA的区别

解决方法：学生首先带着教师提出的问题阅读教材，寻找答案；然后完成教师 设计的表格加强了解。

（2）转录的概念，所需条件和整个过程

解决方法：学生亦是首先带着教师提出的问题研读教材的文字和图形，然后讨论完成教师所设计的问题，最后，观察转录模拟图，自己表述整个过程。

教学难点

（1）

DNA和RNA的异同

解决方法：教师设计表格，学生讨论后自己完成。（3）转录过程中的碱基互补配对原则

解决方法：学生阅读教材，完成教师设计的填空题；教师多举例子，学生回答熟悉。

三、课时安排：2课时（此为第一课时）

四、学生活动：指导学生阅读教材，找出知识点，小组讨论，回答相关问题。

五、教学过程 导课:展示教材内容，明确本章和本节课所要学习的内容，由教材的“问题探讨”引

出本节课； 基因指导蛋白质合成的两的过程—转录和翻译； 由基因和蛋白质在细胞内存在的空间差异矛盾，引出“帮手”—RNA的学习。

（1）RNA的中文名称；

（2）RNA的基本单位；

（3）RNA和DNA的比较（填表格）

（4）RNA的种类 4 转录

（1）转录的概念；

（2）转录所需的原料，模板，能量，酶；

（3）转录的过程（完成填空）5 完成P64“思考与讨论” 6 课堂回顾

六、作业布置（略）

七、板书设计（略）

生物组

张亚