生物技术制药第二版总结

第一篇：生物技术制药第二版总结

生物技术制药 第一章

绪论 要求：

1、熟悉生物技术制药的基本概念

2、熟悉生物技术药物的特点

3、了解生物技术领域及生物制药产业的发展现状

1、生物技术制药:就是利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程技术、等来研究和开发药物，用来诊断、治疗和预防疾病的发生。

2、生物技术药物（biopharmaceutics）是利用生物体、生物组织、细胞或其他组分，综合应用生物学与医学、生物化学与分子生物学、微生物学与免疫学、物理化学与工程学和药学的基本原理与方法加工制造而成的一大类用于预防、诊断、治疗和康复保健的制品。

特性 药理学特性

1、药理活性高

2、治疗的针对性强，治疗的生理、生化机制合理，疗效可靠

3、毒副作用小，营养价值高

4、生理副作用常有发生 理化与生物学特性

1、生物材料中含量低，杂质多，分离提取工艺复杂

2、生物活性物质结构复杂、稳定性差

3、生物材料易染菌、腐败

4、生物技术药物制剂有特殊要求

3、传统生物技术的技术特征是酿造技术

4、近代生物技术的技术特点是微生物发酵技术

5、现代生物技术的技术特征是以基因工程为首要标志

6、生物医药产业的特点：生物医药产业投资大、风险高、周期长。收益高

第二章

基因工程制药 基因工程的概念。

基因工程的原理和技术。基因工程制药——6大步骤

掌握：基因工程、载体的概念；基因工程的原理；常用载体和表达系统的类型。

2、熟悉：基因工程制药的基本流程；目的基因制备、链接的方法；重组基因导入宿主的方法；重组子筛选和鉴定的方法；质粒不稳定的原因、分析方法和提高稳定性的方法。

3、了解：生物技术药物的下游分离和纯化技术。复习

1.基因工程药物制备的一般过程。2.基因工程常用的载体有哪些？各有什么特点？ 3.获得目的基因常用的四种方法是（）、（）、（）和（）。



1、基因工程（genetic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，按照人类的需要进行设计，然后按设计方案创建出具有某种新的性状的生物新品系，并能使之稳定地遗传给后代 

2、原理：

1、提高外源基因的剂量——分子遗传学原理

2、筛选修饰重组基因表达的转录调控元件，如：启动子、增强子、操作子、终止子、上游调控序列等——分子生物学原理

3、修饰构建蛋白质生物合成的翻译调控元件，如：SD序列、mRNA非编码区、密码子等——分子生物学原理

4、基因工程菌（微型生物反应器）的增殖及稳定生产——生化工程学原理

3、理论方面的三个重要的发现

1、生物遗传物质—DNA的发现

2、DNA双螺旋结构和半保留复制机理的建立

3、遗传信息传递方式的确立

4、技术上三个重要成果

1、基因工程的工具酶 DNA连接酶 限制性内切酶 逆转录酶

思考：被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？

一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。逆转录酶是以RNA为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶 特点：逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶 活性：

⑴

以单链RNA为模板，催化合成cDNA单链

⑵

具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA ⑶

以DNA为模板，催化合成cDNA双链。2.基因工程载体

3.基因的体外重组技术

5、重组子转化的成功标志着基因工程的诞生。

6、基因工程的操作流程

1、分：分离目的基因

2、切：对目的基因和载体适当切割

3、接：目的基因与载体连接

4、转：重组DNA转入受体细胞

5、筛：筛选出含有重组体的受体细胞

6、表：目的基因在受体细胞中表达，受体细胞成长为基因改造生物



7、基因工程制药的基本过程

获得目的基因 构建运输载体 组建表达系统 表达系统培养

产物分离纯化



8、目的基因的获得

（一）从基因组中直接分离目的基因

1、密度梯度离心法

2、单链酶法

3、分子杂交法

4、酶切法直接分离目的基因

（二）PCR直接扩增目的基因 聚合酶链式反应 高温变性 低温退火 适温延伸

（三）反转录法合成目的基因 构建cDNA文库 调取基因

（四）化学合成目的基因

从反应机理上分为：

1、磷酸二酯法

2、磷酸三酯法

3、亚磷酸三酯法

4、自动化合成法

9、—运载体的构建

 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 常用载体

来源分类：

1、质粒载体

质粒（plasmid）:是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子。人工质粒载体必须包括三部分：一个DNA复制起始区，两个遗传标记基因和一些限制性内切酶位点。

2、噬菌体载体

λ噬菌体：（1）λ噬菌体宿主为E.coli 2）有溶原、溶菌两种生活方式：

溶原方式：λDNA整合到宿主DNA进行复制；

溶菌方式：可释放出λDNA进行壳蛋白包装增殖。

优点

1）对外源基因的容量较大（可达20多个kb）

（2）重组体DNA可在体外包裹成噬菌体颗粒，具有更高的侵染宿主能力，要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。（3）宿主范围窄，更安全

（4）可利用包装限制性（对DNA分子大小的限制）对重组子分子进行正选择，利于重组子的筛选

3、病毒载体

4、人工染色体载体

用途分类：

1、克隆载体

能使插入的外源DNA序列被复制、扩增而不能表达，这样的载体为克隆载体。常见:质粒、噬菌体

2、表达载体

使插入的外源DNA序列转录翻译，表达出多肽链，这样的载体称为表达载体。具有复制子，筛选标记，位于多克隆位点的上下游具有转录效率较高的启动子，起始密码子和核糖体结合位点，转录终止子结构．

3、穿梭载体 这类载体中含有来源不同的复制子结构，既具备原核细胞复制所需的序列结构，又具有能使外源片段在真核细胞表达所需的结构元件和相应的选择标记基因,故能在两种受体细胞中复制并检测，克隆的外源基因在此类载体直接从一种受体转入另一种受体中进行复制和表达．

10、基因表达载体的构建

1、用一定的_限制酶___切割质粒，使其出现一个切口，露出_黏性末端 2.用__同一种限制酶___切断目的基因，使其产生__相同的黏性末端

3..将切下的目的基因片段插入质粒的___切口___处，再加入适量DNA连接酶_，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）

11、重组工程菌的构建、筛选与鉴定 

1、目的基因与载体DNA的链接 1）黏性末端连接法 2）钝性末端连接法

3）钝性末端连接人工合成的接头 4）同聚物末端连接法



2、将重组体导入宿主细胞（1）转化2）转导3）转染 

3、重组子的筛选与鉴定

（1）抗药性检测筛选法

（2）显色检测

异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）可诱导LacZ基因片段编码β-半乳糖苷酶氨基端片段,与宿主细胞所编码的缺陷型β-半乳糖苷酶实现基因内互补，又称α互补。当培养基中有IPTG时，使含此质粒的菌在X-gal培养基上形成蓝色菌落。（3）限制酶切图谱检测（4）PCR扩增检测（5）原位杂交检测（6）外源蛋白质功能检测

12、表达系统的构建与基因表达

1、最佳的基因表达体系：生物活性高、表达产量高、表达产物稳定、表达产物容易分离纯化。

2、宿主细胞常用两大类：

原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；

真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。

 质粒的不稳定性原因

1）分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒的子代菌的现象。

（2）结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失而导致工程菌性能的改变。 质粒稳定性的分析方法

1）将工程菌培养液样品适当稀释，均匀涂于不含抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数A；

（2）然后随机挑选100个菌落，接种到含有抗生素标记的平板培养基上，培养10-12小时，统计所长出的菌落数B；

（3）计算出B/A的比值。该比值能够反映出质粒的稳定性。提高质粒稳定性的方法

1）分阶段培养法（2）在培养基中加入抗生素，形成选择性压力（3）通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施

第三章

动物细胞工程制药

1、动物细胞培养技术

培养方法和培养条件 细胞的冻存与复苏

2、动物细胞融合技术

动物细胞融合的过程和方法

3、单克隆抗体技术 单克隆抗体的概念；单抗制备的原理和方法

4、动物细胞的大规模培养

1、培养的方法

1、原代培养

2、传代培养

2、营养条件

1、动物细胞的培养基的种类和组成 ：培养基的基本要求 促生长因子 激素 营养成分 渗透压pH 无毒、无污染

培养基的基本要求

1）营养成分： 氨基酸

单糖 维生素 无机离子与微量元素

2）促生长因子及激素各种激素、生长因子的功能：①维持细胞的功能②保持细胞的状态（分化或未分化）

3）渗透压

4）pH大多数细胞适宜 pH为7.2～7.4，培养基应具一定的缓冲能力 5）无毒、无污染

3、血清的主要成分和作用

主要成分 ：血清是由血浆去除纤维蛋白而形成的，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等

主要作用：

1、提供基本营养物质

2、提供激素和各种生长因子

3、提供结合蛋白

4、对培养中的细胞起到某些保护作用

4、动物细胞合成培养基种类：

1、MEM ： 仅含12 种必需氨基酸、谷氨酰胺，8 种维生素及必要的无机盐，由于成分简单，易于添加某种特殊成分适于某些特殊细胞培养。

2、DMEM： 在 MEM 培养基的基础上研制的。与 MEM 比较增加了各种成分用量，分高糖型（低于4500g/L）和低糖型（低于1000g/L）

高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难低肿瘤细胞。

3、IMDM： 含有 42 种成分，与 DMEM 比较增加了许多非必须氨基酸及一些维生素，增加了羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES），葡萄糖含量为高糖型。

适合细胞密度较低、细胞生长困难的情况，如细胞融合之后杂交细胞的筛选培养，DNA 转染后转化细胞的筛选培养。

4、RPMI1640：

其组分较为简单，适合许多种细胞生长，如肿瘤细胞、正常细胞、原代培养、传代培养等。是目前应用最为广泛的培养基之一。

5、动物细胞的种质保存

细胞的冻存与复苏 冷冻速率、复温速率、冷冻保护剂，冷冻保存温度。

1.细胞冻存

2.细胞复苏 ：在体外培养工作中，常要将体外培养物进行冷冻保存，在需要时再复温融解进行体外培养（复苏）

 冻存和复苏的原则：慢冻快融

原因：

当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，冰晶导致细胞损伤甚至死亡。

甘油或二甲基亚砜可使冰点降低，在缓慢冻结条件下，可使细胞内水分逐步透出，避免大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。融化速度快，还可使迅速通过最易受损的-5－0度

冷冻速率：慢冻（？）复苏速率：快融（？）

冷冻保护剂：5－15％甘油或二甲基亚砜（DMSO）（？）冷冻保存温度：－196 ℃（液氮）

 为什么要加冷冻保护剂

对大多数有核哺乳类动物细胞来说，在不加冷冻保护剂的情况下，无最适冷冻速率可言，也不能获得活的冻存物。目前冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类。具有渗透性的冷冻保护剂可以渗透到细胞内，一般是一些小分子的物质，主要有甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。非渗透性冷冻保护剂不能渗透到细胞内，一般是些大分子物质，主要有聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、蔗糖、聚乙二醇、羟乙基淀粉等。

6、动物细胞融合技术 基本过程

1）细胞准备，分贴壁和悬浮细胞两种。前者可直接将两亲本细胞混合培养，后者需制成一定浓度的细胞悬浮液。

（2）细胞融合，加促融因子于将行融合的细胞之中，诱导融合。

（3）杂种细胞选择，利用选择性培养基等，使亲本细胞死亡，而让杂种细胞存活。（4）杂种细胞克隆，对选出的杂种细胞进行克隆（选择与纯化），经过培养，就能获得所需要的无性繁殖系。

促融剂：

1、病毒诱导：某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒和新城鸡瘟病毒的被膜中有融合蛋白（fusion protein），可介导病毒同宿主细胞融合，2、PEG诱导

3、物理学方法－电诱导细胞融合

7、单克隆抗体（monoclonal Antibody，McAb）通过B细胞杂交瘤技术，获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体。单克隆抗体的大量制备：（1）体外培养法：（2）动物体内诱生法：

单克隆抗体的特性：

1、高度均一性：纯度很高的均一性抗体

2、高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定簇起反应

3、大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖传代

8、动物细胞大规模培养：悬浮培养、贴壁培养、假悬浮培养（微载体培养、微囊化培养）等

第四章

植物细胞工程制药

基本概念：植物细胞工程；植物细胞的全能性；细胞融合

植物细胞培养技术：培养材料、培养方法；植物细胞培养的影响因素 植物原生质体培养技术：原生质体获得、纯化和培养的方法 植物细胞融合技术：细胞融合的过程、方法和杂种细胞的筛选

1、植物细胞工程：以植物细胞为基本单位，应用细胞生物学、分子生物学等理论和技术，在离休条件下进行培养、繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而改良品种、制造新品种，加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术。

2、植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核（完整染色体组）的细胞，在一定条件下都有直接发育成一个完整植株的能力。

3、全能性最早在植物细胞中发现。

4、植物细胞培养技术：植物细胞培养从植物组织培养而来，植物组织培养主要用于形成组织和再生成植株 植物细胞培养主要生成次生代谢产物

基本技术：

1、植物材料的准备

2、培养基制备

3、培养方法的选择

5、植物细胞的获得

（1）外植体直接分离法:机械切割、组织破碎直接从植物外植体中分离 外植体：如根、茎、叶、花、花粉等

（2）原生质体再生法：纤维素和果胶酶混合处理外植体或愈伤组织，分离原生质体，再生培养基中培养，原生质体细胞壁再生获得植物细胞。

3）愈伤组织分离法：从愈伤组织制备小细胞团或单细胞悬液

愈伤组织：在一定条件下，从外植体的切口部位长出的脱分化的薄壁细胞团。

6、常用培养基

MS培养基是目前应用最多最普遍的培养基。无机盐的浓度较高，KM-8p主要用于原生质体培养，其特点是有机成分较复杂 White的无机盐含量较低，适于生根培养

7、生长素：用来诱导细胞的分裂、愈伤组织形成和根的分化

8、组织培养中常用的有：吲哚乙酸(IAA)：第一个被发现和人工合成的的激素

二氯苯氧乙酸(2,4-D)；萘乙酸(NAA)；吲哚-3-丁酸(IBA)；萘氧乙酸(NOA)；对氯苯氧乙酸(P-CPA)NAA、IAA、IBA易引起生根，2,4-D有利于愈伤组织的诱导和生长

培养影响

9、植物细胞生长代谢特点：（1）需大量无机盐（2）需多种维生素和植物生长激素（3）无机氮源，硝酸盐、铵盐为主（4）以蔗糖为碳源

10、无机元素的功能：

①参与调节胞内外的pH、渗透压、氧化还原电位等

②参与多种酶的辅酶和激活因子的合成

③P是DNA、RNA、ATP等生物活性物质的组成部分，也影响多种次级代谢产物的合成

11、植物生长物质

1、植物生长调节剂

2、植物生长激素：生长素，细胞分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯。借生长激素调控生长分化，以及细胞培养时，获得最大量的次生代谢产物

12、植物培养物的生长取决于生长素和分裂素的比例：

高浓度生长素和低浓度分裂素——刺激细胞分裂，低浓度生长素和高浓度分裂素——刺激细胞生长

13、诱导子：刺激植物细胞合成防御性次生代谢产物的物质, 可以通过改变次生代谢途径中催化酶的酶活力,引起代谢通量和反应速率的改变, 提高次生代谢产物的产量。

非生物诱导子：水杨酸，茉莉酸等,稀土及重金属盐类

生物诱导子：微生物类，如真菌孢子，菌丝体、真菌培养物滤液等

14、碳源：细胞培养过程中不进行光合作用，需提供糖做碳源（2-5%）。

15、维生素：肌醇（胚状体和芽的生长），B族维生素（B1—根的生长）

16、有机物：甘氨酸或水解络蛋白，酵母提取物等。

17、植物细胞的培养方法 1.单细胞的培养：（1）看护培养法：2）微室培养法 3）平板培养法 4）条件培养法

条件培养基指培养过细胞的培养基上清，有植物生长激素等残留，用于制备成固体培养基 2.单倍体细胞的培养（花药培养）

指将植物单倍体细胞培养成单倍体植株的过程。一般采取花药作为单倍体细胞的培养对象 3.愈伤组织培养 4.毛状根诱导和培养

毛状根具有如下特点：激素自养，不必加外源激素；次级代谢产物含量高且稳定；增殖速度快。

18、植物原生质体培养技术

除去植物细胞壁的裸露细胞，称为原生质体。

1、原生质体材料来源：

1、植物叶片－取材容易－比较容易用酶解法分离

2、植物根尖组织－可由各种植物的种子萌发后取得

3、植物花粉－产生单倍体原生质体

4、愈伤组织、悬浮培养的细胞－细胞壁容易解离

2、分离

1、机械法

先将细胞放在高渗溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原体质体收缩成球形，再用机械法磨碎细胞，从伤口处可以释放出完整的原生质体。

2、酶解法

细胞壁降解酶种类：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等

3、纯化

1）离心沉淀法

原理：原生质体的比重比较大，离心后原生质体沉于底部。2）漂浮法

原理：利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉到管底。3）界面法

原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液密度大于原生质体的密度，另一种溶液小于原生质体的密度，形成不连续密度梯度，通过离心使原生质体和破损细胞处于不同液相中。

4、培养

1）液体浅层培养

将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。2）液体－固体双层培养

在培养皿的底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬浮液滴于固体培养基表面。3）固体平板培养

琼脂糖包埋培养。低融点的琼脂糖可在约30℃融化与原生质体混合而不影响原生质体的生命活动。混合后含有原生质体的培养基铺于培养皿底部，封口后进行培养。4）琼脂糖珠培养

将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50ul一滴的量滴于直径6cm的培养皿，待其固化后向其中添加3ml液体培养基并于摇床上低速旋转培养。

培养过程中，通过调整液体培养基的渗透压来调节培养物的渗透压以利于其进一步的生长和发育。

19、植物细胞融合技术

细胞融合(cell fusion)概念：又称细胞杂交：离体条件下用人工的方法把不同的细胞通过无性方式融合成一个杂合细胞的技术。

1、融合的程序：

1、原生质体分离的分离、纯化

2、融合方法选择

3、杂种细胞的筛选

4、愈伤组织形成器官分化植株再生

5、杂种植物的鉴定

2、融合的方法：

1、盐类融合法

2、高Ca2+和高pH值融合3、聚乙二醇（PEG）融合法

4、PEG与高Ca2+和高pH值结合融合法

5、电融合法

3、原生质体的融合过程包括3个主要阶段：1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密粘连，彼此融合；3)融合完成，形成球形的异核体或同核体。

20、杂种细胞的选择和鉴定 1）融合体的类型

自体融合：发生在亲本原生质体自身 异体融合：

1、谐和的细胞杂种：具有双亲全套染色体组的异源两倍体

2、部分谐和的细胞杂种：双亲的染色体经逐步排斥，便发生少量染色体的重组，然后进入同步分裂，最后形成带有部分重组染色体的植株

3、异胞质体细胞杂种：胞质是双亲的，一亲本细胞核被排斥

4、嵌合细胞杂种：不同种的双亲原生质体，发生了膜融合和胞质融合，尚未发生核融合。双亲的细胞核各自发生核分裂，接着形成细胞壁，最终形成嵌合体植物

2、选择的方法

1、互补选择法(遗传或抗性)

2、可见标记法

3、生长特性选择法

4、物理特性选择法

5、其他方法

6、荧光染料法：异硫氰酸荧光素（FITC）和异硫氰酸罗丹明（RITC）分别发出绿色和红色 3）细胞杂种的鉴定：

①杂种植物形态特征、特性鉴定②杂种植物的核型分析③同工酶分析④分子标记鉴定

第五章

发酵工程制药 发酵工程的概念

2、菌种的获得与选育

3、发酵的基本过程和工艺控制

发酵工程的概念 菌种及其选育、自然育种、诱变育种、原生质体融合、基因工程育种

发酵的基本过程、发酵的工艺控制、发酵产物的提取

1、发酵工程(fermentation engineering)：

微生物工程利用微生物制造工业原料与工业产品并提供服务的技术，是生物技术的基础工程。

2、生产菌种的选育：

1、自然选育：自然状态下，碱基对发生自然突变的机率为10-8～10-9

2、自发突变与定向育种

3、诱变育种：用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选，称为诱变育种。物理诱变剂：紫外线

化学诱变剂 使用最多、最有效的是烷化剂。

4、原生质体融合5、DNA重组

3、发酵产物提取的方法：

1、吸附法

2、沉淀法

3、溶剂萃取法

4、离子交换法

4、菌种保藏

1、斜面低温法：短期保存

2、石蜡油封存法：中期保存

3、沙土管：产孢子和芽孢的

4、麸皮保存法：产孢子的霉菌和放线菌，工厂用

5、甘油悬液法：基因工程菌

6、冻干保藏 ：最广泛使用的方法。大部分菌种可以在冻干状态下保藏10年之久。且经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输

7、液氮法：最为有效，保藏15年以上，8、宿主保藏法：活细胞内寄生的微生物

5、发酵过程的影响因素及控制 一）菌体浓度的影响及控制

菌体浓度反应菌体细胞数和胜利特性 结构越复杂的生物，分裂所需时间越长

发酵中菌液需控制在合理浓度中，过高，营养消耗过快，有毒废物积累，改变菌体代谢途径，影响溶氧；过低，产率下降

二）培养基的影响及其控制

1.碳源：葡萄糖速效碳源，生长菌体，淀粉等迟效碳源，发酵次级代谢产物

2.氮源：氨基酸，玉米浆等速效氮源，生长菌体，豆饼等迟效氮源，发酵次级代谢产物

氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。

3.磷酸盐和微量元素：微生物体内磷含量较高，培养基中以磷酸盐为主，发酵中用来计算磷含量的是磷酸根 抗生素对磷酸盐浓度很敏感，生长浓度：0.32-300 mol/L，生产浓度：1.0 mol/L 4.补料：补基质和前体，中途补料，丰富培养基，避免菌体过早衰老，控制PH，改善通气等 通常在生长旺盛期后期，发酵液泡沫位下降，这时耗氧大，溶氧水平接近临界点，补料少量多次

6、影响发酵温度变化的因素

(1)生物热：

微生物进行有氧呼吸产生的热比厌氧发酵产生的热多。

(2)搅拌热(3)蒸发热：通气时，引起发酵液的水分蒸发，水分蒸发所需的热量叫蒸发热(4)辐射热：发酵罐内温度与环境温度不同，发酵液中有部分热通过罐体向外辐射。

7、.温度的选择与控制

(1)最适温度的选择：嗜冷菌适应于0～26℃生长，嗜温菌适应于15～43 ℃生长，嗜热菌适应于37～65 ℃生长，嗜高温菌适应于65 ℃以上生长 最适生长温度，最适生产（发酵）温度

发酵前期 要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度

中期菌量 已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，发酵后期，产物合成能力降低，提高温度，刺激产物合成到放罐。

8、pH的影响及其控制

菌体自溶，pH上升，发酵后期，pH上升

9、发酵过程pH变化的原因

1）糖代谢：特别是快速利用的糖，分解成小分子酸、醇，使pH下降。糖缺乏，pH上升，是补料的标志之一（2）氮代谢：当氨基酸中的-NH2被利用后pH会下降；尿素被分解成NH3，pH上升，NH3利用后pH下降，当碳源不足时氮源当碳源利用pH上升。（3）生理酸碱性物质利用后pH会上升或下降

10、发酵过程pH的调节

1、调节好基础料的pH。基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5－6.8 ２.在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等 ３.通过补料调节pH ４.当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH

11、溶氧的影响及其控制

溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。供氧不足，代谢异常，通气，搅拌

12、发酵过程的溶氧变化

发酵初期，生产菌大量繁殖，需氧，溶氧下降 过了生长阶段，需氧减少，溶氧上升 发酵中后期，分批发酵的溶氧不变 生产后期，菌体衰老，溶氧上升

13、CO2的影响及控制：降低通气搅拌，则增加CO2在发酵液中溶解度

14、发酵过程泡沫的形成与控制

发酵过程起泡的利弊：气体分散、增加气液接触面积，但过多的泡沫是有害的 消泡：机械消泡，消泡剂消泡：天然油脂，聚醚类消泡剂，高碳醇，硅酮类

15、染菌的防治

发酵前期最易染菌，且危害最大。

原因 ： 发酵前期菌量不很多，与杂菌没有竞争优势；且还未合成产物（抗生素）或产生很少，抵御杂菌能力弱。染菌措施 ： 可以用降低培养温度，调整补料量，用酸碱调pH值，缩短培养周期等措施予以补救。如果前期染菌，且培养基养料消耗不多，可以重新灭菌，补加一些营养，重新接种再用。

第六章

酶工程制药 酶与酶工程的概念 固定化酶和细胞的制备 酶工程技术

酶分子的定点改造、酶分子的定向进化、酶的化学修饰、抗体酶技术

1、酶工程是酶学和工程学相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。酶是生物细胞产生的、具有催化能力的生物催化剂。

2、固定化酶（immobilized enzyme）的定义:指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化所采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系

3、固定化酶的特点

（1）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。

4、固定化酶的制备原则：

（1）不改变酶的性质（2）酶结合牢固，性质稳定，易于与底物分离（3）能够实现生产的自动化，成本合理

5、固定化酶载体材料：

A.高分子载体.天然高分子材料 壳聚糖，海藻酸钠

合成有机高分子材 聚苯乙烯 B.无机载体 玻璃，硅凝胶，铝等

C.复合载体：磁性高分子微球:内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末。

6、固定化方法的选择

①固定化酶应用的安全性 ②固定化酶在操作中的稳定性 ③固定化的成本

7、新型的酶固定化方法：光偶联法，等离子体法，无载体固定化酶

8、固定化细胞的方法：将细胞限制或定位于特定空间位置的方法.9、固定化酶的性质

1）酶活力的变化：酶经过固定化之后活力大都下降。

2）酶稳定性的变化：包括对温度、pH、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。①热稳定性提高：热稳定性越高，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。②对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高③PH，蛋白酶等稳定性提高

3）酶学特性的变化：A、底物专一性：对底物的专一性下降。

B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。

C、最适温度：一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。

D、米氏常数(Km)：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。

E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不变。

10、酶工程研究新技术

一、酶分子的定点改造：有目的的改变酶的特定活性位点或基因，产生具有新性状的酶。定点突变是酶分子定点改造的常规手段，广泛用于改善酶的性能。

定点突变是有目的的在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸。定点突变的方法：

（1）引物介导的定点突变（2）PCR介导的定点突变（3）盒式突变

二、酶分子的定向进化

酶分子的定向进化（directed evolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。特点：适应面广；目的性强；效果显著。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+定向选择。

三、酶的化学修饰：

通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。

目的：① 提高酶的生物活性

② 增强在不良环境中的稳定性

③ 降低或消除其免疫原性 方法：（1）酶的表面化学修饰

： 可降低酶的免疫原性，提高酶的稳定性；或使酶固定到某一载体上。（2）酶分子内部修饰（3）结合定点突变的化学修饰 ：制备化学修饰突变酶，从而得到一些新颖的酶制剂。

修饰酶的特性：⑴热稳定性提高 ⑵抗各类失活因子能力提高

⑶抗原性消除 ⑷体内半衰期延长 ⑸最适pH改变 ⑹酶学性质变化（Vmax不变，Km变大 ⑺对组织分布能力改变

11、抗体酶技术：能与过渡态结合的抗体也具有酶的性质 抗体酶是酶还是抗体 ？

抗体——是B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中,能与相应抗原特异性地结合，具有免疫功能。其本质是一类免疫球蛋白。抗体酶是酶的高效催化能力和抗体的高度选择性巧妙结的产物，本质上是一类具有催化活力的免疫球蛋（Ig）其实抗体酶是一种特殊的抗体，它有着催化特性，可谓是酶和抗体性质的兼得。所以又被称为催化抗体。抗体酶的制备：诱导法，基因工程法，拷贝法，化学修饰法

酶传感器：它将活性物质酶覆盖在电极表面,酶与被测的有机物或无机物反应,形成一种能被电极响应的物质 第七章 药物生物技术新进展 新产品

新疫苗

1、多肽疫苗

2、基因疫苗

核酸药物1.核酶2.反义核酸药物3.RNAi药物

1、抗体工程制药

主体：细胞工程技术和基因工程技术

2、理想的抗体药物的性质：

1、高特异性和高亲和力

2、对人没有免疫原性，不诱导机体对抗体的排斥反应 游离抗体不激活补体

3、一旦结合到靶抗原上，能诱导效应功能细胞系稳定，适合在无血清培养基中进行大规模培养

4、抗体符合生物制品标准

3、抗体治疗存在的问题：

1、异源蛋白导致产生抗抗体，影响靶向性和效果

2、靶部位摄取的量太低

3、效应功能弱

4、在体内被清除速度快

4、基因工程抗体的概念：利用DNA重组技术和蛋白质工程技术对编码抗体分子的基因按照不同需要进行加工改造和重新装配，再转染到合适的受体细胞中所表达的抗体分子。

特点：

1、减少或消除排斥反应

2、分子小，穿透力强，易到达病灶核心部位

3、抗体功能多样化

4、可采用多种表达系统，成本低

研究内容 ①抗体人源化：②构建抗体库从中筛选新的单抗

种类： 人一鼠嵌合抗体：一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区(V区）与人抗体的恒定区（C区）融合而得到的抗体。第一代 鼠单抗可变区的人源化－改型抗体 第二代 小分子抗体 1)Fab 完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。2)Fv 或 ScFv Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。

单链抗体（ScFv）的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌

3)单域抗体 即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构域构成，故称单域抗体。

4)最小识别单位 约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。4 双特异抗体和多价抗体 双链抗体（Diabody）乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。

特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关抗原。另1种为对应效应成分。即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效应细胞, 抗体融合蛋白主要分两种形式： Fc融合蛋白

抗原结合融合蛋白 1)免疫粘附素

2、免疫毒素

噬菌体抗体库技术

定义：将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。

特点 模拟天然全套抗体库 避开了人工免疫和杂交瘤技术 可获得高亲和力的人源化抗体

转基因技术制药

转基因动物（transgenic animal）是指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。

培育1 目标基因克隆和体外重组 2 外源基因的导入3 外源DNA整合、转录及表达的分子检测转基因动物品系或品种的建立

转基因动物技术路线 ：

1、外源目的基因的制备

2、外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞

3、选择获得携有目的基因的细胞

4、选择合适的体外培养系统和宿主动物

4、转基因细胞胚胎发育及鉴定

5、筛选所得的转基因动物品系

外源基因的转移：

1、显微注射法

2、逆转录病毒载体感染

3、胚胎干细胞介导法

4、精子载体介导法

5、YAC介导的基因转移

6、细胞核移植

胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能干细胞。

精子与外源DNA结合的机理：

精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。后来Rottman对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNA相互作用形成脂质体——DNA复合物。这种复合体比较容易和精子细胞融合，从而进入细胞内。

转基因动物的应用：1）生物制药(乳腺生物反应器)；（2）建立人类疾病的动物模型；（3）生产可移植用的动物器官。

动物乳腺生物反应器

一般把目的片段在器官或组织中表达的转基因动物叫动物生物反应器（bioreactor），几乎任何有生命的器官、组织或其中一部分都可经过人为驯化为生物反应器,从生产的角度考虑，生物反应器选择的组织和器官要方便产物的获得，例如，乳腺、膀胱、血液等，由此发展了动物乳腺生物反应器,动物血液生物反应器和动物膀胱生物反应器等。其中，转基因动物乳腺生物反应器的研究最为引人注目。

基因芯片

基因芯片(gene chip)又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列(DNA micro-array)。基因是载有生物体遗传信息的基本单位，存在于细胞的染色体上；将大量的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体上，称之为基因芯片。

原理：基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效、快速的核酸序列分析手段。基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测以及结果分析。

1、芯片制备

1）合成探针

2）探针在载体表面的固定

探针在载体表面的固定可分为两大类方法：

合成后点样，多用于大片段DNA，有时也用于寡核苷酸，甚至mRNA。原位合成（即在支持物表面原位合成寡核苷酸探针），适用于寡核苷酸。原位合成（在片合成）有三种途径：，原位光刻合成，点样法，分子印章原位合成法（东南大学发明）。

3、杂交反应 杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。

蛋白质芯片（protein chip），又称蛋白质微阵列(protein microarray)，是用于蛋白质功能研究及相互作用分析的生物芯片，采用原位合成、机械点样或共价结合的等方法将多肽、蛋白、酶、抗原、抗体固定于硅片、玻璃片、塑料片、凝胶、尼龙膜等固相介质上形成的生物分子点阵。

芯片实验室是将样品制备、生化反应和检测分析的全过程集约化，并缩微到一张芯片上自动完成，形成的所谓微型全分析系统（micro total analysis systen,μ-TAS）,或称“缩微芯片实验室”（lab-on-a-chip）。

生物芯片的应用：

1、寻找和发现新基因

2、基因表达分析

3、DNA序列测定与序列间比较

4、突变体和多态性的检测

基因治疗

基因治疗：指应用DNA重组技术，将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病,以达到治疗的目的。

基因疗法：

1、重建基因调控系统

2、替代异常基因

3、封闭致病基因

4、剪去致病基因

5、修复受损基因

6、增强基因效能

基因干预

基因干预(gene interference)：指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。

基因干预的种类：1核酶： 裂解特异的靶mRNA 2反义RNA： 封闭基因表达 3 RNA干涉技术

肿瘤治疗中基因的选择：

1.能改变肿瘤细胞的恶性表型的基因

肿瘤细胞主要有癌基因的突变、扩增、过度表达，对此可采用反义核酸或核酶；抑癌基因的突变、失活等，可采用野生型的正常基因作为治疗基因，用正常基因剔除或替换缺陷基因。2.能提高肿瘤细胞的免疫原性的基因

3.肿瘤药物增敏基因 常用的自杀基因有单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSK-TK）基因，基因载体的选择 ：有病毒载体和非病毒体两类，多用病毒载体，如逆转录病毒、腺病毒及腺相关病毒载体。

基因治疗中体细胞的选择：

1、免疫细胞

2、骨骼肌细胞

3、血管平滑肌细胞

1、成纤维细胞： 成纤维细胞位于全身并具有较强的自我更新能力。优点有：①易于获得；②容易体外培养和扩增；③分裂中的成纤维细胞易与逆转录病毒一起稳定转导，并能较稳定的表达外源目的基因；④携带外源基因后能稳定地回植体内并进行表达等。

主要缺点是在体内由于细胞凋亡而引起的基因表达失活。

2、造血干细胞

造血干细胞是基因治疗遗传病、自身免疫性疾病及癌症常用的靶细胞。

理想载体应具备下列条件：安全无毒害；不引起免疫反应；高浓度或高滴度；能高效转移外源基因 ,持续有效表达外源基因；可靶向特定组织细胞；可调控；容纳外源基因可大可小；可供体内注射（包括全身性静脉注射）；便于规模生产供临床应用，可惜目前所应用的载体尚没有一个能符合上述全部的条件。这是今后努力研究的方向。基因组学与新药研究 基因组（genome）：生物体单倍体细胞所有基因的总和。基因组学（genomics）：DNA测序、基因及非编码区定位及绘图。

人类基因组计划（human genome project）人类基因组测序、基因定位、破译人类全部遗传信息。世纪90年代初期, 美国生物学家提出并实施了人类基因组计划(human genome project, HGP),2003年4月14日,美国人类基因组研究项目首席科学家Collins F 博士在华盛顿隆重宣布: 人类基因组序列图绘制成功。

药物基因组学

概念：药物基因组学是以提高药物疗效及安全性为目标，研究遗传变异与药物反应相互关系的一门学科。药物效应个体差异：不同个体对同一药物同一剂量的反应存在量与质的差异

药物基因组学的目的是通过基因分型指导个体化治疗，研究的主要策略包括选择药物起效、活化、排泄等相关过程的候选基因进行研究，鉴定基因序列的变异。

一）候选基因分析 候选基因分析（candidate gene approach）通过对已知候选基因与性状表型值的关联分析判断其是否就是主基因（药代动力学和药效动力学相关基因）或是否与主基因紧密连锁。候选基因”策略

给定某一药物的条件下，比较有反应者及无反应者靶基因多态性出现的频率。

局限性：

须明确给定药物的作用机制、所治疗疾病的病理生理学；

不能鉴定那些根据药物作用或疾病生物学难以预测的新基因。

二）全基因组关联分析 全基因组关联分析（Genome-wide association study，GWAS）是一种在全基因组范围内寻找与药物应答相关遗传变异的方法。

GWAS为人们打开了一扇通往研究复杂疾病的大门，将在患者全基因组范围内检测出的SNP位点与对照组进行比较，找出所有的变异等位基因频率，从而避免了像候选基因策略一样需要预先假设致病基因。

药物基因组学的根本目的

运用遗传信息进行个性化用药，将正确药物、正确剂量在恰当的时间给予合适的患者。

后基因组时代

在后基因组时代, 研究的重心已从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对生物功能的研究。

转向的第一个标志——产生了功能基因组学的新学科。另一个标志——产生了一门在整体水平上研究细胞内全部蛋白质组成及其活动规律的新兴学科—蛋白质组学。生命现象的主要体现者是蛋白质

而蛋白质有其自身的特定活动规律,仅仅从基因的角度来研究是远远不够的

必须研究由基因转录和翻译出蛋白质的过程,才能真正揭示生命现象的本质和规律。蛋白质组学的研究策略：

采用高通量的蛋白质组研究技术，分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。（结构、相互作用）研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。（疾病研究——诊断、药物靶点）

新型疫苗，多肽疫苗：基因工程疫苗，基因疫苗

核酶——一种具有核酸内切酶活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA序列，具有解离后重复切割相同靶分子的能力，应用前景：抗肿瘤，抗抗药性，抗AIDS，抗白血病，抗病毒病 靶向肿瘤细胞是以 RNA 干扰为基础的肿瘤治疗的重要发展方向。

第八章 药物制剂的设计

【掌握】药物制剂设计的基本原则；【熟悉】药物制剂设计的内容，制剂处方设计前工作； 【了解】制剂处方的优化设计；新药制剂的研究与申报。

药物制剂设计的程序：

1）对处方前工作包括理化性质、药理学、药动学有一个较全面的认识。如果某些参数尚未具备，而又是剂型设计所必须得，应先进行试验，获得足够的数据以后，再进行处方设计 2）根据药物的理化性质和治疗需要，结合各项临床前研究工作，确定给药的最佳途径，并综合各方面因素，选择合适的剂型；（3）根据所确定的剂型的特点，选择合适于剂型的辅料或添加剂，通过各种测定方法考察制剂的各项指标，采用实验设计优化法对处方和制备工艺进行优选。

药物制剂的设计的五个基本原则 1.安全性 2.有效性 3.可控性 4.稳定性 5.顺应性

药物制剂设计的目的是根据：

疾病的性质；临床用药的需要；药物的理化性质；合适的辅料；制备工艺；制剂的最佳处方和工艺条件；确定包装

处方前研究

一、化合物的物理化学性质测定 解离常数 溶解度

对于易溶于水的药物，可以制成各种固体或液体剂型，适合于各种给药途径

油水分配系数

油/水分配系数是分子亲脂特性的度量，在药剂学研究中主要用于预见药物对在体组织的渗透或吸收难易程度。固有溶出速率

二、原料药的固态性质 盐型 多晶型 吸湿性

水溶性药物在大于其临界相对湿度的环境中吸湿量突然增加，而水不溶性药物随空气中的RH的增加缓缓吸湿。粉体学性质

三、稳定性和配伍研究 药用化合物的稳定性 辅料的配伍研究

四、处方前生物药剂学研究 药物的吸收

在有效期内保持稳定 生物药剂学分类系统 侯选化合物的药代动力学

固体制剂的配伍研究

辅料的添加对固态药物的物理稳定性和化学稳定性都有影响。用dsc

液体制剂的配伍研究

第二篇：生物技术制药总结

生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术

1基因工程制药：利用基因重组技术将外援基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。

2.载体：是携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外援基因或DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

细胞传代passage：将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作。细胞克隆培养（clonal culture）：即单细胞分离培养，是将动物组织分散后，将一个细胞从群体细胞中分离出来，由单个细胞培养成纯系细胞集群。

动物细胞的复苏：其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

细胞融合（cell fusion）：是指在外力（诱导剂或促融剂）作用下，两个或两个以上的异源（种、属间）细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成杂种细胞的现象，或称细胞杂交。

转基因动物（transgenic animal）：采用基因工程技术将外源目的基因导入动物生殖细胞、胚胎干细胞和早期胚胎，并在受体动物的染色体上稳定整合，在经过发育途径将外源目的基因稳定地传给子代，通过这项技术所获得的动物即为转基因动物。

胚胎干细胞（embryo stem cell）：简称ES细胞，是从早期胚胎细胞团分离出来并能在体外培养的一种高度未分化的、具有形成所有成年细胞类型能力的全能干细胞。它是正常二倍体型，像早期胚胎细胞一样具有发育上的全能性。

抗体工程制药（antibody engineering pharmaceutics）：利用基因工程、细胞工程（包括动物细胞工程和植物细胞工程）和转基因动物及转基因植物技术生产抗体药物的过程。

单克隆抗体（monoclonal antibody，mAb）：简称单抗，将能大量扩增和永生的骨髓瘤细胞和能合成分泌特异性抗体的B细胞（仅识别一种抗原表位）进行融合得到杂交瘤细胞，经筛选和克隆化的杂交瘤细胞仅能合成及分泌抗单一抗原表位的特异性抗体。

杂交瘤细胞克隆化（cloning）：是指将阳性孔中分泌抗体的单个细胞分离出来。融合后的杂交瘤细胞一般要经过3次克隆化才能达到100%的阳性克隆。

双特异性抗体（bispecific antibody，bsAb）：亦称双功能抗体，是含有两个不同配体结合位点的抗体分子，它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。嵌合抗体（chimeric antibody）：是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体，表达的抗体分子中轻、重链的V区是异源的，而C区是人源的，即整个抗体分子的60%~70%是人源的。

人源化抗体（humanized antibody，hAb）：通过CDR移植即把鼠抗体的CDR（互补决定区）序列移植到人抗体的可变区内所得到的抗体，也称CDR移植抗体或改型抗体。该抗体既具有鼠源性单抗的特异性又保持了人抗体的功能（C区的功能）。

免疫原性（immunogenicity）：抗原能刺激机体特异性免疫细胞，使其活化、增值、分化，最终产生免疫效应物质（抗体或致敏淋巴细胞）的特性。

免疫反应性（immunoreactivity）：抗原与相应免疫效应物质在体内或体外相遇时，可发生

特异性结合而产生免疫反应的特性。

减毒活疫苗（live attenuated vaccine）：是通过不同的方式手段使病原体的毒性即致病

性减弱或丧失后获得的一种由完整的微生物组成的疫苗制品。

灭活疫苗（inactivated）：是将病原体经培养增殖、灭活纯化处理，使其完全丧失感染性，但保留了病原体的几乎全部组分因此灭活疫苗具有较好的免疫原性和安全性。

亚单位疫苗（subunit vaccine）：利用微生物的某种表面结构成分（抗原）制成、能诱发

机体产生抗体的疫苗。

分解代谢阻遏（catabolite repression）：在菌体的生长阶段被菌体快速利用的碳源会产

生大量的分解产物，这些代谢产物阻遏次级代谢酶系的合成，只有当这类碳源被消耗完后，阻遏作用被消除，菌体才由生长阶段转入次级代谢产物合成阶段，这种发酵过程中的次级代

谢产物在碳源被消耗尽时才产生和积累的现象称为分解代谢阻遏。

生物技术：人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础科学的科学原

理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。

种龄（inoculumage）：种子罐中培养的菌丝转入下一级种子罐或发酵罐时得培养时间

生物技术药物的特性？

（1）理化性质特性（1）相对分子量大（2）结构复杂：蛋白质和核酸均为生物大分子，蛋

白质含有四级结构（3）稳定性差（2）药理学作用特性（1）活性与作用机制明确：活性物

质对生理功能的调节机制比较清楚（2）作用针对性强：有特定的靶分子、靶细胞或靶器官

（3）毒性低：生物技术药物本身是体内天然存在的物质或它们的衍生物（4）体内半衰期短

（5）有种属特异性（6）可产生免疫原抑制（3）生产制备特性（1）药物分子在原料中的含量低（2）原料液中常存在降解目标产物的杂质：应采取快速分离纯化的方法以除去影响

目标产物稳定性的物质（3）制备工艺条件温和：目的产物不稳定（4）分离纯化困难：需要

多种不同原理的层析单元操作才能达到要用的纯度（5）产品易受有害物质（4）质量控制特

性

质粒的特点：（1）是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。（2）质粒

具有遗传传递和遗传交换的能力（3）质粒具有不相容性：两种亲缘关系密切的不同质粒不

能在同一宿主细胞中稳定共存。4..共价闭合环状DNA(ccDNA)，开环DNA(ocDNA)，线状

DNA(lDNA)在琼脂糖凝胶电泳中

5.复制子松弛型复制子的复制和宿主蛋白的合成功能

无关，宿主染色体DNA复制受阻时，质粒仍可复制；严谨型复制子的复制与宿主蛋白质的合成相关，因此在每个宿主细胞中为低拷贝数，仅1~3个。

6.克隆表达的质粒载体涉及三个要素：

（1）复制子（2）选择标记：由质粒携带的赋予宿主细胞新的表型的基因，用于鉴定和筛选

转化有质粒的宿主细胞。常见的标记：氨苄西林（Amp），卡那霉素（Kan）（3）多克隆位点

（MCS）：质粒载体中由多个限制性内切酶识别序列密集排列形成的序列。

7.目的基因常用制备方法

(1)化学合成法（2）PCR法：在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通

过下列步骤扩增DNA：a）变性：双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；b）退火：降

低温度，引物与单链模板结合；c）延伸：温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，最终与单链

模板形成双链，并开始下一个变性、退火、延伸循环。（3）基因文库法（4）cDNA文库法

8.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：

9.（1）DNA片段之间的连接方式：粘性末端的连接效率高于平头末端。（2）目的基因与载

体的浓度和比例：增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因与载体DNA的摩尔数比应大

于1.（3）连接温度、时间、连接酶的活性及缓冲液。

9.重组DNA导入大肠杆菌，常用的感受态细胞制备方法：氯化钙法

10.重组子的筛选与鉴定：

（1）载体遗传标记法：a)抗生素抗性筛选法

b)互补筛选法：重组子转化成宿主细胞，载体的表达产物与宿主细胞中营养缺陷性突变发生

互补作用，从而实现重组子的筛选。蓝白斑筛选：lacZα基因可编码β—半乳糖苷酶α氨基

端的α互补肽段，与宿主细胞编码的缺陷型β—半乳糖苷酶α实现互补，可分解底物5-溴-4-

氢-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，形成蓝色菌落。由于lacAα基因的插入失活而成白色，空载体的宿主细胞呈蓝色。c)营养缺陷筛选法d噬菌斑筛选法(2)核酸分子杂交法

(3)限制性内切酶图谱法(4)DNA序列测定法：双脱氧终止法(5)目的基因表达产物测定法

12.外源基因在大肠杆菌中的表达形式：

(1)胞内表达：(a)非融合蛋白的胞内表达：形成包涵体（B）融合蛋白的胞内表达：在大肠杆

菌内较稳定（2）分泌表达：（a)分泌至周质（b）分泌至胞外

11.外源基因在原核生物中表达的重要调控元件

(1)启动子：是DNA链上能与RNA聚合酶结合并起始mRNA合成的一段序列，是决定外源基

因在原核生物中表达效率的关键因素。(2)核糖体结合位点：SD序列(3)终止子

13.大肠杆菌中外源蛋白表达效率的影响因素：(1)外源基因密码子：偏好密码子（蛋白质合成迅速，错配率低）和稀有密码子(2)mRNA结构：减少G、C含量，增加A、T含量(3)表达

载体：高拷贝数、适用范围广、稳定性高、表达产物容易纯化(4)外源蛋白稳定性

14.分离纯化技术应满足下列要求：(1)技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性；(2)选

择性要好(3)回收率要高(4)两个技术之间要能直接衔接(5)整个分离纯化过程要快

15.基因重组蛋白的主要分离技术

(1)离心(2)沉淀(3)膜分离(4)双水相萃取

16基因重组蛋白的主要纯化技术:

(1)离子交换层析(2)亲和层析(3)凝胶过滤层析(4)反相层析和疏水层析

17.选择分离纯化方法的依据：

（元，层析分离次序的选择也同样重要。(3)根据分离纯化工艺的要求来选择(a)具有良好的稳

定性、重复性和较高的安全性(b)尽可能减少组成工艺的步骤(c)分离纯化工艺所用的时间要

尽可能的短(d)工艺和技术必须高效

18．基因工程药物的质量控制要点

(1)蛋白质含量的测定(2)蛋白质纯度检测(3)蛋白质分子质量测定(4)蛋白质等电点测定(5)蛋

白质序列分析(6)内毒素分析、宿主蛋白与核酸残留分析

19.蛋白质含量的测定

(1)紫外吸收法(2)BCA法(3)Lowry法(4)考马斯亮蓝法(5)SDS-PAGE扫描分析法

20.蛋白质纯度的检测：电泳法、层析法、质谱法、末端氨基酸残基分析法

21.蛋白质Mr测定有SDS-PAGE法、凝胶层析法、质谱法

22.蛋白质等电点测定的常用方法：等电聚焦法。

23.蛋白质序列的分析:N-端氨基酸序列分析，C-端氨基酸序列分析

根据体外培养时动物细胞对生长基质的依赖性，可将动物细胞分为

(1)贴壁依赖性细胞(2)非贴壁依赖性细胞(3)兼性贴壁细胞

1.动物细胞培养的环境条件

(1)培养温度（哺乳类37℃，昆虫25~28℃）(2)pH值（大多数7.2~7.4）(3)通氧量（一定量的CO2）(4)防止污染(5)基本营养物质(6)渗透压

3.动物细胞的培养特性

(1)比微生物细胞大得多，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差；(2)

倍增时间长，生长缓慢，正常二倍体细胞的生长寿命是有限的；(3)对培养基要求高，易受

微生物污染，培养时需要添加抗生素；(4)生长大多需贴附于基质，相互粘连以集群形式存

在，并有接触抑制现象；(5)多半将产物分泌在细胞外，便于收集和纯化；(6)对蛋白质的合成条件和修饰功能与细菌不同，动物细胞可对蛋白质进行完善的翻译后修饰，特别是糖基化，与天然产品更一致，更适合于临床应用。

4.原代培养的主要步骤

(1)从健康动物体内无菌条件下取出适量组织，剪切成小薄片；(2)加入适宜浓度的胰蛋白酶

或胶原酶和EDTA等进行消化作用使细胞分散；(3)将分散的细胞进行洗涤并纯化后，以2×

10^6~7×10^6 /ml的浓度加到培养基中，37℃下进行原代培养，并适时进行传代培养。分为

组织块培养和单层细胞培养两种方法。

5.动物细胞深低温保存的基本原理

在-70℃以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停滞状态，故可以长期保存。

在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发

生机械损伤、电解质浓度升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白质变性等，能引起细胞

死亡。目前为了保存细胞，都采用液氮低温（-196℃）冻存的方法。

6.动物细胞的复苏

其原则是快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻

存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

7.动物细胞营养要求特点

(1)碳源不能为无机物，大多为葡萄糖；(2)氮源不能为无机物，主要为各种氨基酸；(3)在很

多情况下尚需添加5%~20%的小牛血清或适量的动物胚胎浸出液。

8.动物细胞的大规模培养方法

(1)悬浮培养法(2)微载体培养法(3)多孔载体培养法(4)微囊化培养法(5)中空纤维培养法

9.诱导动物细胞融合的方法主要有:(1)病毒法(2)PEG法(3)电击法(4)激光法

10.转基因动物生物反应器（整体掌握？）

(1)转基因动物乳腺生物反应器（药用蛋白，如抗凝血Ⅲ、抗胰蛋白酶、葡萄糖苷酶、C蛋白）

(2)转基因动物血液生物反应器（人血红蛋白、抗体或非活性状态的融合蛋白）(3)转基因动

物尿液生物反应器（促性腺激素）(4)转基因鸡（蛋）生物反应器（人干扰素）

1.单克隆抗体技术的基本原理

基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞和B细胞的融合。骨髓瘤细胞在体外

培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体；抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞和骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了两个亲代

细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗

体的能力。通常使用HAT（H为次黄嘌呤、A为氨基蝶呤、T为胸腺嘧啶核苷）选择培养基

对杂交瘤细胞进行筛选。未融合的脾细胞因不能在体外长期存活而死亡，未融合的骨髓瘤细

胞合成DNA的从头合成途径被培养基中的A阻断，又因缺乏HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸

核糖转移酶）和TK（胸腺嘧啶核苷激酶），不能利用培养基中的H和T完成DNA的合成过

程而死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了HGPRT和TK，因此能在HAT培养基

中长期存活与繁殖并分泌抗体。

2.单克隆抗体的大量制备主要方法:（1）体内培养法（2）体外培养法

6.重组ScFv的应用:(1)用于构建和生产免疫毒素(2)用于肿瘤的影像分析和治疗

7.噬菌体抗体库技术的基本原理:用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的VH和VL基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。这样一来噬菌体DNA中有抗

体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，可以方便地利用抗原-抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。

7.噬菌体抗体库构建过程

(1)从外周血或脾、淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA并反转录为cDNA；

(2)应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段；

(3)构建噬菌体载体；(4)用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。

通过多轮的抗原亲和吸附（结合）-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆。其中，噬

菌体抗体库的筛选是关键环节和步骤。

减毒活疫苗的优缺点：

优点：

（1）通过自然感染途径接种，可以诱导包括体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫在内的更全面的免疫应答，使机体获得更广泛的免疫保护；（2）由于使用的是活的微生物他们可以在体内

长时间起作用而诱导较强的免疫反应，且由于活的微生物有增殖的特性，理论上只需要接

种一次，即可达到满意的免疫效果；（3）可能引起水平传播扩大免疫效果，增强群体免疫屏

障；(4)一般不需要再疫苗中添加佐剂，生产工艺一般不需要浓缩纯化，价格低廉。

缺点：

(1)一般减毒活疫苗均保留一定残余毒力，对一些个体如免疫缺陷者可能诱发严重疾病，并

且由于种种原因如基因修饰等，减毒活疫苗可能出现毒力回复即“返祖”现象；(2)减毒活

疫苗是活的微生物制剂，可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传

染源；(3)缺损颗粒可能干扰免疫效果，因此产品分析评估较为困难；(4)保存运输等条件要

求较高，如需冷藏等。

1.灭活疫苗的特点：(1)灭活疫苗常需多次接种；(2)接种灭活疫苗产生的抗体滴度随着时

间而下降；(3)灭活疫苗需要量大。

第七章 发酵工程制药

1.发酵类型：(1)微生物菌体发酵(2)微生物的酶(3)微生物的代谢产物发酵(4)微生物转化发

酵(5)生物工程菌发酵

2.微生物发酵生产药物的分类：(1)抗生素类(2)氨基酸类(3)核苷酸类(4)维生素类(5)甾体类

激素(6)多糖类(6)治疗酶及酶抑制剂

3.菌种保藏方法：(1)斜面低温保藏法(2)石蜡油封存法(3)沙土管保藏法(4)麸皮保藏法(5)甘

油悬液保藏法(6)冷东真空干燥保藏法(7)液氮超低温保藏法(8)宿主保藏法

4.种子液具备的条件：(1)菌种的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；(2)

生理状态稳定；(3)菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；(4)无杂菌污染，保证纯种培养；()保持稳定的生产能力

5.微生物的发酵方式：（1）分批发酵（2）补料—分批发酵（3）半连续发酵（4）连续发酵

5.发酵过程的中间分析项目：（1）产物产量（2）PH值（3）糖（4）氨基氮（5）菌丝形

态

6.发酵过程的影响因素及控制：（1）菌体浓度的影响及控制（2）营养物质对发酵的影响

及控制（3）温度的影响及控制（4）PH的影响及控制（5）溶氧的影响及控制（6）二氧化碳的影响及控制（7）泡沫的影响及控制（8）染菌对发酵的影响

第三篇：生物技术制药重点总结

1.生物药物：又称为生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其它基础学科的科学原

理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的技术。

2.生物技术药物： 采用DNA重组技术或其它生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白和

核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂、血浆因子等。

3.质粒载体：质粒是指独立于原核生物染色体之外具有自主复制能力的遗传物质。分三种构型：共价闭合环状

DNA(cccDNA)、开环DNA(ocDNA)、线状DNA(IDDNA)。在琼脂糖凝胶电泳中迁移率：cccDNA > IDDNA > ocDNA

4.目的基因的常用制备方法主要包括化学合成法、PCR法、基因文库法和cDNA文库法等。

5.PCR法是指聚合酶链反应，是根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模

板特异性的扩增DNA。在含有DNA模板、引物、DNA聚合酶、dNTP的缓冲溶液中通过三个循环步骤扩增DNA：：①变性—双链DNA模板加热变性，解离成单链模板；②退火—温度下降，引物与单链模板结合（温度下降，PCR特性下降，效率升高）；③延伸—温度调整至DNA聚合酶最适宜温度，DNA聚合酶催化dNTP加至引物3′-OH，引物以5′→3′方向延伸，最终与单链模板形成双联DNA, 并开始下一个循环。

6.cDNA文库法：cDNA是指与mRNA互补的DNA。cDNA文库法是指提取生物体总mRNA，并以mRNA作为模板，在逆转录酶的催化下合成cDNA的一条链，再在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA，将全部cDNA都克隆到宿主细胞而构建成cDNA文库。

7.影响目的基因与载体之间连接效率的主要因素：

①DNA片段之间的连接方式；粘性末端的连接效率高于平头末端。

②目的基因与载体的浓度和比例；增加DNA浓度可以提高连接效率，目的基因于载体DNA的摩尔数比应大于1。③连接温度，时间，连接酶的活性及缓冲体系。

8.重组DNA导入宿主细胞的方法：转化、转染、显微注射和电穿孔。

9.互补筛选法（最常见蓝白班筛选法）需添加X–gal（X–Gal是β–半乳糖苷酶（β–galactosidase）的底物，水解后呈蓝

色）和IPTG（是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质）筛选物质进行筛选。

10.菌落原位杂交：又称探针原位杂交法，制备与目的的基因某一区域同源的探针序列，根据核酸杂交原理，探针序列

特异性地杂交目的基因，并通过放射性同位素或荧光基团进行定位监测。

11.凝胶过滤层析：凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)法又称排阻层析或分子筛方法。基本原理是：根据生物

大分子的蛋白质的质量的大小来实现目的蛋白的分离纯化。在凝胶过滤层析中所用的凝胶是一种惰性的不带电荷具有三维空间结构的多孔网状物质，凝胶的每个颗粒的微粒结构就如一个筛子，当样品随流动相经过凝胶柱时，较大的分子内不能进入凝胶网孔内而收到排阻，将与流动相一起首先被洗脱下来，而较小的分子进入部分凝胶网孔内，所以流出的速度相对较慢。

12.反相层析（RPC）和疏水层析（HIC）的比较：是根据蛋白质疏水性差异来实现分离纯化。先比反相层析而言，疏

水层析回收率较高，蛋白质变性的可能性较小。反相层析和疏水层析的差异在于前者在有机相中进行，蛋白质经过反向流动相与固定相作用有时会发生部分变性，而后者通常在水溶液中进行，蛋白质在分离过程中一般仍保持其天然构象。

13.蛋白质含量测定方法：紫外吸收法、BCA法、福林—酚试剂法（lowry）、考马斯亮蓝法、ELISA法等。

14.蛋白质纯度检查的常见方法：SDS-PAGE法（最常用）、非变性PAGE法、层析法等。

15.蛋白质序列的分析方法：N-端氨基酸序列分析法（基本原理Edman法）、C-端氨基酸序列分析法。

16.体外培养动物细胞的类型：贴壁依赖性细胞，非贴壁依赖性细胞和兼性贴壁细胞。

17.动物细胞与微生物细胞，植物细胞相比较具有的特点：

①比微生物细胞大得多，无细胞壁，抗机械强度低，对剪切力敏感，适应环境能力差

②倍增时间长生长缓慢，正常二倍体细胞的生长寿命是有限的③对培养基的要求高，易受微生物污染，培养时常常需要添加抗生素

④生长大多需贴附于基质，相互黏连以集群形式存在，并有接触抑制现象

⑤多半将产物分泌在细胞外，便于收集和纯化。

18.动物细胞的营养要求是：1.碳源不能为无机物，大多为葡萄糖

2.氮源也不能为无机物，主要为各种氨基酸

3.在很多情况下尚需添加5%-20%的小牛血清或适量的动物胚胎浸出液

19.动物培养基可分为：天然培养基，合成培养基和无血清培养基三大类.20.原代细胞：直接将动物组织或器官经过粉碎，消化而制的的悬浮细胞称为原代细胞.21.悬浮培养法：是细胞在培养液中呈悬浮状态生长繁殖的培养方法，它适用于一切种类的非贴壁细胞，兼性贴壁细胞，可连续测定细胞浓度，连续收集部分细胞进行继代培养，也无需消化分散，细胞收率高

22.木瓜蛋白酶水解IgG分子可产生两个抗原结合片段（Fab）和一个可结晶片段（Fc）

23.胃蛋白酶水解IgG分子可产生一个F(ab’)2和若干裂解小分子片段（pFc’）

24..单克隆抗体技术的基本原理：基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。骨髓瘤细胞在体外培养能大量无限增殖，但不能分泌特异性抗体，而抗原免疫的B细胞能产生特异性抗体，但在体外不能无限增殖。将免疫B细胞与骨髓瘤细胞融合后形成的杂交瘤细胞，继承了连个亲代细胞的特性，既具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，又具有免疫B细胞合成和分泌特异性抗体的能力。

25.骨髓瘤细胞发生回复突变每3-6个月应用8-氮杂鸟嘌呤（8-AG）筛选一次，以便杀死突变细胞

26.细胞融合的方法：常用的有转动法和离心法.27.杂交瘤细胞的克隆化的方法有：有限稀释法和软琼脂平板法，显微操作法

28.双特异性抗体：是含有两个不同配体结合位点的抗体分子，它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。其中一个可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物（如药物，效应细胞等）结合，从而将效应物直接导向靶组织细胞。

29.细胞内抗体：亦称内抗体，主要是指细胞内合成并作用于细胞内组分的抗体。

30.如何构建噬菌体抗体库？构建噬菌体抗体库通常包括以下几个过程：1.从外周血或脾，淋巴结等组织中分离B细胞，提取mRNA并反转录为cDNA2，应用抗体轻链和重链引物，根据建库的需要通过PCR技术扩增不同的抗体基因片段3，构建噬菌体载体4，用表达载体转化细菌，构建全套抗体库。通过多伦的抗原亲和吸附-洗脱-扩增，最终筛选出抗原特异性地抗体克隆。筛选为关键环节和步骤。

31.疫苗的组成：具有免疫保护性的抗原（Ag）如蛋白质，多肽，多糖或核酸等与免疫佐剂混合制备而成。

32.佐剂是指能非特异性的增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，可先于抗原或与抗原一起注入机体。

33.目前用于人体的佐剂只有两种：1，铝佐剂（氢氧化铝或磷酸铝）2，MF59

34.灭活疫苗和活疫苗的特点比较：（P122,表5-4）

35.联合疫苗包括多联疫苗和多价疫苗，多联疫苗可用于预防由不同病原微生物引起的传染病，而多价疫苗仅预防同一

种病原微生物的不同亚型引起的传染病。

36.核酸疫苗是20世纪90年代发展起来的一种新型疫苗。核酸疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由能引起机体保护性

免疫反应的抗原的编码基因和载体组成。核酸疫苗又称为基因疫苗，基因免疫或核酸免疫

37.酶的分离纯化过程必须遵循以下原则：

1、全部操作一般在低温（0-4摄氏度）进行。

2、在分离提纯过程中，不能

剧烈搅拌。

3、在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA,少量 –巯基乙醇等

4、在分离提纯过程中要不断测定酶的的活力和蛋白质浓度，以对纯化过程进行检测。一般用两个指标来衡量分离纯化方法的好坏：总活力的回收率和比活力提高倍数。

38.传统的酶固定化方法大致可分为载体联合法，交联法和包埋法

39.固定化对酶稳定性的影响：

1、热稳定性提高

2、对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高

3、对PH，蛋白酶，储存

盒操作条件的稳定性提高

40.目前常用的菌种保藏方法有：

1、斜面低温保藏法，一般可保存1-6个月左右

2、石蜡油封存法，一般可保存1-2年左右

3、砂土管保藏法，保藏期约1-10年

4、麸皮保藏法，保藏期在一年以上

5、甘油悬液保藏法，-20度保藏期约为0.5-1年，-70度下保藏期可达10年

6、冷冻真空干燥保藏法，5-15年

7、液氮超低温度保藏法，15年以上

8、宿主保藏法

41、产物产量的测定方法有：生物测定法和化学测定法，一般采用化学测定法，以求迅速跻身反应生产情况。中国微生物菌种保藏委员会CCCCM中国典型培养物保藏中心CCTCC

美国典型菌种保藏中心 ATCC美国的北部地区研究实验室NRRL

英国的国家典型菌种保藏所NCTC日本的大阪发酵研究所IFO

德国菌种保藏中心DSM42、中间反应产量测定：产物产量、ph值、糖、氨基酸、菌丝形态。

43、PH对发酵的影响有哪些？

1.PH影响酶的活性，当PH值抑制菌体的某些酶的活性时使菌的新陈代谢受阻

2.PH影响微生物细胞膜所带电荷的改变，从而改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物质的吸收和代谢物的排泄，因此影响新陈代谢的进行

3.PH影响培养基某些成分和中间代谢物的解离，从而影响微生物对这些物质的利用

4.PH影响代谢方向，PH不同，往往引起菌体代谢过程不同，是代谢产物的质量和比例发生改变。

44、基因工程菌发酵生产的特点？采用基因重组技术构建的基因工程菌与细胞，由于带有外来基因，对其进行培养和

发酵的工艺技术通常与单纯的微生物细胞的工艺技术有不同之处。基因工程菌发酵的目的主要是实现外源基因的高效表达，以获取大量的外源基因产物。而外源基因的高技术表达不仅涉及宿主、载体与外源基因三者之间的相互关系，与所处环境条件密切相关。基因工程菌发酵一般分两个阶段：前期是菌体生长阶段，后期是菌体生长阶段。

45、基因工程菌不稳定性的原因？主要表现在质粒的不稳定性以及表达产物的不稳定性。而质粒的不稳定性又分结构的不稳定性以及分离不稳定。结构不稳定性是由于转位作用和重组作用所引起的质粒DNA的重排与损失。分离的不稳定性是细胞分裂过程中发生的不平均分配，从而造成质粒的缺陷型分配，以致造成质粒丢失。引起质粒载体不稳定性的原因只要是宿主新陈代谢负荷的加重，大量外源蛋白的形成对宿主细胞的损害，通常是致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生长的快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这就导致了基因工程菌的不稳定性。

46、突变生物合成：采用一些诱变剂，如紫外线，激光，高速电子流或一些化学药物如亚硝基胍，溴化乙啶等对药物的产生菌进行诱变，是他们丧失合成某种中间体的能力，因而不能合成原来结构的化合物，陈武阻断突变株。在发酵培养这些阻断突变株时添加某些天然或化学合成的化合物作为中间体，这些突变株能利用这些中间体合成一些新结构的最终化合物，这个过程称为突变生物合成。

47、微生物转化系酶促化学反应，具有与通常有机化学反应不一样的特点：

1.以具有活性中心和特殊空间结构的酶作为催化剂

2、对作用的基质有严格的选择性和专一性

3、酶催化反应的速度极高，非一般催化剂可比

4、一般在常温常压下进行，反应条件温和

48、微生物对甾体转化反应的特点：在微生物转化过程中，专一，有效的菌体量的多少，以及甾体底物在水相的溶解

性等问题成为影响转化率的重要因素，目前采用的两阶段发酵及两相发酵方法很好的解决了这些甾体微生物转化中的问题。

49、蛋白质药物对化学修饰的意义：

50、最常用的修饰剂有：主要是水溶性高分子聚合物，如葡聚糖、右旋糖苷、肝素以及低分子肝素、多聚唾液酸、聚

乙烯吡咯烷酮、聚氨基酸、PEG、白蛋白等。目前以PEG最常用的。其毒性小、无抗原性、溶解性良好。

51、修饰策略有随机修饰与定点修饰两类。氨基修饰主要用随机修饰，在利用特定的修饰剂可以实现定点修饰。巯基

修饰多为定点修饰。羧基修饰为定点修饰。

52、选择PEG修饰剂应该考虑的因素：PEG的Mr，修饰位点，水解稳定性和反应活性。

53、核酶：核酶不是普通的蛋白质酶，而是一类具有催化活性的核酸分子。目前已知的具有核酶催化功能的RNA结

构至少可以分成5类：发夹状核酶，锤头状核酶，I型内含子核酶，RNaseP核酶，丁型肝炎病毒核酶等

54、反义核酸：是指具有抑制基因表达作用。包括反义RNA、反义DNA分子，由部分RNA和部分DNA形成RNA-DNA

嵌合分子，以及经高度化学修饰的寡聚核酸类似物，这些分子统称反义核酸类药物。

55、褔米韦生经美国FDA批准上市成为第一个反义核酸类药物。

56、RNAi:即RNA干扰现象，是近几年发现的一种由双链RNA诱导的基因表达调控和基因沉默过程。主要阶段：

启动阶段和执行阶段

57、小干扰RNA(siRNA)：在启动阶段，当细胞由于病毒感染等原因出现双链RNA分子或带有较长双链的发卡结构

RNA时，细胞中的Dicer的核酸酶会识别其双链RNA，将其降解成21~23bp长的小干扰RNA。主要参与RNA干扰（RNAi）现象，以带有专一性的方式调节基因的表达。

第四篇：生物技术制药教学大纲

第一章 绪论（2学时）第一节 生物技术概述 1 生物技术的概念 2 生物技术发展史 第二节 生物技术制药 1 生物技术制药的概念 2 生物技术在制药中的应用 我国生物技术制药现状和发展前景 4 医药生物技术发展展望

第二章 生物药物（10学时）

1．生物药物的来源、特性、分类与制备。（2学时）

2．氨基酸类药物：氨基酸类药物研究概况；在医药中的应用；氨基酸生产。（2学时）3．多肽、蛋白质类药物：多肽、蛋白质类药物的特点、分离纯化方法、工业生产制备过程。（2学时）

4．核酸类药物：概述（分类、应用）；生产方法；核酸类药物的制备。（2学时）5．糖类药物：制备；纯化。（2学时）

第三章 基因工程制药（8学时）

通过本章学习，了解基因工程药物研制的意义，掌握基因工程药物的研制过程、研制方法。1概述。

2基因工程药物生产的基本过程。(2)3目的基因的获得：直接分离法；从基因文库中筛选；逆转录法；人工合成法。4目的基因与运载体的体外重组：常用载体；目的基因与运载体的体外重组。5重组分子导入受体细胞；导入方法；影响转化的因素；阳性重组体的筛选。(2)6基因表达：大肠杆菌中的基因表达；真核基因在原核生物中的表达方式；真核基因在真核生物中的表达；真核基因在动物细胞中的表达。(2)7基因工程下游技术；下游技术的要求；基因工程菌的稳定性；基因工程菌发酵。8基因工程药物的分离、纯化：分离纯化的基本过程；分离纯化的技术。

9基因工程药物的质量控制:材料的质量控制;培养过程的质量控制;纯化工艺工程的质量控制。(2)第四章 动物细胞工程制药（8学时）1 概述： 形态及生理特性。（2）生产用的动物细胞：生产用动物细胞的要求；生产用动物细胞的获取。4 基因工程细胞的构建和筛选；真核细胞基因表达载体的构建；基因载体的导入和高效表达工程细胞株的筛选。（2）动物细胞的培养条件和培养基 6 动物细胞培养的基本方法（2）7 动物细胞大量培养的方法和操作方式 动物细胞生物反应器及检测控制系统：搅拌式生物反应器；气升式生物反应器；流化床生物反应器。（2）

第五章 抗体制药（4学时）1概述

2单克隆抗体：制备；细胞融合；杂交瘤的培养、筛选及克隆化。（2）

3鼠源性单克隆抗体的改造：Ig分子的结构模式图；结构改造；基因工程抗体。4抗体的应用：临床检验；层析介质；导向药物。（2）

第五篇：生物技术制药现状及发展前景

新疆农业大学

题目:

姓名:

学院:

专业:

班级:

学号:

指导教师: 文献综述生物技术制药现状及发展前景刘元元农学院生物技术082班083135210张华 职称 教授

2011 年 11 月 21日

生物技术制药现状及发展前景

作者：刘元元指导老师：张华

摘要：生物技术制药是以基因工程为基础的现代生物工程，即利用基因工程技术、细胞工程技术、微生物工程技术、酶工程技术、蛋白质工程技术、分子生物学技术等来研究和开发生产出传统制药技术难以获得的生物药品。生物制药业是目前生物技术发展最活跃，进展最快的产业之一，21世纪是生物制药行业飞速发展的时代。关键字：生物技术制药；研究进展；现代生物技术；新技术

Biotechnology pharmaceutical situation and development prospect

Abstract: Biotechnology-based pharmaceuticals is based on modern genetic engineering, biological engineering, namely the use of genetic engineering, cell engineering, microbial engineering, enzyme engineering, protein engineering, molecular biology technology to research and development and production of the traditional system Difficult to obtain bio-medicine technology medicine.Biopharmaceutical industry is currently the most active in the development of biotechnology, one of the industries most advanced, 21st century is the rapid development of bio-pharmaceutical industry of the time.Keywords: Biotechnology Pharmaceutical;Research;Modern biotechnology;New Technology生物技术制药现状

现代生物技术是以基因为源头，基因工程和基因组工程为主导技术，与其他高技术相互交叉、渗透的高新技术。比尔·盖茨预言：下一个首富可能是从事生物技术的投资者。生物技术制药可以分为二类：一类是生化药物，主要是运用生物化学方法从生物体中分离．纯化得到的一些生物活性物质，如维生素、酶、核酸、激素等；另一类是生物医药，主要是以微生物、生物组织、人或动物的血液等原料采用物理方法和生物化学工艺制得的生物活性制剂、血液制品、抗血清、抗毒素等。

1.1 非基因工程生化物

此类药物有脑蛋白水解物注射液、玻璃酸钠、分子肝素钙、分子肝素钠、促肝细胞生长素、蚓激酶、甘糖酯等共97种。

1.2 先导化合物

以天然产物为先导化合物，通过组合化学技术合成大量结构相关的物质，建立有序变化的化合物库，供药物筛选和药效关系研究用。

1.3 生化制药中先进分离分析技术的运用

多种层析（如亲和层析、高效液相层析）、超速离心等技术的运用，可成功地制得高纯度的生化药物。如尿激酶、胰岛素、重组人胰岛素、激肽释放酶、辅酶A、肝素钠等都是通过这种技术使药效得到较大的提高。

1.4 应用生物技术、化学合成、结构后修饰研究开发新药

应用上述技术系统综合研制开发的新药，主要有以下各类药物：1）多糖类，如玻璃酸钠、香菇多糖、低分子肝素等；2）酶及酶抑制剂类，如门冬酚胺酶、葡激酶、人胰蛋白酶抑制剂、胶原酶、降纤酶等；3）多肽类，如人降钙素、鲑鱼降钙素等；4）细胞因子类，如白介素-

6、肿瘤坏死因子、神经生长因子、血小板生成素等；5）结构后修饰类，如修饰门冬酚胺酶、修饰超氧化物歧化酶等。

1.5 应用生物技术改造传统制药工艺

微生物发酵是制药工业生产微生物药品的重要手段。微生物转化是利用微生物产生的特异酶完成特定的生化反应，使有机物转变成工业产品。由于生物药品具有疗效好、副作用小、且可大规模生产、利润极高、无环境污染等优点，受到各国政府重视，行业前景十分广阔。

2生物制药研究新进展

2.1 计算机辅助药物设计技术发展

计算机技术的发展和向药物化学学科的渗透，促进了药物设计的发展。20 世纪90年代计算机辅助药物设计取得突破性进展，现已成为药物研究和开发的重要方法和工具。

计算机辅助药物设计利用了计算机快速、全方位的逻辑推理功能、图形显示控制功能，并将量子化学、分子力学、药物化学、生物化学和信息科学结合起来，研究受体生物分子与药物结合部位的结构与性质、药物与受体复合物的构型和立体化学特征、药物与受体结合的模式和选择性、特异性、、药物分子的活性基团和药效构象关系等，从药物机理出发，改进现有生物活性物质的结构，快速发现并优化先导化合物，使其尽早进入临床前研究，减少传统的新药研究的盲目性，缩短新药研制的时间。

计算机辅助药物设计有两类方法，一类是基于机理的药物设计（MBDD），另一类是基于结构的药物设计（SBDD），基于机理的药物设计要针对药物作用机理，从靶点出发，考虑药物与受体的作用过程，并要模拟药物在体内的吸收、转运、代谢等动态过程，比基于结构的药物设计更合理，但该法还不成熟。目前的计算机辅助药物设计主要还是基于结构的药物设计，今后的计算机辅助药物设计的目标是向基于机理的药物设计方向发展。相信随着生命科学和计算机科学的发展，考虑药物不同作用机理和全部作用过程的计算机辅助药物设计技术将逐步建立并不断完善。

2.2 组合化学与高通量筛选技术发展

组合化学是近20年发展起来的一种合成大量化合物的新方法，它是建立在高效平行的合成之上，在同一个反应器内使用相同条件同时制备出多种化合物，建立各类化合物库的策略。组合化学通常采用操作、分离简便的固相化学合成。液相化学合成技术也在快速发展和完善中。

在药物研究过程中，通过化合物活性筛选而获得具有药物活性的先导化合物是新药研究的基础。随着分子水平的药物筛选模型的建立，筛选方法和技术都发生了根本性的变化，出现了高通量筛选的新技术，大大加快了先导化合物的寻找和发现，并促进了高通量有机合成。近年来，组合化学与高通量筛选结合，使组合化学的化合物库种类、数量不断扩大，筛选的先导化合物数量和种类也在不断地增多，使新药的种类和数量也在不断地增加。组合化学实现的自动化合成仅20世纪90年代后得到的各类化合物总和已超过了人类有史以来所发现化合物的总和，故有人把组合化学与高通量筛选结合技术称为“新药发现的高速公路”，据文献记载，1992年～1998年的几年，经过组合化学化合物库与高通量筛选，确定的候选药物已有46个，并已进入人体测试阶段。显然，组合化学与高质量筛选的结合技术，大大地加快了新药研制的步伐。虽然如此，组合化学建立的大型化合物库，为筛选也带来了困难，因此，利用组合化学设计，构建具有结构多样性的小型而便于筛选的组合化合物库，结合化学信息学和高通量筛选，将是组合化学与高通量筛选结合的一项重要课题。

2.3 药物手性合成技术发展

化学合成技术在新药发现过程中发挥着十分重要的作用。近年来由于有机化学学科新理论、新反应、新技术不断发现，使得合成反应具有化学选择性成为现实，并促进了药物合成技术的快速发展，其中手性合成技术使新药研制的领域不断扩大。

手性是自然界的本质属性。在生物体手性环境，如酶、受体、离子通道、蛋白质、载体中，分子之间手性匹配是分子识别的基础，受体与配体的专一作用，酶与底物的高度、区域、位点和立体催化专一性，抗原与抗体的免疫识别都与手性有关，同时药物的生物应答常受到手性影响，包括药物在体内的吸收、转运、分配、位点活性的作用以及代谢和消除。所以，手性药物的开发是当前医药界重点研究的热点之一，并取得了令人注目的成就。目前已上市的药物中手性药物约占1/3，如2000年全球手性药物销售额达1233亿美元。

手性药物的制备技术主要有拆分法、化学合成法和生物合成等三大类，发展较快的是后二类。化学合成法是在不对称催化剂存在下，利用化学反应的动力学和热力学不对称性，进行单一对映体合成。在已上市的手性药物中，其手性中间体均可通过现有的重（双）键不对称还原技术，特别是不对称氢化和不对称转移氢化来合成。至今为止在不对称催化合成中，昂贵的手性配体和贵金属的使用，以及手性催化剂的催化效率仍是制约其在手性技术上应用的关键。因而，手性催化剂的设计和合成，以及催化剂的回收循环使用是当今不对称催化合成研究的方向。

生物合成法则利用催化剂, 酶-催化反应的高度、底物、区域、位点和立体选择性来合成手性药物。生物合成法具有选择性高、产率高、反应条件温和等特点，随着科学技术的发展，生物合成法将成为手性制备的高效手段。

2.4 药物生物技术发展

生物技术药物是指利用DNA重组技术或单克隆抗体技术或其它生物技术研制的蛋白质、抗体或核酸类药物，它是目前生物技术研究最为活跃的领域，给生命科学的研究和生物制药工业带来了革命性变化。未来生物技术的展望

研究和发展方向：我国生物制药产业的研发方向要结合传统医药的优势，发展重点应针对神经系统、肿瘤、心血管系统、艾滋病及免疫缺陷等重大疾病的多肽、蛋白质和核酸。乙肝基因疫苗与单克隆抗体的研究开发、血液替代品的研究与开发、生物技术在医药领域的应用，如基因治疗、生物人基因芯片、干细胞等。目前，我国已经制定了明确的生物制药产业发展规划和产业技术政策，政府从上到下对生物技术研究开发的支持和政策扶持；国内各大企业（包括民营企业）对生物技术的关注和资金投入；我国金融界积极参与生物技术产业的发展，尤其是许多有实力的公司都参与了生物技术的开发；而我国生物技术产业领域目前已经汇集了一批自己培养和从国外归来的具有高学历、高素质的科学家和企业家，这四方面的因素对于我国生物技术产业的快速发展起到了很重要的作用。由于生物医药产业投资回报周期为5 年至8 年，而我国进人生物工程领域的时间尚短，回报的周期尚未到来。预计到二十一世纪的前几年将是我国生物制药产业的收获季节。

参考文献:

[1] 沈铁军.提高中草药市场竞争几点思考[J].时珍国医国药, 1999, 10(11):9-10.[2] 刘诒.治疗抑郁及相关病症的植物提取物制剂[J].国外医药:植物药分册, 2007, 22(5):223-225.[3] 姜倩倩, 刘京贞, 苏瑞强.单克隆抗体药物进展[J].药物生物技术, 2005, 12(4):270-274.[4] 胡显文, 陈惠鹏, 汤仲明, 等.生物制药的现状和未来[J].中国生物工程杂志, 2005, 25(1):86-89.[5] 徐明波, 何玮, 马清钧.生物技术药品产业化的现状及前景[M].北京:化学工业出版社, 2003:35-43.[6[ 王立新.徐薇.关东庆C3d-P28增强乙肝病毒基因免疫诱导的特异性细胞免疫应答[期刊论文]-细胞与分子免疫学杂志 2003(03)

[7] 米力.陈志南动物细胞大规模培养生产蛋白的工艺选择[期刊论文]-中国生物工程杂志 2003(07)

[8] 张学文.章怀云干扰素γ诱导细胞抗病毒的分子机制[期刊论文]-湖南农业大学学报(自然科学版)2001