血液涂片的制作与染色

第一篇：血液涂片的制作与染色

血液涂片的制作与染色

日期:2010-06-04来源: 作者: 点击:10

31次

我要评论

腾讯微博 搜狐微分享到：检验微博

博

新浪微博 网易微博

QQ空间 朋友社区 人人网

核心提示:做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节

做好血液涂片和正确染色是血液细胞检验的重要步骤，涂片和染色效果的好坏直接关系着检验的结果，必须以认真负责的态度注意操作过程的每一个环节。一．玻片的清洁 1．一般清洗法

（1）将玻片放入肥皂或洗衣粉水中煮沸20 分钟。

（2）用热水将肥皂和血膜等污物洗去，再用自来水反复冲洗，最后再用蒸馏水冲洗3 ～5 次。必要时再置95%乙醇中浸泡1小时，然后擦干或烘干备用。新玻片常有游离碱质，因此应用清洁液或10 %盐酸浸泡24小时，然后分别用自来水及蒸馏水彻底洗涤。2．油污载片清洗法（1）清洗液

甲液：10g/L的过锰酸钾水溶液，乙液：25g/L的草酸水溶液。

（2）清洗方法：将用过的玻片投入甲液数小时，取出后再投入乙液数小时，然后用自来水和蒸馏水冲洗干净后再置95%乙醇中，以毛巾擦干净即成。久用后甲液可出现泥沙样沉淀，乙液有乳白色沉淀，可用棉花滤去再用，如乙液褪色应重新配置。二．血涂片制作

取末梢血1滴，置载玻片一端，取另一边缘光滑的推片，放在血滴前面慢慢后移，接触血滴后稍停。血液即沿推片散开，将推片与载片保持30 ～45°角，向前平稳均匀推动推片，载片上便留下一层薄血膜。血涂片制成后，立即在空气中挥动，使其迅速干燥，以免血细胞变形。血膜干燥后，用铅笔在血膜的一侧写上病人姓名或编号。

一张良好的血片，厚薄要适宜，头体尾要明显，细胞分布要均匀，膜的边缘要整齐，并留有一定的空隙。

涂片时，血滴愈大，角度愈大，推片速度愈快则血膜愈厚，反之血膜愈薄。太薄的血膜片50%的白细胞集中于边缘或尾部，不利于白细胞分类。如果血膜分布不匀，主要是推片不整齐，用力不均匀，载片不清洁所致。三．染色

1．瑞氏染色法（Wright staining）

本法的特点是将固定和染色合并在一起进行，手续简便，染色时间短，对白细胞中 的特异性颗粒着色较好，但对核的着色较差。

（1）原理 瑞氏染粉是由伊红和美蓝混合后组成的一种中性盐染料。伊红是一种酸性染料，为伊红钠盐，其有色部分为阴离子；美蓝是一种碱性染料，为氯化美蓝，有色基团为阳离 子。如以M+代表美蓝，以E-代表伊红，其反应式为： M+Cl-+Na+E→ ME↓+NaCl 美蓝 伊红 伊红化美蓝（瑞士染料）

将适量的ME溶解在甲醇中，即成为瑞氏染液。甲醇的作用可使ME溶解，解离为M+和E－，这两种有色离子可以选择性地吸附血细胞内的不同成分而着色。甲醇的另一个作用是有很强的脱水作用，可将细胞固定为一定形态，当细胞发生凝固时，蛋白质被沉淀为颗粒状或者网状结构，增加细胞结构的表面积，提高对染料的吸附作用，增强染色效果。细胞的着色过程是染料透入被染物并存留其内部的一种过程，此过程既有物理吸附作用，又有化学亲和作用。各种细胞及细胞的各种成分由于其化学性质不同，对各种染料的亲和力也不一样，因此，在血片上可以见到不同的着色。细胞中碱性物质与酸性染料伊红结合染成红色，因此该物质又称为嗜酸性物质。如，红细胞中的血红蛋白，嗜酸 性粒细胞胞浆中的颗粒为碱性物质，这些物质可与伊红结合染成红色。细胞中的酸性物质可与染液中的碱性染料美蓝结合染成蓝色，该物质又称嗜碱性物质，如：嗜碱性粒细胞中的颗粒为酸性物质可与碱性染料美蓝结合染成蓝色。细胞核主要由脱氧核糖核酸和 强碱性的组蛋白、精蛋白等形式的核蛋白所组成，这种强碱性的物质与瑞氏染液中的酸 性染料伊红结合成红色，但因为核蛋白中还有少量的弱酸性物质，它们又与染料中的碱 性染料美蓝作用染成蓝色。但因含量太少，蓝色反应极弱，故核染色呈现紫红色。幼稚 红细胞的胞浆和细胞核的核仁中含有酸性物质，它们与染液中的碱性染料美蓝有亲和 力，故染成蓝色。当细胞含酸、碱性物质各半时，它们既与酸性染料作用，又与碱性染 料作用，染成红蓝色或灰红色，即所谓多嗜性。当胞浆中的酸性物质消失时，只与染液 中的伊红起作用，则染成红色，即所谓正色性。（2）试剂 ①.瑞氏染液

瑞氏染料（粉）1．0g 纯甲醇（AR 级以上）600．0 ml 将全部染料放入乳钵内，先加少量甲醇慢慢地研磨（至少半小时），以使染料充分 溶解，再加一些甲醇混匀，然后将溶解的部分倒人洁净的棕色瓶内，乳钵内剩余的未溶 解的染料，再加入少许甲醇细研，如此多次研磨，直至染料全部溶解，甲醇用完为止。密闭保存。②.磷酸盐缓冲液（pH6．4 ～6．8）磷酸二氢钾（KH2PO4）0．3g 磷酸氢二钠（Na2 HPO4）0．2g 蒸馏水 加至1000．0ml 配好后用磷酸盐溶液校正pH，如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替。（3）操作

①用蜡笔在血膜两头划线，以防染液溢出，然后将血膜平放在染色架上。②用瑞氏染液3 ～5滴覆盖整个血膜，固定细胞0．5 ～1分钟。

③滴加等量或稍多的缓冲液，用吸球将其与染液吹匀，或者摇动玻片染色5 ～10分钟。④慢慢摇动玻片，然后用流动水从玻片的一侧冲去染液，待血片自然干燥后（或用滤纸吸干），即可镜检。

2．姬姆萨染色法（Giemsa staining）

（1）原理 姬姆萨染料由天青、伊红组成，其染色原理与瑞氏染色法基本相同，但姬姆萨染色

法对细胞核着色较好，结构显示更清晰，而对胞浆和中性颗粒则染色较差。（2）试剂

姬姆萨（Giemsa）染料 1．0g 甘油 66．0ml 甲醇 66．0ml 将1．0g 姬姆萨染料粉末全部倒入盛有66．0ml 甘油的圆锥烧瓶内，在56 ℃的水浴锅 上加热90 ～120 分钟，使染料与甘油充分混匀溶解，然后加入60 ℃预热的甲醇，充分摇 匀后置棕色瓶中，于室温下7 天，过滤后才能使用。此种染液放置时间愈久，细胞着色 越佳。（3）操作

①.将干燥血片用甲醇固定3 ～5 分钟。

②.将固定的血片置于被pH6．4 ～6．8 磷酸盐缓冲液（同瑞氏染色）稀释10 ～20 倍的 姬姆萨染液中，浸染10 ～30 分钟（标本较少可用滴染法）。③.取出用水冲洗，待干后镜检。3．瑞氏姬姆萨混合一次染色法

I 液：取瑞氏染粉1g、姬姆萨染粉0．3g，置洁净研钵中，加少量甲醇（分析纯）研 磨片刻，吸出上层染液。再加少量甲醇，继续研磨，再吸出上液。如此连续几次，共用 甲醇500ml，收集于棕色瓶中，每天早、晚各振摇3分钟，共5天，以后存放1周即能使用。Ⅱ液：pH6．4 ～6．8 磷酸盐缓冲液

磷酸二氢钾（无水）6．64g 磷酸氢二钾（无水）2．56g 加少量蒸馏水溶解，用磷酸盐调整pH，加水至1000ml。

操作平置玻片于染色架上，滴加染液3 ～5 滴，使其迅速盖满血膜，约1 分钟后，滴加缓冲液5 ～10 滴，轻轻摇动玻片或对准血片吹气，与染液充分混合，5 ～10分钟后 用水冲去染液，待干。四．血涂片的质量控制

1．血膜片的质量要求是厚薄均匀适度，低倍镜下观察全片，细胞不重叠，头尾及 两侧有一定的空隙，血膜头部有明确的病人标志。

2．些体积较大的特殊细胞常在血膜的尾部出现，因此蜡笔划线时应注意保存血膜 尾部细胞，血膜必须充分干燥，否则在染色过程中容易脱落。

3．配制染料须用优质甲醇，稀释染液用缓冲液，因为缓冲液的pH 对细胞染色的影响很重要。在偏酸性环境中正电荷增多，在偏碱性环境中负电荷增多，又因为细胞着色 对氢离子浓度十分敏感。如果染色偏碱，原是紫红色的中性颗粒则染成深蓝色，造成识 别困难。冲洗须用中性水，虽亦可用自来水（但不能保持稳定）。

4．对所用染液应进行预染试验，新配制的染液放置一段时间后其中的美蓝逐渐氧 化成天青B，天青B 对细胞核的着色效果比美蓝好，因此，瑞氏染液放置时间越长染色 效果越好，临床上称之为成熟。判断染液成熟程度的简易方法是用正常优质血片做预染 试验，先用低倍镜观察载有染液的血片，认为着色满意后，再按照染色后冲洗顺序最后 用油镜镜检，这样不仅可了解染液的成熟程度，而且还可以选择合适的染色时间，供临 床标本染色时参考。

5．染液与缓冲液的比例要适当，以1∶27 为宜。一般说来缓冲液稀释度愈大，染色 时间愈长，细胞着色愈匀称、鲜艳。缓冲液和染液量要充足，否则染液很快蒸发，染料 沉淀于细胞上，使细胞深染而无法检查。细胞较多较厚的涂片（如红细胞增多症）染液 应多些。细胞较少的涂片染液应少些。

6．染色时间与染液浓度、室温高低、细胞多少有关，染液愈淡，室温越低，细胞 愈多，所需时间越长，应适当增加染液浓度，因此必须根据情况灵活掌握。

7．染色良好的血膜片，外观呈浅红色，红细胞呈粉红色，白细胞核呈暗紫红色，染色质结构能辨，粒细胞的颗粒呈固有种异颜色。

(责任编辑：admin)

第二篇：HE染色与免疫组织化学染色实验报告

HE染色与免疫组织化学染色实验报告

实验目的及意义

1.1了解石蜡切片的制作过程

1.2

掌握HE染色与免疫组织化学染色的基本原理以及染色方法

1.3

熟悉HE染色与免疫组织化学染色后的读片知识

实验方法及步骤

2.1

石蜡切片制作及HE染色步骤

2.1.1取材与固定：

从人或动物新鲜尸体上取下组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。

2.1.2脱水透明：

一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。

2.1.3浸蜡包埋：

将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。

2.1.4切片前的准备工作：

先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡块，块两边必须切成平行的直线。将玻片擦洗干净后均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油，放置冰箱备用。

2.1.5切片与贴片：

将预冷的蜡块固定于切片机上，调节切片厚度为6微米，切成薄片。切下的薄片往往皱折，放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。

2.1.6

脱蜡至水

二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟，无水乙醇3分钟，95％酒精3分钟，80％酒精3分钟，70％酒精3分钟，自来水洗5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.7染色：

苏木素液7分钟，自来水洗5分钟，1％盐酸溶液分化30秒，自来水洗5分钟，1％氨水返蓝10秒，自来水洗20分钟，95％酒精3分钟，1％伊红酒精溶液2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.8脱水和透明：

95％酒精2分钟，无水酒精Ⅰ2分钟，无水酒精Ⅱ2分钟，二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.1.9封固：

将已透明的切片滴上中性树胶，盖上盖玻片封固，放入37℃烘箱。

2.2

SABC

染色步骤

2.2.1脱蜡至水：

二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ15分钟，100％酒精2分钟，95％酒精2分钟，80％酒精2分钟，70％酒精2分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.2.2流水冲洗5分钟（水流要小）

2.2.3用蒸馏水配置新鲜的3%双氧水（30%双氧水1：9配制，配100ml），室温封闭15分钟，注意避光。

2.2.4蒸馏水洗5分钟，重复2次。

2.2.5热抗原修复，将切片浸入0.01M枸盐酸盐缓冲液中，置微波炉内高火5分钟，低火20分钟，完后自然冷却。

2.2.6取出切片放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.7取出切片放入湿盒中，滴加5%BSA封闭液（覆盖满组织为宜），室温20分钟。

2.2.8甩去多余液体（擦去周围的流痕），滴加一抗（覆盖满组织为宜）注:阴性对照滴加PBS,放入4℃冰箱过夜。

2.2.9放入染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.10取出放入湿盒中滴加二抗（覆盖满组织为宜），室温30分钟。

2.2.11取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。放回湿盒中加SABC（覆盖满组织为宜），室温30分钟。

2.2.12取出置染色缸中PBS洗5分钟，重复3次。

2.2.13

DAB显色，取一试管加1ml单蒸水，B、C、A试剂按顺序各一滴加入试管中混匀，滴加于切片上，观察是否终止显色。

2.2.14终止显色用单蒸水洗5分钟，重复2次。

2.2.15苏木素衬染1分钟，流水冲洗5分钟。

2.2.16脱水透明，70％酒精3分钟，80％酒精2分钟，90％酒精2分钟，95％酒精2分钟，95％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅰ2分钟，100％酒精Ⅱ2分钟，100％酒精Ⅲ2分钟二甲苯Ⅰ8分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，依次按上述顺序加入相应试剂并作用相应时间。

2.2.17中性树胶封片，放入37℃烘箱。

实验结果

3.1

HE

染色结果

IB

IB

B

A

A

IB：

狂犬病毒包涵体（内基氏（Negri）小体）

图1

狂犬病毒感染后脑组织病变

HE染色

A:

小脑浦肯野细胞内包涵体x400;

B:

脑神经元内多处包涵体x400

狂犬病的病理变化在显微镜下主要表现为神经元退变,淋巴细胞和单核细胞浸润，胶质细胞增殖以及特征包涵体形成。狂犬病毒包涵体又称为内基体，直径

约3～10nm，边缘整齐，内有1～2个状似细胞核的小点,主要出现在大脑海马区及小脑，其他部位也可见，在病变神经元胞浆内成圆形或卵圆形，苏木素一伊红染色脑组织切片中呈嗜酸性反应，病变神经元可含包涵体。大脑海马区神经元和小脑浦肯野细胞胞浆内检出狂犬病病毒包涵体，伴脑组织淤血、水肿。神经元变性．

CP

D

C

B

A

CP：

豆状囊尾蚴虫卵的壳

图2

肝脏与肾脏的病变

HE染色

A:

豆状囊尾蚴在肝脏形成包囊x200;

B:

脑神经元内多处包涵体x400

C：肾小管结构模糊，破坏x200;

D:

肾小管上皮从基底膜脱落x400

囊尾蚴感染后肝脏的病理变化可分为一般性变化和特征性变化两种。一般性病理变化主要表现为肝细胞变性与间质性肝炎。颗粒变性：表现为肝细胞肿大，肝细胞中有蛋白性颗粒，肝窦隙变小。水泡变性：肝脏细胞肿大，细胞质有些溶解，较为透亮，但细胞核的位置多无改变，肝窦隙变小。脂肪变性：有程度不等的脂肪滴。脂肪变性和颗粒变性常见于同一肝脏。间质病变：表现为程度不等的间质性肝炎，在汇管区或小叶间有结缔组织增生和灶状淋巴细胞浸润，小叶间静脉扩张。小叶间胆管都有程度不等的增生，其数量增加。胆管上皮增生，单层变成两层甚至复层，胆管黏膜上皮变厚，胆管周围结缔组织明显增生，呈慢性胆管炎与胆管周围炎。特征性病理变化是肝组织形成肉芽肿。可能是幼虫移行对肝细胞造成损伤后在局部发生的慢性炎症反应。幼虫移行造成肝细胞坏死和少量出血，接着局部上皮样细胞增生，其间有异物巨细胞以及多少不等的中性粒细胞浸润。这些中性粒细胞大多在结节外侧分布，在肉芽肿外围是结缔组织构成的包囊，包囊内分布着许多空壳样结构以及均质红染的椭圆形的虫卵。

肾脏的病变主要集中在大量的肾小管上皮从基底膜上脱落，肾小球囊腔变大，肾小球萎缩变小，血管球数目减少，肾小囊囊壁增厚。由于没有见到明显的炎性细胞的浸润，主要变现肾小管的病变，所以推断可能是肾病。而引起的原因也可能是多方面的，如临床的升汞急性中毒便会引起相应的病变。

C

B

A

图3

肺脏形成的霉菌结节

HE染色

A:

肺泡结构大面积的消失x80;

B:

霉菌结节的炎性反应带x200

C：肺脏的霉菌结节x400

肺脏的病理变化：肺细支气管及其周围小叶内都可看到很多肉芽肿。肉芽肿的中心含有细胞崩解物一嗜酸性坏死块占据，其周围为淋巴球、组织球等单核细胞。再往外，还可看到多核巨细胞及其上皮细胞。结节则可波及两个或两个以上的肺

小叶，使其固有结构完全遭到破坏。较小的结节是由上皮样细胞、巨细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、数量不等的假性嗜伊红细胞和排列疏松的网状结构构成，巨细胞的位置不定，有的在结节中心，有的偏向边沿，数量和核的多少也不等。大的结节内细胞成分与小结节相同，但在排列上有一定的层次性，中心多为干酪样坏死区，外围是核巨细胞构成的细胞带，最外层是淋巴样细胞、成纤维细胞所形成的包膜。同样结节中也有数量不等的假性嗜伊红细胞和不规则排列的纤维素。结界中有时可见不同程度的出血。但没有发现很明显的淡染的菌丝体，可能是由于组织过厚，细胞成分过多，颜色过深，将菌丝体遮盖了，故难于发现。

3.2

SABC

染色结果

B

A

D

C

图4

Ki67蛋白在乳腺上皮的表达（SABC染色）

A:

乳腺组织Ki67阴性（核内）x400;B:

乳腺组织Ki67阴性（核内）x100

C:

乳腺组织Ki67阳性（核内）x400;

D:

乳腺组织Ki67阴性（核内）x200

Ki67抗原是1983年由Gerdes等发现在增殖细胞中表达的一种核抗原，也是目前较为肯定的核增殖标志物。Ki67是一个标记细胞增殖状况的常用指标，尤其经常用于反映恶性肿瘤细胞的增殖状况。Ki67在正常乳腺组织有表达，但在从正常乳腺或是纤维腺瘤及增生上皮来的样本显示，ki67表达的水平极低。Ki67高表达与乳腺癌恶性程度成正相关，Ki67在细胞核内的定位形式复杂又有特异性，并随细胞周期改变。Ki67作为一种与细胞周期相关的增殖细胞核蛋白，只与增生细胞核反应，无组织特异性，是一个界定细胞凋亡和增殖的有价值的标记物。Ki67能准确地反映肿瘤细胞的增殖活性，并与多种肿瘤的发展、转移及预后有关，除细胞周期的G0期外，在每个有丝分裂期都可检测到Ki67，尤以M期为最高，可直接、敏感地反映肿瘤细胞的增殖活性，并能较全面地反映增殖细胞的数量。其高阳性表达可反映肿瘤细胞的增殖和侵袭能力强，恶性程度高。在浸润性乳腺癌中发现Ki67与肿瘤细胞增殖及侵袭转移密切相关。部分学者认为Ki67表达与乳腺癌肿瘤临床分期有关，即分期越晚，Ki67阳性率越高。Ki67与肿瘤恶性程度呈正比与肿瘤的生长、侵袭及转移能力密切相关，是乳腺癌诊断和预后判断的一项重要指标。Ki67表达阳性的乳腺癌肿瘤细胞的恶性程度大，细胞增殖活跃,肿瘤生长速度快侵袭性大，转移的机会高，预后差。Ki67高表达是乳腺癌预后不良的指标。

小结

4.1石蜡切片制作的体会

石蜡切片是组织学常规制片技术中最为广泛应用的方法。石蜡切片不仅用于观察正常细胞组织的形态结构，也是病理学和法医学等学科用以研究、观察及判断细胞组织的形态变化的主要方法，而且也已相当广泛地用于其他许多学科领域的研究中。下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。

4.1.1取材应根据要求选取材料来源及部位。

4.1.2固定用适当的化学药液（固定液）浸渍切成小块组织材料，并选择合适固定液量以及固定时间。

4.1.3.脱水透明，固定后的组织材料需除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染色效果。脱水时间长短应根据组织厚度，组织较薄或小，脱水时间不宜过长，否则组织会出现过硬或过脆的现象；组织厚度大时相对要求时间长些。透明时要注意：①

要保证最后一级纯酒精的浓度，使组织彻底脱水，否则在二甲苯内就不能得到完全透明。②

切片从纯酒精取出后进入二甲苯时，在空气中停留的时间不宜过长，特别是在阴天，空气湿度较大时，因纯酒精吸水性较强，致使切片进入二甲苯时其表面出现雾状而使切片透明不良。

4.1.4浸蜡要掌握时间，过短石蜡没有完全渗入组织中，会出现组织过软，切片困难。过长会造成组织硬脆，切片也难。组织包埋时要掌握好标本切面，选择较完整平坦面为切面，切面朝下。小标本包埋速度应快，否则易造成组织块与

周围石蜡的脱裂，包埋好的蜡块放置4℃冰箱中过夜，便于切片。

4.1.5切片

包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多由切片刀不锋利所致。刀有缺口时，易造成断裂、破碎和不完整。切片时组织块固定不牢时，切片上常形成横纹及切片厚薄不均。因此刀放置的要有合适的夹角。为保证切片的完整性，对于组织结构致密的组织如淋巴结等应适当薄切以防细胞成分叠加，影响观察效果。遇到硬化过度的肝、脾、脑等组织时应轻轻切削，以防组织由于震动产生空洞现象。

4.1.6贴片与烤片，用蛋白甘油作为粘附剂，在洁净的载玻片上涂抹薄层蛋白甘油，防止蛋白甘油吸附过多，在染色时出现脱片现象。

4.2应用HE染色的体会

苏木精—伊红染色法简称HE染色法，它是最常用的普通染色方法。苏木精（hematoxylin）是阳离子染料，将细胞核内的嗜碱性物质染成蓝紫色。伊红（eosin）是阴离子染料，将细胞质和胶原纤维等染成粉红色。虽然HE染色是一种十分常见的染色方法，但对于不同的组织，其脱水，染色，透明等步骤的具体时间有所不同，很多环节还有待进一步摸索。

下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。

4.2.1染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长，组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液

中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

4.2.2苏木精染色后，分色是至关重要的，应该在显微镜下进行。一般以细胞核染色比较清晰，细胞质等基本无色为宜。如发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新进行染色后再分色，总之必需分色至细胞核清晰而背景基本无色才能往下进行。

4.2.3切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。

4.2.4在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响神经元形态。

4.2.5切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

4.2.6最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

4.3应用SABC法进行免疫组化染色的体会

SABC（Strept

Actividin-Biotin

Complex）法是一种显示组织和细胞中抗原分布的简便而敏感的免疫组化染色方法。由于该方法中的链霉亲和素的等电点接近中性（pH=6.0-6.5），对组织和细胞的吸附性特别低，因而具有较低的背景。它的步骤与其他免疫组化染色基本相似，有良好的可操作性。尽管SABC法操作简便，敏感性强，但是，在操作中仍然要遵循一定的原则，才能得到可信度高的结果。

下面就按照实验步骤，谈一下我的一些体会。

4.3.1试验前要先做好标记，以防滴加试剂时出现混乱。

4.3.2切片常规脱蜡至水：二甲苯虽然可以反复使用，但次数不宜多。乙醇的浓度是从高到低，与脱水时相反。

4.3.3灭活内源性酶：使用30%双氧水和蒸馏水按1:9的溶剂比混合较为理想。

4.3.4抗原修复：由于Ki67蛋白在细胞核内表达，可进行热修复抗原。

4.3.5正常犊牛血清封闭：封闭时应该注意室温与时间的相对关系。室温低，时间就要长一些，反之亦然。另外，保持反应池湿润是重要的一环，否则，前功尽弃。后面的步骤也是如此。

4.3.6一抗的浓度：这需要自行探索，虽然试剂公司给出了参考浓度，但仍然要探索出恰当的浓度，任何取巧的念头都是得不偿失的。孵育时间与温度：抗原抗体充分反应是得到可靠结果的关键。因此，控制温度与时间也是一个严肃的问题。由于室温控制较为困难，可放在4℃冰箱过夜（≥18h）

4.3.7滴加BSA、一抗、二抗、SABC等要以覆盖满组织为宜。

4.3.8所有的反应均应在湿盒中进行，PBS洗切片时要将组织完全浸润在液体中。

4.3.9DAB显色镜下控时：DAB浓度应该比推荐的要低一些，这样可以便于控制反应时间以及在合适的时候中止反应。同时注意，使用后残余的DAB应妥善处理，而不是随便倒入下水道，因为它可能有致癌性。

4.3.10脱水透明：脱水乙醇的浓度由低到高，有一个较准确判断脱水成功与否的办法是：观察透明后盛二甲苯容器的壁，若发现白色雾状现象，则说明脱水不成功，应再次脱水。透明时间不要太长，1分钟左右就可以了。

4.3.11封片：封片时，中性树脂量宜少，同时注意不要产生气泡。

4.4在整个实验过程中，要注意的方面

4.4.1要设立对照，以及做好记录，以便于在问题产生时查找原因。

4.4.2注意时间与温度的相对关系，留心试验过程，优化试验结果。

4.4.3要提前准备：例如各种浓度的乙醇要提前准备好，孵育设备提前开机等，都要考虑周到，否则会影响实验的进程，甚至影响实验的结果。

4.4.4准备一份操作流程图，按部就班做实验，同时也有利于查找失败的原因.华中农业大学动物科技动物医学院

文档内容仅供参考，如果您需解决具体问题，建议您详细咨询相关领域专业人士。

第三篇：实验六ABO血型鉴定、血涂片的制作与血细胞显微观察(精)

实验六：ABO血型鉴定、血涂片的制作与血细胞显微观察

一、实验目的.了解 ABO 和 Rh 血型分类系统的背景知识和遗传学原理 2.掌握微量采血及血涂片的制作方法

3.学习使用光学显微镜观察和区分红细胞与各种白细胞

二、实验材料

1.实验材料 ：医用采血针、酒精棉球、载玻片、血推片、消毒牙签 2.实验试剂： 瑞氏染液、抗 B 血清、抗 A 血清、生理盐水、蒸馏水 3.仪器设备： Motic 光学显微镜

三、实验内容和方法 ABO 血型鉴定

1.1 取一块清洁玻片，用记号笔标上记号。

1.2 用小滴管吸 A 型标准血清（抗 B）一滴加入左侧，用另一小滴管吸 B 型标准血清（抗 A）一滴加入右侧

1.3 以穿刺法自左手无名指指尖取血，在玻片的每侧各放入一小滴血，用牙签搅拌，使每侧抗血清和血液混和。每边用一支牙签，切勿混用。

1.4 静置室温下 10—15min 后，观察有无凝集现象，并据此判断血型。2 血涂片的制作及血细胞观察

2.1 取末捎血一滴置于玻片的一端 , 左手持载玻片 , 右手以边缘平滑的推片的一端从血滴前方后移接触血滴，血滴即沿推片散开。然后便推片与载片夹角保持 30-45 度平稳地向前移动 , 载片上保留下一薄层血膜

2.2 血涂片制成后可手持玻片在空气中挥动 , 使血膜迅速干燥 , 以免血细胞皱缩.2.3 用蜡笔在血膜两侧划线 , 以防染液溢出 , 然后将血膜平放在染色架上.加瑞氏

染液 2-3 滴 , 使覆盖整个血膜 , 固定 0.5-1.0 分钟.滴加等量或稍多的新鲜蒸馏水 , 与染料混匀染色 5-10 分钟.2.4 用清水冲去染液 , 待自然干燥后或用吸水纸吸干 , 即可置血涂片于显微镜下进行镜检。

2.5 白细胞分类计数: 选择涂片的体尾交界处染色良好的区域 , 在油镜下计数 100 个红细胞 , 按其形态特征进行分类计数 , 求出各类细胞所占比值。

注：

1.瑞氏染液 : 瑞氏染料 1g 加甲醇(AR)600ML。将瑞氏染料放在清洁干燥乳钵中 , 加少量甲醇 , 充分研磨使染料溶解.将已完全溶解的部分倒入棕色试剂瓶中 , 未溶解部分再加少量甲醇研磨 , 直至染料完全溶解于甲醇为止.新配制的染料偏碱 , 须在室温和 37℃ 下一定时间待染料成熟 , 主要美蓝逐渐增多为天青 B 后才能使用.贮存时间越久染色效果越好 , 因此 ,Deamgilliland 等采用吸光度比值(rA)作为瑞氏染料的质量规格.rA 测定方法如下 : 取瑞氏染液 15-25ul(视染液浓度而定)加甲醇 10ml 稀释 , 混匀后以甲醇为空白管分别以波长 650nm,525nm 比色 ,rA=A650/A525。因为美蓝吸收峰为波长 650nm, 伊红吸收峰波长为 525nm, 天青 B 吸收峰也为 650nm, 但吸光度 A 约为美蓝的一半.所以新配制染料的 RA 接近2, 随着美蓝逐渐氧化为天青 B,RA 也相应下降 ,RA 下降达 1.3±0.1 即可使用.瑞氏染料在贮存过程中必须塞严 , 以防甲醇挥发和氧化为甲酸.有人主张配方中加入 30ml 甘油 , 防止甲酸挥发 , 并可使细胞染色清晰.甲醇必须纯净 , 如甲醇中丙酮含量过多 , 染色偏酸 , 使细胞着色不良.2.磷酸盐缓冲液(PH6.4-6.8)：磷酸二氢钾 0.3g 加磷酸氢二钠 0.2g 再加蒸馏水至 1000ml, 配制成磷酸盐缓冲液调整 PH, 如无缓冲液可用新鲜蒸馏水代替.3.白细胞分类计数正常参考值 细胞类别 成人

杆状核 0.01-0.05 分叶核 0.50-0.70

嗜酸性粒细胞 0.005-0.05 嗜碱性粒细胞 0-0.01 淋巴细胞 0.20-0.40 单核细胞 0.03-0.08

四、注意事项

1)玻片的清洗：新玻片常有游离碱质 , 因此应用清洗液或 10% 盐酸浸泡 24 小时 , 然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸 20 分钟 , 再用热水将肥皂和血膜洗去 , 用自来水反复冲洗 , 必要时再置 95% 乙醇中浸泡 1 小时 , 然后擦干或烤干备用。使用玻片时只能手持玻片边缘 , 切勿触及玻片表面;, 以保持玻片清洁 , 干燥 , 中性、无油腻。

2)细胞染色对氢离子浓度十分敏感 , 在染色过程中玻片必须化学清洁 , 配制瑞氏染液必须用优质甲醇 , 稀释染液必须用缓冲液 , 冲洗用水应近中性 , 否则各种细胞染色反应异常 , 致使细胞的识别困难 , 甚至造成错误。

3)一张良好的血片 , 要求厚薄适宜 , 头体尾分明 , 分布均匀 , 边缘整齐 , 两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色 , 以免细胞溶解和发生退行性变。

4)血膜未干透 , 细胞尚未牢固附在玻片上 , 在染色过程中容易脱落 , 因此血膜必需充分干燥.5)染色时间与染液浓度 , 室温高低 , 细胞多少有关.染液越淡 , 室温越低 , 细胞越多 , 所需染色时间越长或应适当增加染液量 , 因此染色时间应视具体情况而定.特别是更换新染料时必须经试染 , 摸索最佳染色条件.6)染液不可过少 , 以防蒸发干燥染料沉着于血片上难冲洗干净.7)冲洗时应用流水将染液冲去.不能先倒掉染液 , 以免染料沉着于血片上.8)染色过深可用甲醇或酒精适当脱色 , 最好不复染 , 必须复染时 , 可将染液先稀释好再复染.9)染色时应注意保护血膜尾部细胞 , 不能划掉.因为体积较大细胞常在此处出现.染色结果 : 在正常情况下血膜外观为粉红色 , 在显微镜下红细胞呈肉红色；白细胞胞浆能显示各种细胞的特有色彩 , 细胞核染紫红色 , 染色质清楚 , 粗细松紧可辨。染色结果偏酸 , 则红细胞和嗜酸性粒细胞颗粒偏红 , 白细胞核呈浅蓝色或不着色；染色结果偏碱 , 则所有细胞染成灰蓝色 , 颗粒深暗，嗜酸性颗粒可染成暗褐色 , 甚至紫黑色或蓝色。嗜中性颗粒偏粗 , 偏碱(紫黑色).血片原处呈绿色.五、思考题

(1)如何区别血液的凝集和凝固？其机理有何差别？

(2)根据你的血型，判断你能接受何种血型并且能够给何种血型供血？

(3)O 型血人又被称为“万能供血者”，试根据 ABO 血型分型作出你对这一说法的理解(4)试根据父母的血型，写出后代的可能血型：

第四篇：细菌细胞壁与革兰氏染色-讲稿

讲稿-常祖明

上节课回顾

上节课我们主要讲了细菌的基本形态，细菌根据其基本形态分为三种，球菌、杆菌和螺旋菌。下面我们简单回顾一下这三类细菌。

首先是球菌，球菌根据其分裂的方向和分裂后连接的方式分为下图几类，单球菌、双球菌、四联球菌、八叠球菌和葡萄球菌。

其次是杆菌，杆菌是细菌中种类最多的类型。其菌体细胞的形状有下面几种，短杆状、棒状、梭状、分支状、螺杆状、竹节状等。

最后一类是螺旋菌，螺旋菌根据其螺旋的环数多少分成三类，不到一环的是弧菌、2-6环为螺旋菌、6环以上为螺旋体。

当然，细菌不只有这三种基本的形态，还有一些特殊的形态，种类极少，像丝状和方形细菌。

在介绍细菌的细胞壁之前，我们首先来了解一下细菌的基本结构，如图，细菌细胞的结构分为一般结构和特殊结构，一般结构是所有细菌所共有的结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞质和细胞核。从这张模式图上我们可以看到细菌的细胞和真核生物的细胞最大的不同就是无核膜。

而特殊结构只有部分细菌具有或者某些细菌在特殊的条件下产生，主要有四类，即荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢。下面我们通过图片了解一下这四类页数结构。

荚膜是某些细菌在生长繁殖过程中能合成,并向细胞壁外分泌一层疏松透明的粘液状质，厚者为荚膜；薄者微荚膜，般染色法不易着色，光镜下呈透明圈。

鞭毛是伸出于菌体表面细长弯曲的丝状物，鞭毛为细菌的运动器官。

菌毛较鞭毛更细、短、直、数目多，必须用电子显微镜观察，菌毛和鞭毛的区别，举一个例子，鞭毛就像人的四肢，具有运动功能，而菌毛则像人的头发、汗毛。

芽孢则是某些细菌在生长发育后期，在细胞内形成的一个圆形或椭圆形，厚壁，含水量低，抗逆性强的休眠体构造。

我们在这里先简单介绍一些这四类特殊构造的基本形态，它们具体的结构和功能我们在后面还会专门讲到。

在细菌的结构中，最重要的就是细胞壁，这是本章的最重要的知识点，也是本课程的重点内容。我们先来了解一下细胞壁的概念。细胞壁是位于细胞表面，内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧，略具弹性的细胞结构。在这个概念中，大家要注意几点，一是位于细胞表面而不是细胞最外层，有点教材上的概念就是最外层，这个说法不够确切，因为刚刚我们讲到了有些细菌的最外层是荚膜。二是紧贴细胞膜说的是它的位置，虽然紧贴，但可以用质壁分离的方法把它们分离开，便于观察细胞壁。三是细胞壁的基本特点，坚韧略具弹性，这个特点可以保护细菌当低渗环境中膨胀而不破裂。

细胞壁对于细菌非常的重要，下面我们就来介绍一下细胞壁的功能。

（1）固定细胞外形和提高机械强度；细菌呈现各种外形一种很重要的原因就是有细胞壁，比如一个杆状细菌，除去细胞壁后的原生质体会变成球型。提高机械强度，我们刚才从细胞壁的概念上讲到了细胞壁的基本特点是坚韧略具弹性，包含细胞吸水膨胀不破裂，比如大肠杆菌的细胞壁能够承受2个大气压的压力，相当于汽车内胎的压力。举例：细胞壁就相当于自行车的外车胎，如果外胎破损了，内胎很容易炸。

（2）为细胞的生长、分裂和鞭毛运动所必需；

首先解释和生长的关系，随着细菌的生长变大，细胞壁也会随着变大，否则细菌就永远一个大小了。和分裂的关系，上节课我们讲了细菌是以二等分裂繁殖的，在这个过程中，中间部分的细胞壁后凹陷分离成两个细菌。和鞭毛运动的关系，后面我们会学到细菌的鞭毛是生长在细胞膜上的，但鞭毛的运动支点是由细胞壁提供的。可以通过实验证实，当细菌失去细胞壁后，它的鞭毛将不能运动。举例：头发长在头皮上，头发自己是不会动的，但中间加一把梳子就能摆动头发，梳子就相当于细胞壁，头皮就相当于细胞膜。

（3）渗透屏障，阻拦抗生素等大分子物质（分子量大于800）进入细胞，保护细胞免受溶菌酶、消化酶和青霉素等有害物质的损伤；细胞壁是一层网格状结构，就像一层防护网罩在细胞表面，阻拦抗生素等大分子物质对细菌的伤害。细胞壁相当于细菌的防盗网。

（4）细菌特定的抗原性、致病性以及对抗生素和噬菌体的敏感性的物质基础；

细菌的抗原性与细胞壁有关，例如一些致病菌侵入人体后会使人产生抗体，促使人产生抗体的物质就是抗原，细菌的抗原就是由细胞壁提供给的。细菌侵入人体生长繁殖会产生一些对人有刺激性的毒素，这些毒素也是由细胞壁提供的。一些抗生素如青霉素杀菌原理就是通过破坏细胞壁来杀死细菌。噬菌体进入细菌内时需要一把钥匙，这把钥匙就存在于细胞壁上，噬菌体需要先识别细胞壁上的这些钥匙才能进入细菌内。革兰氏染色：

正染色和负染色：而背景因未被染色而呈光亮，这种染色称为正染色。而负染色则相反，由于染液中某些电子密度高的物质(如重金属盐等)“包埋”低电子密度的样品，结果在图像中背景是黑暗的，而样品像“透明”地光亮。两者之间的反差正好相反，故称为负染色。

革兰氏染色在细菌分类上的地位就像把人分成男女，把动物分成雌雄一样。

在脱色过程中，可能因为脱色过度，将革兰氏阳性菌脱色，也可能脱色不够，革兰氏阴性菌未脱色，所以做革兰氏染色时注意作对照，对照有两种方法，一种是混合法，就是找一种和要鉴定的菌不同形状的已知菌作对照，混合染色。另一种是在同一个载玻片上设对照。

直到1983年，用铂代替碘液对细菌进行染色后在电镜下观察，发现染色的不同跟细胞壁的构造有关。

革兰氏染色原理： G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。

Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后呈红色。

革兰氏阳性菌的细胞壁结构：

成分的区别：细菌-肽聚糖，真菌-几丁质，植物细胞-纤维素和果胶质。

细胞壁的机械强度有赖于肽聚糖的存在。合成肽聚糖是原核生物特有的能力。

细胞壁的厚度一般在10～25纳米之间，约占细胞总体积的20%。

凡能破坏肽聚糖结构或抑制其合成的物质，大多能损伤细菌细胞壁而杀伤细菌，如溶菌酶、青霉素等。溶菌酶水解的是β-1,4糖苷键，青霉素攻击肽尾和肽桥连接的部分转肽酶。

肽桥就像钢筋把各条聚糖N-乙酰胞壁酸上的肽尾连接起来，形成一种牢固的网状结构。

N-乙酰胞壁酸是原核生物特有的己糖。

只有细菌的细胞壁含有肽聚糖。

磷壁酸使细胞壁形成一个负电荷环境，所以碱性燃料更有利于染色。

S.aureus 金黄葡萄球菌

在N-乙酰胞壁酸上的四肽尾为L-Ala（丙氨酸）→ D-Glu（谷氨酸）→ L-Lys（赖氨酸）→ D-Ala（丙氨酸）

金黄色葡萄球菌的肽桥为五个甘氨酸组成的五肽，交联的肽链占肽链总数的 75～100％。立体的交联使肽聚糖形成多层次网状结构。

肽键(peptide bond)一分子氨基酸的α－羧基和一分子氨基酸的α－氨基脱水缩合形成的酰胺键，即-CO-NH-。氨基酸借肽键联结成多肽链。

一个氨基酸不能称为肽，也不能合成肽，必须是两个或两个以上氨基酸以肽键相连的化合物。两个氨基酸以肽键相连的化合物称为二肽；三个氨基酸以肽键相连的化合物称为三肽，以此类推。

α/β指C1、C5基团同侧/异侧位。

一个手性碳原子可以有两种构型，所以，含有一个手性碳原子的化合物有两种构型不同的分子，它们组成一对对映异构体，一个使偏振光右旋D，另一个使偏振光左旋L。

人体是左旋还是右旋？

生命最基本的东西氨基酸也有手性（左右）之分。检验手性的最好方法就是，让一束偏振光通过它，使偏振光发生左旋的是左旋氨基酸，反之则是右旋氨基酸。通过这种方法的检验，人们发现了一个令人震惊的事实，那就是除了少数动物或昆虫的特定器官内含有少量的右旋氨基酸之外，组成地球生命体的几乎都是左旋氨基酸，而没有右旋氨基酸！

右旋体有什么危害？

右旋分子是人体生命的克星，因为人是由左旋氨基酸组成的生命体，它不能很好地代谢右旋分子，所以食用含有右旋分子的药物就会成为负担，甚至造成对生命体的损害。上个世纪60年代，有一个叫典子的日本姑娘，她天生没有双臂，可是她用双脚学会了写字、做饭、穿衣，而且还学会了游泳，完全做到了生活自理。她的事迹感动了许许多多的人，人们在关心典子的同时也不禁会问；典子的父母都是健康的正常人，为什么典子会天生没有双臂呢？与不幸的典子一样来到这个世界的残疾婴儿在全世界有好几万。后来发现，之所以会发生这样的悲剧只因为她的母亲服用了一种叫“反应停”的药物。反应停里的一种分子具有治疗作用，可以减轻孕妇的早期妊娠反应，但是它的对映体（右旋体）却使用药的母亲生下了残疾的孩子。

为什么药物必须考虑手性问题？

正是有了60年代的这个教训，所以现在的药物在研制成功后，都要经过严格的生物活性和毒性试验，以避免其中所含的另一种手性分子对人体的危害。在化学合成中，这两种分子出现的比例是相等的，所以对于医药公司来说，每生产一种药物，最好要把另一半分离出来。但是，这个造福人类的技术还被某些国家所垄断，人们只好多花钱才能享受到。如已经用于临床的降血压“左旋氨氯地平”，治疗甲减的“左旋甲状腺素”，抗菌的“左旋氧佛沙星”等。

甘油磷酸是细菌细胞壁磷壁酸的主要成分之一。

细菌保存法：时间最久的是冻干保存法，将菌液和脱脂奶粉混合冻干真空，-80℃保存。

Mg2+是酶的一种辅助因子，没有它，酶的活性发挥不出来；两者必须在适当的比例下，才能发挥出良好的功效；

磷壁酸抗原性很强，是革兰氏阳性菌的重要表面抗原；在调节离子通过粘液层中起作用；也可能与某些酶的活性有关；某些细菌的磷壁酸，能粘附在人类细胞表面，其作用类似菌毛，可能与致病性有关。

自溶素是细菌自身产生的可降解细菌细胞壁的蛋白水解酶，与细菌细胞分裂、生物膜形成、表面黏附、遗传感受态和细胞壁更新有关。自溶素的活性受到严格调控。

周质酶位于细菌细胞壁和细胞膜之间的酶。

一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。另一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A成分。类脂A是脂化的葡萄胺二糖，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。

抗原决定簇（antigenic determinant）：决定抗原性的特殊化学基团。又称抗原表位。抗原决定簇大多存在于抗原物质的表面，有些存在于抗原物质的内部，须经酶或其他方式处理后才暴露出来。一个天然抗原物质可有多种和多个决定簇。抗原分子越大，决定簇的数目越多。

第五篇：血液标本采集与处理

血液标本采集与处理

一：静脉采血法

（一）普通采血法 试剂与器材 1．30g/L碘酊。2.75%乙醇。

3.其他 一次性注射器，压脉带，垫枕，试管，消消毒棉签。操作

1.取试管一支（需抗凝者应加相应抗凝剂）。

2.打开一次性注射器包装，取下针头无菌帽，将针头与针筒链接，针头斜面对准针筒刻度，抽拉针栓检查有无阻塞和漏气，排尽注射器内的空气，套上针头无菌帽，备用。3.受检者取坐位，前臂水平伸直置于桌面枕垫上，选择容易固定、明显可见的肘前静脉或手背静脉，幼儿可用颈外静脉采血。

4.用30g/L碘酊自所选静脉穿刺处从内向外、顺时针方向消毒皮肤，待碘酊挥发后，再用75%乙醇以同样方式脱碘，待干。

5.在穿刺点上方约6CM处系紧压脉带，瞩受检者紧握拳头，使静脉充盈显露。

6.取下针头无菌帽，以左手拇指固定静脉穿刺部位下端，右手拇指和中指持注射器针筒，市指固定针头下座，针头斜面和针筒刻度向上，沿静脉走向使针头与皮肤呈30度角，快速刺入皮肤，然后成5度角向前刺破静脉壁进入静脉腔。见回血后，将针头顺势深入少许。穿刺成功后右手固定注射器，左手松压脉带后，再缓缓抽动注射器针栓至所需血量。受检者松拳，消毒干棉球压住穿刺孔，拔出针头。瞩受检者继续压按针孔数分钟。

7.取下注射器针头，将血液沿试管壁缓缓注入试管中。抗凝血需立即轻轻摇匀，盖紧试管塞，及时送检。《附注》

1:采血部位通常选择肘前静脉，如此处静脉不明显，可采用手背，手腕，腘窝和外踝部静脉。幼儿可采用颈外静脉。2：采血一般取坐位或卧位。体位影响水分在血管内外的分布，从而影响被测血液成分浓度。

3：压脉带捆扎时间不应超过1分，否则会使血液成分浓度发生改变。

4：血液注入试管前应先取下注射器针头，然后将血液沿试管壁缓缓注入试管中，防止溶血和泡沫产生。需要抗凝时应与抗凝剂混匀，切勿用力震荡试管。

5：如遇受检者发生晕针，应立即拔出针头，让其平卧。必要时可用拇指压掐或针刺人中，合谷等穴位，或嗅吸芳香酊等药物。

二，真空采血管采血法 原理

将有头盖胶塞的采血试管预先抽成不同的真空度，利用其负压自动定量采集静脉血样。试剂与器材

目前真空采血器有软接式双向采血针系统（头皮静脉双向采血式）和硬接式双向采血针系统（套筒双向采血式）两种，都是一端为穿刺针，另一端为刺塞针。另附不同用处的一次性真空采血管，有的加有不同抗凝剂，或其他添加剂，均均用不同颜色头盖标记便于识别。真空采血法复合生物安全措施。操作

一：消毒：为受检者选静脉与消毒

二：采血

1：软接式双向采血针系统采血，拔除采血穿刺针的护套，以左手固定受检者的前臂，右手拇指和示指持穿刺针，沿静脉走向使针头与皮肤呈30度，快速刺入皮肤，然后成5度角向前刺破静脉壁进入静脉腔，见回血后将刺塞针端直接刺穿真空采血管盖中央的胶塞中，血液自动流入试管内，如需多管血样，将刺塞端拔出，刺入另一真空采血管即可。达到采血量后，松压脉带，瞩受检者松拳，拔下刺塞端的采血试管。将消毒干棉球压住穿刺孔，立即拔出穿刺针，瞩受检者继续按压针孔数分钟。2：硬连接式双向采血针系统采血:静脉穿刺如上：采血时将真空采血试管拧入硬连接式双向采血针的刺塞针端中，静脉血就会自动流入采血试管中，拔下采血试管后，再拔出穿刺针头。3：抗凝血

须立即混匀。附注

1.使用真空采血器前应仔细阅读厂家说明书，严格按说明书要求操作。

2.尽量选粗大的静脉进行穿刺。

3.刺塞针端的乳胶套能防止拔出采血试管后继续流血污染周围，达到封闭采血防止污染环境的作用，因此不可取下乳胶套。

4.带乳胶套的刺塞端须从真空采血试管的胶塞中心垂直穿刺。

5.采血完毕后，先拔下刺塞端的采血试管，后拔穿刺针端。6.使用前勿松动一次性真空采血管盖塞，以防采血量不准。

7.如果一次采血要求采取几个标准时，应按以下顺序采血：血培养管，无抗凝剂及添加剂管，凝血象管，有抗凝剂管。